CN108998485A - 一种甜菊糖苷复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甜菊糖苷复合物及其制备方法，属于生化工程技术领域，该方法是以甜菊糖苷中含量最高的莱鲍迪苷A(Reb A)为起始原料，在一定工艺条件下，利用葡萄糖基转移酶一锅法得到含有莱鲍迪苷D(Reb D)和莱鲍迪苷M(Reb M)这两种口感优异的甜菊糖苷复合物。该方法工艺周期短，产率高，选择性可控，不容易受杂菌污染等优点。本发明提供了一种高效简便新思路以得到高经济附加值的代糖甜味剂。本发明的一锅法的制备方法使该甜菊糖苷复合物的工业生产的获得难度降低，同时降低了成本，产品能够有效满足市场需求。

Description

一种甜菊糖苷复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生化工程技术领域，具体地说是一种甜菊糖苷复合物及其制备方法。

背景技术

甜菊糖苷是从南美菊科植物甜叶菊的叶子中提取的一种萜类化合物。国标GB8270-2014列出甜菊糖苷包括九种糖苷，即甜菊苷(Stv)，莱鲍迪苷A，莱鲍迪苷B，莱鲍迪苷C，莱鲍迪苷D，莱鲍迪苷F，杜克苷A和甜茶苷。当中以Reb A含量最高，占到整个糖苷的50％以上。Reb A的甜度为蔗糖的200倍以上，而热量几乎为零，对于糖尿病人、肥胖人群和爱美人士，是一种非常理想的代糖天然甜味剂，已经被广泛认可和使用。同时甜菊糖苷还有辅助治疗“三高”，抑菌，免疫调节等活性。

尽管甜菊糖苷优点众多，但甜菊糖苷在使用过程中，存在一个非常严重的缺点——口感比蔗糖差，有后苦涩味，这显然不利于甜菊糖苷功能产品的开发。根据文献报道，在甜叶菊中还含有很多稀有甜菊糖苷，如Reb D和Reb M，其口感明显优于Reb A，市场前景看好。2017年第84届JECFA会议上已经提出了新的甜菊糖苷检测标准，将Reb D和Reb M增补为必须检测的甜菊糖苷。但由于稀有甜菊糖苷含量低，工业化提取难度大，成本高，也无法满足市场需求。由分子结构可知，Reb D比Reb A多一个葡萄糖基(1→2)，而Reb M比Reb D也多一个葡萄糖基(1→3)。由于在Reb A存在多个可供取代的糖基位点，这就需要通过生化手段选择性将Reb A转化为Reb D和Reb M。

发明内容

本发明的技术任务是解决现有技术的不足，提供一种甜菊糖苷复合物及其制备方法。

本发明的技术方案是按以下方式实现的，本发明的一种甜菊糖苷复合物及其制备方法是以甜菊糖苷中含量最高的莱鲍迪苷A(Reb A)为起始原料，在一定工艺条件下，利用葡萄糖基转移酶一锅法得到含有莱鲍迪苷D(Reb D)和莱鲍迪苷M(Reb M)这两种口感优异的甜菊糖苷复合物。

具体反应方程式如下：

本发明的一种甜菊糖苷复合物，该复合物的组分包含有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。

该复合物中组分的质量百分比的配比为：10％～30％的莱鲍迪苷A、30％～70％的莱鲍迪苷D和10％～40％的莱鲍迪苷M。

该复合物中莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M三种糖苷的总质量含量大于等于99％，其余杂质含量小于等于1％。

杂质为甜菊苷、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、杜克苷A、甜茶苷A和甜菊双糖苷中的一种以上的组分。

本发明的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，该方法是以莱鲍迪苷A为起始原料，在具有葡萄糖基供体的环境下，利用葡萄糖基转移酶一锅法得到含有莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的甜菊糖苷复合物。

一锅法是：葡萄糖基供体、莱鲍迪苷A的混合溶液以及葡萄糖基转移酶酶液，在pH为2.5～6.5，酶活控制在10～50U/mL，控制温度55～95℃，转速为300±100rpm的工艺条件下，反应1～3天，利用葡萄糖基转移酶将葡萄糖基供体的葡萄糖基选择性的转移到莱鲍迪苷A的可供取代的糖基位点上，获得莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。

葡萄糖基供体和Reb A初始浓度均为50～200g/L。

一锅法反应1～3天后，向反应液中加入乙醇终止反应，并过滤去除酶蛋白，之后通过大孔吸附树脂去除杂质，然后喷雾干燥，得到的粗提物，粗提物在甲醇中重结晶一次，最后在95％乙醇中重结晶二次，即可得含有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的复合物。

葡萄糖基转移酶来源于硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus sulfataricus。

葡萄糖基转移酶为表达在基因工程菌的改造酶制剂。

基因工程菌采用大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌和丝状真菌中一种以上的基因工程菌。

葡萄糖基转移酶来源于硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussulfataricus)，表达在大肠杆菌，酵母菌，枯草杆菌和丝状真菌的基因工程菌的改造酶制剂。具体操作是：含有糖基转移酶工程菌溶液细胞破壁后即为粗酶液，控制pH为2.5～6.5，酶活控制在10～50U/mL，温度55～95℃，转速为300rpm，葡萄糖基供体和Reb A初始浓度均为50～200g/L，反应时间1～3天后，加入乙醇终止反应，并过滤去除酶蛋白，大孔吸附树脂去除杂质，然后喷雾干燥，得到的粗提物在甲醇中重结晶一次，然后在95％乙醇中重结晶二次，即可得含有Red D和Reb M的复合物。复合物的组成为10％～30％Reb A，30％～70％Reb D，10％～40％Reb M，并且三种糖苷总含量大于99％。杂质甜菊苷、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、杜克苷A、甜茶苷A和甜菊双糖苷的总含量小于等于1％。

本发明与现有技术相比所产生的有益效果是：

本发明的一种甜菊糖苷复合物及其制备方法的工艺周期短，产率高，选择性可控，不容易受杂菌污染等优点。本发明提供了一种高效简便新思路以得到高经济附加值的代糖甜味剂，通过该方法得到的甜菊糖苷复合物口感优异，大大减小了后苦涩味。

本发明的一锅法的制备方法使该甜菊糖苷复合物的工业生产的获得难度降低，同时降低了成本，产品能够有效满足市场需求。

本发明的一种甜菊糖苷复合物及其制备方法工艺操作简单、安全可靠、易于扩大生产，具有很好的推广使用价值。

附图说明

附图1是本发明的复合物制备过程中Reb D和Reb M的选择性离子流图；

附图2是本发明的Reb D和Reb M对应的质谱图；

附图3是本发明的反应液中组分变化曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的一种甜菊糖苷复合物及其制备方法作以下详细说明。

本发明的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，是以甜菊糖苷中含量最高的Reb A为起始原料，在一定工艺条件下，利用葡萄糖基转移酶一锅法得到含有Reb D和Reb M这两种口感优异的甜菊糖苷复合物。

实施例：

本发明的一种甜菊糖苷复合物的制备方法的步骤是：

步骤1：

利用基因工程手段，构建含有来源于硫磺矿硫化叶菌Sulfolobussulfataricus的葡萄糖基转移酶的4种基因工程菌，即大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌和丝状真菌，分别超声破壁之后，测定酶活。

粗酶液酶活测定结果分别为165，143，160，123U/mL。

步骤2：

利用步骤1中4种粗酶液分别在pH为5.0，酶活控制在10U/mL，温度55～95℃，转速为300rpm，葡萄糖基供体和Reb A初始浓度均为50g/L，反应3天后，均能检测到Reb D和RebM生成，且Reb A转化率均为48％。其中以大肠杆菌粗酶液催化的反应为例，LC-MS结果见图1和图2，反应过程见图3。

步骤3：

在35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95℃下进行温度筛选，以Reb A的转化率为指标，固定其他反应条件，55～95℃为反应温度，最佳的温度应控制在85℃左右。

步骤4：

通过固定温度，反应液浓度，粗酶液酶活等反应条件，只变化控制pH，发现为2.5～6.5为最佳的反应pH。

步骤5：

筛选最佳的酶活，分别考察5，10，20，30，40，50，60，70，80，100和200U/mL加酶量，确定最佳的加酶量范围为10～50U/mL，过量的酶加入，转化率没有明显区别。

步骤6：

分别考察5～500g/L的底物浓度，以Reb A的转化率为指标，确定最佳的底物浓度为50～200g/L。

步骤7：

选取大肠杆菌粗酶液催化合成甜菊糖苷复合物，控制pH为4.5，酶活控制在50U/mL，温度85℃，转速为300rpm，葡萄糖基供体和Reb A初始浓度均为200g/L。反应时间3天，加入乙醇终止反应，并过滤去除酶蛋白。大孔吸附树脂去除杂质，然后喷雾干燥，得到的粗提物在甲醇中重结晶一次，然后在95％乙醇中重结晶二次，即可得含有Red D和Reb M的复合物。复合物的组成为10％Reb A，50％Reb D，40％Reb M，并且三种糖苷总含量为99.5％。杂质总含量为0.5％。所得该甜菊糖苷复合物的口感明显优于Reb A，具有相当的甜度，可取代现有的代糖天然甜味剂。同时具备甜菊糖苷辅助治疗“三高”，抑菌，免疫调节等的特性。

Claims (10)

1.一种甜菊糖苷复合物，其特征在于该复合物的组分包含有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。

2.根据权利要求1所述的一种甜菊糖苷复合物，其特征在于：该复合物中组分的质量百分比的配比为：10％～30％的莱鲍迪苷A、30％～70％的莱鲍迪苷D和10％～40％的莱鲍迪苷M。

3.根据权利要求1或2所述的一种甜菊糖苷复合物，其特征在于：该复合物中莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷M三种糖苷的总质量含量大于等于99％，其余杂质含量小于等于1％。

4.根据权利要求3所述的一种甜菊糖苷复合物，其特征在于：杂质为甜菊苷、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C、杜克苷A、甜茶苷A和甜菊双糖苷中的一种以上的组分。

5.一种甜菊糖苷复合物的制备方法，其特征在于：该方法是以莱鲍迪苷A为起始原料，在具有葡萄糖基供体的环境下，利用葡萄糖基转移酶一锅法得到含有莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的甜菊糖苷复合物。

6.根据权利要求5所述的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，其特征在于：

一锅法是：葡萄糖基供体、莱鲍迪苷A的混合溶液以及葡萄糖基转移酶酶液，在pH为2.5～6.5，酶活控制在10～50U/mL，控制温度55～95℃，转速为300±100rpm的工艺条件下，反应1～3天，利用葡萄糖基转移酶将葡萄糖基供体的葡萄糖基选择性的转移到莱鲍迪苷A的可供取代的糖基位点上，获得莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M。

7.根据权利要求6所述的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，其特征在于：

一锅法反应1～3天后，向反应液中加入乙醇终止反应，并过滤去除酶蛋白，之后通过大孔吸附树脂去除杂质，然后喷雾干燥，得到的粗提物，粗提物在甲醇中重结晶一次，最后在95％乙醇中重结晶二次，即可得含有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D和莱鲍迪苷M的复合物。

8.根据权利要求5～7任一项所述的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，其特征在于：葡萄糖基转移酶来源于硫磺矿硫化叶菌Sulfolobus sulfataricus。

9.根据权利要求5～7任一项所述的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，其特征在于：葡萄糖基转移酶为表达在基因工程菌的改造酶制剂。

10.根据权利要求9所述的一种甜菊糖苷复合物的制备方法，其特征在于：基因工程菌采用大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌和丝状真菌中一种以上的基因工程菌。