CN103397064A - 一种酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及
一种酶法制备瑞鲍迪甙
M
的方法，该方法以瑞鲍迪甙
A
或瑞鲍迪甙
D
为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在
UDP-
葡萄糖基转移酶和
/
或含有
UDP-
葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙
M
。
本发明提供的酶法制备瑞鲍迪甙
M
的方法具有重要的应用价值。与已有从甜菊叶中提取
瑞鲍迪甙
M
的
技术相比，本发明方法生产周期显著缩短，产能提高，成本较低，且可提供纯度更高的产品，因而能更经济的用于食品饮料业。
Description
技术领域
本发明涉及一种瑞鲍迪甙M的制备方法，特别涉及一种瑞鲍迪甙M的生物制备方法。
背景技术
甜味剂是一类广泛应用于食品、饮料及糖果生产的食品添加剂。其既可以在食品的生产过程中添加，也可以在家庭烘焙时经过适当稀释作为蔗糖的替代品使用。甜味剂包括天然甜味剂和人工甜味剂，前者如蔗糖、高果糖玉米糖浆、蜜糖等，后者如阿斯巴甜、糖精等。甜菊糖是一类从植物甜菊中提取出来的天然甜味剂，目前已被广泛用在食品及饮料中。甜菊的提取物中含有包含瑞鲍迪甙在内的多种甜菊糖，天然提取的甜菊糖不同的批次成分差异较大，需要后续的提纯。目前商业化的产品瑞鲍迪甙A包含一些其它的甜菊糖如瑞鲍迪甙C，D及F等。提取的方法制备的甜菊糖通常还有混有一些杂质，有可能对其使用范围造成一定的影响。瑞鲍迪甙M相较于瑞鲍迪甙A具有优势，但其在甜菊叶中的含量极少，且只在甜菊Morita植株中被检测到（2010，J.Appl.Glycosci.,57,199-209）。目前尚未有瑞鲍迪甙M的商业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法可以较低的成本，较短的周期生产出高纯度的瑞鲍迪甙M产品。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和/或含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M。
根据本发明，所述葡萄糖基供体可以为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系（2007，FEBS Letters，581，2562–2566）。其中，优选由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系，UDP葡萄糖价格较高，采用由UDP-葡萄糖再生体系可以大幅度降低成本。
根据本发明，UDP-葡萄糖基转移酶（即脲苷二磷酸葡萄糖基转移酶，简称UGT）是已知的。优选地，本发明所用的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊（Stevia rebaudiana）的UGT-A和/或来自水稻（Oryza sativa）的UGT-B。
UGT-A的氨基酸序列可以与序列2具有至少60%的一致性。优选地，UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少70%的一致性。进一步优选地，UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。最优选地，UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少90%的一致性。根据一个具体方面，UGT-A的氨基酸序列与序列2完全一致。
UGT-B的氨基酸序列可以与序列4具有至少60%的一致性。更优选地，UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少70%的一致性。进一步优选地，UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。最优选地，UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少90%的一致性。根据一个具体方面，UGT-B的氨基酸序列与序列4完全一致。
根据本发明，可以使所述反应在温度4℃～50℃以及pH5.0～9.0的水相体系中进行。优选地，使所述反应在温度25℃～35℃以及pH6.5～7.5的水相体系中进行。
更优选地，使反应在温度30℃下进行。
更优选地，使反应在pH7.0下进行。
根据一个具体优选方面，使反应在pH7.0的磷酸缓冲液中进行。
根据本发明，当采用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞来进行所述催化时，可以使所述反应在细胞通透剂存在下进行。优选的，所述细胞通透剂为甲苯，其在整个反应体系中的体积比浓度可以为1%～3%。更优选地，甲苯的体积比浓度为2%。
根据本发明，所述的重组细胞可以且优选为微生物细胞，其中微生物可以且优选为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母等。
根据一个具体和优选方面，所述方法实施如下：将反应所用的全部原料加入到反应釜中，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。反应完毕后，通过提纯处理即可获得达到使用要求的瑞鲍迪甙M产品。一个具体的提纯方方法是经包括树脂分离在内的后处理，按照该提纯方法，可获得纯度高达95%的瑞鲍迪甙M产品。
根据本发明的一个具体方面：底物为瑞鲍迪甙A，UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的混合物，来自甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性；来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。优选地，混合物中，来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的重量比为1:0.8～1.2，例如二者的重量比可以为1:1。
根据本发明的又一具体方面：底物为瑞鲍迪甙D，UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A，该来自甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。
由于以上技术方案的实施，本发明与已有技术相比具有如下优势：
本发明提供的酶法制备瑞鲍迪甙M的方法具有重要的应用价值。由于微生物生长速度远远快于植物，采取所述方法可以较大幅度的降低生产成本，缩短生产周期，极大的提高产品的竞争力。此外，植物中的甜菊糖含量低，且有较多不同结构的甜菊糖，很难提取较纯的产品，而采用本发明的酶法合成方法能够提供纯度更高的产品，将会进一步扩大其应用范围。与已有从甜菊叶中提取瑞鲍迪甙M的技术相比，本发明方法生产周期显著缩短，产能提高，成本较低，且可提供纯度更高的产品，因而能更经济的用于食品饮料业。
附图说明
图1为本发明实施例5所得产品的氢核磁谱图。
具体实施方式
以下瑞鲍迪甙A、瑞鲍迪甙D、瑞鲍迪甙M分别简称Reb A、Reb D和Reb M，三者的结构式分别参见式I、II和III。
本发明主要提供四条合成Reb M的路线：
路线一：
路线二：
路线三：
路线四：
根据本发明，所用的UGT-A或UGT-B可以酶冻干粉形式存在或存在于重组细胞中。
UGT-A或UGT-B的获得方法如下：
利用分子克隆技术、基因工程技术获得UGT-A或UGT-B的重组大肠杆菌（或其它微生物菌）表达菌株，然后将重组大肠杆菌发酵，制备得到含有UGT-A或UGT-B的重组细胞，或者制备得到UGT-A或UGT-B的冻干粉。
本发明所述的分子克隆技术和基因工程技术均是已知的。分子克隆技术可参见《分子克隆实验指南》第三版（J.沙姆布鲁克著,2005）。
采用基因工程技术构建本发明重组菌株的表达步骤如下：
（1）（根据序列1及序列2，或根据序列3及序列4）基因合成所需的基因片段，连入pUC57载体，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点；
（2）通过双酶切、连接，将各基因片段插入表达载体pET30a相应的酶切位点中，使各基因置于T7启动子的控制之下；
（3）将重组质粒转化进入大肠杆菌BL21（DE3）中，利用IPTG诱导目的蛋白表达，得到UGT-A或UGT-B的重组大肠杆菌表达菌株。
利用含有UGT-A或UGT-B的重组大肠杆菌表达菌株制备含有UGT-A或UGT-B的重组细胞，或者UGT-A或UGT-B的冻干粉的步骤如下：
以1%比例将含有UGT-A或UGT-B的重组大肠杆菌表达菌株接种到4ml液体LB培养基中，，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mM IPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得所述重组细胞，或进一步于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000rpm，10min），收集上清液冻干24h，获得所述冻干粉。
以下结合具体的实施例对本发明作更为详细的描述。
实施例1：制备含UGT-A的重组大肠杆菌细胞
根据序列1及序列2，基因合成UGT-A基因片段，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，连入pUC57载体（苏州金唯智生物技术有限公司）。将UGT基因片段用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pET30a对应酶切位点，转化BL21（DE3）菌株。
以1%比例将UGT菌种接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mM IPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得含UGT-A的重组细胞用于催化。
实施例2：制备UGT-A冻干粉
将实施例1中制得的UGT-A的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000rpm，10min），收集上清液冻干24h，获得UGT-A的冻干粉。
实施例3：制备含UGT-B的重组大肠杆菌细胞
根据序列3及序列4，基因合成UGT-B基因片段，两端分别加上NdeI和BamHI酶切位点，连入pUC57载体（苏州金唯智生物技术有限公司）。将UGT基因片段用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切，回收纯化片段，加入T4连接酶将片段连入pET30a对应酶切位点，转化BL21（DE3）菌株。
以1%比例将UGT菌种接种到4ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）过夜，取过夜培养物以1%接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振荡培养（200rpm）至OD600值达到0.6-0.8，加入终浓度0.4mM IPTG于20℃振荡培养过夜。诱导结束后离心收集细胞（8,000rpm，10min），用5ml2mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）重悬细胞，获得含UGT-B的重组细胞用于催化。
实施例4：制备UGT-B冻干粉
将实施例3中制得的UGT-B的重组细胞于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心（8,000rpm，10min），收集上清液冻干24h，获得UGT-B的冻干粉。
实施例5：以Reb D为底物酶法合成Reb M（路线一）
在本实施例中，按照实施例2方法制备的UGT-A冻干粉被用于催化合成Reb M。
在反应体系中依次加入150mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.255gUDP葡萄糖，0.17g Reb D，UGT-A冻干粉1.5g，混合均匀后置于30℃水浴，160rpm搅拌反应2h。反应结束后，取500μl反应液加入等体积无水甲醇混匀，8,000rpm离心10min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilent eclipse sb-C184.6X250mm；检测波长：210nm；流动相：1%甲酸水溶液﹕甲醇=20%﹕80%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃）。Reb D的转化率为40%以上。经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到Reb M0.054g，纯度大于95%。
实施例6：以Reb A为底物酶法合成Reb M（路线二）
在本实施例中，按照实施例2方法制备的UGT-A冻干粉和按照实施例4方法制备的UGT-B冻干粉被用于催化合成Reb M。
在反应体系中依次加入150mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.51gUDP葡萄糖，0.145g Reb A，UGT-A及UGT-B冻干粉各1.5g，混合均匀后置于30℃水浴，160rpm搅拌反应2h。反应结束后，取500μl反应液加入等体积无水甲醇混匀，8,000rpm离心10min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilent eclipse sb-C184.6X250mm；检测波长：210nm；流动相：1%甲酸水溶液﹕甲醇=20%﹕80%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃）。Reb A的转化率为40%以上。经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到Reb M0.05g，纯度大于95%。
实施例7：以Reb D为底物酶法合成Reb M（路线三）
在本实施例中，使用蔗糖、来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的蔗糖合成酶（以下简称AtSUS1）以及UDP组成的UDP-葡糖糖再生体系作为葡糖糖基供体。
在反应体系中依次加入150mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.182gUDP，51.3g蔗糖，0.17g Reb D，UGT-A冻干粉1.5g以及AtSUS1冻干粉0.5g，混合均匀后置于30℃水浴，160rpm搅拌反应2h。反应结束后，取500μl反应液加入等体积无水甲醇混匀，8,000rpm离心10min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilent eclipse sb-C184.6X250mm；检测波长：210nm；流动相：1%甲酸水溶液﹕甲醇=20%﹕80%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃）。Reb D的转化率为80%以上。经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到Reb M0.11g，纯度大于95%。
实施例8：以Reb A为底物酶法合成Reb M（路线四）
在本实施例中，使用蔗糖、来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的蔗糖合成酶（以下简称AtSUS1）以及UDP组成的UDP-葡糖糖再生体系作为葡糖糖基供体。
在反应体系中依次加入150mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.364gUDP，51.3g蔗糖，0.145g Reb A，UGT-A和UGT-B各1.5g以及AtSUS1冻干粉0.5g，混合均匀后置于30℃水浴，160rpm搅拌反应2h。反应结束后，取500μl反应液加入等体积无水甲醇混匀，8,000rpm离心10min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilent eclipsesb-C184.6X250mm；检测波长：210nm；流动相：1%甲酸水溶液﹕甲醇=20%﹕80%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃）。Reb A的转化率为80%以上。经硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到Reb M0.108g，纯度大于95%。
实施例9：以Reb D为底物全细胞催化合成Reb M
在本实施例中，按照实施例1方法制备的含UGT-A的重组细胞用于催化合成Reb M。
在反应体系中依次加入150mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.255gUDP葡萄糖，3mL甲苯，0.17g Reb D，含有UGT-A的重组细胞10g，混合均匀后置于30℃水浴，160rpm搅拌反应2h。反应结束后，取500μl反应液加入等体积无水甲醇混匀，8,000rpm离心10min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilent eclipse sb-C184.6X250mm；检测波长：210nm；流动相：1%甲酸水溶液﹕甲醇=20%﹕80%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃）。Reb D的转化率为40%以上。经离心，上清过硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到Reb M0.052g，纯度大于95%。
实施例10：以Reb A为底物全细胞催化合成Reb M
在反应体系中依次加入150mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0），0.51gUDP葡萄糖，3mL甲苯，0.145g Reb A，同时含有UGT-A和UGT-B的全细胞各10g，混合均匀后置于30℃水浴，160rpm搅拌反应2h。反应结束后，取500μl反应液加入等体积无水甲醇混匀，8,000rpm离心10min取上清液过滤膜后用高效液相色谱检测（色谱条件：色谱柱：Agilent eclipsesb-C184.6X250mm；检测波长：210nm；流动相：1%甲酸水溶液﹕甲醇=20%﹕80%；流速：1.0mL/min；柱温：25℃）。Reb A的转化率为40%以上。经离心，上清过硅胶树脂分离、结晶等后处理纯化后得到Reb M0.05g，纯度大于95%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，其特征在于：该方法以瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，使所述底物在葡萄糖基供体存在下，在UDP-葡萄糖基转移酶和/或含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞的催化下反应生成瑞鲍迪甙M。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖基供体为UDP-葡萄糖或由蔗糖、蔗糖合成酶和UDP组成的UDP-葡萄糖再生体系。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和/或来自水稻的UGT-B。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少90%的一致性。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少90%的一致性。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使所述反应在温度25℃~35℃以及pH 6.5~7.5的水相体系中进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：使反应在pH 7.0的磷酸缓冲液中进行。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：采用含有UDP-葡萄糖基转移酶的重组细胞来进行所述催化，所述反应的体系中还含有体积比浓度为1%~3%的甲苯。
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法实施如下：将反应所用的全部原料加入到反应釜中，混合均匀后，置于设定温度下，搅拌反应。
12. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的重组细胞为微生物细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述的微生物为大肠埃希氏杆菌、酿酒酵母或毕赤酵母。
14.根据权利要求1至13中任一项权利要求所述的方法，其特征在于：所述的底物为瑞鲍迪甙A，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的混合物，所述来自甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性；所述来自水稻的UGT-B的氨基酸序列与序列4具有至少80%的一致性。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述混合物中，来自甜菊的UGT-A和来自水稻的UGT-B的重量比为1:0.8~1.2。
16.根据权利要求1至13中任一项权利要求所述的方法，其特征在于：所述的底物为瑞鲍迪甙D，所述的UDP-葡萄糖基转移酶为来自甜菊的UGT-A，所述甜菊的UGT-A的氨基酸序列与序列2具有至少80%的一致性。
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