KR20220034793A - 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제 효소 - Google Patents

우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제 효소 Download PDF

Info

Publication number
KR20220034793A
KR20220034793A KR1020227002106A KR20227002106A KR20220034793A KR 20220034793 A KR20220034793 A KR 20220034793A KR 1020227002106 A KR1020227002106 A KR 1020227002106A KR 20227002106 A KR20227002106 A KR 20227002106A KR 20220034793 A KR20220034793 A KR 20220034793A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
enzyme
amino acid
acid sequence
leu
Prior art date
Application number
KR1020227002106A
Other languages
English (en)
Inventor
제이슨 에릭 도날드
아지쿠마르 파라일 쿠마란
애런 러브
크리스토퍼 토미
크리스틴 니콜 에스. 산토스
Original Assignee
마누스 바이오, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 마누스 바이오, 인크. filed Critical 마누스 바이오, 인크.
Publication of KR20220034793A publication Critical patent/KR20220034793A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01262—Soyasapogenol glucuronosyltransferase (2.4.1.262)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01017—Glucuronosyltransferase (2.4.1.17)

Abstract

다양한 양태에서, 본 발명은 NDP-당에서 기질, 예컨대, 테르페노이드 글리칸의 당 모이어티의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 전달을 촉매하여, 이에 의해 "1-3 UGT"로 기능할 수 있는 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT) 효소를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 1-3 UGT를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 효소 및 숙주 세포를 사용하여 스테비올 배당체를 포함하는 글라이코실화된 기질을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제 효소
관련 출원
본 출원은 2019년 6월 25일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/866,148호의 이익을 주장하며, 이의 전체 개시내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
기술분야
본 개시내용은 효소, 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포, 및 글라이코실화된 기질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명
본 명세서와 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다: 컴퓨터로 판독 가능한 형식의 서열 목록 사본(파일명: MAN-024PC_Sequence Listing_ST25.txt; 기록일: 2020년 6월 24일; 파일 크기: 28,457 바이트).
고강도 감미료는 수크로스의 단맛 수준보다 몇 배 더 높은 감미료 수준을 가진다. 이러한 고강도 감미료는 본질적으로 칼로리가 없으며, 식품 및 음료를 포함하여 다이어트 및 칼로리 저감 제품에 일반적으로 사용된다. 고강도 감미료는 혈당 반응을 유발하지 않으므로, 당뇨병 환자 및 탄수화물 섭취 조절에 관심이 있는 사람들을 대상으로 하는 제품에 사용하기에 적합하다.
스테비올 배당체는 남아메리카의 특정 지역에 자생하는 국화과(아스테라케아이(Asteraceae)); (콤포시타이(Compositae))의 다년생 관목인 르토니(Stevia rebaudiana Bertoni)의 잎에서 발견되는 화합물의 부류이다. 이는 C13 및 C19 위치에서 탄수화물 잔기의 존재에 따라 상이한, 단일 염기인 스테비올에 의해 구조적으로 특징지어진다. 이는 스테비아 잎에 축적되어, 총 건조 중량의 대략 10% 내지 20%를 구성한다. 건조 중량 기준으로, 스테비아의 잎에서 발견되는 4가지 주요 배당체는 전형적으로 스테비오사이드(9.1%), 레바우디오사이드 A(3.8%), 레바우디오사이드 C(0.6 내지 1.0%) 및 둘코사이드 A(0.3%)를 포함한다. 다른 알려진 스테비올 배당체는 레바우디오사이드 B, C, D, E, F 및 M, 스테비올바이오사이드 및 루부소사이드를 포함한다.
소수의 글라이코실화 생성물인 레바우디오사이드 M(RebM)은 수크로스보다 약 200 내지 350배 더 강력한 것으로 추정되며, 약간 쓰거나 감초의 뒷맛이 있는 깔끔하고 달콤한 맛을 가지는 것으로 설명된다(Prakash I. et al., Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M, Foods 3(1), 162-175 (2014)). RebM에는 세계적인 식품 산업에 대한 많은 흥미가 있다.
스테비아 식물로부터 스테비올 배당체를 제조하는 공정은 지속 가능하지 않으며, 스테비아 잎의 소수의 글라이코실화 생성물을 제공하는 데 적합하지 않다. 따라서, 고도로 정제된 스테비올 배당체 조성물을 포함하여 스테비올 배당체를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 지속 가능하고 경제적인 방법에 대한 필요성이 남아 있다. 또한, 소수의 글라이코실화 생성물, 예컨대, RebM 등을 상당량 생산하기 위한 방법이 필요하다.
다양한 양태에서, 본 발명은 NDP-당(예를 들어, 우리딘 다이포스페이트(UDP)-당)에서 기질, 예컨대, 테르페노이드 글리칸의 당 모이어티의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 전달을 촉매하여, 이에 의해 "1-3 UGT"로 기능할 수 있는 우리딘 다이포스페이트(UDP)-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT) 효소를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 1-3 UGT를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 효소 및 숙주 세포를 사용하여 스테비올 배당체를 포함하는 글라이코실화된 기질을 제조하는 방법을 제공한다.
1-3 UGT는 테르페노이드 배당체, 예컨대, 스테비올 배당체에 대해 높은 글라이코실트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 예를 들어, 1-3 UGT는 NDP-당에서 테르페노이드 글리칸, 예컨대, 스테비오사이드 및 RebD의 당 모이어티의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 전달을 촉매한다. 즉, 기질이 스테비올 배당체인 경우, 1-3 UGT는 C13- 또는 C19-연결 글루코스 모이어티 둘 모두의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 NDP-의존성 전달을 촉매한다. 다양한 실시형태에서, 1-3 UGT는 RebM의 생합성을 촉매한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1-3 UGT 효소를 제공한다. 일부 실시형태에서, 효소는 서열번호 1(스테비아 레바우디아나 UGT76G1)의 29, 200, 357, 및 414번 위치에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 서열번호 5 및 6의 효소에 포함되는 이들 위치(정중하게, 서열번호 5에서 183, 354, 54, 및 111번 위치)에서의 치환은 서열번호 1의 효소에 비해 활성의 극적인 개선을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 155번 위치에 해당하는 위치 다음에 (서열번호 1에 대해) 5 내지 약 15개의 아미노산, 또는 약 6 내지 약 12개의 아미노산 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입은 가요성 및 친수성 서열이며, 이는 주로 글리신 및 세린 잔기일 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열은 GSGGSG(서열번호 7) 또는 GSGGSGGSG(서열번호 8)이다.
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 UGT76G1-L200A(서열번호 3)와 비교하여, 스테비오사이드의 RebA로의 개선된 전환, 및 RebD의 RebM으로의 개선된 전환을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 서열번호 5의 183, 354, 54, 및 111번 위치에 해당하는 위치에서 아미노산의 동일성은 다른 위치에서의 추가 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 UGT 효소는, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G) 또는 트레오닌(T); 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 또는 아이소류신(I); 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 또는 류신(L); 및 서열번호 5의 354번 위치에 해당하는 위치에서 알라닌(A), 또는 글리신(G), 또는 세린(S)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M), 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G), 및 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 중 2개 또는 3개를 가진다. 이들 변형은 서열번호 1의 해당하는 위치에서의 아미노산 동일성에 비해, 효소의 활성에 상당한 개선을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는, 서열번호 5의 아미노산 서열을 참조하여 159 내지 161번 아미노산 잔기의 결실, 262번 위치에서의 치환(예를 들어, L262Q), 294번 위치에서의 치환(예를 들어, R294), 및 413번 위치에서의 치환(예를 들어, D413E) 중 하나 이상을 포함하며, 각각의 경우는 서열번호 5의 아미노산 서열을 참조한다.
실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 159 내지 161번 아미노산 잔기의 결실뿐만 아니라, 아미노산 치환 L262Q, R294P 및 D413E를 포함하며, 각각은 서열번호 5의 아미노산 서열을 참조한다. 이들 실시형태에 따른 예시적인 UGT 효소는 본 명세서에 서열번호 6으로 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열을 참조하여, 잔기 E225 내지 T232 중 하나 이상의 잔기의 결실을 포함한다. 이들 또는 다른 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 72번 위치(예를 들어, S72Q), 305번 위치(예를 들어, A305C), 345번 위치(예를 들어, Y345F), 및 428번 위치(예를 들어, L428I)로부터 선택되는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하며, 각각의 경우는 서열번호 6의 아미노산 서열을 참조한다. 예시적인 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 아미노산 잔기 E225 내지 T232의 결실뿐만 아니라, 아미노산 치환 S72Q, A305C, Y345F, 및 L428I를 포함하며, 각각의 경우는 서열번호 6의 아미노산 서열을 참조한다. 이들 실시형태에 따른 예시적인 UGT 효소는 본 명세서에 서열번호 9로 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 아미노산 변형은 대안적으로 SrUGT76G1, 또는 이의 원형 치환체(circular permutant)에 적용된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 1-3 UGT 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라, 이를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 미생물, 진균 세포, 조류 세포, 또는 식물 세포일 수 있다. 식물은 스테비아 식물, 또는 보다 특히 스테비아 레바우디아나 식물일 수 있다. 스테비아 식물은 스테비올 및 스테비올 배당체를 합성하는 데 필요한 효소를 자연적으로 발현하지만, 이들 식물은 고도로 글라이코실화된 스테비올 배당체, 예컨대, RebM을 극소량만 생산한다. 대조적으로, 1-3 UGT를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 스테비아 또는 스테비아 레바우디아나 식물의 RebM 함량은 비교적 높은 수준의 RebA, RebD, 및/또는 RebM; 또는 1-3 글라이코실화를 포함하는 다른 전형적으로 소수인 스테비올 배당체, 예컨대, RebB, RebG, RebI, 및 Reb4를 생산할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 미생물 세포, 예컨대, 대장균(이. 콜라이(E. coli))이다.
다양한 실시형태에서, 숙주 세포는 C-13 UGT 효소, C-19 UGT 효소, 및 1-2 UGT 효소로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 UGT 효소를 발현할 수 있다. "C-13 UGT" 또는 UGTc13은 이의 C13 하이드록실 기에서 스테비올 또는 스테비올 배당체를 글라이코실화할 수 있는 글라이코실트랜스퍼라제이다. "C-19 UGT" 또는 UGTc19는 이의 C19 카복실 기에서 스테비올 또는 스테비올 배당체를 글라이코실화할 수 있는 글라이코실트랜스퍼라제이다. "1-2 UGT" 또는 UGT1-2는 13-O-글루코스, 및/또는 19-O-글루코스의 C2'의 β1,2 글라이코실화가 가능한 글라이코실트랜스퍼라제이다. "1-3 UGT" 또는 UGT1-3은 13-O-글루코스, 및/또는 19-O-글루코스의 C3'의 β1,3 글라이코실화가 가능한 글라이코실트랜스퍼라제이다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 (1-3 UGT 효소에 추가적으로) 이종성 C-13 UGT 효소, 이종성 C-19 UGT 효소, 및 이종성 1-2 UGT 효소를 발현하고, 따라서 스테비올 및 스테비올 배당체 기질을 글라이코실화하여 RebM을 생산할 수 있다.
일부 실시형태에서, 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 또는 효모 세포)는 스테비올의 생합성을 위한 내인성 및/또는 이종성 효소의 발현에 의해 스테비올 기질을 생산한다. 이들 실시형태에서, 세포는 탄소원, 예컨대, 특히 글루코스, 수크로스, 또는 글리세롤로부터 스테비올 배당체, 예컨대, RebM을 생산한다.
일부 양태에서, 본 발명은 단당류 기를 기질로 전달하는 방법을 제공한다. 방법은 NDP-당(예를 들어, UDP-단당류) 및 기질을 본 명세서에 기재된 1-3 UGT 효소, 또는 1-3 UGT 효소를 발현하는 숙주 세포 또는 이의 용해물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 테르페노이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다양한 기질이 본 개시내용에 따라 글라이코실화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 테르페노이드 기질이고, 다이테르페노이드, 예컨대, 스테비올 및/또는 스테비올 배당체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 스테비오사이드 및/또는 RebD를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 다이포스페이트는 UDP 또는 ADP, 또는 글라이코실 공여체 분자로서 작용할 수 있는 다른 NDP이다. 다양한 실시형태에서, 단당류는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 람노스, 또는 자일로스이다. 일부 실시형태에서, 단당류는 글루코스이다. NDP-당은 시험관 내 반응을 위해 외인성으로 공급될 수 있거나, 미생물 발효 또는 생체 내변환 반응을 이용하는 실시형태의 경우 숙주 세포에 의해 내인성으로 생산된다. 이용 가능한 UDP-글루코스를 증가시켜 반응을 지원하기 위해 숙주 세포에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, 기질은 식물 추출물을 포함하며, 식물 추출물은 선택적으로 스테비아 잎 추출물이다. 다양한 실시형태에서, 1-3 UGT를 발현하는 미생물 세포는 RebD 및 RebM을 포함하는 고급 스테비올 배당체의 생산을 위해 스테비올 또는 저급 스테비올 배당체를 공급받을 수 있다. 스테비아 잎 추출물로부터의 고급 중간체는 스테비올 배당체의 기존 산업 추출로부터 용이하게 입수 가능하다.
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT는 저급 스테비올 배당체를 고급 스테비올 배당체로 전환시킨다. 예를 들어, UGT 효소는 스테비오바이오사이드를 RebB로, 루부소사이드를 RebG로, 스테비오사이드를 RebA로, RebA를 RebI로, RebG를 Reb4로, RebE를 RebD로, 및/또는 RebD를 RebM으로 전환시키기 위한 1-3' UGT 활성을 가질 수 있다. 대안적으로, UGT는 특정 기질에 대한 특이성을 선호하는 또 다른 1-3 UGT 효소 또는 효소들과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 UGT는 C13 글라이코실 기질에서 1-3 UGT로서 우선적으로 작용할 수 있는 반면, 또 다른 UGT 효소는 C19 글라이코실 기질에서 1-3 UGT로서 우선적으로 작용한다.
일부 실시형태에서, 방법은 기질의 존재 하에 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 기질은 배양물에 공급될 수 있거나, 일부 실시형태에서, 기질은 숙주 세포에 의해 합성된다. 일부 실시형태에서, 기질은 스테비올을 포함하거나 주요 구성요소로서 스테비오사이드 및 RebA의 혼합물을 포함하고, 숙주 세포는 복수의 UGT 효소를 발현하여 목표 스테비올 배당체, 예컨대, RebM을 생산한다.
도 1은 스테비올 배당체 패밀리의 소수 구성요소인 레바우디오사이드 M(RebM)의 화학 구조를 나타내는 도면. RebM은 6개의 글루코실 변형이 있는 다이테르페노이드 스테비올(상자)의 유도체이다.
도 2는 스테비올에서 RebM 및 다른 스테비올 배당체로의 글라이코실 경로를 나타내는 도면. UGTc13은 이의 C13 하이드록실 기에서 스테비올 또는 스테비올 배당체를 글라이코실화할 수 있는 글라이코실트랜스퍼라제이다. UGTc19는 이의 C19 카복실 기에서 스테비올 또는 스테비올 배당체를 글라이코실화할 수 있는 글라이코실트랜스퍼라제이다. UGT1-2는 13-O-글루코스, 및/또는 19-O-글루코스의 C2'의 β1,2 글라이코실화가 가능한 글라이코실트랜스퍼라제이다. UGT1-3은 13-O-글루코스, 및/또는 19-O-글루코스의 C3'의 β1,3 글라이코실화가 가능한 글라이코실트랜스퍼라제이다.
도 3은 SrUGT76G1(서열번호 1) 및 SrUGT76G1의 원형으로 치환된 형태인 MbUGT1-3_2(서열번호 6)의 아미노산 서열 정렬을 나타내는 도면. 패널 A는 MbUGT1-3_2의 C-말단 부분에 대해 정렬된 SrUGT76G1의 N-말단 부분을 나타낸다. 패널 B는 MbUGT1-3_2의 N-말단 부분에 대해 정렬된 SrUGT76G1의 C-말단 부분을 나타낸다.
도 4는 UGT76G1-L200A(서열번호 3), MbUGT1-3_0(서열번호 4), MbUGT1-3_1(서열번호 5), 및 MbUGT1-3_2(서열번호 6)의 글라이코실트랜스퍼라제에 의한 시험관 내 스테비오사이드의 RebA로의 전환율, 및 RebD의 RebM으로의 전환율을 나타내는 도면.
도 5는 UGT76G1-L200A와 비교하여, 스테비오사이드의 RebA로의 전환 및 RebD의 RebM으로의 전환에 대한 개선 배수를 나타내는 도면. MbUGT1-3_1 및 MbUGT1-3_2는 두 가지 전환 모두에 대해 효소 생산성에서 매우 극명한 개선을 나타낸다.
다양한 양태에서, 본 발명은 NDP-당(예를 들어, 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT)-글루코스)에서 기질, 예컨대, 테르페노이드 글리칸의 당 모이어티의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 전달을 촉매하여, 이에 의해 "1-3 UGT"로 기능할 수 있는 UGT 효소를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 1-3 UGT를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 개시내용의 효소 및 숙주 세포를 사용하여 스테비올 배당체를 포함하는 글라이코실화된 기질을 제조하는 방법을 제공한다.
1-3 UGT 효소는 테르페노이드 배당체, 예컨대, 스테비올 배당체에 대해 높은 글라이코실트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 예를 들어, 1-3 UGT 효소는 NDP-당에서 테르페노이드 글리칸, 예컨대, 스테비오사이드 및 RebD의 당 모이어티의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 전달을 촉매한다. 즉, 기질이 스테비올 배당체인 경우, 1-3 UGT는 C13- 또는 C19-연결 당(예를 들어, 글루코스) 모이어티 둘 모두의 3' 탄소로 단당류 모이어티의 NDP-의존성 전달을 촉매할 수 있다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 C13-연결 당과 비교하여, C19-연결 당에서 글라이코실화에 대한 더 높은 속도 또는 생산성을 가진다. 일부 실시형태에서, 단당류는 글루코스이지만, 다른 실시형태에서, 단당류는 갈락토스, 프럭토스, 람노스, 자일로스, 또는 다른 단당류일 수 있다.
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT는 RebM의 생합성을 촉매한다. RebM의 구조는 도 1에 나타내어져 있다. RebM은 다음과 같은 6개의 글라이코실화가 있는 스테비올 스캐폴드를 포함한다: (1) C13 O-글라이코실화, (2) C13 1-2 글라이코실화, (3) C13 1-3 글라이코실화, (4) C19 O-글라이코실화, (5) C19 1-2 글라이코실화, 및 (6) C19 1-3 글라이코실화. 도 2에 나타낸 바와 같이, 1-3 UGT는 추가적인 글루코스의 RebD 기질로의 전달을 통해 RebM을 생산할 수 있다. 또한, 1-3 UGT 효소는 단당류의 다른 스테비올 배당체 기질로의 전달을 촉매하여, RebB(스테비올바이오사이드로부터), RebG(루부소사이드로부터), Reb4(RebG로부터), RebA(스테비오사이드로부터), RebD(RebE로부터), 및 RebI(RebA로부터)와 같은 생성물을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 식물 추출물, 예컨대, 스테비아 잎 추출물을 포함하고, (다른 글라이코실트랜스퍼라제 효소의 작용과 함께) 1-3 UGT는 다양한 주요 또는 소수 글라이코실화 생성물을 글라이코실화하여 주로 RebM인 생성물을 생산할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1-3 UGT 효소를 제공한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT는 서열번호 5 또는 6과 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 6과 적어도 약 85% 동일하거나, 서열번호 5 또는 6과 적어도 약 90% 동일하거나, 서열번호 5 또는 6과 적어도 약 95% 동일하거나, 서열번호 5 또는 6과 적어도 약 98% 동일하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 6의 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 약 75% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT는 서열번호 9와 적어도 약 80% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 9와 적어도 약 85% 동일하거나, 서열번호 9와 적어도 약 90% 동일하거나, 서열번호 9와 적어도 약 95% 동일하거나, 서열번호 9와 적어도 약 98% 동일하다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산을 포함한다.
예를 들어, 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 6의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 10개의 아미노산 변형(예를 들어, 1 내지 5개)을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, UGT 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개의 아미노산 변형을 가진다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 10개의 아미노산 변형(예를 들어, 1 내지 5개)을 가진다. 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열에 대한 아미노산 변형은 이용 가능한 효소 구조 및 상동성 모델의 작제에 의해 안내될 수 있다. 예시적인 구조는, 예를 들어 문헌[Li, et al., "Crystal Structure of Medicago truncatula UGT85H2-insights into the Structural Basis of a Multifunctional (iso) Flavonoid Glycosyltransferase," J. of Mol . Biol . 370.5 (2007): 951-963; 및 Lee et al., "Molecular Basis for Branched Steviol Glucoside Biosynthesis," PNAS 116:13131-13136 (2019)]에 기재되어 있다. 공개적으로 이용 가능한 결정 구조(예를 들어, PDB 등재: 2PQ6)가 아미노산 변형에 대한 정보를 알아내는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 활성 부위에 또는 활성 부위의 부근에 하나 이상의 아미노산 변형이 이루어져 기질의 결합을 개선시키고/시키거나 이들 기질과 촉매 측쇄의 반응 기하학적 구조를 개선시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 효소는 서열번호 1(스테비아 레바우디아나 UGT76G1)의 29, 200, 357, 및 414번 위치에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 서열번호 5, 6, 및 9의 효소에 포함되는 이들 위치(정중하게, 서열번호 5에서 183, 354, 54, 및 111번 위치)에서의 치환은 활성의 극적인 개선을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 183, 354, 54, 및 111번 위치에 해당하는 위치에서 아미노산의 동일성은 다른 위치에서의 추가 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 UGT 효소는, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G) 또는 트레오닌(T); 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 또는 아이소류신(I); 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 또는 류신(L); 및 서열번호 5의 354번 위치에 해당하는 위치에서 알라닌(A), 또는 글리신(G), 또는 세린(S)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M), 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G), 및 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 중 2개 또는 3개를 가진다. 이들 변형은 효소의 활성에 상당한 개선을 제공할 수 있다.
1-3 UGT 효소는 서열번호 1의 해당하는 위치(357)에 있는 세린 이외에, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 다른 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서의 치환은 소수성 아미노산, 예컨대, 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 아이소류신(I), 페닐알라닌(F), 또는 메티오닌(M)이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서의 아미노산은 수소 결합을 제공하는 능력을 가지지 않는 측쇄를 가진다. 다른 실시형태에서, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서의 아미노산은 글리신(G), 아스파라긴(N), 시스테인(C), 글루타민(Q), 트레오닌(T) 또는 타이로신(Y)이다.
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 이 위치에서 류신 이외의 아미노산을 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치는, 서열번호 1의 해당하는 위치에서의 아미노산인 발린이 아닐 것이다. 111번 위치에 해당하는 위치에서 다른 적합한 치환은 글리신(G), 알라닌 (A), 아이소류신(I) 또는 메티오닌(M)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서의 아미노산은 발린보다 덜 소수성이고/이거나 부피가 더 작은 측쇄를 가진다.
다양한 실시형태에서, UGT는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 아미노산을 포함한다. 다양한 실시형태에서, UGT는 서열번호 1의 해당하는 위치에 있는 아이소류신 이외에 이 위치에 적합한 또 다른 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 이 위치에서의 아미노산은 아이소류신보다 덜 소수성인 측쇄를 가질 수 있고/있거나 수소 결합을 제공할 수 있다. 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 일부 예시적인 치환은 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 시스테인(C), 세린(S), 트레오닌(T), 타이로신(Y), 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 아스파르트산(D), 및 글루탐산(E)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT는 서열번호 5의 354번 위치에 해당하는 위치에서 알라닌(A) 또는 글리신(G)을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 이 위치에서의 아미노산은 서열번호 1의 해당하는 위치에 있는 류신보다 덜 소수성이고/이거나 부피가 더 작은 측쇄를 가진다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 155번 위치에 해당하는 위치 다음에 (서열번호 1인 UGT76G1에 대해) 5 내지 약 15개의 아미노산, 예컨대, 6 내지 12개의 아미노산, 또는 약 6 또는 약 11개의 아미노산 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입은 가요성 및 친수성 서열이며, 이는 주로 글리신 및 세린 잔기이다. 일부 실시형태에서, 서열은 GSGGSG(서열번호 7) 또는 GSGGSGGSG(서열번호 8)이다.
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 UGT76G1-L200A(서열번호 3)와 비교하여, 스테비오사이드의 RebA로의 개선된 전환, 및 RebD의 RebM으로의 개선된 전환을 나타낸다. 이러한 개선된 전환은 스테비오사이드 또는 RebD 기질이 본 개시내용의 1-3 UGT 효소를 발현하는 미생물 세포에 공급되는 생물전환 분석에서 나타난다. 개선된 전환은 재조합으로 발현된 1-3 UGT를 포함하는 세포 용해물과의 반응에서 또는 정제되거나 부분적으로 정제된 1-3 UGT와의 시험관 내 반응에서 입증될 수 있다. 이와 같은 반응은 당업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로, 전체 세포 분석이 사용될 수 있다. 예를 들어, 1-3 UGT 효소를 발현하는 대장균 균주(ΔushA, ΔgalETKM, Δpgi; 과발현된 pgm, galU)를 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 밤새 성장시킨다. 그 다음 세포를 총 부피의 10%가 되도록 신선한 생산 배양물로 옮긴다. 0.5mM 기질(예를 들어, 스테비오사이드 또는 레바우디오사이드 D)을 생산 배양물에 포함시킨다. 그 다음 생산 배양물을 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 48시간 동안 성장시킨다. 생성물은 LC-MS QQQ를 사용하여 정량화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열번호 5의 183, 354, 54, 및 111번 위치에 해당하는 위치에서 아미노산의 동일성은 다른 위치에서의 추가 변형을 가능하게 한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 UGT 효소는, 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G) 또는 트레오닌(T); 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 또는 아이소류신(I); 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 또는 류신(L); 및 서열번호 5의 354번 위치에 해당하는 위치에서 알라닌(A), 또는 글리신(G), 또는 세린(S)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT는 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M), 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G), 및 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 중 2개 또는 3개를 가진다. 이들 변형은 효소의 활성에 상당한 개선을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열은 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일하거나, 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일하거나, 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일하거나, 서열번호 5, 6, 또는 9의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일하다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G) 아미노산, 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 아미노산; 및 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G) 아미노산, 및 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G) 아미노산, 및 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L) 아미노산 및 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M) 아미노산을 포함한다.
이들 또는 다른 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 위치 E225 내지 T232에서 하나 이상의 아미노산의 결실을 가진다. 예를 들어, UGT는 서열번호 6의 아미노산 E225 내지 T232에 해당하는 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 8개 아미노산의 결실을 가질 수 있다.
이들 또는 다른 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 72번 위치, 305번 위치, 345번 위치, 및 428번 위치에 해당하는 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 추가로 포함한다. 예를 들어, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6의 72번 위치에 해당하는 위치에서 글루타민(Q) 또는 아스파라긴(N)의 치환을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6의 305번 위치에 해당하는 위치에서 중성의 친수성 아미노산, 예컨대, 시스테인(C), 세린(S), 또는 트레오닌(T)의 치환을 가진다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6의 345번 위치에 해당하는 위치에서 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W)의 치환을 가진다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6의 428번 위치에 해당하는 위치에서 아이소류신(I), 발린(V), 또는 알라닌(A)의 치환을 가진다. 일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 6에 대하여 S72Q, A305C, Y345F, 및 L428I의 치환 중 2, 3, 또는 4개를 가진다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 155번 위치에 해당하는 위치 다음에 (76G1에 대해) 5 내지 약 15개의 아미노산, 예컨대, 약 6 내지 약 12개의 아미노산, 또는 약 6 또는 약 11개의 아미노산 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 삽입은 가요성 및 친수성 서열, 예컨대 주로 글리신 및 세린 잔기인 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, 서열은 GSGGSG(서열번호 7) 또는 GSGGSGGSG(서열번호 8)이다.
또 다른 양태 및 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 UGT76G1의 원형 치환체가 아니며, 즉 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 75% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 이와 같은 실시형태에서, 효소는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. UGT76G1(서열번호 1)의 예시적인 변형은 다음으로부터 선택되는 서열번호 1에 대한 변형을 포함한다: (i) E74 내지 T81에 해당하는 하나 이상의 아미노산의 결실, (ii) 357번 위치에 해당하고, 선택적으로 글리신인 위치에서의 치환, (iii) 414번 위치에 해당하고, 선택적으로 류신인 위치에서의 치환, (iv) 29번 위치에 해당하고, 선택적으로 메티오닌인 위치에서의 치환, (v) 402번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환, (vi) 154번 위치에 해당하고, 선택적으로 시스테인인 위치에서의 치환, (vii) 194번 위치에 해당하고, 선택적으로 페닐알라닌인 위치에서의 치환, (viii) 277번 위치에 해당하고, 선택적으로 아이소류신인 위치에서의 치환, (ix) 208번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환, (x) 140번 위치에 해당하고, 선택적으로 프롤린인 위치에서의 치환, 및 (xi) 259번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루탐산인 위치에서의 치환.
예를 들어, 일부 실시형태에서, UGT 효소는 서열번호 1의 E74 내지 T81에 해당하는 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 8개 모두의 아미노산의 결실을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 효소는 서열번호 1의 200번 위치에 해당하는 위치에서 알라닌의 치환을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 효소는 357G, 414L, 29M, 402Q, 154C, 194F, 277I, 208Q, 140P, 및 259E 중 적어도 2, 3, 또는 4개를 가지며, 각각은 서열번호 1에 따라 번호가 매겨진다.
이와 같은 실시형태에서, 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 또는 적어도 약 90% 서열 동일성, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성, 또는 적어도 약 98% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 효소는 서열번호 1에 대하여 아미노산 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개, 또는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.
또 다른 양태 및 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 SrUGT76G1의 원형 치환체이고(US 제2017/0332673호를 참조하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용됨) 선택적으로 서열번호 1의 해당하는 위치에 대하여 아미노산 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개 또는 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 가진다. 서열번호 1의 위치에 대한 예시적인 변형은 다음으로부터 선택될 수 있다: (i) E74 내지 T81에 해당하는 하나 이상의 아미노산의 결실(본 명세서에 기재된 바와 같음), (ii) 357번 위치에 해당하고, 선택적으로 글리신인 위치에서의 치환, (iii) 414번 위치에 해당하고, 선택적으로 류신인 위치에서의 치환, (iv) 29번 위치에 해당하고, 선택적으로 메티오닌인 위치에서의 치환, (v) 402번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환, (vi) 154번 위치에 해당하고, 선택적으로 시스테인인 위치에서의 치환, (vii) 194번 위치에 해당하고, 선택적으로 페닐알라닌인 위치에서의 치환, (viii) 277번 위치에 해당하고, 선택적으로 아이소류신인 위치에서의 치환, (ix) 208번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환, (x) 140번 위치에 해당하고, 선택적으로 프롤린인 위치에서의 치환, 및 (xi) 259번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루탐산인 위치에서의 치환. 일부 실시형태에서, UGT 효소는 E74 내지 T81에 해당하는 아미노산의 결실을 포함한다.
효소의 아미노산 서열에 대한 변화는 효소의 활성을 변경시키거나 어떠한 측정 가능한 효과가 없을 수 있다. 측정 가능한 효과가 없는 침묵(silent) 변화는 활성 부위 및 기질-결합 부위에서 멀리 떨어진 용매에 노출된 표면에서 보존적 치환 및 작은 삽입 또는 결실일 가능성이 가장 높다. 대조적으로, 효소 활성은 활성 부위, 기질-결합 부위 내에서, 그리고 단백질 접힙 또는 형태에 중요한 묻힌 위치에서 비-보존적 치환, 큰 삽입 또는 결실, 및 변화에 의해 영향을 받을 가능성이 더 크다. 효소 활성을 변경시키는 변화는 반응 속도를 증가시키거나 감소시킬 수 있거나 특정 기질에 대한 친화도 또는 특이성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 기질-결합 부위의 크기를 증가시키는 변화는 효소가 더 큰 기질에 작용할 수 있도록 허용할 수 있고 촉매 아미노산 측쇄를 기질의 표적 부위에 더 가깝게 위치시키는 변화는 효소 속도를 증가시킬 수 있다.
효소의 3차원 구조와 관련 활성 부위, 기질-결합 부위, 및 다른 상호작용 부위의 위치에 대한 지식은 돌연변이의 합리적인 설계를 용이하게 하고 특정 변화의 표현형에 대한 기계론적 통찰력을 제공할 수 있다. 식물 UGT는 상대적으로 낮은 아미노산 서열 동일성을 가지면서 고도로 보존된 2차 및 3차 구조를 공유한다. Osmani et al, Substrate specificity of plant UDP-dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling, Phytochemistry 70 (2009) 325-347. UGT의 당 수용체 및 당 공여체 기질은 N-말단 도메인과 C-말단 도메인 사이에 형성된 틈에 수용된다. 1차 서열의 여러 영역은 구조적으로 보존된 도메인을 포함하는 기질 결합 포켓뿐만 아니라, 아미노산 서열 및 서열 길이에 대하여 이들 둘 모두가 상이한 루프 영역의 형성에 기여한다.
UGT 유도체의 작제는 구조 분석 및 상동성 모델링을 기반으로 하여 안내될 수 있다. 문헌[Soon Goo Lee, et al., Molecular Basis for Branched Steviol Glucoside Biosynthesis, PNAS, June 19, 2019]을 참조한다.
예를 들어, SrUGT76G1_L200A의 독립적인 결정 구조 준비 및 분석과 MbUGT3-1_1에 대한 SrUGT76G1의 아미노산 서열 정렬을 기반으로 하여, 스테비오사이드의 스테비올 코어는 MbUGT3-1_1의 다음 잔기에 (4Å 이내로) 가까운 것으로 예측된다: I244, L280, W351, A354, I357, M362, 및 T438. 또한, C19 1-2 글라이코실화는 T438에 (4Å 이내로) 가까운 것으로 예측된다. RebD의 스테비올 코어는 MbUGT3-1_1의 다음 소수성 측쇄에 (4Å 이내로) 가까운 것으로 예측된다: L239, M242, I244, L280, I353, A354, 및 I357. C13 1-2' 글라이코실화는 MbUGT3-1_1의 다음 수소 결합 부위에 (4Å 이내로) 가까운 것으로 예측된다: S301 및 D77. L200A에 해당하는 돌연변이가 이들 나선 사이의 루프에 있기 때문에 MbUGT3-1_1의 V341-Q352 및 K355-A367 나선의 위치 및 아미노산 함량은 촉매 작용에 중요할 수 있다. MbUGT3-1_1의 L76 및/또는 D77 위치는 스테비오사이드의 C13 글라이코실화와 상호작용할 수 있다.
아미노산의 치환은 보존적 치환 또는 비-보전적 치환일 수 있다. 보존적 치환은 기존 아미노산과 새로운 아미노산이 크기 및 전하와 같은 유사한 특징을 가지는 경우로 정의된다. 자연적으로 발생하는 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기반으로 한 그룹으로 나뉜다:
(그룹 1) 소수성(지방족): 메티오닌(Met), 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 아이소류신(Ile);
(그룹 2) 중성 친수성: 시스테인(Cys), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln);
(그룹 3) 산성: 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu);
(그룹 4) 염기성: 히스티딘(His), 라이신(Lys), 아르기닌(Arg);
(그룹 5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신(Gly), 프롤린(Pro); 및
(그룹 6) 방향족: 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 페닐알라닌(Phe).
비-보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 다른 부류의 다른 아미노산으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
UGT 효소의 아미노산 서열은 세포에서 턴오버를 감소시키기 위해 2번 위치에 삽입되거나 치환된 알라닌을 선택적으로 포함할 수 있다. 다양한 실시형태에서, 1-3 UGT 효소는 생체 내에서 추가적인 안정성을 제공하기 위해, 서열번호 5, 6, 또는 9에 대해 2번 위치에 삽입되거나 치환된 알라닌 아미노산 잔기를 포함한다.
아미노산 서열의 동일성, 즉 서열 동일성의 백분율은 서열 정렬을 통해 결정될 수 있다. 이와 같은 정렬은 몇 가지 알려진 알고리즘, 예컨대, Karlin 및 Altschul에 의해 설명된 것(Karlin & Altschul (1993) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90: 5873-5877)을 이용하여, hmmalign(HMMER 패키지)을 이용하여 또는 CLUSTAL 알고리즘(Thompson, J. D., Higgins, D. G. & Gibson, T. J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)을 이용하여 수행될 수 있다. 서열 동일성(서열 매칭)의 등급은, 예를 들어 BLAST, BLAT 또는 BlastZ(또는 BlastX)를 사용하여 계산될 수 있다. 유사한 알고리즘이 문헌[Altschul et al (1990) J. Mol . Biol. 215: 403-410]의 BLASTN 및 BLASTP 프로그램에 혼입된다. BLAST 단백질 정렬은 BLASTP 프로그램, 점수 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 얻기 위해, 문헌[Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST가 이용된다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수가 사용된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 1-3 UGT 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라, 이를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 미생물, 진균 세포, 조류 세포, 또는 식물 세포일 수 있다. 식물은 스테비아 식물, 또는 보다 특히, 스테비아 레바우디아나 식물일 수 있다. 스테비아 식물은 스테비올 및 스테비올 배당체를 합성하는 데 필요한 효소를 자연적으로 발현하지만, 이들 식물은 고도로 글라이코실화된 스테비올 배당체, 예컨대, RebM을 극소량만 생산한다. 대조적으로, 1-3 UGT를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 스테비아 또는 스테비아 레바우디아나 식물의 RebM 함량은 식물 잎의 스테비올 배당체 함량의 약 1% 초과, 또는 약 2% 초과, 또는 약 5% 초과, 또는 약 10% 초과일 수 있다. 또한, 1-3 UGT를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 스테비아 또는 스테비아 레바우디아나 식물의 RebA 함량은 식물 잎의 스테비올 배당체 함량의 약 5% 초과, 또는 약 10% 초과, 또는 약 15% 초과일 수 있다.
다양한 실시형태에서 미생물 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물 숙주 세포는 에셰리키아 종(Escherichia spp.), 바실러스 종(Bacillus spp.), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 로도박터 종(Rhodobacter spp.), 자이모모나스 종(Zymomonas spp.), 비브리오 종(Vibrio spp.), 및 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.)으로부터 선택되는 박테리아이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 비브리오 나트리에겐스(Vibrio natriegens), 또는 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로부터 선택되는 종이다. 일부 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 대장균이다. 대안적으로, 미생물 세포는 효모 세포, 예컨대 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 및 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하여, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 또는 야로위아(Yarrowia)(이들로 제한되지 않음)일 수 있다.
1-3 UGT 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 미생물 세포의 염색체 내로 통합될 수 있거나, 대안적으로 염색체 외에서 발현된다. 예를 들어, 1-3 UGT 효소는 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 플라스미드로부터 발현될 수 있다.
UGT 효소의 발현은, 예를 들어 유전자 모듈(예를 들어, 오페론) 또는 UGT 효소의 독립적인 발현을 사용하여 최적의 활성을 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 유전자 또는 오페론의 발현은 상이한 강도(예를 들어, 강함, 중간, 또는 약함)를 가지는, 프로모터, 예컨대, 유도성 또는 구성적 프로모터의 선택을 통해 조절될 수 있다. 상이한 강도의 프로모터의 몇 가지 비제한적인 예는 Trc, T5 및 T7을 포함한다. 추가적으로, 유전자 또는 오페론의 발현은 세포에서 유전자 또는 오페론의 복제 수의 조작을 통해 조절될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 각각의 UGT 효소의 단일 복제를 발현한다. 일부 실시형태에서, 유전자 또는 오페론의 발현은 모듈 내 유전자의 순서를 조작함으로써 조절될 수 있으며, 여기서 먼저 전사된 유전자는 일반적으로 더 높은 수준으로 발현된다. 일부 실시형태에서, 유전자 또는 오페론의 발현은 염색체 내로 하나 이상의 유전자 또는 오페론의 통합을 통해 조절된다.
UGT 발현의 최적화는 또한 적절한 프로모터 및 리보솜 결합 부위의 선택을 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이는 높은 복제 수의 플라스미드, 또는 단일-, 낮은- 또는 중간-복제 수의 플라스미드의 선택을 포함할 수 있다. 전사 종결 단계는 또한, 스템-루프와 같은 구조의 도입 또는 제거를 통해 유전자 발현의 조절을 위한 표적이 될 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 식물 세포이다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 적합한 프로모터, 예컨대, 구성적 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 스테비아 식물에서 이종성으로 발현될 수 있다.
다양한 실시형태에서, 숙주 세포는 C-13 UGT 효소, C-19 UGT 효소, 및 1-2 UGT 효소로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 UGT 효소를 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 숙주 세포는 (1-3 UGT 효소에 추가적으로) 이종성 C-13 UGT 효소, 이종성 C-19 UGT 효소, 및 이종성 1-2 UGT 효소를 발현하고, 따라서 스테비올 및 스테비올 배당체 기질을 글라이코실화하여 RebM을 생산할 수 있다.
도 2는 스테비올과 다양한 스테비올 배당체의 구조를 예시하며, 스테비올에서 RebM으로 이어지는 생합성 경로에서 효소 활성을 확인시켜 준다. 마찬가지로, 표 1은 스테비올에서 RebM으로 이어지는 생합성 경로에 대한 기질 및 생성물을 확인시켜 준다. 각각의 기질 및 생성물 쌍에 대해, 표 1은 글라이코실화 유형을 기재하고 필요한 활성을 가지는 효소를 확인시켜 준다. RebM의 생산에 4가지 유형의 글라이코실화 활성, 즉 C13 및 C19 탄소의 1차 글라이코실화, 및 1차 글리칸의 2' 또는 3' 위치에서의 2차 글라이코실화가 필요하다. 글리칸에 한 번에 1개의 6-탄소 단당류 단위가 추가된다. 따라서, 1차 글리칸은 2차 글리칸이 1차 글리칸에 접합될 수 있기 전에 스테비올 또는 스테비올 배당체의 C13 또는 C19에 접합되어야 한다. 그러나, 스테비올 배당체의 글라이코실화 순서는 달리 제한되지 않는다. 표 2는 스테비올에서 RebM으로 이어지는 생합성 경로에 필요한 활성을 가지는 다양한 공급원의 효소를 확인시켜 주며 이들의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 대한 참조를 제공한다. 미국 특허 출원 공개 제20170332673호를 참조하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
Figure pct00001
Figure pct00002
일부 실시형태에서, 숙주 세포는 스테비올의 생합성을 위한 내인성 및/또는 이종성 효소의 발현에 의해 스테비올을 생산한다. 숙주 세포는 테르페노이드 및 테르페노이드 배당체에 활성인 다른 UGT 효소, 예컨대, C-13 UGT 효소, C-19 UGT 효소, 및 1-2 UGT 효소(표 1 내지 2 참조)와 함께 1-3 UGT를 공동 발현하도록 조작될 수 있다. 미생물 세포는 스테비올 생합성을 위한 효소, 예컨대, MEP 또는 MVA 경로의 효소, 코팔릴 신타제 및 카우렌 신타제(이들은 일부 실시형태에서 이중기능성 효소로 존재할 수 있음), P450 효소, 예컨대, 카우렌 옥시다제 및 카우레노산 하이드록실라제 및 P450 리덕타제 효소를 공동 발현하도록 추가적으로 조작될 수 있다. 표 3. 스테비올의 생합성을 위한 경로 및 효소가 US 제20170332673호에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
Figure pct00003
Figure pct00004
일부 양태에서, 본 발명은 단당류 기를 기질로 전달하는 방법을 제공한다. 방법은 NDP-당(예를 들어, UDP-단당류) 및 기질을 본 명세서에 기재된 1-3 UGT 효소, 또는 1-3 UGT 효소를 발현하는 숙주 세포 또는 이의 용해물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 테르페노이드를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 다양한 기질이 본 개시내용에 따라 글라이코실화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 테르페노이드 기질이고, 다이테르페노이드, 예컨대, 스테비올 및/또는 스테비올 배당체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 기질은 스테비오사이드 및/또는 RebD를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 단당류는 글루코스, 갈락토스, 프럭토스, 람노스, 또는 자일로스이다. 일부 실시형태에서, 단당류는 글루코스이다. 일부 실시형태에서, 방법은 재조합 1-3 UGT를 이용하여 시험관 내에서 일어나고, 외인적으로 첨가된 NDP-당(예를 들어, UDP-글루코스 또는 ADP-글루코스) 시약을 포함한다. 다른 실시형태에서, 1-3 UGT는 세포에서 재조합적으로 발현되고, NDP-글루코스는 내인적으로 이용 가능하다. 이러한 실시형태에서, 기질은 세포에 공급될 수 있고, 글라이코실트랜스퍼라제 반응을 위해 세포에서 이용 가능하다.
전체 세포 전환(즉, "생체 내변환 반응")은 기질(예를 들어, 배당체 중간체) 및 생성물이 각각 세포 내로 그리고 세포 밖으로 수송되고, 세포가 UDP-글루코스 보조인자 재생을 제공하는 것을 필요로 한다. 이는 외인성 NDP-글루코스 공급 또는 NDP-글루코스 전구체 또는 NDP-글루코스 재생 매커니즘 또는 NDP-글루코스 재생 효소 시스템을 필요로 하는 세포 용해 또는 세포 외부 분비로부터의 효소를 사용하는 과정과 대조적이다. 본 발명의 실시형태에서, 촉매 작용(글라이코실화)은 살아있는 미생물 세포 내에서 수행된다. UDP-글루코스 보조인자 재활용은 외부에서 제공되는 효소 또는 값비싼 기질의 공급을 필요로 하지 않으면서 고유한 세포 대사를 사용하여 일어난다. 일부 실시형태에 따르면, 배당체 중간체는 세포 내로 수송되고, 생성물은 세포 밖으로 수송된다.
US 제2017/0332673호는 하류 스테비올 생합성 경로와 함께 MEP 경로 효소, 및 UGT 효소를 과발현하여 글루코스로부터 RebM의 생산을 유도하는 대장균 균주를 기재한다. 그러나, 이러한 균주는 공급된 스테비올 배당체 중간체의 RebM으로의 생체 촉매 반응을 수행하지 않으며, 이는, 부분적으로 숙주 세포가 스테비올 배당체 기질을 들여올 수 없기 때문일 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물 세포에 대한 유전자 변형은 글라이코실화된 중간체가 세포 내로 전위될 수 있게 하는 한편, 진보된 글라이코실화된 생성물은 배지 내로 분비된다.
일부 실시형태에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스 이용 가능성을 증가시키는 하나 이상의 유전자 변형을 가진다. 일부 실시형태에서, 이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 이들 변형은 또한 글루코스 이용 가능성에 대해 세포에게 스트레스를 주어, 스테비올 배당체를 세포 내로 들여오기 위한 내인성 수송체의 발현을 증가시킬 수 있다. 기하급수적으로 성장하는 대장균에서 야생형 UDP-글루코스 수준은 약 2.5mM이다(Bennett BD, et al., Absolute metabolite concentrations and implied enzyme active site occupancy in Escherichia coli . Nat Chem Biol. 2009;5(8):593-9). 일부 실시형태에서, 숙주 세포에 대한 유전자 변형은 기하급수적으로 성장하는 세포(예를 들어, UGT 효소의 재조합 발현을 가지지 않는 세포)에서, UDP-글루코스를, 예를 들어 적어도 5mM, 또는 적어도 10mM 증가시키도록 조작된다.
일부 실시형태에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스를 소비하는 효소를 인코딩하는 유전자의 결실, 불활성화, 또는 활성 또는 발현 감소를 가진다. 예를 들어, 미생물 세포는 미생물 종에서 ushA(UDP-당 가수분해효소) 및/또는 galE, galT, galK, 및 galM(UDP-글루코스로부터 UDP-갈락토스 생합성을 담당함) 중 하나 이상, 또는 이의 동원체의 결실, 불활성화, 또는 활성 감소를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, galETKM 유전자는 발현이 불활성화되거나, 결실되거나, 실질적으로 감소된다.
이들 또는 다른 실시형태에서, 미생물 세포는 UDP-글루코스에 대한 전구체를 소비하는 효소를 인코딩하는 유전자의 결실, 불활성화, 또는 활성 또는 발현 감소를 가진다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 미생물 세포는 숙주 세포의 미생물 종에서 pgi(글루코스-6-포스페이트 아이소머라제), 또는 이의 동원체의 결실, 불활성화, 또는 활성 또는 발현 감소를 가진다.
이들 또는 다른 실시형태에서, 세포는 글루코스-6-포스페이트를 UDP-글루코스로 전환시키는 데 관여하는 효소를 인코딩하는 하나 이상의 유전자의 과발현 또는 활성 증가를 가진다. 예를 들어, pgm(포스포글루코뮤타제) 및/또는 galU(UTP-글루코스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제)(또는 이들의 동원체 또는 유도체)는 효소 생산성을 증가시키기 위해 과발현되거나 변형될 수 있다. US 제2020/0087692호를 참조하며, 이는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
일부 실시형태에서, 기질은 식물 추출물이며, 식물 추출물은 선택적으로 스테비아 잎 추출물이다. 다양한 실시형태에서, 1-3 UGT를 발현하는 미생물 세포는 RebD 및 RebM을 포함하는 고급 스테비올 배당체의 생산을 위해 스테비올 또는 저급 스테비올 배당체를 공급받을 수 있다. 스테비아 잎 추출물로부터의 고급 중간체는 스테비올 배당체의 기존 산업 추출로부터 용이하게 입수 가능하다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 이용 가능한 잎 추출물은 주로 경로 중간체인 스테비오사이드 및 레바우디오사이드 A(RebA)를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 스테비아 잎 추출물은 스테비올 배당체의 추출물이다. 일부 실시형태에서, 추출물은 주요 구성요소로서 스테비오사이드, 스테비올바이오사이드, 및 레바우디오사이드 A 중 하나 이상을 포함한다. 두드러진 구성요소는 일반적으로 추출물에서 스테비올 배당체의 적어도 약 10%를 구성하지만, 일부 실시형태에서는, 추출물에서 스테비올 배당체의 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%를 구성할 수 있다.
Figure pct00005
다양한 실시형태에서, 1-3 UGT는 저급 스테비올 배당체를 고급 스테비올 배당체로 전환시킨다. 예를 들어, UGT 효소는 스테비오바이오사이드를 RebB로, 루부소사이드를 RebG로, 스테비오사이드를 RebA로, RebA를 RebI로, RebG를 Reb4로, RebE를 RebD로, 및/또는 RebD를 RebM으로 전환시키기 위한 1-3' UGT 활성을 가질 수 있다. 대안적으로, UGT는 특정 기질에 대한 특이성을 선호하는 또 다른 1-3 UGT 효소 또는 효소들과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 UGT는 C13 글라이코실 기질에서 1-3 UGT로서 우선적으로 작용할 수 있는 반면, 또 다른 UGT 효소는 C19 글라이코실 기질에서 1-3 UGT로서 우선적으로 작용한다.
일부 실시형태에서, 1-3 UGT 효소를 발현하는 미생물 세포는 RebD를 공급받고, RebD의 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%를 RebM으로 전환시킨다. 다양한 실시형태에서, 이와 같은 전환은 적어도 약 8시간, 또는 일부 실시형태에서는 적어도 약 24시간 동안 일어나도록 허용된다. 예를 들어, 전환은 배양물에서 8시간 내지 약 72시간 동안 일어나도록 허용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전환은 약 24시간 내지 약 60시간 동안 일어나도록 허용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물 세포는 약 48시간 이하 또는 약 24시간 이하 이내에 RebD의 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%를 RebM으로 전환시킨다.
일부 실시형태에서, 미생물 세포는 스테비오사이드를 공급받고, 1-3 UGT를 발현하며, 스테비오사이드의 적어도 약 15%, 또는 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 25%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 50%를 RebA로 전환시킨다. 일부 실시형태에서, 효소는 스테비오사이드의 적어도 약 75% 또는 적어도 약 90%를 RebA로 전환시킨다. 다양한 실시형태에서, 이와 같은 전환은 적어도 약 8시간, 또는 일부 실시형태에서는 적어도 약 24시간 동안 일어나도록 허용된다. 예를 들어, 전환은 배양물에서 8시간 내지 약 72시간 동안 일어나도록 허용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 전환은 약 24시간 내지 약 60시간 동안 일어나도록 허용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 미생물 세포는 약 48시간 이하 또는 약 24시간 이하 이내에 스테비오사이드의 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 75%를 RebA로 전환시킨다.
천연 UGT 효소는 일반적으로 식물 효소(이는 종종 20 내지 24℃ 범위의 최적 온도를 가짐)이거나 식물 효소로부터 유래되지만, 일부 실시형태에서 본 개시내용은 24℃ 초과, 예컨대, 24℃ 내지 37℃, 또는 27℃ 내지 37℃, 또는 30℃ 내지 37℃의 온도에서 효소 생산성으로, 미생물 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 예컨대, 대장균)에서 높은 수율로 글라이코실화된 생성물의 생산을 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 배양은 30 내지 34℃에서 수행된다.
일부 실시형태에서, 공정은 대규모 생산을 위해 확장 가능하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 배양물의 크기는 적어도 약 100ℓ, 적어도 약 200ℓ, 적어도 약 500ℓ, 적어도 약 1,000ℓ, 또는 적어도 약 10,000ℓ, 또는 적어도 약 100,000ℓ, 또는 적어도 약 500,000 ℓ이다.
다양한 실시형태에서, 방법은 세포 배양물 또는 세포 용해물로부터 글라이코실화된 생성물을 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양물은 적어도 약 100 ㎎/ℓ, 또는 적어도 약 200 ㎎/ℓ, 또는 적어도 약 500 ㎎/ℓ, 또는 적어도 약 1 g/ℓ, 또는 적어도 약 2 g/ℓ, 또는 적어도 약 5 g/ℓ, 또는 적어도 약 10 g/ℓ, 또는 적어도 약 20 g/ℓ, 또는 적어도 약 30 g/ℓ, 또는 적어도 약 40 g/ℓ, 또는 적어도 약 50 g/ℓ의 글라이코실화된 생성물을 생산하며, 일부 실시형태에서는 배양 배지로부터 추출된다.
일부 실시형태에서, 기질은 테르페노이드, 예컨대, 모노테르페노이드, 세스퀴테르페노이드, 또는 트라이테르페노이드이다. 일부 실시형태에서, 테르페노이드는 트라이테르페노이드이고, 트라이테르페노이드는 선택적으로 모그롤 또는 모그로사이드이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 1-3 UGT 효소는 배당체, 지방족 및 분지형 알코올, 치환된 페놀, 플라보노이드 및 갈레이트에 대해 광범위한 기질 활성을 가진다. 예를 들어, 문헌[Dewitt, G. et al., Screening of recombinant glycosyltransferases reveals the broad acceptor specificity of stevia UGT -76G1, J. Biotechnology 233 (2016) 49-55]을 참조한다. UGT 효소의 기질은 다이테르페노이드 배당체, 예컨대, 스테비올 배당체 및 트라이테르페노이드 배당체, 예컨대, 모그로사이드를 포함하는 테르페노이드 배당체(아이소프레노이드)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 방법은 기질의 존재 하에 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 기질은 배양물에 공급될 수 있거나, 일부 실시형태에서, 기질은 숙주 세포에 의해 합성된다. 일부 실시형태에서, 기질은 스테비올이고, 숙주 세포는 복수의 UGT 효소를 발현하여 목표 스테비올 배당체, 예컨대, RebM을 생산한다.
일부 실시형태에서, 글라이코실화된 생성물(예를 들어, RebM)은 배지 구성요소로부터 정제된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 방법은 대장균 세포로부터 성장 배지를 분리하는 단계, 및 성장 배지로부터 원하는 글라이코실화 생성물(예를 들어, RebM)을 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, RebM과 같은 생성물은 세포 재료로부터 추가로 추출된다.
일부 양태에서, 본 발명은 글라이코실화된 생성물, 예컨대, RebM을 포함하는 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 표적 스테비올 배당체(본 개시내용에 따라 생산됨)를 생성물, 예컨대, 식품, 음료, 구강 관리 제품, 감미료, 향미제, 또는 다른 제품에 혼입시키는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 제조된, 정제된 스테비올 배당체는, 식품, 음료, 결착제(예를 들어, 전분, 섬유, 검, 지방 및 지방 모사체, 및 유화제), 약학 조성물, 담배 제품, 기능식품 조성물, 구강 위생 조성물, 및 화장료 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 제품에 사용될 수 있다. RebM이 함께 사용될 수 있는 향미제의 비제한적인 예는 라임, 레몬, 오렌지, 과일, 바나나, 포도, 배, 파인애플, 망고, 비터 아몬드(bitter almond), 콜라, 시나몬, 설탕, 솜사탕 및 바닐라 향을 포함한다. 다른 식품 성분의 비제한적인 예는 향미제, 산미료, 및 아미노산, 착색제, 증량제, 변성 전분, 검, 텍스처화제, 보존제, 항산화제, 유화제, 안정화제, 증점제 및 겔화제를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 복수의 고강도 감미료를 포함하는 감미료 제품을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 복수의 고강도 감미료는 스테비올 배당체, 모그로사이드, 수크랄로스, 아스파탐, 네오탐, 아드반탐, 아세설팜 칼륨, 사카린, 사이클라메이트, 네오헤스페리딘 다이하이드로칼콘, 그네티폴린 E, 및/또는 피세아탄올 4'-O-β-D-글루코피라노사이드 중 둘 이상을 포함한다. 방법은 감미료 제품을 식품, 음료, 구강 관리 제품, 감미료, 향미제, 또는 상기 기재된 것을 포함하는 다른 제품에 혼입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
RebM과 같은 표적 스테비올 배당체(들), 및 이를 포함하는 감미료 조성물은 다양한 생리 활성 물질 또는 기능성 성분과 조합하여 사용될 수 있다. 기능성 성분은 일반적으로, 카로티노이드, 식이 섬유, 지방산, 사포닌, 항산화제, 기능식품, 플라보노이드, 아이소싸이오시아네이트, 페놀, 식물 스테롤 및 스탄올(피토스테롤 및 피토스탄올); 폴리올; 프리바이오틱스, 프로바이오틱스; 피토에스트로겐; 대두 단백질; 설파이드/싸이올; 아미노산; 단백질; 비타민; 및 미네랄과 같은 범주로 분류된다. 기능성 성분은 또한, 예컨대, 심혈관, 콜레스테롤-감소, 및 항염과 같은 이들의 건강상의 이익을 기반으로 하여 분류될 수 있다.
또한, 표적 스테비올 배당체(들), 예컨대, RebM, 및 본 발명에 따라 수득된 감미료 조성물은 맛 특징이 개선된 제로 칼로리, 칼로리 저감 또는 당뇨병 음료 및 식료품을 생산하기 위해 고강도 감미료로서 적용될 수 있다. 또한 설탕을 사용할 수 없는 음료, 식품, 의약품, 및 기타 제품에도 사용될 수 있다. 추가적으로, RebM 및 감미료 조성물은 음료, 식품, 및 기타 인간 소비 전용 제품뿐만 아니라, 특징이 개선된 동물용 식품 및 사료에도 감미료로서 사용될 수 있다.
표적 스테비올 배당체(들) 및 감미료 조성물이 사용될 수 있는 제품의 예는, 예컨대, 보드카, 와인, 맥주, 리큐어, 및 사케와 같은 알코올 음료, 천연 쥬스, 탄산 청량 음료, 다이어트 음료, 제로 칼로리 음료, 칼로리 저감 음료 및 식품, 요거트 음료, 인스턴트 쥬스, 인스턴트 커피, 분말형 인스턴트 음료, 통조림 제품, 시럽, 발효 된장, 간장, 식초, 드레싱, 마요네즈, 케첩, 카레, 스프, 인스턴트 부용, 분말형 간장, 분말형 식초, 비스킷 종류, 쌀 비스킷, 크래커, 빵, 초콜릿, 캐러멜, 사탕, 츄잉검, 젤리, 푸딩, 보존처리된 과일 및 채소, 생크림, 잼, 마멜레이드, 플라워 페이스트, 분유, 아이스크림, 소르베, 병에 포장한 채소 및 과일, 통조림 및 삶은 콩, 가당 소스에 삶은 육류 및 식품, 농업 채소 식료품, 해산물, 햄, 소시지, 어육 햄, 어육 소시지, 어묵, 생선 튀김 제품, 건어물 제품, 냉동 식료품, 보존처리된 해초, 보존처리된 육류, 담배, 의약품, 및 기타 여러 제품을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다.
식품, 음료, 의약품, 화장품, 탁상용 제품, 및 츄잉검과 같은 제품을 제조하는 동안, 혼합, 반죽, 용해, 피클링, 침투, 퍼컬레이션, 살포, 분무, 주입 및 기타 다른 방법과 같은 통상적인 방법이 사용될 수 있다.
이제 본 발명의 양태 및 실시형태를 하기 실시예를 참조하여 설명한다.
실시예
이제 본 발명의 양태 및 실시형태를 하기 실시예를 참조하여 설명한다.
실시예 1: MbUGT1 -3_1(서열번호 5)에 대한 돌연변이체의 스크리닝
UGT MbUGT1-3_1(서열번호 5) 및 95개의 선택된 돌연변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드를 대장균 세포(ΔushA, ΔgalETKM, Δpgi; 과발현된 pgm, galU)로 형질전환시켰다. 생성된 균주를 풍부한 종자 배지에 시딩하고, 종자 배양물을 만들기 위해 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 밤새 인큐베이션하였다.
0.5mM의 스테비오사이드 및 0.5mM의 레바우디오사이드 D를 포함하는 360 ㎕의 신선한 생산 배지에 40 ㎕의 종자를 첨가함으로써 생산 배양물을 종자 배양물과 함께 시딩하였다. 생산 배양물을 후속적으로 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 48시간 동안 성장시켰다. LC-MS QQQ를 사용하여 생성물을 정량화하였다.
스크리닝된 95개의 돌연변이체는 다음을 포함한다(이들 돌연변이체의 아미노산 위치는 MbUGT1-3_1(서열번호 5)에 대한 것임):
i) 치환:
F11L, K13R, T16E, V18L, E19A, G48T, S62A, D73P, L89W, V93L, Y94E, W99F, E100C, N106R, E115K, Y119T, Q122E, K130W, V133A, V133S, M136K, S153L, G164R, R165N, R166G, I169L, F200L, F204H, F204P, K206A, K208D, K208N, F219D, F219S, L221P, R229A, I230F, L233I, G241A, R243M, P245S, I246L, R257D, E260A, L261K, L262Q, L264S, D269E, E271P, S273A, R294P, L296I, S301N, F304S, H309F, V310A, T327S, A333V, F336L, V341I, Y348T, Q352A, Q352D, Q352E, A354S, A354T, K355Y, L358I, M361Q, I362V, S375T, E383F, V387L, I388E, I388S, R389Q, L400F, L404F, A406S, D413E, V418C, P426A, S428K, S428G, V441I, D445E, D455N, Q457G, Q457K/S458Q, 또는 Q457K.
ii) 치환 및 결실:
Q457K 및 S458 결실(ΔS458).
iii) 결실:
ΔG159; ΔG159ΔG161; 또는 ΔG159ΔS160ΔG161.
iv) 삽입:
158번과 159번 위치 사이에 S의 삽입 또는 456번과 457번 사이에 K의 삽입.
스테비오사이드(기질)로부터 RebA 및 RebI뿐만 아니라, RebM을 생산하는 능력에 대해 MbUGT1-3_1의 95개 돌연변이체를 모두 스크리닝하였다. 표 5는 RebA 및 RebI(C-13-글루코스에서 1-3 글루코실화를 통함)뿐만 아니라, RebM(C-19-글루코스에서 1-3 글루코실화를 통함)을 생산하는 MbUGT1-3_1의 선택된 돌연변이체의 개선 배수를 나타낸다. 표 5에서, 칼럼 2는 일반적으로 기질의 C13-글루코스에서의 글라이코실화에 해당하는 한편, 칼럼 3은 일반적으로 기질의 C19-글루코스에서의 글라이코실화에 해당한다. 나타낸 바와 같이, C-19 글라이코실화는 C-13 글라이코실화보다 더 향상된다. 표 5의 돌연변이로 작제된 돌연변이체는 본 명세서에서 MbUGT1-3_2(서열번호 6)로 지칭된다.
Figure pct00006
실시예 2: 1 -3' 글라이코실화 효소에 의한 생물전환
3개의 UGT, SrUGT76G1-L200A(서열번호 1), MbUGT1-3_0(서열번호 4), MbUGT1-3_1(서열번호 5), 및 MbUGT1-3_2(서열번호 6)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드를 대장균 세포(ΔushA, ΔgalETKM, Δpgi; 과발현된 pgm, galU)로 개별적으로 형질전환시켰다. 생성된 균주를 1mM 스테비오사이드 또는 1mM RebD를 포함하는 배양 배지에 시딩하였다. 성장 후, 스테비올 배당체를 배양 배지로부터 회수하였다. 균주를 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 밤새 성장시켰다. 그 다음 세포를 총 부피의 10%가 되도록 신선한 생산 배양물로 옮겼다. 스테비오사이드(0.5mM) 및 레바우디오사이드 D(0.5mM) 각각을 생산 배양물에 포함하였다. 그 다음 생산 배양물을 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 48시간 동안 성장시켰다. LC-MS QQQ를 사용하여 생성물을 정량화하였다.
도 4는 스테비오사이드의 RebA로의 전환율, 및 RebD의 RebM으로의 전환율을 나타낸다. 두 반응 모두에 대한 전환율은, 각각 서열번호 5 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 MbUGT1-3_1 및 MbUGT1-3_2에 대해 가장 높았다. 도 5는 SrUGT76G1-L200A와 비교하여 MbUGT1-3_1 및 MbUGT1-3_2의 개선 배수를 나타낸다.
실시예 3: MbUGT1 -3_2(서열번호 6)에 대한 돌연변이체의 스크리닝
UGT MbUGT1-3_2(서열번호 6) 및 MbUGT1-3_2의 96개의 선택된 돌연변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드를 대장균 세포(ΔushA, ΔgalETKM, Δpgi; ΔaraA, 과발현된 pgm, galU, UGT1-2 효소)로 형질전환시켰다. 생성된 균주를 풍부한 종자 배지에 시딩하고, 종자 배양물을 만들기 위해 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 밤새 인큐베이션하였다.
그 다음 1 g/ℓ의 스테비오사이드/RebA 잎 추출물을 포함하는 360 ㎕의 신선한 생산 배지에 40 ㎕의 종자를 첨가함으로써 생산 배양물을 종자 배양물과 함께 시딩하였다. 그 다음 생산 배양물을 37℃에서 250 rpm으로 96-웰 플레이트에서 48시간 동안 성장시켰다. UPLC-DAD를 사용하여 생성물을 정량화하였다.
스크리닝된 돌연변이체는 다음을 포함한다(아미노산 위치는 MbUGT1-3_1(서열번호 5)에 대한 것임):
i) 치환:
T16G, V18L, E19A, D23E, R31K, C64S, I70V, L76N, P79M, W99F, D114E, R125L, V133A, S150D, T202M, F204E, Y212F, Y212H, R218L, D227S, E228S, I230F, I230Y, L233I, G237S/P238A, P238S, L239E, L239G, A240S, A240V, M242A, M242I, I246Y, I247F, A252I, D253E, L261K, L264E, A265D, E271P, S273A, C274G, C274L, Y282W, N292K, S302G, L303M, F306W, L312M, Q314L, L318W, P323L, E331A, K340R, S346V, Y348F/S349D/N350T/W351L/Q352E/I353N, Y348G/S349E/N350F/W351G/Q352E/I353K, Y348T/S349N/N350E/W351P/Q352E/I353E, W351F/Q352E/A354G, W351P, Q352D/A354G, Q352E, A354S, I362L, A367N, E383S, E385A, H403Y, L404F, F419K, S428K, L431I, D445E, D445I, A450L, 또는 Q457G.
ii) 치환 및 결실:
D227T 및 Δ228 내지 234
iii) 결실:
ΔG158 내지 G161; ΔG159 내지 G161; ΔS160 내지 ΔG161; ΔG161; Δ228; Δ228 내지 229; Δ228 내지 230; Δ228 내지 231; Δ228 내지 232; Δ228 내지 233; Δ228 내지 234; Δ228 내지 235; Δ228 내지 236; Δ228 내지 237; ΔY320 내지 P323; ΔD325 내지 K326; 또는 ΔK326.
iv) 삽입:
F25와 L26 사이에 LEA 삽입;
iv) 대체:
Y348 내지 I353을 INPQG로 교체
표 6은 RebM을 생산하는 MbUGT1-3_2(서열번호 6)의 선택된 돌연변이체의 능력을 나타낸다. 표 6의 칼럼 2는 반응 생성물에서 RebM의 백분율의 개선 배수를 나타낸다.
Figure pct00007
아미노산 E225 내지 T232의 결실은 RebM의 생산에서 11배의 놀라운 개선을 나타내었다. 상동성 모델링을 기반으로 하여, 아미노산 E225 내지 T232는 결합된 기질 근처에서 루프를 형성하는 것으로 보인다. 아미노산 E225 내지 T232의 결실은 RebD에서 RebM으로의 반응에 유리한 UGT 효소의 기질 특이성의 이동을 유발할 수 있다. MbUGT1-3_2(서열번호 6)에 대해 E225 내지 T232 루프의 결실 및 S72Q, A305C, Y345F 및 L428I 돌연변이를 가지는 서열을 MbUGT1-3_3(서열번호 9)으로 지칭한다.
E225 내지 T232 영역의 몇 가지 결실을 테스트하였으며, 이들은 또한 RebM 생산의 향상을 나타내었다. 표 7은 E225 내지 T232 영역의 다양한 유익한 결실을 나타낸다(서열번호 6에 따라 번호를 매김).
Figure pct00008
서열
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
SEQUENCE LISTING <110> Manus Bio, Inc. <120> URIDINE DIPHOSPHATE-DEPENDENT GLYCOSYLTRANSFERASE ENZYME <130> MAN-024PC/107590-5023 <140> PCT/US2020/039648 <141> 2020-06-25 <150> US 62/866,148 <151> 2019-06-25 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 458 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 1 Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile 1 5 10 15 Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu 20 25 30 Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr 35 40 45 Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg 50 55 60 Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro 65 70 75 80 Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His 85 90 95 Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser 100 105 110 Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu 130 135 140 Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln 145 150 155 160 Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu 165 170 175 Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser 180 185 190 Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile 195 200 205 Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu 210 215 220 Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser 245 250 255 Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro 260 265 270 Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp 275 280 285 Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln 290 295 300 Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp 305 310 315 320 Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val 325 330 335 Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala 340 345 350 Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu 355 360 365 Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn 370 375 380 Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn 385 390 395 400 Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val 405 410 415 Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu 435 440 445 Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455 <210> 2 <211> 459 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 2 Met Ala Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys 1 5 10 15 Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser 35 40 45 Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu 50 55 60 Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro 65 70 75 80 Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu 85 90 95 Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln Ser 100 105 110 Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp Val 115 120 125 Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val Lys 130 135 140 Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala Phe 145 150 155 160 Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu Gly 165 170 175 Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn Ala 180 185 190 Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn Gly 195 200 205 Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val Asp 210 215 220 Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln Lys 225 230 235 240 Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu Glu 245 250 255 Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr 260 265 270 Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly 275 280 285 His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly 290 295 300 Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser 305 310 315 320 Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln 325 330 335 Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met 340 345 350 Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu 355 360 365 Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys 370 375 380 Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser 385 390 395 400 Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe 405 410 415 His Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp 420 425 430 Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met 435 440 445 Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser 450 455 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 3 Met Ala Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile 1 5 10 15 Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln 20 25 30 Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His 35 40 45 Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe 50 55 60 Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu 65 70 75 80 Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu 85 90 95 His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala 100 105 110 Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp 115 120 125 Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val 130 135 140 Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro 145 150 155 160 Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu 165 170 175 Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys 180 185 190 Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met 195 200 205 Ile Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys 210 215 220 Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala 225 230 235 240 Pro Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser 245 250 255 Ser Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln 260 265 270 Pro Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val 275 280 285 Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys 290 295 300 Gln Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr 305 310 315 320 Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile 325 330 335 Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly 340 345 350 Ala Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys 355 360 365 Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu 370 375 380 Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu 385 390 395 400 Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met 405 410 415 Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys 420 425 430 Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser 435 440 445 Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu 450 455 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 4 Met Ala Lys Gln Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys 1 5 10 15 Gly Ser Thr Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg 20 25 30 Gly Arg Ile Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly 35 40 45 Ala Ile Gly Ala Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu 50 55 60 Ser Val Cys Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp 65 70 75 80 Gln Pro Leu Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val 85 90 95 Tyr Leu Glu Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg 100 105 110 Arg Val Met Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg 115 120 125 Val Leu Lys Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Tyr Glu Ser Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Glu Asn 145 150 155 160 Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro 165 170 175 Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu Ala Asn Val 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn 195 200 205 Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu 210 215 220 Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly 225 230 235 240 Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp 245 250 255 Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp 260 265 270 Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln 275 280 285 Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Met Thr Ser 290 295 300 Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu 305 310 315 320 Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala 325 330 335 Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser 340 345 350 Asn Trp Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys Gln Thr 355 360 365 Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Glu 370 375 380 Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser Phe Leu 385 390 395 400 Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu Leu Asp 405 410 415 His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro Ser Ser 420 425 430 Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu Lys Asp 435 440 445 Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser 450 455 <210> 5 <211> 458 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 5 Met Ala Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr 1 5 10 15 Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile 20 25 30 Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly 35 40 45 Ala Phe Trp Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys 50 55 60 Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu 65 70 75 80 Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu 85 90 95 Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Leu Met 100 105 110 Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys 115 120 125 Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser 130 135 140 Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Ser Gly Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe 165 170 175 Gln Gly His Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys 195 200 205 Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp 210 215 220 Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala 225 230 235 240 Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg 245 250 255 Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val 260 265 270 Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala 275 280 285 Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe 290 295 300 Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr 305 310 315 320 Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe 325 330 335 Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln 340 345 350 Ile Ala Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys Gln Thr Lys Ala Ser 355 360 365 Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu 370 375 380 Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser Phe Leu Ile Pro Leu 385 390 395 400 Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu Leu Asp His Asp Arg 405 410 415 Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro Ser Ser Val Leu Tyr 420 425 430 Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu 435 440 445 Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Gln Ser 450 455 <210> 6 <211> 455 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 6 Met Ala Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr 1 5 10 15 Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile 20 25 30 Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly 35 40 45 Ala Phe Trp Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys 50 55 60 Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu 65 70 75 80 Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu 85 90 95 Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Leu Met 100 105 110 Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys 115 120 125 Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser 130 135 140 Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His 165 170 175 Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe 180 185 190 Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn 195 200 205 Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp 210 215 220 Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg 225 230 235 240 Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu 245 250 255 Glu Leu Gln Met Leu Ala Ser Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu 260 265 270 Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu 275 280 285 Asn Leu Pro Arg Leu Val Leu Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His 290 295 300 Ala His Val Ser Leu Pro Gln Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro 305 310 315 320 Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu 325 330 335 Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Ala Lys 340 345 350 Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val 355 360 365 Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val 370 375 380 Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His 385 390 395 400 Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu Leu Glu His Asp Arg Thr Val Phe 405 410 415 Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe 420 425 430 Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg 435 440 445 Gly Leu Val Asp Ser Gln Ser 450 455 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 7 Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 8 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 9 <211> 447 <212> PRT <213> Stevia rebaudiana <400> 9 Met Ala Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr 1 5 10 15 Trp Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile 20 25 30 Val Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly 35 40 45 Ala Phe Trp Thr His Gly Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys 50 55 60 Glu Gly Val Pro Met Ile Phe Gln Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu 65 70 75 80 Asn Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu 85 90 95 Asn Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Leu Met 100 105 110 Val Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys 115 120 125 Gln Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser 130 135 140 Leu Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu Gly Ser Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Arg Arg Arg Arg Ile Ile Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His 165 170 175 Ile Asn Pro Met Leu Gln Leu Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe 180 185 190 Ser Ile Thr Ile Phe His Thr Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn 195 200 205 Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp 210 215 220 His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His Gly 225 230 235 240 Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Gln Met Leu Ala Ser Glu 245 250 255 Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr Phe 260 265 270 Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Pro Arg Leu Val Leu Met 275 280 285 Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Cys His Val Ser Leu Pro Gln Phe 290 295 300 Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu Glu 305 310 315 320 Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser Ala 325 330 335 Phe Ser Asn Trp Gln Ile Ala Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile Lys 340 345 350 Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu Leu 355 360 365 Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro Ser 370 375 380 Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Leu 385 390 395 400 Leu Glu His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro Pro 405 410 415 Ser Ser Val Ile Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp Glu 420 425 430 Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Gln Ser 435 440 445

Claims (73)

  1. 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 75% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT) 효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 약 80% 동일한, 효소.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 약 85% 동일한, 효소.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 약 90% 동일한, 효소.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 약 95% 동일한, 효소.
  6. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6과 적어도 약 98% 동일한, 효소.
  7. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열인, 효소.
  8. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개의 아미노산 변형을 가지는, 효소.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 가지는, 효소.
  10. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 가지는, 효소.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1의 29, 200, 357, 및 414번 위치 중 하나 이상에 해당하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 효소.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G);
    서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L); 및
    서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M)
    중 하나 이상을 포함하는, 효소.
  13. 제12항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 Gly, 서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 Leu, 및 서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 Met를 가지는, 효소.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 5의 155번 위치에 해당하는 위치 다음에 약 6 내지 약 12개의 아미노산 삽입을 포함하는, 효소.
  15. 제14항에 있어서, 상기 삽입은 주로 글리신 및 세린 잔기인 가요성 및 친수성 서열이고, 선택적으로 GSGGSG(서열번호 7) 또는 GSGGSGGSG(서열번호 8)인, 효소.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 E225 내지 T232에 해당하는 하나 이상의 아미노산의 결실을 포함하는, 효소.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 아미노산 E225 내지 T232에 해당하는 아미노산의 결실을 포함하는, 효소.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 72번 위치, 305번 위치, 345번 위치, 및 428번 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 효소.
  19. 제18항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 72번 위치에 해당하는 위치에서 글루타민(Q); 서열번호 6의 305번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인(C); 서열번호 6의 345번 위치에 해당하는 위치에서 페닐알라닌(F); 및 서열번호 6의 428번 위치에 해당하는 위치에서 아이소류신(I)으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 효소.
  20. 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 60% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT) 효소이되, UGT 효소는
    서열번호 5의 54번 위치에 해당하는 위치에서 글리신(G);
    서열번호 5의 111번 위치에 해당하는 위치에서 류신(L); 및
    서열번호 5의 183번 위치에 해당하는 위치에서 메티오닌(M)
    을 포함하는, 효소.
  21. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 70% 동일한, 효소.
  22. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일한, 효소.
  23. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 90% 동일한, 효소.
  24. 제20항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 6의 아미노산 서열과 적어도 약 95% 동일한, 효소.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1-3 UGT 효소는 서열번호 5의 155번 위치에 해당하는 위치 다음에 약 5 내지 약 15개의 아미노산의 삽입을 포함하는, 효소.
  26. 제25항에 있어서, 상기 삽입은 주로 글리신 및 세린 잔기인 가요성 및 친수성 서열이고, 선택적으로 GSGGSG(서열번호 7) 또는 GSGGSGGSG(서열번호 8)인, 효소.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 아미노산 서열에 대하여 아미노산 E225 내지 T232에 해당하는 하나 이상의 아미노산의 결실을 포함하는, 효소.
  28. 제27항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 아미노산 E225 내지 T232에 해당하는 아미노산의 결실을 포함하는, 효소.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 72번 위치, 305번 위치, 345번 위치, 및 428번 위치에 해당하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는, 효소.
  30. 제29항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 6의 72번 위치에 해당하는 위치에서 글루타민(Q); 서열번호 6의 305번 위치에 해당하는 위치에서 시스테인(C); 서열번호 6의 345번 위치에 해당하는 위치에서 페닐알라닌(F); 및 서열번호 6의 428번 위치에 해당하는 위치에서 아이소류신(I)으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, 효소.
  31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 동일한, 효소.
  32. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개의 아미노산 변형을 가지는, 효소.
  33. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 가지는, 효소.
  34. 제20항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 9의 아미노산 서열에 대하여, 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 5개의 아미노산 변형을 가지는, 효소.
  35. 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 75% 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하고,
    E74 내지 T81에 해당하는 하나 이상의 아미노산의 결실,
    357번 위치에 해당하고, 선택적으로 글리신인 위치에서의 치환,
    414번 위치에 해당하고, 선택적으로 류신인 위치에서의 치환,
    29번 위치에 해당하고, 선택적으로 메티오닌인 위치에서의 치환,
    402번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환,
    154번 위치에 해당하고, 선택적으로 시스테인인 위치에서의 치환,
    194번 위치에 해당하고, 선택적으로 페닐알라닌인 위치에서의 치환,
    277번 위치에 해당하고, 선택적으로 아이소류신인 위치에서의 치환,
    208번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환,
    140번 위치에 해당하고, 선택적으로 프롤린인 위치에서의 치환, 및
    259번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루탐산인 위치에서의 치환
    으로부터 선택되는 서열번호 1에 대하여 하나 이상의 변형을 포함하는 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT) 효소.
  36. 제35항에 있어서, 상기 UGT 효소는 E74 내지 T81에 해당하는 적어도 2개 또는 적어도 3개 아미노산의 결실을 포함하는, UGT 효소.
  37. 제35항에 있어서, 상기 UGT 효소는 E74 내지 T81에 해당하는 적어도 4개 또는 적어도 5개의 아미노산의 결실을 포함하는, UGT 효소.
  38. 제35항에 있어서, 상기 UGT 효소는 E74 내지 T81에 해당하는 적어도 6개 또는 적어도 7개의 아미노산의 결실을 포함하는, UGT 효소.
  39. 제35항에 있어서, 상기 UGT 효소는 E74 내지 T81에 해당하는 아미노산의 결실을 포함하는, UGT 효소.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1의 200번 위치에 해당하는 위치에서 알라닌의 치환을 추가로 포함하는, UGT 효소.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 357G, 414L, 29M, 402Q, 154C, 194F, 277I, 208Q, 140P, 및 259E 중 적어도 2, 3, 또는 4개를 가지며, 각각은 서열번호 1에 따라 번호가 매겨진, UGT 효소.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 85%, 또는 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 98% 동일한, UGT 효소.
  43. 제42항에 있어서, 상기 효소는 서열번호 1에 대하여, 아미노산 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개, 또는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 가지는, UGT 효소.
  44. SrUGT76G1의 원형 치환체(circular permutant)이고, 선택적으로 서열번호 1의 해당하는 위치에 대하여 아미노산 치환, 결실, 및 삽입으로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 20개 또는 1 내지 15개, 또는 1 내지 10개의 아미노산 변형을 가지되, 단 원형 치환체는
    E74 내지 T81에 해당하는 하나 이상의 아미노산의 결실,
    357번 위치에 해당하고, 선택적으로 글리신인 위치에서의 치환,
    414번 위치에 해당하고, 선택적으로 류신인 위치에서의 치환,
    29번 위치에 해당하고, 선택적으로 메티오닌인 위치에서의 치환,
    402번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환,
    154번 위치에 해당하고, 선택적으로 시스테인인 위치에서의 치환,
    194번 위치에 해당하고, 선택적으로 페닐알라닌인 위치에서의 치환,
    277번 위치에 해당하고, 선택적으로 아이소류신인 위치에서의 치환,
    208번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루타민인 위치에서의 치환,
    140번 위치에 해당하고, 선택적으로 프롤린인 위치에서의 치환, 및
    259번 위치에 해당하고, 선택적으로 글루탐산인 위치에서의 치환
    으로부터 선택되는 서열번호 1에 대하여 하나 이상의 변형을 포함하는, 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제(UGT) 효소.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  46. 제45항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 세포는 미생물인, 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아인, 숙주 세포.
  49. 제48항에 있어서, 상기 박테리아는 대장균(이. 콜라이(E. coli))인, 숙주 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 숙주 세포는 ushA 및 galETKM의 결실 또는 불활성화, pgi의 결실 또는 불활성화, 및 pgm 및 galU의 과발현 또는 활성 증가를 포함하는, 숙주 세포.
  51. 제47항에 있어서, 상기 미생물은 효모인, 숙주 세포.
  52. 제46항에 있어서, 상기 세포는 식물인, 숙주 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 식물은 스테비아 식물인, 숙주 세포.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 C-13 UGT 효소, C-19 UGT 효소, 및 1-2' UGT 효소로부터 선택되는 하나 이상의 추가적인 UGT 효소를 발현하는, 숙주 세포.
  55. 제54항에 있어서, 상기 숙주 세포는 이종성 C-13 UGT 효소, 이종성 C-19 UGT 효소, 및 이종성 1-2 UGT 효소를 추가로 발현하는, 숙주 세포.
  56. 제47항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포는 스테비올의 생합성을 위한 내인성 및/또는 이종성 효소의 발현에 의해 스테비올을 생산하는, 숙주 세포.
  57. NDP-당 및 기질을 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 UGT 효소, 또는 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항의 숙주 세포 또는 이의 용해물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 단당류 기를 기질로 전달하는 방법.
  58. 제57항에 있어서, 상기 기질은 테르페노이드인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 테르페노이드는 다이테르페노이드인, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 다이테르페노이드는 스테비올 및/또는 스테비올 배당체인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드 및/또는 RebD인, 방법.
  62. 제57항에 있어서, 상기 기질은 식물 추출물이고, 상기 식물 추출물은 선택적으로 스테비아 잎 추출물인, 방법.
  63. 제58항에 있어서, 상기 테르페노이드는 모노테르페노이드, 세스퀴네르페노이드, 또는 트라이테르페노이드인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 테르페노이드는 트라이테르페노이드이고, 상기 트라이테르페노이드는 선택적으로 모그롤 또는 모그로사이드인, 방법.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NDP-당은 UDP-글루코스인, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 반응은 내인성 UDP-글루코스를 이용하여 숙주 세포에서 일어나는, 방법.
  67. 기질의 존재 하에 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 성장시키는 단계를 포함하는, 글리코실 기를 기질로 전달하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 기질은 숙주 세포에 의해 합성되는, 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 기질은 테르페노이드인, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 테르페노이드는 다이테르페노이드인, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 다이테르페노이드는 스테비올 및/또는 스테비올 배당체인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 스테비올 배당체는 스테비오사이드 및/또는 RebD인, 방법.
  73. 제69항에 있어서, 상기 테르페노이드는 트라이테르페노이드이고, 상기 트라이테르페노이드는 선택적으로 모그롤 또는 모그로사이드인, 방법.
KR1020227002106A 2019-06-25 2020-06-25 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제 효소 KR20220034793A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962866148P 2019-06-25 2019-06-25
US62/866,148 2019-06-25
PCT/US2020/039648 WO2020264179A1 (en) 2019-06-25 2020-06-25 Uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220034793A true KR20220034793A (ko) 2022-03-18

Family

ID=74062053

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227002106A KR20220034793A (ko) 2019-06-25 2020-06-25 우리딘 다이포스페이트-의존성 글라이코실트랜스퍼라제 효소

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11168309B2 (ko)
EP (1) EP3990628A4 (ko)
JP (1) JP2022530706A (ko)
KR (1) KR20220034793A (ko)
CN (1) CN114174501A (ko)
AU (1) AU2020302789A1 (ko)
BR (1) BR112021026306A2 (ko)
CA (1) CA3144658A1 (ko)
IL (1) IL289202A (ko)
MX (1) MX2022000150A (ko)
WO (1) WO2020264179A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2019001631A (es) 2016-08-12 2019-08-05 Amyris Inc Glicosiltransferasa dependiente de uridina difosfato para la produccion de alta eficiencia de rebaudiosidos.
JP7365707B2 (ja) * 2018-03-12 2023-10-20 コナゲン インコーポレイテッド ステビオール配糖体レバウジオシドｊ及びレバウジオシドｎの生合成による製造
KR102532079B1 (ko) * 2018-07-16 2023-05-12 마누스 바이오, 인크. 전체 세포 생체변환을 통한 스테비올 글리코시드의 생산
BR112021026306A2 (pt) * 2019-06-25 2022-09-06 Manus Bio Inc Enzima de glicosiltransferase dependente de uridina difosfato
JP2024505906A (ja) * 2021-01-27 2024-02-08 コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体およびその用途
CN115725528B (zh) * 2021-08-30 2024-01-12 弈柯莱生物科技(集团)股份有限公司 一种糖基转移酶及其应用
KR102628374B1 (ko) * 2021-10-19 2024-01-24 씨제이제일제당 주식회사 신규한 당전이효소 및 이의 용도
WO2023121427A1 (ko) * 2021-12-24 2023-06-29 주식회사 삼양사 당전이 효소 변이체 및 이를 이용한 스테비올 배당체의 제조방법
CN115094074B (zh) * 2022-06-28 2024-02-27 诸城市浩天药业有限公司 双功能udp-糖基转移酶及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR122021005304B1 (pt) * 2010-06-02 2022-02-22 Evolva, Inc Hospedeiro recombinante que compreende genes recombinantes para produção de esteviol ou glicosídeo de esteviol, ácido nucleico, método para produzir esteviol, glicosídeo de esteviol ou composição de glicosídeo de esteviol e método para sintetizar esteviol ou glicosídeo de esteviol
CN103732753B (zh) * 2011-08-08 2018-03-30 埃沃尔瓦公司 甜菊醇糖苷类的重组生产
CA3171770A1 (en) * 2013-02-06 2014-08-14 Evolva Sa Methods for improved production of rebaudioside d and rebaudioside m
WO2015011209A1 (en) * 2013-07-23 2015-01-29 Dsm Ip Assets B.V. Diterpene production in yarrowia
CN107105734A (zh) 2014-09-19 2017-08-29 谱赛科有限责任公司 高纯度甜菊醇糖苷
WO2016073740A1 (en) * 2014-11-05 2016-05-12 Manus Biosynthesis, Inc. Microbial production of steviol glycosides
EP3577229A4 (en) 2017-02-03 2020-12-23 Codexis, Inc. MANIPULATED GLYCOSYL TRANSFERASES AND METHOD FOR STEVIOL GLYCOSIDE GLUCOSYLATION
KR102532079B1 (ko) * 2018-07-16 2023-05-12 마누스 바이오, 인크. 전체 세포 생체변환을 통한 스테비올 글리코시드의 생산
BR112021026306A2 (pt) * 2019-06-25 2022-09-06 Manus Bio Inc Enzima de glicosiltransferase dependente de uridina difosfato

Also Published As

Publication number Publication date
US20210009968A1 (en) 2021-01-14
BR112021026306A2 (pt) 2022-09-06
US11168309B2 (en) 2021-11-09
CN114174501A (zh) 2022-03-11
EP3990628A4 (en) 2023-08-02
IL289202A (en) 2022-02-01
EP3990628A1 (en) 2022-05-04
US20220090031A1 (en) 2022-03-24
CA3144658A1 (en) 2020-12-30
MX2022000150A (es) 2022-05-20
WO2020264179A1 (en) 2020-12-30
AU2020302789A1 (en) 2022-01-27
US11788070B2 (en) 2023-10-17
JP2022530706A (ja) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11788070B2 (en) Uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase enzyme
KR102532079B1 (ko) 전체 세포 생체변환을 통한 스테비올 글리코시드의 생산
US20190226000A1 (en) Diterpene production in yarrowia
JP2024040374A (ja) 高純度ステビオールグリコシド
JP2021045155A (ja) ステビオール配糖体の微生物による生成
JP7382946B2 (ja) モグロシドを含むトリテルペノイドの微生物生産
KR102540615B1 (ko) 스테비올 글리코시드의 생합성 제조 및 이를 위한 방법
KR20200133250A (ko) 고-순도 스테비올 글리코사이드
US20210246156A1 (en) High-purity steviol glycosides
KR20210125474A (ko) 고순도 스테비올 글리코사이드
KR20210129679A (ko) 고순도 스테비올 글리코사이드
CN112512337A (zh) 高纯度甜菊糖苷
WO2024010442A1 (en) High-purity steviol glycosides
KR20230112673A (ko) 글리코시드 생성물 생합성 및 회수
WO2023277680A1 (en) High-purity steviol glycosides
KR20220164469A (ko) 모그롤 및 모그로사이드의 미생물 생산

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal