JP2024505906A - Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体およびその用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は新規なＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体およびその用途に関するものであり、本発明によるＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、野生型Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼに比べてグリコシド結合生成能が向上しており、ポリケチド群および類似天然物、特に、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩポリケチド、非リボソームペプチド、フェニルプロパノイドおよびその他の芳香族天然物の配糖体生産効果を高めることができるところ、Ｃ－グリコシド化合物を構成成分とする薬物、食品添加剤、栄養補助剤などの製造に有用に活用できるであろう。

Description

本発明は、新規なＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体およびその用途に関するものであり、より詳しくはＣ－グリコシルトランスフェラーゼの活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）に位置するアミノ酸が変異して、基質炭素のグリコシル化反応が強化されたことを特徴とするＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体およびポリケチド配糖体およびフェニルプロパノイド配糖体の生産における前記変異体の用途に関するものである。
ポリケチドは様々な生物学的効能を持つ魅力的な天然物の一分類であり、日常で食品、化粧品、薬物などに様々に応用されている。ポリケチドを生合成する酵素群をポリケチド生合成酵素（ＰＫＳ）と総称するが、これらは生合成メカニズムによってタイプＩ、ＩＩおよびＩＩＩの３種類に区分される。これらのうち、タイプＩＰＫＳを通じては、マクロライド（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）系ポリケチドが生産され、タイプＩＩおよびＩＩＩでは主に芳香族ポリケチドが生産される。
薬物または栄養補助剤などのように医薬的効能を持つ物質の場合、全般的にグリコシド結合の生成を通じて非配糖体に比べて安定性、加水分解などに対する抵抗性、生体利用率などがはるかに改善された配糖体が好まれる。特に、安定したＣ－グリコシド結合は化学的にＯ－グリコシド結合に比べて安定である。しかし、大腸菌における天然物のＯ－グリコシル化（Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、いくつかの事例が報告されているが（Ｃｈｅｎ、Ｄ．；Ｃｈｅｎ、Ｒ．；Ｘｉｅ、Ｋ．；Ｄｕａｎ、Ｙ．；Ｄａｉ、Ｊ．、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ Ｃ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２０１８、５９（１９）、１８７５－１８７８）、Ｃ－グリコシル化はほとんど報告されていない。大腸菌だけでなく自然界にもＣ－グリコシル化に比べてＯ－グリコシル化について多くの報告がなされている。
代表的なＣ－グリコシド天然物としては、カルミン酸（ｃａｒｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）などがある。
カルミン酸は広く使用されている赤色の色素であり、食品、化粧品および医薬品などとして活用されている。Ｃｏｃｈｉｎｅａｌ Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ Ｃｏｃｃｕｓなどの鱗昆虫から直接抽出され、ケチャップ、イチゴミルク、キャンディーのような食品に添加されており、アイシャドウ、マニキュア、口紅などの化粧品に添加されている。しかし、コキネアル（ｃｏｃｈｉｎｅａｌ）はゆっくりと成長し、限られた領域でのみ成長し（暑くて乾燥した地域でのみ成長することができる）、生産容量を簡単に増加させにくいという商業的生産の限界を見せている。特に、抽出過程もまた非常に非効率的であるが、例えば、１ポンドのカルミン酸を生産するためには、７０、０００匹の雌コキネアルが必要である。このような状況で、カルミン酸を生産するためのより持続可能な方法の開発が必要であった。
アロエシンはアロエベラ（Ａｌｏｅ ｖｅｒａ）から抽出され、抗チロシナーゼ（ａｎｔｉ－ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）効果および抗メラニン生成効果のため、化粧品業界で美白剤として広く活用されている。それだけでなく、アロエシンは抗炎症および抗ラジカル効果を見せるので、様々な薬物または化粧品の主成分として活用できる。しかし、アロエ植物から抽出されるアロエシンの量は極微量で、より効率的で持続可能なバイオ基盤生産方法の開発が必要であった。
前記のようにＣ－グリコシド天然物に対する需要は非常に高いことに対し、その供給量は不十分であるが、これを効果的に生産できる方法に対する開発がほとんどなされていない実情であった。特に、前記化合物を生物学的工程で生産しようとしても、そのための酵素がよく明らかになっていないか、低い酵素の転換効率のため、微生物細胞工場から効率的な生産が不可能であった。
このような技術的背景の下で、本発明者らは、優れたＣ－グリコシル化能力を有するＣ－グリコシルトランスフェラーゼを開発するために鋭意努力した結果、アミノ酸の置換を通じて優れたＣ－グリコシル化能力を示すＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を開発し、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体遺伝子を導入した組換え微生物において、タイプＩ、タイプＩＩおよびタイプＩＩＩポリケチド、非リボソームペプチド、フェニルプロパノイド、芳香族天然物に対して顕著に優れたＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体の配糖体生産能を示すことを確認し、本発明を完成した。
本背景技術部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、よって、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって既知の先行技術を形成する情報を含まないこともある。
（非特許文献１）Ｃｈｅｎ、Ｄ．Ｃｈｅｎ、Ｒ．；Ｘｉｅ、Ｋ．；Ｄｕａｎ、Ｙ．；Ｄａｉ、Ｊ．、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ Ｃ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｎｅｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２０１８、５９（１９）、１８７５－１８７８
発明の要約
本発明の目的は、新規なＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体およびその用途を提供することにある。
前記目的を達成するために、
本発明は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７、Ｖ９３、Ｖ１３２、Ｙ１９３、Ｌ１６４およびＲ３２２からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に、変異を含むＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を提供する。
本発明はまた、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸を提供する。
本発明はまた、前記核酸が導入された組換え微生物を提供する。
本発明はまた、次のステップを含むポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）本発明の組換え微生物を培養してポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を生成させるステップと、
（ｂ）前記生成されたポリケチド配当体および／またはフェニルプロパノイド配当体を回収するステップ。
本発明はまた、次のステップを含むポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体または前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を発現する微生物とポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドを反応させてポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を生成させるステップと、
（ｂ）前記生成されたポリケチド配当体および／またはフェニルプロパノイド配当体を回収するステップ。
図１は、カルミン酸の生産経路を示す。
図２は、互いに異なる代謝工学戦略を導入した場合のフラボケルメス酸（ｆｌａｖｏｋｅｒｍｅｓｉｃ ａｃｉｄ）の生産量を示す。タイプＩＩＩポリケチド生合成酵素（Ａｌｏｅ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ由来ＡａＰＫＳ５）と、ＺｈｕＩＪよりもタイプＩＩポリケチド生合成酵素（Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来ＡｎｔＤＥＦＢＧ）とＺｈｕＩＪがより高い濃度のＦＫを生成した。
図３は、ＤｎｒＦの導入によるケルメス酸の生産量の変化を示す。
図４は、ｄｃＩＩ生成のための候補Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼおよび各候補酵素の元の酵素反応を示す。
図５は、９種類の酵素候補のｄｃＩＩ生産能を比較したものである。
図６は、ＫＡとｄｃＩＩ生産量を増大するためのホモロジーモデリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）およびドッキングシミュレーション（ｄｏｃｋｉｎｇ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の結果を示す。（ａ）ＤｎｒＦに対するシミュレーションを通じて選別された変異体のＫＡ生産能。（ｂ）最も効果の高いＤｎｒＦ変異体（Ｐ２１７Ｋ）に対するタンパク質構造シミュレーションの結果。（Ｃ）ＧｔＣＧＴに対するシミュレーションを通じて選別された変異体のｄｃＩＩ生産能。（ｄ）最も効果の高いＧｔＣＧＴ変異体（Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）のタンパク質構造。
図７は、グルコースからのカルミン酸の生産を示す。（ａ）互いに異なる条件でのカルミン酸の生産量。（ｂ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を通じたカルミン酸の分析。上のデータは市販のカルミン酸を分析した結果、下のデータはグルコースから大腸菌で生産されたカルミン酸含有サンプルの分析結果。左のグラフは抽出イオンクロマトグラム（ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ；ＥＩＣ）、右のグラフはＭＳ／ＭＳフラグメントパターン（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）。（Ｃ）最終株に対する流加式培養発酵グラフ。赤い矢印はＩＰＴＧを介した遺伝子発現の開始時点を示し、ＤＣＷは乾燥細胞重量を示す。
図８は、アロエシンの生産経路を示す。
図９は、大腸菌を介したアロエシンの生成を示す。（ａ）アロエソン増産のためにＲｐＡＬＳを含むさらなるプラスミドを構築してテストした結果、（ｂ）アロエシン生産のためのＧｔＣＧＴおよびその変異体テストの結果。（Ｃ）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を通じたアロエシンの分析。上のデータは市販のアロエシンを分析した結果、下のデータはグルコースから大腸菌で生産されたアロエシン含有サンプルの分析結果。左側のグラフは抽出イオンクロマトグラム、右側のグラフはＭＳ／ＭＳフラグメントパターンを示す。
図１０は、アロエシン生産量を増大するためのＧｔＣＧＴ追加変異体テストの結果を示す。追加変異体は、ＧｔＣＧＴ変異体（Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）の構造モデルを分析することで予測した。
図１１は、アロエシン生産量を増大するためのＧｔＣＧＴ追加変異体テストの結果を示す。追加変異体は、ＧｔＣＧＴ変異体（Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）をベースにドッキングシミュレーションを実施することで予測した。
図１２は、ＧｔＣＧＴ変異体（Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）によるいくつかのフェニルプロパノイドＣ－グリコシドの生産量（％転換率で表記）を示す。
図１３は、ＧｔＣＧＴおよびＧｔＣＧＴ変異体（Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）のＫＭとＶｍａｘ値を計算するためのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを示す。
他の式で定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で使用された命名法は、本技術分野で周知であり、かつ通常使用されるものである。
本発明では、野生型酵素に比べてグリコシド結合生成能が著しく改善されたＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を発掘するためにタンパク質構造を予測し、タンパク質構造分析とコンピュータシミュレーションを通じて活性が増大した変異候補群を導出し、これらのうち、特に基質結合性が向上し、グルコシル化反応を強化できる効果的な変異体を選別することができた。
したがって、本発明は一観点から、Ｃ－グリコシル化能力が向上したＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体に関するものである。
本発明において、本発明の変異体の鋳型（または野生型）となるＣ－グリコシルトランスフェラーゼは、基質（例えば、化合物、タンパク質など）の炭素にＣ－グリコシド結合を形成してＣ－グリコシル化を誘導する酵素を意味する。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼは配列番号１で表したが、これに限定されるものではなく、特定のアミノ酸残基位置で、アミノ酸残基が保存的に置換されたタンパク質を含む意味として解釈されなければならない。
本明細書において、「保存的置換」とは、１つ以上のアミノ酸を、Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼまたはその変異体の生物学的または生化学的機能の喪失をもたらさない類似の生化学的特性を有するアミノ酸に置換することを含むＣ－グリコシルトランスフェラーゼの変形を意味する。
本発明の「保存的アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸残基を類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換える置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基部類は、当該技術分野に規定されており、周知である。これらの部類は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラジン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐された側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
したがって、本発明の変異体の鋳型となるＣ－グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１だけでなく、これと実質的に同じ機能および／または効果を有し、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、好ましくは８０％以上または８５％以上で、さらに好ましくは９０％以上９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸配列相同性を有するＣ－グリコシルトランスフェラーゼ、組換えＣ－グリコシルトランスフェラーゼおよびその断片をすべて含む意味と解釈される。
本発明の「断片」という用語は、親タンパク質が切断された一部の断片を意味し、Ｃ’－末端および／またはＮ’－末端が切断されたものであり得る。本発明において、前記切片は、本発明の脱糖化したＣ－グリコシルトランスフェラーゼと実質的に同じ機能および／または効果を有する切片を意味する。例えば、前記切片は、全長タンパク質において信号配列が切断された断片を含むことができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼは、配列番号１で表されるＧｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ由来ＧｔＵＦ６ＣＧＴの他にも、他の株または他の生物に由来し得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ由来のＩｒｏＢ（ＥｎＣＧＴ）。Ｚｅａ ｍａｙｓ由来ＵＧＴ７０８Ａ６（ＺｍＣＧＴ） ｄｕａｌ Ｃ／Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ由来ＵＧＴ７０８Ｃ２（ＦｅＣＧＴ）、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ由来ＭｉＣＧＴ；Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ＯｓＣＧＴ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ由来ＵＧＴ７０８Ｄ１（ＧｍＣＧＴ）、Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ由来ＧｔＵＦ６ＣＧＴ１（ＧｔＣＧＴ）、Ａｌｏｅ ｖｅｒａ由来のＡｖＣＧＴであり得り、好ましくは、Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ由来ＧｔＵＦ６ＣＧＴ１（ＧｔＣＧＴ）またはＺｅａ ｍａｙｓ由来ＵＧＴ７０８Ａ６（ＺｍＣＧＴ） ｄｕａｌ Ｃ／Ｏ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅであり得るが、これに限定されるものではない。
本発明の一実施形態において、野生型Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸の一部を置換して変異体を生成する場合、顕著に優れたＣ－グリコシル化誘導能力を示し、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼをポリケチド合成用の組換え株に導入する場合、Ｃ－糖化されたポリケチドを著しい収率で製造できることを確認した。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７、Ｖ９３、Ｖ１３２、Ｙ１９３、Ｌ１６４およびＲ３２２からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に変異を含むことを特徴とすることができ、より好ましくは、Ｖ９３および／またはＹ１９３のアミノ酸に変異を含むことを特徴とすることができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７、Ｖ９３、Ｖ１３２、Ｙ１９３、Ｌ１６４およびＲ３２２からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸以外にも、１つ以上の他のアミノ酸に変異を含むことを特徴とすることができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７、Ｖ４０５、Ｐ１０７、Ｌ２０８、Ｌ１６４、Ｐ４５、Ｉ３０５、Ｌ３１６、Ｆ４０１、Ｙ９４、Ｎ５７、Ｙ１８７、Ｃ１６、Ｐ３１９、Ｆ１６７、Ｖ１３２、Ｎ２０６、Ｒ４０６、Ｑ３８６、Ｖ１２９、Ｌ１２５、Ｌ１９４、Ｉ９５、Ｓ２１５、Ｌ１８４、Ｙ１５８、Ｌ２９、Ｌ２７、Ｆ２０２、Ｈ１５９、Ｓ３７０、Ｈ３６５、Ｖ３２９、Ｍ３０１、Ｖ３１５、Ｖ１９０、Ｃ３６６、Ｗ８０、Ｌ５８、Ｑ２１０、Ｆ３１２、Ｄ６１、Ｉ２０７、Ｌ３６３、Ｐ１９６、Ｌ１０６、Ｖ９３、Ａ３９４、Ｗ３１４、Ｓ１５５、Ｐ８８、Ｄ９９、Ｙ２８４、Ｅ１８９、Ｇ４９、Ｈ３２８、Ｅ３９９、Ｔ３９２、Ｆ３８７、Ａ４４、Ｐ１９９、Ｅ４６、Ｒ２８、Ｖ２８５、Ｉ１２４、Ｒ４１９、Ｌ３０６、Ｙ１５７、Ｙ２００、Ｅ３７３、Ｐ１９１、Ｌ２１４、Ｓ３７６、Ｖ１５、Ｅ３３２、Ｅ５１、Ｉ４１７、Ｌ９８、Ｉ３２３、Ｈ１６１、Ｔ３８３、Ｐ１２７、Ｅ３０９、Ｎ８４、Ｌ３１３、Ｑ１０４、Ｔ３７１、Ｎ２１３、Ｇ７９、Ｌ３３０、Ｎ３０７、Ｋ１０５、Ｌ１２８、Ａ１５２、Ｉ１８、Ｎ５９、Ｗ１４７、Ｓ８６、Ｌ２９３、Ｅ２９６、Ｓ３７７、Ｌ１８５、Ｋ２１６、Ｆ８９、Ｓ２８６、Ｆ３９６、Ｆ２１１、Ｙ３０３、Ｄ２２３、Ｒ４１５、Ｎ９６、Ｖ２２、Ｓ１５３、Ｆ１５４、Ｄ１９２、Ｙ１９３、Ｈ１９５、Ｐ２０１、Ｙ２９２、およびＲ３２２からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に変異をさらに含むことができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｉ１８、Ｑ２０、Ｔ５０、Ｉ９５、Ｖ２９０、Ｉ３２３、Ｖ２２、Ｌ２９、Ｅ４６、Ｖ４８、Ｅ５１、Ａ５５、Ｓ８６、Ｄ９９、Ｒ１０３、Ｃ１５１、Ｌ１８４、Ｌ１９４、Ｅ３３２およびＰ３８５からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に変異をさらに含むことができる。
本発明において、好ましくは、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｉ３２３、Ｔ５０、Ｉ１８、Ｉ９５、Ｑ２０、Ｐ３８５、Ｌ１９４、Ｖ４８からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に変異をさらに含むことができる。
本発明の「変異体」という用語は、参照配列（正常Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ配列例、配列番号１）のアミノ酸配列において、一部のアミノ酸残基の変異、好ましくはアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入、より好ましくは、アミノ酸残基の置換を含むだけでなく、そのようなアミノ酸残基の置換、欠失および／または挿入と共に、Ｎ－末端またはＣ－末端における一部のアミノ酸残基の欠失が起こったことをすべて含む概念として使用される。本発明の一実施形態において、前記変異体は配列番号１の一部のアミノ酸を置換して製造したが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記「変異」はアミノ酸の置換であることを特徴とすることができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７Ｇ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ１３２Ａ、Ｙ１９３Ｆ、Ｌ１６４ＧおよびＲ３２２Ｄからなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とすることができ、より好ましくは、Ｖ９３Ｑおよび／またはＹ１９３Ｆ、最も好ましくは、Ｖ９３ＱおよびＹ１９３Ｆのアミノ酸置換を含むことを特徴とすることができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７Ｇ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ１３２Ａ、Ｙ１９３Ｆ、Ｌ１６４ＧおよびＲ３２２Ｄからなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換以外にも、１つ以上の他のアミノ酸の置換をさらに含むことを特徴とすることができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｖ９３ＱおよびＹ１９３Ｆアミノ酸置換以外にも、１つ以上の他のアミノ酸の置換をさらに含むことを特徴とすることができる。
本発明において、前記さらに含むことができる他のアミノ酸の置換は、Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｆ１７Ｇ、Ｖ４０５Ｍ、Ｐ１０７Ｇ、Ｌ２０８Ｇ、Ｌ１６４Ｇ、Ｐ４５Ｇ、Ｉ３０５Ａ、Ｌ３１６Ｇ、Ｆ４０１Ｈ、Ｙ９４Ｇ、Ｎ５７Ｇ、Ｙ１８７Ａ、Ｃ１６Ｇ、Ｐ３１９Ｇ、Ｆ１６７Ｇ、Ｖ１３２Ａ、Ｎ２０６Ｅ、Ｒ４０６Ｇ、Ｑ３８６Ｈ、Ｖ１２９Ａ、Ｌ１２５Ｖ、Ｌ１９４Ａ、Ｉ９５Ｇ、Ｓ２１５Ｄ、Ｌ１８４Ｇ、Ｙ１５８Ｔ、Ｌ２９Ａ、Ｌ２７Ａ、Ｆ２０２Ｓ、Ｈ１５９Ｇ、Ｓ３７０Ａ、Ｈ３６５Ｇ、Ｖ３２９Ｔ、Ｍ３０１Ｗ、Ｖ３１５Ａ、Ｖ１９０Ａ、Ｃ３６６Ｇ、Ｗ８０Ｙ、Ｌ５８Ｅ、Ｑ２１０Ｇ、Ｆ３１２Ｇ、Ｄ６１Ｇ、Ｉ２０７Ｐ、Ｌ３６３Ｇ、Ｐ１９６Ｇ、Ｌ１０６Ｇ、Ｖ９３Ｇ、Ａ３９４Ｇ、Ｗ３１４Ｃ、Ｓ１５５Ａ、Ｐ８８Ｄ、Ｄ９９Ｇ、Ｙ２８４Ｈ、Ｅ１８９Ａ、Ｇ４９ＴＨ３２８Ｇ、Ｅ３９９Ｄ、Ｔ３９２Ａ、Ｆ３８７Ｔ、Ａ４４Ｇ、Ｐ１９９Ｅ、Ｅ４６Ｇ、Ｒ２８Ｇ、Ｖ２８５Ｉ、Ｉ１２４Ｔ、Ｒ４１９Ａ、Ｌ３０６Ｍ、Ｙ１５７Ｔ、Ｙ２００Ｌ、Ｅ３７３Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ１９１Ｇ、Ｌ２１４Ａ、Ｓ３７６Ｇ、Ｖ１５Ｇ、Ｅ３３２Ｐ、Ｅ５１Ｃ、Ｉ４１７Ｌ、Ｌ９８Ｇ、Ｉ３２３Ａ、Ｈ１６１Ｇ、Ｔ３８３Ｃ、Ｐ１２７Ａ、Ｅ３０９Ｎ、Ｎ８４Ｓ、Ｌ３１３Ｔ、Ｑ１０４Ｄ、Ｔ３７１Ａ、Ｎ２１３Ｌ、Ｇ７９Ｓ、Ｌ３３０Ｇ、Ｎ３０７Ａ、Ｋ１０５Ｇ、Ｌ１２８Ｄ、Ａ１５２Ｇ、Ｓ１５３Ｇ、Ｉ１８Ａ、Ｎ５９Ｖ、Ｗ１４７Ｆ、Ｓ８６Ｖ、Ｌ２９３Ｖ、Ｅ２９６Ｄ、Ｓ３７７Ａ、Ｌ１８５Ｖ、Ｋ２１６Ｒ、Ｆ８９Ａ、Ｓ２８６Ｃ、Ｆ３９６Ｌ、Ｆ２１１Ｇ、Ｙ３０３Ａ、Ｄ２２３Ｇ、Ｒ４１５Ｌ、Ｎ９６Ａ、Ｖ２２Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｌ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｌ、Ｄ１９２Ｓ、Ｙ１９３Ｆ、Ｈ１９５Ｙ、Ｈ１９５Ｌ、Ｐ２０１Ｔ、Ｙ２９２Ｈ、Ｙ２９２Ｆ、Ｒ３２２ＤおよびＲ３２２Ａからなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換であることを特徴とすることができる。
発明において、前記さらに含むことができる他のアミノ酸の置換は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｉ１８Ｐ、Ｑ２０Ｍ、Ｔ５０Ｎ、Ｔ５０Ｑ、Ｔ５０Ｋ、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｖ、Ｉ９５Ｍ、Ｉ９５Ｔ、Ｖ２９０Ｇ、Ｖ２９０Ａ、Ｉ３２３Ｓ、Ｉ３２３Ａ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ２２Ａ、Ｌ２９Ａ、Ｅ４６Ｇ、Ｖ４８Ｇ、Ｅ５１Ｃ、Ａ５５Ｓ、Ｓ８６Ｖ、Ｄ９９Ｇ、Ｒ１０３Ｖ、Ｃ１５１Ｇ、Ｌ１８４Ｇ、Ｌ１９４Ａ、Ｅ３３２Ｐ、Ｉ１８ＡおよびＰ３８５Ａからなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換であることを特徴とすることができる。
本発明において、好ましくは、前記さらに含むことができる他のアミノ酸の置換は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｉ３２３Ｓ、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｖ、Ｉ１８Ｐ、Ｉ９５Ｔ、Ｑ２０Ｍ、Ｉ３２３Ａ、Ｐ３８５Ａ、Ｌ１９４ＡおよびＶ４８Ｇからなる群でから選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸の置換であることを特徴とすることができる。
本発明の一実施形態において、
ｉ）配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｖ９３ＱおよびＹ１９３Ｆアミノ酸置換、
ｉｉ）配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｖ９３Ｑ、Ｙ１９３ＦおよびＩ３２３Ｓアミノ酸置換、または
ｉｉｉ）配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、Ｖ９３Ｑ、Ｙ１９３ＦおよびＰ３８５Ａアミノ酸置換を含むＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体が最も優れたＣ－グリコシル化を示すことを確認したが、これに限定されるものではない。
アミノ酸変異のアミノ酸残基の前記位置は、参照として配列番号１で表されるアミノ酸配列を使用して正確に残基を番号付けることができ、ここで「残基Ｘｎ（ｒｅｓｉｄｕｅ Ｘｎ）」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において位置ｎに対応する残基Ｘを表し、ｎは正の整数であり、Ｘは任意のアミノ酸残基の略語である。例えば、「残基Ｖ９３」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において位置９３に対応するアミノ酸残基Ｖを指す。
本発明において、「アミノ酸変異」は、「アミノ酸置換Ｘｎ（ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｘｎ）」であってもよく、一態様として配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、位置ｎのアミノ酸残基Ｘで発生するアミノ酸置換を意味し、ここで、ｎは正の整数であり、Ｘは任意のアミノ酸残基の略語である。例えば、「アミノ酸置換Ｖ９３」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の位置９３に対応するアミノ酸残基Ｖで生じるアミノ酸置換を意味する。
本発明において、参照配列として用いられる配列番号１のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ以外の他のアミノ酸配列を有するＣ－グリコシルトランスフェラーゼを参照配列として用いる場合、配列番号１を参照して記載された特定のアミノ酸残基に「対応する」アミノ酸残基は、一般的に、最適化条件下でアミノ酸配列のアライメントによって得られる。前記配列アラインメントは、当業者が、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＮＥＥＤＬＥまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して理解する手段によって行われ得る。当業者は、比較される全長配列において最適なアライメントを達成することに必要な任意のアルゴリズムを含めて、アライメントに使用するための適切なパラメータを決定することができる。
本発明のアミノ酸置換は、非保存的置換（ｎｏｎ－ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）であり得る。前記非保存的置換は、例えば、特定の側鎖サイズまたは特定の特性（例えば、親水性）を有するアミノ酸残基を、異なる側鎖サイズまたは異なる特性（例えば、疎水性）を有するアミノ酸残基に置き換えるような非保存的方法で、標的タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基を変更することを含むことができる。
前記アミノ酸置換はまた、保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）であり得る。前記保存的置換は、例えば、特定の側鎖サイズまたは特定の特徴（例えば、親水性）を有するアミノ酸残基を同一または類似の側鎖サイズまたは同一または類似の特性（例えば、依然として親水性）を有するアミノ酸残基に置き換えることのように、保存的方法で標的タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸残基を変更することを含むことができる。このような保存的置換は、一般的に生成されたタンパク質の構造または機能に大きな影響を及ぼさない。本出願において、融合タンパク質の突然変異であるアミノ酸配列変異体、その断片、または１つ以上のアミノ酸が置換された変異体は、タンパク質の構造または機能を著しく変化させない保存的アミノ酸置換を含むことができる。
例えば、以下の各グループにおけるアミノ酸間の相互置換（ｍｕｔｕａｌ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）は、本出願において保存的置換と見なすことができる。
非極性側鎖を有するアミノ酸基：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニン。
極性側鎖を有する非荷電アミノ酸基：グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン。
極性側鎖を有する負電荷アミノ酸基：アスパラギン酸およびグルタミン酸。
正電荷を帯びた塩基性アミノ酸基：リジン、アルギニンおよびヒスチジン。
フェニルを有するアミノ酸基：フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
本発明に含まれたタンパク質、ポリペプチドおよび／またはアミノ酸配列はまた、少なくとも以下の範囲を含むと理解することができる：前記タンパク質またはポリペプチドと同一または類似の機能を有する変異体または相同体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）。
本発明において、前記変異体は、野生型Ｃ－グリコシル化トランスフェラーゼのアミノ酸配列に比べて、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失または添加によって生成されたタンパク質またはポリペプチドであり得る。例えば、前記機能的変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、欠失および／または挿入、例えば１～３０、１～２０または１～１０、代案的に、例えば、１、２、３、４、または５アミノ酸の置換、欠失および／または挿入によるアミノ酸変化を有するタンパク質またはポリペプチドを含むことができる。前記機能的変異体は、変化（例えば、置換、欠失または添加）の前に前記タンパク質または前記ポリペプチドの生物学的特性を実質的に保持することができる。例えば、前記機能的変異体は、変更前に前記タンパク質または前記ポリペプチドの生物学的活性の６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％以上を保持することができる。
本発明において、前記相同体は、前記タンパク質および／または前記ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の配列相同性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。
本発明において、前記相同性は、一般的に、２つ以上の配列間の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）、有意性（ａｎａｌｏｇｏｕｓｎｅｓｓ）、または関連性（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を指す。「配列相同性百分率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、同じ核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同じアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が存在する位置の数を決定する比較ウィンドウで整列された２つの配列を比較する方法によって計算されることができ、比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）の一致する位置の数を提供するために、一致する位置の数を総位置数で分け、結果に１００を乗じて配列相同性の百分率を提供する。配列相同性の百分率を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業界に知られている様々な方法で実施することができる。当業者は、比較される全長配列内または標的配列領域内で最大アラインメントを達成することに必要な任意のアルゴリズムを含めて、配列アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。前記相同性はまた、以下の方法によって決定することができる：ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、例えば、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ’ｓ ’’Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ’’、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８５：２４４４－２４４８、１９８８；およびＤ、Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ ａｎｄ Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ’’Ｆａｓｔ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｅａｒｃｈ’’、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７：１４３５－１４４１、１９８９に開示されており、ＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する説明は、Ｓ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｗ．Ｇｉｓｈ、Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｅ．Ｗ．Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｄ．Ｌｉｐｍａｎ、’’Ａ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ’’、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２１５：４０３－４１０、１９９０を参照できる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、野生型に比べて基質炭素のグリコシル化反応を強化させることを特徴とすることができる。
本発明において、前記変異されたアミノ酸は、酵素の活性部位に位置し、前記アミノ酸に変異を通じて変異体の基質結合力が野生型に比べて１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上向上したことを特徴とすることができる。
本発明の一実施形態において、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を用いる場合、様々なポリケチド系化合物（フラボケルメス酸、ケルメス酸、アロエゾン）、またはフェニルプロパノイド系化合物（ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、またはルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）を基質として、基質の種類にかかわらず野生型に比べて著しく高いＣ－グリコシル化を示すことができることを確認した。したがって、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、様々な化合物、タンパク質を基質として、前記基質をＣ－グリコシル化するための用途として用いることができる。例えば、前記ポリケチド系化合物またはフェニルプロパノイド系化合物のＣ－グリコシル化に用いられることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記基質は、ポリケチドまたはフェニルプロパノイド系化合物を制限なく使用可能であり、好ましくは一実施形態で確認したように、フラボケルメス酸、ケルメス酸、アロエゾン、ナリンゲニン、アピゲニン、またはルテオリンであってもよいが、これに限定されるものではない。
前記基質は、好ましくはフラボケルメス酸またはケルメス酸であり、前記変異体は前記フラボケルメス酸の第２炭素をグリコシル化させることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
前記基質は好ましくはアロエゾンであり、前記変異体は前記アロエゾンの第８炭素をグリコシル化することを特徴とすることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明は、他の観点から、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸に関するものである。
また別の観点から、本発明は、前記核酸を含むベクターに関するものである。
また別の観点から、本発明は、前記核酸が導入された組換え微生物に関するものである。
本発明において、前記組換え微生物には、宿主微生物に前記核酸がプラスミド形態で導入されているか、またはゲノムに挿入されていることを特徴とすることができる。
本発明において、前記組換え微生物は、ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体生産用であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記組換え微生物は、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの基質として、ポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドを生産する能力を有することを特徴とすることができ、前記ポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドは、本発明の組換え微生物が発現するＣ－グリコシルトランスフェラーゼによって糖化され、ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体に転換され得ることができる。
本発明において、前記ポリケチドは、
ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、三酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｌａｃｔｏｎｅ）、および６－メチルサリチル酸（６－ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択されるタイプＩポリケチドと、
アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、イプシロン・ロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ－ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、カルミン酸（ｃａｒｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）およびフレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）からなる群から選択されるタイプＩＩポリケチドと、
アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５、７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン（５、７－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－２－ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなる群から選択されるタイプＩＩＩポリケチドとからなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、前記フェニルプロパノイドは、
アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、テイクソバクチン（ｔｅｉｘｏｂａｃｔｉｎ）、チロシジン（ｔｙｒｏｃｉｄｉｎｅ）、グラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）、ズウィッターマイシンＡ（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ Ａ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、ピオベルジン（ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ）、エンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）、ミクソケリンＡ（ｍｙｘｏｃｈｅｌｉｎ Ａ）、インジゴイジン（ｉｎｄｉｇｏｉｄｉｎｅ）、シアノフィシン（ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ）などからなる非リボソームペプチド、ピノセンブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ジヒドロケンペロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、エリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロクェルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、コニフェリルアルコール（ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、シリビニン（ｓｉｌｙｂｉｎ）、イソシリビン（ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ）、シリクリスチン（ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ）、シリナイド（ｓｉｌｉｎｉｄｅ）、２、３－ジヒドロシリビン（２、３－ｄｅｈｙｄｒｏｓｉｌｙｂｉｎ）、シリジアニン（ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、ケンペロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、クェルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、シアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、アフゼレチン（ａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ヘスペレチン（ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、タンゲレチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）およびナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、前記宿主微生物は、生産しようとするポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体の生産能を有することを特徴とすることができる。
本発明において、前記ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体は、ポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドであってもよく、好ましくは糖化されていないポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドであってもよい。
本発明において、前記宿主微生物は、先天的に前記ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体を生成するか、または遺伝子操作により、ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体を生成するように製造された組換え微生物であることを特徴とすることができる。
本発明において、前記組換え微生物は、導入されたＣ－グリコシルトランスフェラーゼによる配糖体の転換率を向上させるために、ヌクレオチド、好ましくは、ＮＴＰ－糖（ＮＴＰ－ｓｕｇａｒ）の生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明の組換え微生物は、ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＵＴＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）および／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子の発現が強化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、宿主株によって、ＮＴＰ－糖の生成に関与する遺伝子の発現が増強されることを特徴とすることができる。
本発明の一実施形態において、前記ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体として、フラボケルメス酸、ケルメス酸、アロエゾン、ナリンゲニン、アピゲニンまたはルテオリンを使用したが、これに限定されるものではなく、前記記載の様々なポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体は当業界に自明に公知されているので、これから容易に選択することができる。
本発明の「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」という用語は、一般的に、自然環境から単離または人工的に合成された単離された形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチド、または任意の長さのこれらの類似体を意味する。本発明の核酸は単離することができる。例えば、これは以下の方法で生産または合成することができる。（ｉ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のようなインビトロ増幅、（ｉｉ）クローン組換え、（ｉｉｉ）精製、例えば制限酵素分解による分別（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）およびゲル電気泳動、または（ｉｖ）合成、例えば化学的合成。一部の具体例において、前記単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術によって製造された核酸分子である。本発明において、前記変異体をコードする核酸は、当業界に公知された様々な方法によって製造され得る。このような方法は、制限断片作業または合成オリゴヌクレオチドを使用するオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｈｉｏｎ ＰＣＲ）を含むが、これに限定されるものではない。製造方法と原理は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ、１９９３で確認することができる。
本発明の「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」という用語は、ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）と相互交換的に使用することができ、一般的に挿入された核酸を宿主細胞（これは宿主微生物を含む）に伝達し、宿主細胞や微生物において自己複製が可能な核酸分子を指す。前記ベクターは、主にＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するために使用されるベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡ複製に使用されるベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳発現に主に使用されるベクターを含むことができる。前記ベクターはまた、複数の機能を有するベクターを含む。前記ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたとき、ポリペプチドに転写および翻訳することができるポリヌクレオチドであってもよい。一般的に、前記ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することによって、前記ベクターは所望の発現生成物を生産することができる。本発明において、前記ベクターは、前記核酸のうち１つ以上を含むことができる。例えば、前記ベクターは、前記変異体をコードするのに必要なすべての核酸分子を含むことができる。この場合、本出願の融合タンパク質を得るために、１つのベクターのみが必要である。一部の具体例において、前記ベクターは、前記変異体の一部をコードする核酸分子を含むことができる。代案的に、前記ベクターは、例えば、前記組換え微生物における遺伝子発現を調節するための核酸分子を含むことができる。このとき、本発明の組換え微生物を得るためには、２つ以上の互いに異なるベクターが必要となる場合がある。
また、前記ベクターは、適切な宿主細胞および適切な条件下でベクターを選択するマーカー遺伝子のような他の遺伝子を含むことができる。さらに、前記ベクターは、適切な宿主においてコード領域が適切に発現されるようにする発現制御要素（ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むこともできる。このような制御要素は、当業者に周知である。例えば、これらは、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサーおよび遺伝子転写またはｍＲＮＡ翻訳を調節する他の制御要素を含むことができる。一部の具体例において、前記発現調節配列は調節要素（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）である。前記発現調節配列の特定の構造は、種または細胞型の機能に応じて変わり得るが、一般的に、ＴＡＴＡボックス、キャップ化配列（ｃａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、ＣＡＡＴ配列などのような転写および翻訳の開始に関与する５’非転写配列ならびに、５’および３’非翻訳配列を含む。例えば、５’非転写発調節配列は、プロモーター領域を含むことができ、プロモーター領域は機能的に連結された核酸の転写調節のためのプロモーター配列を含むことができる。本発明において、前記ベクターは、ｐＥＴ－３０ａ－ｃ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ－１、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ、ｐＳＣ１０１、ｐＴａｃ１５Ｋ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ－１およびｐＢＲ３２２からなる群から選択することができるが、これに限定されるものではなく、通常の技術者は、前記ベクター以外にも、本技術分野で通常用いられるベクターを適宜選択して使用することができる。
本発明の「宿主細胞」、「細胞」、「宿主微生物」および「宿主」という用語は、相互交換的に使用することができ、一般的に、本発明の核酸を含むか、または含むことができるプラスミド、またはベクター、または本発明の変異体または発現が調節されるタンパク質やポリペプチドを発現できる個別細胞、細胞株、微生物または細胞培養物を指す。前記宿主細胞は単一宿主細胞の子孫を含むことができる。自然的、偶発的（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ）、または故意的（ｄｅｌｉｂｅｒａｔｅ）な突然変異により、子孫細胞と元の母細胞は、本発明の目的タンパク質やポリペプチドを発現することができる限り、形態やゲノムが必ずしも完全に同一ではない。前記宿主細胞は、本発明のベクターでインビトロ細胞を形質感染させることによって得ることができる。前記宿主細胞は、好ましくは微生物であってもよく、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、マンヘイミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）、アクチノバシラス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シアノバクテリウム（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびシクロバクテリウム（Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択されることができるが、これに限定されるものではない。
一方、本発明では、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を発現できる組換え微生物を用いて、様々なポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体を効果的に生産できることを確認した。
したがって、本発明はさらに別の観点から、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸が導入されたポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物に関するものである。
本発明において、前記ポリケチド配糖体はタイプＩポリケチド配糖体、タイプＩＩポリケチド配糖体、またはタイプＩＩＩポリケチド配糖体であってもよい。
本発明において、前記ポリケチドは、
ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、三酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｌａｃｔｏｎｅ）、および６－メチルサリチル酸（６－ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択されるタイプＩポリケチドと、
アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、イプシロン・ロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ－ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、カルミン酸（ｃａｒｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）およびフレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）からなる群から選択されるタイプＩＩポリケチドと、
アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５、７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン（５、７－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－２－ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなる群から選択されるタイプＩＩＩポリケチドとからなる群から選択されることを特徴とすることができるが、これらに限定されるものではない。
本発明において、前記ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物は、各配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。例えば、前記組換え微生物は、各配糖体の前駆体であるポリケチドまたはフェニルプロパノイドを生成することを特徴とすることができる。
本発明において、前記ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物は、さらなる遺伝子の導入によってポリケチドまたはフェニルプロパノイドを生産することを特徴とすることができる。遺伝子の導入によるポリケチド合成能を有する組換え微生物は、例えば、本発明者らの公開論文であるＹａｎｇ、Ｄ．、Ｋｉｍ、Ｗ．Ｊ．、Ｙｏｏ、Ｓ．Ｍ．、Ｃｈｏｉ、Ｊ．Ｈ．、Ｈａ、Ｓ．Ｈ．、Ｌｅｅ、Ｍ．Ｈ．、ａｎｄ Ｌｅｅ、Ｓ．Ｙ．"Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｓ ａ ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ"、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＰＮＡＳ）、１１５ （４０） ９８３５－９８４４ （ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８０８５６７１１５） （２０１８．１０．２）および韓国登録特許第１０－２１８７６８２号に記載の遺伝子および方法により製造可能であるが、これに限定されるものではない。通常の技術者は、当業界に記載の様々なポリケチドまたはフェニルプロパノイドの合成経路およびそれに関与する遺伝子を用いて様々な宿主微生物に導入することにより、ポリケチドまたはフェニルプロパノイド合成能を有する組換え微生物を製作することができる。
本発明において、前記ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物は、ポリケチド合成酵素またはフェニルプロパノイド合成酵素が導入されたことをさらなる特徴とすることができる。
本発明において、前記ポリケチド合成酵素は、例えば、タイプＩポリケチド合成酵素、タイプＩＩポリケチド合成酵素、またはタイプＩＩＩポリケチド合成酵素であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物が各配糖体の前駆体を生産しない場合、培養培地に各配糖体の前駆体を添加して前記ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体を生成することができる。
本発明において、前記組換え微生物は、タイプＩポリケチド配糖体の生産用であることを特徴とすることができる。
本発明において、前記タイプＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、タイプＩポリケチド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。例えば、タイプＩポリケチド配糖体の前駆体は、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記タイプＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、さらなる遺伝子の導入によってタイプＩポリケチド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。
本発明において、前記タイプＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、例えば、
（ｉ）タイプＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子がさらに導入されたことを特徴とすることができる。
本発明において、前記タイプＩポリケチド生合成酵素は、様々なタンパク質および遺伝子データベースから容易に選択することができる。
したがって、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸およびタイプＩポリケチド生合成酵素遺伝子が導入される宿主微生物は、補酵素Ａ、好ましくはマロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡの生産能を有することを特徴とすることができる。
したがって、本発明において、前記組換え微生物は、補酵素Ａの生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉ）ｐａｂＡ遺伝子の発現が抑制または弱化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、当業界で公知の様々な補酵素Ａの大量生産戦略を用いて補酵素Ａの生産が強化された組換え微生物を製造することができる。
本発明において、前記組換え微生物は、導入されたＣ－グリコシルトランスフェラーゼによる配糖体の転換率を向上させるために、ヌクレオチド、好ましくは、ＮＴＰ－糖の生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉｉ）ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記組換え微生物は、タイプＩＩポリケチド配糖体の生産用であることを特徴とすることができる。例えば、前記タイプＩＩポリケチド配糖体はカルミン酸であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記タイプＩＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、タイプＩＩポリケチド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。例えば、タイプＩＩポリケチド配糖体の前駆体はフラボケルミン酸またはケルミン酸であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記タイプＩＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、さらなる遺伝子の導入によってタイプＩＩポリケチド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。
本発明において、前記タイプＩＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、（ｉ）タイプＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子がさらに導入されたことを特徴とすることができる。
本発明において、前記タイプＩＩポリケチド配糖体、好ましくは、カルミン酸の生産用組換え微生物は、例えば、
（ｉ）タイプＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子と、
（ｉｉ）４’－ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４’－ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子と、
（ｉｉｉ）シクラーゼ（ｃｙｃｌａｓｅ）をコードする遺伝子と、
（ｉｖ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子と、
（ｖ）アクラビネオン１２－水酸化酵素（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ １２－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子であって、構成された群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子がさらに導入されることを特徴とすることができ、好ましくは、前記遺伝子が全て導入されることを特徴とすることができる。
図１に示すように、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの基質であるタイプＩＩポリケチドは、例えば、マロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡのような補酵素Ａ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ－ＣｏＡ）から前記導入された遺伝子がコードする酵素によって、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの基質であるタイプＩＩポリケチドに変換され得る。したがって、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸およびタイプＩＩポリケチド生合成酵素遺伝子または前記（ｉ）～（ｖ）の遺伝子が導入される宿主微生物は、補酵素Ａ、好ましくはマロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡの生産能を有することを特徴とすることができる。
本発明の実施形態において、ｐａｂＡ遺伝子の発現抑制または弱化によって補酵素Ａが蓄積され、結果的に、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの前駆体であるポリケチドの合成が向上することを確認した。
したがって、本発明において、前記組換え微生物は、補酵素Ａの生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉ）ｐａｂＡ遺伝子の発現が抑制または弱化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、当業界で公知の様々な補酵素Ａの大量生産戦略を用いて補酵素Ａの生産が強化された組換え微生物を製造することができる。
本発明において、前記組換え微生物は、導入されたＣ－グリコシルトランスフェラーゼによる配糖体の転換率を向上させるために、ヌクレオチド、好ましくは、ＮＴＰ－糖の生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉｉ）ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、宿主株によって、ＮＴＰ－糖の生成に関与する遺伝子の発現が増強されることを特徴とすることができる。
本発明において、前記ＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子は、ａｎｔＤ（ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ）、ａｎｔＥ（ｃｈａｉｎ－ｌｅｎｇｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ａｎｔＦ（ＡＣＰ）、ａｎｔＢ（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）およびａｎｔＧ（ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ：ＡＣＰ ｍａｌｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子またはそれらの組み合わせであることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記アクラビネオン１２－水酸化酵素は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、２１７番目のアミノ酸がプロリンからリジンへの変異（Ｐ２１７Ｋ）を含むことを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記タイプＩＩポリケチド生合成酵素は、Ｐ．ルミネッセンス由来、
前記４’－ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来、
前記シクラーゼはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来、
前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来、および／または
前記アクラビネオン１２－水酸化酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ由来であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記組換え微生物は、タイプＩＩＩポリケチド配糖体の生産用であることを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記タイプＩＩＩポリケチド配糖体はアロエシンであることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記タイプＩＩＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、タイプＩＩＩポリケチド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。例えば、タイプＩＩＩポリケチド配糖体の前駆体はアロエゾンであることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記タイプＩＩＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、さらなる遺伝子の導入によってタイプＩＩＩポリケチド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。
本発明において、タイプＩＩＩポリケチド配糖体の生産用組換え微生物は、例えば、
（ｉ）タイプＩＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子が導入されたことを特徴とすることができる。例えば、前記タイプＩＩＩポリケチド生合成酵素は、アロエゾン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記アロエゾン合成酵素は、Ｒ．ｐａｌｍａｔｕｍ由来であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
図８に示すように、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの基質であるタイプＩＩＩポリケチド（例えば、アロエゾン）は、例えば、マロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡのような補酵素Ａ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ－ＣｏＡ）から前記導入された遺伝子がコードする酵素により、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの基質であるタイプＩＩＩポリケチドに変換され得る。したがって、Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸、およびタイプＩＩＩポリケチド生合成酵素遺伝子が導入される宿主微生物は、補酵素Ａ、好ましくはマロニルＣｏＡまたはアセチルＣｏＡの生産能を有することを特徴とすることができる。
したがって、本発明において、前記組換え微生物は、補酵素Ａの生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉ）ｐａｂＡ遺伝子の発現が抑制または弱化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、当業界で公知の様々な補酵素Ａの大量生産戦略を用いて、補酵素Ａの生産が強化された組換え微生物を製造することができる。
本発明において、前記組換え微生物は、導入されたＣ－グリコシルトランスフェラーゼによる配糖体の転換率を向上させるために、ヌクレオチド、好ましくは、ＮＴＰ－糖の生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、宿主株によって、ＮＴＰ－糖の生成に関与する遺伝子の発現が増強されることを特徴とすることができる。
本発明において、前記組換え微生物はフェニルプロパノイド配糖体の生産用であることを特徴とすることができる。例えば、前記フェニルプロパノイド配糖体は、ビテキシン（Ｖｉｔｅｘｉｎ）、ナリンゲニン－６－グルコシド（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ－６－Ｃ－ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）またはイソオリエンチン（ｉｓｏｏｒｉｅｎｔｉｎ）であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記フェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物は、前記フェニルプロパノイド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。例えば、前記フェニルプロパノイド配糖体の前駆体は、アピゲニン、ナリンゲニンまたはルテオリンであることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記フェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物は、さらなる遺伝子の導入によってフェニルプロパノイド配糖体の前駆体を生産することを特徴とすることができる。
本発明において、フェニルプロパノイド配糖体の生産用組換え微生物は、例えば、
（ｉ）フェニルプロパノイド生合成酵素をコードする遺伝子がさらに導入されたことを特徴とすることができる。
フェニルプロパノイドは、マロニルＣｏＡまたは芳香族ＣｏＡ（例えば、クマロイルＣｏＡ）のような補酵素Ａ（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ａ－ＣｏＡ）から前記導入された遺伝子がコードする酵素により、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼの基質であるフェニルプロパノイドに変換され得る。したがって、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸、およびフェニルプロパノイド生合成酵素遺伝子が導入される宿主微生物は、補酵素Ａ、好ましくはマロニルＣｏＡまたはクマロイル－ＣｏＡの生産能を有することを特徴とすることができる。
したがって、本発明において、前記組換え微生物は、補酵素Ａの生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉ）ｐａｂＡ遺伝子の発現が抑制または弱化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、当業界で公知の様々な補酵素Ａの大量生産戦略を用いて補酵素Ａの生産が強化された組換え微生物を製造することができる。
本発明において、前記組換え微生物は、導入されたＣ－グリコシルトランスフェラーゼによる配糖体の転換率を向上させるために、ヌクレオチド、好ましくは、ＮＴＰ－糖の生産が強化されたことを特徴とすることができる。例えば、本発明において、前記組換え微生物は、（ｉｉｉ）ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されたことをさらなる特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来であることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、宿主株によって、ＮＴＰ－糖の生成に関与する遺伝子の発現が増強されることを特徴とすることができる。
例えば、本発明の組換え微生物は、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸が導入された組換え微生物において、
（ｉ）タイプＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子の導入と、
（ｉｉ）４’－ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入と、
（ｉｉｉ）シクラーゼをコードする遺伝子の導入と、
（ｉｖ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする遺伝子の導入と、
（ｖ）アクラビネオン１２－水酸化酵素をコードする遺伝子の導入と、
（ｖｉ）ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現の強化と、
（ｖｉｉ）ｐａｂＡ遺伝子の発現の弱化とからなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子の導入または遺伝子発現が調節されている、カルミン酸生産用組換え微生物であることを特徴とすることができる。
別の例として、本発明の組換え微生物は、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸が導入された組換え微生物において、
（ｉ）アロエゾン合成酵素をコードする遺伝子の導入と、
（ｉｉ）ｐａｂＡ遺伝子の発現の弱化と、および
（ｉｉｉ）グルコース６－リン酸１－デヒドロゲナーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子の発現の強化とからなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子の導入または遺伝子の発現が調節されている、アロエシン生産用の組換え微生物であることを特徴とすることができる。
別の例として、本発明の組換え微生物は、本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼをコードする核酸が導入された組換え微生物において、
ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ホスホグルコムターゼおよび／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼをコードする遺伝子の発現が強化されている、ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体生産用組換え微生物であることを特徴とすることができる。
本発明において、遺伝子の導入とは、外来の遺伝子が宿主微生物にベクターのような手段によって導入されたり、または直接的に宿主微生物のゲノムに挿入されたことを意味する。
本発明において、遺伝子の発現強化とは、前記遺伝子によって生成されるペプチドまたはタンパク質が宿主微生物にない場合、これを人工的に宿主微生物で発現させるようにしてペプチドまたはタンパク質の活性または機能を有するようにすることを意味し、前記遺伝子が既に宿主微生物にある場合、その遺伝子の発現を調節する内在的プロモーターを強力な常時発現プロモーターに切り替えるか、前記遺伝子を外部から複製能の強いベクターなどを用いてさらに導入するなど、遺伝子のコピー数を増加させるなど一連の方法を使用して、前記遺伝子の過剰発現などを誘導するか、前記遺伝子によって生成されるペプチドまたはタンパク質の活性または機能が、内在的活性または機能に比べて増強されるように変形することを意味する。
本発明において、遺伝子の発現弱化とは、当該遺伝子の一部または全塩基を変異、置換または削除させたり、前記遺伝子発現を阻害できる阻害剤（例えば、ｓＲＮＡなど）の導入によって当該遺伝子が発現されないようにするか、または発現されても活性または機能を示すことを防止することで、前記遺伝子によって生成されるペプチドまたはタンパク質の活性または機能が、内在的活性または機能に比べて弱化するように変形されることを包括する概念である。
本発明の「内在的活性または機能」という用語は、本来微生物が変形されていない状態で有する酵素、ペプチド、タンパク質などが保有する活性または機能を意味する。
本発明において「内在的活性または機能に比べて強化されるように変形」されたことは、活性または機能を示す遺伝子が導入されたり、または当該遺伝子のコピー数の増加（例えば、遺伝子が導入されたプラスミドを用いた発現）、前記遺伝子発現の抑制調節因子の欠失または発現調節配列の変形、例えば改良されたプロモーターの使用などのように、操作が行われる前の微生物が有する活性に比べて操作が行われた後の微生物が有している活性または機能が新たに発生または増加した状態を意味する。
本発明において「内在的活性または機能に比べて弱化するように変形」されたことは、活性または機能を示す遺伝子の欠失や遺伝子の不活性化（例えば、突然変異遺伝子への置換）、遺伝子発現の弱化（例えば、弱いプロモーターへの置換、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓＲＮＡなどの導入、開始コドンをＡＴＧからＧＴＧなどへの置換）、遺伝子によって発現されたペプチドの機能阻害（例えば、非競合的阻害剤または競合的阻害剤添加）などの操作が行われる前の微生物が有する機能に比べて、操作が行われた後の微生物が有する機能が減少または失われた状態を意味する。
本発明において、遺伝子またはプロモーターの「切り替え」とは、従来の遺伝子またはプロモーターを除去し、これとは異なる遺伝子（例えば、変異遺伝子など）または強度の異なるプロモーターを新たに導入することを意味するものであって、前記従来の遺伝子またはプロモーターを除去するというのは、当該遺伝子またはプロモーターを欠失させるだけでなく、その機能を抑制または減少させることも包括する概念である。
本発明において「過剰発現」とは、通常状態で細胞内の当該遺伝子が発現されるレベルより高いレベルの発現を指すものであって、遺伝体上に存在する遺伝子のプロモーターを強力なプロモーターに置換したり、発現ベクターに当該遺伝子をクローニングして細胞に形質転換させる方法を通じて発現量を増加させることなどを含む概念である。
本発明における「ベクター」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現することができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的なゲノム挿入物であってもよい。適切な宿主に形質転換されると、ベクターは宿主ゲノムとは関係なく複製して機能できるか、または場合によってはゲノム自体に組み込まれ得る。プラスミドが現在ベクターの最も一般的に使用されている形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は時々相互交換的に使用される。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが好ましい。このような目的に使用され得る典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数個から数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターに形質転換された宿主細胞が選択できるようにする抗生物質耐性遺伝子および（Ｃ）外来ＤＮＡ断片を挿入することができる制限酵素切断部位を含む構造を有する。適切な制限酵素切断部位が存在しない場合でも、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）またはリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を使用すると、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。ライゲーション後に、ベクターは適切な宿主細胞に形質転換されなければならない。形質転換は、塩化カルシウム法または電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｎｅｕｍａｎｎ、ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、１：８４１、１９８２）などを用いて容易に達成することができる。
前記ベクターのプロモーターは、構成的または誘導性であってもよく、本発明の効果のためにさらに変形されることができる。また、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターである場合、複製起点（Ｏｒｉ）を含む。ベクターは、自己複製または宿主ゲノムＤＮＡに組み込まれ得る。好ましくは、ベクター内に挿入されて伝達された遺伝子が、宿主細胞のゲノム内に不可逆的に融合され、細胞内での遺伝子発現が長期間安定して持続するようにすることが好ましい。
塩基配列は、他の核酸配列と機能的な関係で配置されたとき、「作動可能に連結（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」される。これは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列（ら）に結合したときに遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子および調節配列（ら）であってもよい。例えば、前配列（ｐｒｅ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）または分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）に対するＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプロタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか、または、リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結されるか、または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置された場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また分泌リーダーの場合に接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは接触する必要はない。これらの配列の連結は、便利な制限酵素部位でのライゲーション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを使用する。
当業界で周知のように、宿主細胞における形質転換遺伝子の発現レベルを高めるためには、その遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写および／または解毒発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列および／または当該遺伝子は、細菌選択マーカーおよび複製開始点をともに含んでいる１つの組換えベクター内に含まれるようにする。宿主細胞が真核細胞である場合には、組換えベクターは真核発現宿主内に有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
上述した組換えベクターによって形質転換された宿主細胞は、本発明の別の側面を構成する。本願明細書の「形質転換」という用語は、ＤＮＡを宿主に導入して、ＤＮＡが染色体外因子としてまたは染色体統合完成によって複製可能になることを意味する。
もちろん、全てのベクターが本発明のＤＮＡ配列を発現することにおいて全て均等に機能を発揮するわけではないことを理解すべきである。同様に、すべての宿主が同じ発現系に対して同じように機能するわけではない。しかし、当業者であれば、過度な実験的負担なしに本発明の範囲から逸脱することなく、様々なベクター、発現調節配列および宿主の中から適宜選択することができる。例えば、ベクターを選択する際には、宿主を考慮しなければならないが、これはベクターがその中から複製されなければならないためである。
本発明は、また別の観点から、以下のステップを含むポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の製造方法に関するものである。
（ａ）本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸が導入された組換え微生物を培養して、ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体を生産するステップと、
（ｂ）前記生成されたポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体を回収するステップ。
本発明において、前記ステップ（ａ）は、ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体を添加してＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸が導入された組換え微生物を培養することを特徴とすることができる。
本発明において、前記ステップ（ａ）のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸が導入された組換え微生物は、ポリケチド配糖体またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体の生産能を有する宿主微生物にＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸が導入されたことを特徴とすることができ、前記宿主微生物は外来遺伝子の導入または遺伝子発現が調節された組換え微生物であることを特徴とすることができる。
本発明において、前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体をコードする核酸が導入された組換え微生物は、本発明のポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体生産用組換え微生物に記載されたものと同じ特徴を有することができる。
本発明において、前記ステップ（ａ）は、培養時に培養培地にアスコルビン酸を添加して微生物を培養することを特徴とすることができ、この場合、好ましくは０．１～１．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．２～１．０ｇ／Ｌのアスコルビン酸を添加して微生物を培養することを特徴とすることができるが、これに限定されるものではない。
本発明の製造方法は別途記載がない限り、通常の技術者が理解できる範囲内で前記の別の観点で記載された内容と同等の特徴を有することができる。
本発明は、別の観点から、以下のステップを含むポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の製造方法を提供する。
（ａ）本発明のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体または前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を発現する微生物とポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドとを反応させてポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を生成するステップ、
（ｂ）前記生成されたポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を回収するステップ。
本発明では特定の遺伝子名を記載したが、本発明が当該遺伝子に限定されるものではないことは当業者にとって自明である。
一方、本発明で導入した遺伝子においても、特定微生物由来の遺伝子名を記載したが、本発明の保護範囲が当該遺伝子名に限定されるものではなく、当業者が当該遺伝子と同じ機能を有するものであると認められる範囲内で遺伝子名を異にする他の微生物由来の遺伝子を本発明の技術的特徴に従って導入する場合、当該組換え微生物も本発明の保護範囲に属することができることは自明である。
以下、本発明を具体的な実施形態によってより詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施形態によって限定されるものではなく、本発明のアイデアと範囲内で様々な変形または修正が可能であることは、通常の技術者には自明である。
（実施形態１．実験方法）
１－１．フラスコ培養
フラスコ培養は以下の条件で行われた。コロニーを適切な濃度の抗生剤を添加した１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その後、準備された培養液を３ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌ グルコース（また、必要に応じて０．４５ｇ／Ｌ アスコルビン酸）が添加されたた５０ｍＬのＲ／２培地を含む２５０ｍＬバッフルフラスコで継代した後、３０℃ ２００ｒｐｍで培養した。Ｒ／２培地（ｐＨ ６．８）の組成は以下の通りである（１リットルあたり）：２ｇ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、６．７５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ、０．７ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ａｎｄ ５ｍｌ ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＭＳ）［１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ａｎｄ ０．１ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４ ｐｅｒ ｌｉｔｅｒ ｏｆ ５Ｍ ＨＣｌ］。培養液のＯＤ６００が０．６～０．８になったとき、１ｍＭのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を添加して外来遺伝子の発現を誘導した。誘導後、４８時間培養した。
１－２．流加式発酵
流加式発酵の場合、６．６Ｌ ＢｉｏＦｌｏ ３２０発酵槽（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて２０ｇ／Ｌ グルコース、３ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、０．４５ｇ／Ｌ アスコルビン酸、および適切な抗生剤を含む１．９５ＬＲ／２培地（ｐＨ ６．８）で行った。コロニーを適切な濃度の抗生剤を添加した１０ｍＬ ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養した。その後、準備された培養液を３ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌ グルコース、０．４５ｇ／Ｌ アスコルビン酸が添加された５０ｍＬのＲ／２培地を含む２５０ｍＬバッフルフラスコで継代した後、３０℃ ２００ｒｐｍでＯＤ６００が約４に達するまで培養した。その後、発酵槽で接種されたが、ｐＨはアンモニア溶液の自動添加により６．８に維持され、温度は３０℃に維持された。酸素飽和度（ＤＯ）は、空気飽和レベルの４０％に保たれ、１ｖｖｍ［（ａｉｒ ｖｏｌｕｍｅ）・（ｗｏｒｋｉｎｇ ｖｏｌｕｍｅ）－１・（ｍｉｎｕｔｅ）－１］の空気を連続的に吹き込み、攪拌速度を上げるか、または添加される純酸素の濃度を高める方式でＤＯを維持した。ＩＰＴＧ添加（０．５ｍＭ）は、ＯＤ６００が約２０程度に達したときに行われ、ｐＨーｓｔａｔ戦略によって枯渇した炭素源およびその他の栄養素を自動的に発酵槽に添加した。このとき、添加液は１リットル当たり以下の成分を含んでいた：６５０ｇ グルコース、５ｇ アスコルビン酸、６ｍＬ ＴＭＳ、８ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ。ｐＨが６．８５より高くなると自動的に添加液が発酵槽に添加されるように操作した。
１－３．生産量分析
培養後、次のような条件で生産量分析を行った。フラスコ培養後５０ｍＬの培養液を４,０００ｇで３０分間遠心分離した後、上層液の塩を除去して濃縮する過程を行った。このとき、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒ）を使用した。ＦＫの場合は１倍、ＫＡの場合は３０倍、ｄｃＩＩの場合は４５倍、カルミン酸の場合は２００倍濃縮した。濃縮されたサンプルを適切な体積のＤＭＳＯに再び溶かした後、０．２２μｍのＰＴＦＥフィルターで不純物を除去した。準備されたサンプルは、ＨＰＬＣ（１１００ ｓｅｒｉｅｓ；Ａｇｉｌｅｎｔ）と連動されたＭＳ（ＬＣ／ＭＳＤ ＶＬ；Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析した。Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢーＣ１８カラムを活用し、Ａバッファーは０．１％ ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄを、Ｂバッファーはｍｅｔｈａｎｏｌを活用した。ＥＳＩネガティブモードで分析した。カルミン酸のより正確な分析のために、ＨＰＬＣ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＬＣＭＳ－８０５０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）を介してＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った（ＭＲＭ ｍｏｄｅ）。
一方、アロエシン分析のためにＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、ｕｌｔｒａ ＨＰＬＣ（ＵＨＰＬＣ；１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣ Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ）と連動されたＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ ６５５０ ｉＦｕｎｎｅｌ ＱーＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いた。この時、Ｅｃｌｉｐｓｅーｐｌｕｓ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎを使用し、バッファーＡには０．１％ ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ、バッファーＢには０．１％ ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄを添加したａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅを使用した。
（実施形態２：カルミン酸生産のためのＣ－グリコシルトランスフェラーゼの究明）
カルミン酸の生産経路はまだ具体的に究明されていないが、カルミン酸の炭素骨格はアントラキノン（ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）系列の構造を有しているので、ＰＫＳを用いてカルミン酸生産を誘導しようとした（図１）。
これにより、外来ａｃｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＡＣＰ）の活性のために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来Ｓｆｐが、ゲノム上に導入されたＥ．ｃｏｌｉ ＢＡＰ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））からの製造方法は、Ｂ．Ｐｆｅｉｆｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１、２９１（５５０９）、１７９０－１７９２／Ｄ．Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ２０１８、１１５（４０）９８３５－９８４４論文を参照）を活用した。その後、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来タイプＩＩ ＰＫＳを適用するために、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来ａｎｔＤ（ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ）、ａｎｔＥ（ｃｈａｉｎ－ｌｅｎｇｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ａｎｔＦ（ＡＣＰ）、ａｎｔＢ（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ａｎｔＧ（ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ：ＡＣＰ ｍａｌｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を導入するために、ｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢＧを構築した。まず、ａｎｔＤＥＦ遺伝子を、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓのｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからａｎｔＤＥ＿ＦプライマーとａｎｔＤＥＦ＿Ｒプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、ｐＤＳ００（制限酵素配列を除いてｐＥＴー３０ａ（＋）プライマーと同じプラットフォームのプラスミド、Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ制限酵素部位に挿入した。ｐＤＳ００プラスミドは以下のように構築された。ｐＥＴー３０ａ（＋）からＴ７プロモーター、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ（ＭＣＳ）－Ｔ７ターミネーターを含む遺伝子断片を、ｐＥＴ＿ＮｈｅＩ＿ＤｒａＩＩＩとｐＥＴ＿ＳｐｅＩ＿ＳｐｈＩプライマーを用いて増幅した後、ＳｐｈＩ、ＤｒａＩＩＩ制限酵素処理してｐＥＴー３０ａ（＋）プラスミドのＳｐｈＩとＤｒａＩＩＩ部位に挿入してｐＤＳ００プラスミドを構築した。その後、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからａｎｔＢをａｎｔＢ＿ＦプライマーとａｎｔＢ＿Ｒプライマーを用いて増幅し、ｐＤＳ００のＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入してｐＤＳ００－ａｎｔＢプラスミドを構築した。続いて、ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてｄｉｇｅｓｔｉｏｎさせた後、ｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦプラスミドもＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてａｎｔＤＥＦ断片を得た後、２つの断片をＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて合わせ、ｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢプラスミドを得た。そして、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからａｎｔＧをａｎｔＧ＿ＦプライマーとａｎｔＧ＿Ｒプライマーを用いて増幅し、ｐＤＳ００のＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＤＳ００－ａｎｔＧプラスミドを構築した。構築されたプラスミドをＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ制限酵素でｄｉｇｅｓｔｉｏｎしてａｎｔＧ断片を得た後、ｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢプラスミドのＮｈｅＩ部位に挿入してｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢＧプラスミドを構築した。
Figure 2024505906000002
その次に、フラボケルメス酸（ＦＫ）の生産のために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｒ１１２８由来のシクラーゼであるＺｈｕＩとＺｈｕＪを導入したが、そのために、ｐＦＫ（ｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢＧ－ｚｈｕＩＪ）プラスミドを構築した。まず、大腸菌での発現のためにコドン最適化されたｚｈｕＩＪ ＤＮＡをベースにして、ｚｈｕＩ＿ＦプライマーとｚｈｕＪ＿Ｒプライマーを用いてｚｈｕＩＪ断片をＰＣＲ増幅し、ｐＤＳ００のＮｄｅＩ、ＥＣｏＲＩ部位に挿入した。このように構築されたｐＤＳ００－ｚｈｕＩＪをＮｈｅＩ、ＳｐｅＩ制限酵素で切断してｚｈｕＩＪ断片を得てから、これをｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢＧのＮｈｅＩ部位に挿入してｐＦＫを構築した。
ＢＡＰ１にｐＤＳ００－ａｎｔＤＥＦＢＧ－ｚｈｕＩＪが形質転換された株は、グルコースから８８ｍｇ／ＬのＦＫを生成した。培養液の色が培養初期には明るい赤色であったが、時間が経つにつれて濁った茶色に変化することが観察された。これは、ＦＫがメラニン類似体などに転換されるものと仮定されるところ、ＦＫのメラニン化を防ぐために、培地に０．４５ｇ／Ｌのアスコルビン酸を添加し、これによりＦＫ生産量を１５４．９ｍｇ／Ｌまで増産することができた。
Figure 2024505906000003
マロニルＣｏＡの細胞内濃度を増加させることもまた、ＦＫの生成を増加させることができる方法であると予測し、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃＢＣＤ１遺伝子によってコードされる）を過剰発現させるか、またはｐａｂＡ遺伝子をノックダウンした。その結果、ａｃｃＢＣＤ１を過剰発現させた株でＦＫ生産量が１８０．３ｍｇ／Ｌまで増産された（図２）。
フラスコ培養の際、ＬＢアガプレート上のコロニーを１０ｍＬのＬＢが含まれたテストチューブ上に接種することから始めた。この時、適切な濃度の抗生剤を添加し、３７℃ ２２０ｒｐｍで一晩培養した。このように準備された種培養中の１ｍＬを、５０ｍＬのＲ／２培地（３ｇ／Ｌ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌ グルコース追加を含む）を含む２５０ｍＬのバッフルフラスコで接種し、３０℃と２００ｒｐｍで培養した。Ｒ／２培地の組成は以下の通りである（ｐＨ ６．８、１Ｌあたり）：２ｇ（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、６．７５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、０．８５ｇ ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ、０．８ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＭＳ）。ＴＭＳの組成は以下の通りである（０．１Ｍ ＨＣｌ基盤、１Ｌあたり）：１０ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５８ｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２ｇ Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、２ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ。培養液のＯＤ ６００が０．６－０．８になったとき、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加して外来酵素発現を誘導した。その後、４８時間培養を行った。フラボケルメス酸、ケルメス酸、ｄｃＩＩ、カルミン酸生産実験の場合には、全て０．４５ｇ／Ｌのアスコルビン酸をさらに添加した。
前記フラスコ培養の結果、少量のケルメス酸（ＫＡ）も観察された（０．１４ｍｇ ＦＫ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ／Ｌ；すなわち、ｍｇ ＦＫ ｅｑ／Ｌ）。これは大腸菌内在酸化酵素またはＺｈｕＩＪによるものと考えられたが、転換効率があまりにも低く、当該反応を行う酵素はまだ究明されていないところ、本発明では既存に報告された文献と化合物データベースを活用して生化学反応分析を行った。
その結果、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ由来ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ １２－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＤｎｒＦ）をコードする遺伝子が当該反応を行う酵素と予測され、ｄｎｒＦ＿ＦプライマーとｄｎｒＦ＿Ｒプライマーを用いて増幅した後、ｐＤＳ００にＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＤＳ００－ｄｎｒＦを構築し、当該プラスミドをベースにして、ｐＥＴ３０ａ＿ｆｒａｇ＿ＦプライマーとｐＥＴ３０ａ＿ｆｒａｇ＿Ｒプライマーを用いてｄｎｒＦ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｐＢＢＲ１－Ｔ７プラスミド（Ｋｏｖａｃｈ、Ｍ．Ｅ．；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、Ｒ．Ｗ．；Ｅｌｚｅｒ、Ｐ．Ｈ．；Ｒｏｏｐ、Ｒ．Ｍ．、ＩＩ；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｋ．Ｍ．、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ：ａ ｂｒｏａｄ－ｈｏｓｔ－ｒａｎｇｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９４、１６（５）、８００－８０２．）から、Ｓ．Ｙ．Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．、ｂｉｏＲｘｉｖ、ＤＯＩ：１０．１１０１／２０２０．１１．２７．４０１０００方法で構築された）をｐＥＴ３０ａ＿ＩＶ＿ＲプライマーとｒｒｎＢ＿ＩＶ＿Ｆプライマーを用いて逆ＰＣＲ増幅し、Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて２つのＤＮＡ断片をライゲーションしてｐＢＢＲ１－ｄｎｒＦを構築した。ＦＫ生成株にｐＢＢＲ１－ｄｎｒＦを導入した後、フラスコ培養を行った。その結果、１．２０ｍｇのＦＫ ｅｑ／ＬのＫＡを生産した（図３ａ）。
Figure 2024505906000004
ＦＫからカルミン酸（ＣＡ）への生産は、二種類の生合成経路を選択することができるが、両方ともモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｏｘｙ ｇｅｎａｓｅ）とＣ－グリコシルトランスフェラーゼを必要とする。ＦＫは酸化してＫＡに転換されるか、Ｃ－グリコシル化されてｄｃＩＩに転換され得る。Ｄ．ｃｏｃｃｕｓ由来ＤｃＵＧＴ２が、ＦＫからｄｃＩＩ（またはＫＡからＣＡ）への切り替えを触媒することが見出され、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで活性が証明されたが（Ｋａｎｎａｎｇａｒａ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１７、８）、当該酵素が活性を有するためには、グリコシル化されなければならず、膜貫通ヘリックス（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｈｅｌｉｘ）とシグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）も有しているため、大腸菌のような細胞では成功的に発現しにくいと予想された。実際、ＤｃＵＧＴ２は、ＦＫ生成大腸菌に導入されたときにｄｃＩＩを生成できなかった。このようなＤｃＵＧＴ２の発現上の問題を解決するために、Ｎ末端シグナルペプチドを除去したＮｔｒ－ＤｃＵＧＴ２、Ｃ末端膜貫通ヘリックスを除去したＣｔｒ－ＤｃＵＧＴ２、Ｎ末端シグナルペプチドおよびＣ末端膜貫通ヘリックスを全て除去したＮｔｒ－Ｃｔｒ－ＤｃＵＧＴ２を製作し、Ｎｔｒ－ＤｃＵＧＴ２とＮｔｒ－Ｃｔｒ－ＤｃＵＧＴ２のＮ末端には、大腸菌ＯｍｐＡシグナルペプチドを付着したプラスミドも構築したが、いずれもｄｃＩＩの生産に失敗した。したがって、ＤｃＵＧＴ２は大腸菌で活性を有さないと結論付けた。
大腸菌における天然物のＯ－グリコシル化はいくつかの事例が報告されているが、Ｃ－グリコシル化はほとんど報告された事例がない。したがって、本発明では、生化学反応分析を通じて大腸菌でＣ－グリコシル化反応を行うと判明されたＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼを選定した。選定された８つの酵素候補は次のとおりである：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ由来ＩｒｏＢ（ＥｎＣＧＴ）。Ｚｅａ ｍａｙｓ由来ＵＧＴ７０８Ａ６（ＺｍＣＧＴ）Ｃ ｄｕａｌ／Ｏ－グリコシルトランスフェラーゼ、Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ由来ＵＧＴ７０８Ｃ２（ＦｅＣＧＴ）、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ由来ＭｉＣＧＴ、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ由来ＯｓＣＧＴ、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ由来ＵＧＴ７０８Ｄ１（ＧｍＣＧＴ）、Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ由来ＧｔＵＦ６ＣＧＴ１（ＧｔＣＧＴ）、アロエベラ由来ＡｖＣＧＴ（図４）。
前記選択された酵素について、ｐＣＤＦ－ＤｃＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＭｉＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＳｆＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＥｎＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＯｓＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＦｅＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＧｍＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＡｖＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＡｖＣＧＴ、ｐＣＤＦ－ＺｍＣＧＴを構築したが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡからｉｒｏＢ＿ｇｉｂ＿ＦプライマーおよびｉｓｏＢ＿ｇｉｂ＿Ｒプライマーを用いて増幅されたｉｒｏＢ遺伝子を除いては全て人工合成し、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミド上のＮｄｅＩ部位にＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて挿入して構築した。
Figure 2024505906000005
ＧｔＣＧＴとＺｍＣＧＴのみがＦＫをｄｃＩＩに成功的に転換させることができたが、ＺｍＣＧＴの場合、主要生産物はＯ－グリコシル化されたＦＫであって、ｄｃＩＩはごく少量生産された。ＧｔＣＧＴの場合、０．１３ｍｇ ＣＡ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ／Ｌ（ｍｇ ＣＡ ｅｑ／Ｌ）のｄｃＩＩが生成された（図５）。Ｃ－グリコシル化反応は高いレベルのＵＤＰ－グルコース量を必要とするので、ｇａｌＵ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＵＴＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ)、ｐｇｍ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）、また、ｎｄｋ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）を過剰発現し、その結果、ｄｃＩＩの生産量が０．３０ｍｇ ＣＡ ｅｑ／Ｌに増産された（図５）。ｐＢＢＲ１－ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋプラスミドを製作するために（３つの遺伝子いずれもが大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から増幅された）、まず、ｇａｌＵ遺伝子がｇａｌＵ＿ｇｉｂ＿ＦとｇａｌＵ＿ｇｉｂ＿Ｒプライマーから増幅され、ｐＢＢＲ１ＴａＣプラスミド上のＥｃｏＲＩ部位にＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを介して挿入された。また、ｐｇｍ遺伝子は、ｐｇｍ＿ｇｉｂ＿Ｆとｐｇｍ＿ｇｉｂ＿Ｒプライマーから増幅され
ｐＢＢＲ１ＴａＣ－ｇａｌＵプラスミドのＫｐｎＩ部位に挿入され、ｎｄｋ遺伝子は、ｎｄｋ＿ｇｉｂ＿Ｆとｎｄｋ＿ｇｉｂ＿Ｒプライマーから増幅され、ｐＢＢＲ１－ｇａｌＵ－ｐｇｍプラスミドのＳｐｈＩ部位に挿入され、これでｐＢＢＲ１－ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋが構築された。
Figure 2024505906000006
ＧｔＣＧＴとＤｎｒＦの活性を向上させて成功的にカルミン酸を生成するために、本発明ではコンピュータシミュレーションを通じて活性が増大した突然変異を製作しようとした。しかし、当該酵素の構造が明らかにされていないので、まず、ＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｗｅｂｂ、Ｂ．；Ｓａｌｉ、Ａ．、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＭＯＤＥＬＬＥＲ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１６ ５４、５．６．１－５．６．３７）を用いてタンパク質構造を予測した。その後、ＰｙＲｏｓｅｔｔａによるドッキングシミュレーション（Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ、Ｓ．；Ｌｙｓｋｏｖ、Ｓ．；Ｇｒａｙ、Ｊ．Ｊ．、ＰｙＲｏｓｅｔｔａ：ａ ｓｃｒｉｐｔ－ｂａｓｅｄ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｆｏｒ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｕｓｉｎｇ Ｒｏｓｅｔｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１０、２６（５）、６８９－６９１）を通じて活性が増大した突然変異をスクリーニングしようとした。コンピュータシミュレーションベース予測の他にも、構造分析の結果を通じて活性を増加させると予想される突然変異をさらに選定した。
ＧｔＣＧＴに対するｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇを、ＴＣＣＧＴ（Ｔｒｏｌｌｉｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ由来Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ；ＰＤＢ ＩＤ ６ＪＴＤ；タンパク質配列類似度３５．１％）を比較群として活用して行った。算出されたＧｔＣＧＴ構造モデルを用いて、ＦＫをリガンドとするコンピュータベースのドッキングシミュレーション（ＳＷ：ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａ）を行った。その結果、２３９個の突然変異が算出されたが、そのうち、１２２個の突然変異が野生型酵素に比べて高いドッキングスコアを示した（表６）。これらのうち、上位２０個の突然変異について実験を行ったが、ＧｔＣＧＴの予測された構造分析の結果、活性を増大させることができると予想される１４個の突然変異もさらにテストした。前記３４個の突然変異をＦＫ株に形質転換した後、フラスコ培養を行った結果、野生型ＧｔＣＧＴに対して高いＫＡ生成量を示す６つの突然変異が選定された（Ｖ９３Ｑ、Ｙ１９３Ｆ、Ｌ１６４Ｇ、Ｆ１７Ｇ、Ｒ３２２Ｄ、Ｖ１３２Ａ）。これらのうち、最も高いｄｃＩＩ生産量を示した突然変異はＧｔＣＧＴＶ９３Ｑであり、生産量は約２．９倍に増加することが示された（図６ｃ）。当該突然変異において、Ｇｌｎ９３アミノ酸が活性化部位に位置しており、直接的にＦＫと結合すると判断された。Ｇｌｎ９３アミノ酸は、Ｃ６のヒドロキシル基と水素結合を形成するが、これはＦＫリガンドがＣ２でＣ－グリコシル化されるために正確な方向をとるものと予測される。Ｙ１９３Ｆ突然変異は、２番目に高いｄｃＩＩ濃度を示したが、当該２つの突然変異間の相乗効果を見るために、二重突然変異を構築した後（ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）、ＦＫ株に導入した。当該二重突然変異は、０．７４ｍｇ ＣＡ ｅｑ／ＬのｄｃＩＩを生成したが、これは野生型ＧｔＣＧＴに比べて５．３倍増産された結果である（図６ｃ）。Ｖ９３Ｑ突然変異において、Ｔｙｒ１９３アミノ酸は、Ｃ１０のカルボニル基と水素結合を形成しながら、Ｇｌｎ９３がＣ６のヒドロキシル基と水素結合を形成するのを妨げる。したがって、Ｔｙｒ１９３をＰｈｅ１９３に変えながらＣ１０での水素結合が阻害され、ＦＫのリガンド結合が改善されたものと予測される（図６ｄ）。
※最もドッキングスコアが高い２０個は太字で表記。構造ベースのさらに選択された突然変異は青色で表記した。‡野生型ＧｔＣＧＴ
ＤｎｒＦについても同様の方法を用いて突然変異ライブラリーを製作し、その結果、最も高いＫＡ生産量を示した突然変異はＤｎｒＦＰ２１７Ｋであり、約２．２倍ＫＡ生産量が増加された（２．６８ｍｇ ＦＫ ｅｑ／Ｌ）（図６ａ、６ｂ）。
特定の配列に対する突然変異の発生は、既存の文献で報告されたものと同じように行われた（Ｚｈｅｎｇ、Ｌ．；Ｂａｕｍａｎｎ、Ｕ．；Ｒｅｙｍｏｎｄ、Ｊ．Ｌ．、Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｒｏｔｏｃｏｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００４、３２（１４）、ｅ１１５．）。このとき、ｄｎｒＦＰ２１７Ｋが導入されたプラスミドｐＢＢＲ１－Ｔ７はｐＫＡで、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆが導入されたｐＣＤＦＤｕｅｔ－１プラスミドはｐｄｃＩＩと命名した。ＤｎｒＦのＰ２１７Ｋ突然変異を製作するために、ＤｎｒＦ＿Ｐ２１７Ｋ＿ＦプライマーとＤｎｒＦ＿Ｐ２１７Ｋ＿Ｒプライマーが使用され、ＧｔＣＧＴのＶ９３Ｑ突然変異を製作するために、ＧｔＣＧＴ＿Ｖ９３Ｑ＿ＦプライマーとＧｔＣＧＴ＿Ｖ９３Ｑ＿Ｒプライマーが使用され、ＧｔＣＧＴのＹ１９３Ｆ突然変異を製作するために、ＧｔＣＧＴ＿Ｙ１９３Ｆ＿ＦプライマーとＧｔＣＧＴ＿Ｙ１９３Ｆ＿Ｒプライマーが使用された。
Figure 2024505906000008
本発明で製作されたＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ（ＧｔＵＦ６ＣＧＴ１Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）突然変異のタンパク質配列は以下の通りである。
ＭＧＳＬＴＮＮＤＮＬＨＩＦＬＶＣＦＩＧＱＧＶＶＮＰＭＬＲＬＧＫＡＦＡＳＫＧＬＬＶＴＬＳＡＰＥＩＶＧＴＥＩＲＫＡＮＮＬＮＤＤＱＰＩＫＶＧＳＧＭＩＲＦＥＦＦＤＤＧＷＥＳＶＮＧＳＫＰＦＤＶＷＱＹＩＮＨＬＤＱＴＧＲＱＫＬＰＩＭＬＫＫＨＥＥＴＧＴＰＶＳＣＬＩＬＮＰＬＶＰＷＶＡＤＶＡＤＳＬＱＩＰＣＡＴＬＷＶＱＳＣＡＳＦＳＡＹＹＨＹＨＨＧＬＶＰＦＰＴＥＳＥＰＥＩＤＶＱＬＰＧＭＰＬＬＫＹＤＥＶＰＤＦＬＨＰＲＴＰＹＰＦＦＧＴＮＩＬＧＱＦＫＮＬＳＫＮＦＣＩＬＭＤＴＦＹＥＬＥＨＥＩＩＤＮＭＣＫＬＣＰＩＫＰＩＧＰＬＦＫＩＰＫＤＰＳＳＮＧＩＴＧＮＦＭＫＶＤＤＣＫＥＷＬＤＳＲＰＴＳＴＶＶＹＶＳＶＧＳＶＶＹＬＫＱＥＱＶＴＥＭＡＹＧＩＬＮＳＥＶＳＦＬＷＶＬＲＰＰＳＫＲＩＧＴＥＰＨＶＬＰＥＥＦＷＥＫＡＧＤＲＧＫＶＶＱＷＳＰＱＥＱＶＬＡＨＰＡＴＶＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＱＥＡＩＳＳＧＶＰＶＩＴＦＰＱＦＧＤＱＶＴＮＡＫＦＬＶＥＥＦＫＶＧＶＲＬＧＲＧＥＬＥＮＲＩＩＴＲＤＥＶＥＲＡＬＲＥＩＴＳＧＰＫＡＥＥＶＫＥＮＡＬＫＷＫＫＫＡＥＥＴＶＡＫＧＧＹＳＥＲＮＬＶＧＦＩＥＥＶＡＲＫＴＧＴＫ
前記のように活性が増大されたＤｎｒＦとＧｔＣＧＴ突然変異を構築した後、当該２つの突然変異酵素を組み合わせてＣＡ株を構築した。ＣＡ株は、ｐＦＫとｐＣＡ（ｐＣＤＦ－ｄｎｒＦＰ２１７Ｋ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ）プラスミドをＢＡＰ１株に形質転換して製作した。このとき、２つの遺伝子を１つのプラスミドに挿入するために、ｐＫＡからｄｎｒＦ＿ＮｃｏＩ＿ＦとｄｎｒＦ＿ＢａｍＨＩ＿Ｒプライマーを用いたＰＣＲ増幅によりｄｎｒＦＰ２１７Ｋを増幅し、これはｐｄｃＩＩにＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ部位に挿入してｐＣＡを構築した。構築されたＣＡ株をフラスコで培養した結果、２２．２μｇ／Ｌのカルミン酸が生成された（図７）。グルコースから生成されたカルミン酸の真偽は、図７に示すようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって判別した。
カルミン酸生産能を増加させるために、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍａｃ ＢＣＤ１過剰発現、ｐａｂＡノックダウン、ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋ過剰発現をそれぞれ、または組み合わせてテストし、各株の生産量は次のとおりである（図７ａ）。ｐａｂＡ ＫＤ、２５．９μｇ／Ｌ；ａｃｃＢＣＤ１ ＯＥ、７４．９μｇ／Ｌ；ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋ ＯＥ、４１．０μｇ／Ｌ；ａｃｃＢＣＤ１ ＯＥ－ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋ ＯＥ、４９．９μｇ／Ｌ；ｐａｂＡ ＫＤ－ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋ ＯＥ、５７．７μｇ／Ｌ；ｐａｂＡ ＫＤ－ａｃｃＢＣＤ１ ＯＥ、５７．２μｇ／Ｌ；ｐａｂＡ ＫＤ－ａｃｃＢＣＤ１ ＯＥ－ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋ ＯＥ、２５．２μｇ／Ｌとして現れ、ａｃｃＢＣＤ１を過剰発現した株（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐＦＫ、ｐＣＡ、ｐＡＣＣ；ｐＦＫ：ｐＤＳ００ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ－ａｎｔＤＥＦＢＧ ｆｒｏｍ ｌｕｍｉｎｉｓｃｅｎｓ ａｎｄ ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｚｈｕＩＪ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｒ１１２８（ＰＴ７－ａｎｔＤＥＦＢＧ－Ｔ７ＴーＰＴ７－ｚｈｕＩＪ－Ｔ７Ｔ）；ｐＣＡ：ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｎｒＦＰ２１７Ｋ ａｎｄ ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｏｐｅｒｏｎｓ（ＰＴ７－ｄｎｒＦＰ２１７Ｋ－Ｔ７Ｔ－ＰＴ７－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ－Ｔ７Ｔ）；ｐＡＣＣ：ｐＢＢＲ１ＴａＣ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａｃｃＢＣ ａｎｄ ａｃｃＤ１ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ １３０３２）で最も高いカルミン酸濃度である７４．９μｇ／Ｌが生成されることを確認した。また、当該株に対する流加式発酵の実施結果、０．６５ｍｇ／Ｌのカルミン酸が生産された。
Figure 2024505906000009
（実施形態３：ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆによるアロエシン生産）
アロエシンは、アロエベラから抽出される代表的な化粧品添加物である。アロエシンは抗チロシナーゼ（ａｎｔｉ－ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）と抗メラノゲニス（ａｎｔｉ－ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ）効果のため、化粧品業界で美白剤として活用されており、抗炎症および抗ラジカル特性のため、潜在的な薬物または化粧品原材料として脚光を浴びている。しかし、植物におけるアロエシンの含有量は非常に低く、より効率的な製造方法が必要であった。アロエシン生産については、既存の論文発表を通じて報告されたことがある（Ｄ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１８、１１５（４０）、９８３５－９８４４．）。しかし、アロエゾンからアロエシンに転換するＣ－グリコシルトランスフェラーゼはまだ報告されておらず（図８）、本発明では前記実施形態２を通じて開発したＧｔＣＧＴ突然変異がアロエシンを生成する効果があるかどうかをテストしようとした。
本発明者らは、アロエソンを生産するためにＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を以下のプラスミドで形質転換した：ｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳ、ｐＷＡＳ－ａｎｔｉ－ｐａｂＡ、ｐＢＢＲ１－ｚｗｆ。したがって、当該株は以下の遺伝子を発現している：ＲｐＡＬＳ（Ｒ．ｐａｌｍａｔｕｍ ａｌｏｅｓｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅをコードする）、ａｎｔｉ－ｐａｂＡ合成調節ｓＲＮＡ、ｚｗｆ（Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｌｕｃｏｓｅ ６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ １－ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅをコードする）（Ｙａｎｇ、Ｄ．；Ｋｉｍ、Ｗ．Ｊ．；Ｙｏｏ、Ｓ．Ｍ．；Ｃｈｏｉ、Ｊ．Ｈ．；Ｈａ、Ｓ．Ｈ．；Ｌｅｅ、Ｍ．Ｈ．；Ｌｅｅ、Ｓ．Ｙ．、Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ａｓ ａ ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１８、１１５（４０）、９８３５－９８４４を参照）。
当該株は、３０．９ｍｇ／Ｌのアロエゾンをグルコースから生成する。アロエシンの生産に先立って、アロエゾンの生産量を増加させるために、互換性のあるプラスミド上にＲｐＡＬＳをさらに導入してアロエゾンの生産量を増加させようとした。このため、高いコピー数のＲＳＦ複製起点を有するｐＲＳＦＤｕｅｔ－１プラスミド上にＲｐＡＬＳを導入した。ＲｐＡＬＳを既存構築したｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳからＡＬＳ＿ＮｄｅＩ＿ＦとＡＬＳ＿ＮｄｅＩ＿Ｒプライマーを用いて増幅した後、ｐＲＳＦＤｕｅｔ－１上のＮｄｅＩ部位にＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて挿入して当該プラスミドを構築した。その後、ｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳとｐＲＳＦ－ＲｐＡＬＳを同時にｐＷＡＳ－ａｎｔｉ－ｐａｂＡとｐＢＢＲ１－ｚｗｆプラスミドを既に保有しているＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換し、当該株に対するフラスコ培養を行った。その結果、１０２．１ｍｇ／Ｌのアロエゾンが生産され、改良前に比べてアロエゾン生産量が著しく増加することを確認した。
Figure 2024505906000010
その後、アロエシン生成をテストするために、ｐＷＡＳ－ａｎｔｉ－ｐａｂＡ ｐＲＳＦ－ＲｐＡＬＳ、ｐＢＢＲ１－ｚｗｆプラスミドを保有しているＢＬ２１（ＤＥ３）株上にｐＣＤＦ－ＧｔＣＧＴまたはｐＣＤＦ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆプラスミドを形質転換した後、フラスコ培養を行った。その結果、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆを含む株が０．０６μｇ／Ｌのアロエシンを生成し、ＧｔＣＧＴを含む株よりも多くのアロエシンを生成することに成功した（図９）。
アロエゾンの増産のためにテストしたのと同じようにＲｐＡＬＳをさらに導入してアロエシンの生産量を増加させようとした。このため、ｐＣＤＦ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆを導入する代わりに、ｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆを構築した。このため、ＲｐＡＬＳをｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳからｐＣＤＦＤｕｅｔ＿ＦとｐＣＤＦＤｕｅｔ＿Ｒプライマーを用いて増幅し、ｐＣＡプラスミド上のＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ部位にＧｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙを通じて導入した。その後、ｐＲＳＦ－ＲｐＡＬＳ、ｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３、ｐＷＡＳ－ａｎｔｉ－ｐａｂＡ、ｐＢＢＲ１－ｚｗｆの４種のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した後、ＡＬＳ株と名付けた。
ＡＬＳ株はグルコースから０．３μｇ／Ｌのアロエシンを生産することに成功した。生成されたアロエシンの真偽は、図９のようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって判別された。
このように、本発明者らは、ＧｔＣＧＴの導入を通じて酵素すら明らかにされていない状態でアロエシン生産に成功し、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆの導入を通じてアロエシン生産能を著しく高めることができた。このように、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ酵素突然変異はポリケチド全般にわたって配糖体を生産する能力がある酵素であると言え、本発明者らはアロエシン生産能をさらに高めることができる突然変異を構築するために、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆをベースに追加的な突然変異製作を進めることになった。
（実施形態４：ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆへのさらなる突然変異導入を通じたアロエシン増産）
本発明者らは、先に開発した芳香族ポリケチドに活性を示すＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ突然変異をさらに改良し、アロエソンからアロエシンへの転換効率を高めようとした。このために、実施形態２を通じて算出したＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ構造モデル上に新しい基質であるアロエソンをドッキングした。これにより、アロエゾンとより安定した結合を形成して酵素活性を高めると予想される突然変異を表１０のように選定した。
Figure 2024505906000011
特定の配列に対する突然変異の発生は、実施形態２と同じ方法で行われた。このとき、ｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆを鋳型として、下記表１１のプライマー対を用いて遺伝子突然変異を含むプラスミドを製作した。製作したプラスミドは、それぞれｐＷＡＳ－ａｎｔｉ－ｐａｂＡ、ｐＲＳＦ－ＲｐＡＬＳ、ｐＢＢＲ１－ｚｗｆの３種のプラスミドと共にＢＬ２１（ＤＥ３）株上に形質転換した後、このように構築された株を用いて実施形態３と同じ条件下でフラスコ培養を行った。生産されたアロエシンの濃度は、カイストバイオコアセンターのＨＰＬＣ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＬＣＭＳ－８０５０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）のＭＲＭモードで測定された。
Figure 2024505906000012
Figure 2024505906000013
フラスコ培養の結果、Ｉ３２３Ｓ、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｖ、Ｉ１８Ｐ、Ｉ９５Ｔ、Ｑ２０Ｍ、Ｉ３２３Ａの追加突然変異の導入により、アロエシン生成量が１０倍以上増加し、特に、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ／Ｉ３２３Ｓ突然変異により、７．７５μｇ／Ｌのアロエシンが生成された（図１０）。これは、既存の濃度である０．３μｇ／Ｌに比べて２５．８倍以上増加した結果である。
構造ベースのさらなる突然変異探索に加えて、さらに酵素活性を高めるために、ＧｔＣＧＴ構造モデルを用いてアロエゾンをリガンドとするコンピュータベースのドッキングシミュレーション（ＳＷ：ＡｕｔｏＤｏｃｋ Ｖｉｎａ）を実施した。その結果、１５個の突然変異が野生型酵素に比べて高いドッキングスコアを示した（表１２）。
Figure 2024505906000014
特定の配列に対する突然変異の発生は、実施形態２と同じ方法で行われた。このとき、ｐＣＤＦ－ＲｐＡＬＳ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆを鋳型として、下記表１３のプライマー対を用いて遺伝子突然変異を含むプラスミドを製作した。製作したプラスミドは、それぞれｐＷＡＳ－ａｎｔｉ－ｐａｂＡ、ｐＲＳＦ－ＲｐＡＬＳ、ｐＢＢＲ１－ｚｗｆの３種のプラスミドと共にＢＬ２１（ＤＥ３）株上に形質転換した後、このように構築された株を用いて実施形態３と同じ条件下でフラスコ培養を行った。生産されたアロエシンの濃度は、カイストバイオコアセンターのＨＰＬＣ Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＬＣＭＳ－８０５０、Ｓｈｉｍａｄｚｕ）のＭＲＭモードで測定した。
フラスコ培養の結果、Ｐ３８５Ａ、Ｌ１９４Ａ、Ｖ４８Ｇの追加突然変異の導入により、アロエシン生成量が５倍以上増加し、特に、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ／Ｐ３８５Ａ突然変異により、４．２３μｇ／Ｌのアロエシンが生成された（図１１）。これは、既存の濃度である０．３μｇ／Ｌに比べて１４．１倍以上増加した結果である。
Figure 2024505906000015
Figure 2024505906000016
（実施形態５：ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆによるフェニルプロパノイド配糖体の生産）
本発明を通じて開発したＣ－グリコシルトランスフェラーゼのフェニルプロパノイド系天然物への拡張性をテストするために、本発明者らは以下の実験を実施した。
細胞内発現されたＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆの酵素活性を確認するため、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にｐＣＤＦ－ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３ＦとｐＢＢＲ１－ｇａｌＵ－ｐｇｍ－ｎｄｋが全て形質転換された株をフラスコ培養し、細胞の成長がＯＤ６００．６～０．８に達したときに１ｍＭのＩＰＴＧを投与した。この時、７０μＭのルテオリン、０．５ｍＭのナリンゲニンまたは１８５．２μＭのアピゲニンを一緒に投与し、さらに３６時間培養した。ＬＣ－ＭＳにより基質および産物の量を分析した。フラスコ培養は、５０ｍＬのＲ／２培地（３ｇ／Ｌのｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌのグルコースをさらに含む）を含む２５０ｍＬのバッフルフラスコで行われ、３０℃と２００ｒｐｍで培養を行った。
培養結果、１８５．２μＭのアピゲニンから１５．０μＭのビテキシンが生成され、０．５ｍＭのナリゲニンから５１．６μＭのナリンゲニン－６－グルコシドが生成され、７０μＭのルテオリンから２７．９μＭのイソオリエンチンが生成された。これはそれぞれ８．１％、１０．３％、２７．９％の転換率に対応する値である（図１０）。
前記のように、本願発明のグルコシルトランスフェラーゼは、様々なフェニルプロパノイドＣ－グルコシドも生産できる活性も示しており、これは本願発明の酵素が様々なポリケチドおよびフェニルプロパノイドＣ－グルコシドを生産することができる汎用酵素であることを示す。
（実施形態６：ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ精製およびＫＭ、Ｖｍａｘ測定）
本発明を通じて開発したＣ－グリコシルトランスフェラーゼＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆの特性をより詳細に究明するために、酵素を精製して酵素反応速度論的変数を測定しようとした。Ｈｉｓ－ｔａｇを用いた酵素精製のために、Ｎ－末端にそれぞれ６ｘＨｉｓ－ｔａｇが連結されたＧｔＣＧＴとＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆを発現させるｐＣＤＦ－ＮＨｉｓ－ＧｔＣＧＴとｐＣＤＦ－ＮＨｉｓ－ＧｔＣＧＴｍｕｔプラスミドを構築した。ｐＣＤＦ－ＧｔＣＧＴとｐＣＤＦ－ＧｔＣＧＴｍｕｔを、ＧｔＣＧＴ＿Ｎ＿Ｈｉｓ＿ＩＶ＿Ｆ／ＧｔＣＧＴ＿Ｎ＿Ｈｉｓ＿ＩＶ＿Ｒプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、ＤｐｎＩ処理およびＴ４ ＰＮＫとＴ４リガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）処理を通じてｂｌｕｎｔーｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎすることにより、各プラスミドを構築した。構築された２つのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株上にそれぞれ形質転換した後、１０ｍＬのＬＢを含むテストチューブ上での種培養を経て、５００ｍＬのＬＢを含むフラスコ中のＯＤ６００値が０．８になるまで３７℃で培養した。酵素発現のために、１ｍＭ ＩＰＴＧ処理した後、２０℃で１６時間さらに培養し、遠心分離による細胞捕集後、３０ｍＬのｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）に再懸濁した。超音波により細胞を破砕した後、１０、０００ｒｐｍ、４℃、４０minの条件で遠心分離して水溶性タンパク質を含む上清を得た。上清をＴＡＬＯＮレジン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に流すことで、Ｈｉｓ－ｔａｇが結合したタンパク質のみを精製しようとした。Ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）で不純物を除去した後、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ上に９０、１６０、２３０、３００ｍＭのイミダゾールが添加されたｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒを処理して酵素を精製した。
Figure 2024505906000017
精製された酵素は、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、５０、０００ ＮＭＷＬ；Ｍｅｒｃｋ）を用いて酵素貯蔵溶液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロール、ｐＨ７．５）でバッファー交換され、ＫＭとＶｍａｘ値を計算するために精製された酵素を用いてＦＫをｄｃＩＩに切り替えようとした。このとき、反応の程度を把握するために、ＵＤＰ－Ｇｌｏ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を活用した。当該キットは、反応の副産物で発生するｆｒｅｅ ＵＤＰを発光量で測定することができるようにするので、０．１Ｍの酵素および様々な濃度のＦＫを含む２００Ｌ酵素反応液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ ＵＤＰ－グルコース、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５）を２５℃で１時間反応させた後、２５μＬを取り除き、キットを活用して発管量を測定した。反応速度と基質の濃度をＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ式に導入した後、ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ２０１９プログラムで分析することにより、ＧｔＣＧＴとＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３ＦのＫＭとＶｍａｘ値を計算した。その結果、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３ＦのＫＭ値はＧｔＣＧＴに比べて１９．５％減少した一方、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３ＦのＶｍａｘ値はＧｔＣＧＴに比べて１８．２％増加した（図１３；表１５）。つまり、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３ＦのＶｍａｘ／ＫＭ値はＧｔＣＧＴに比べて４６．８％向上し、これは、ＧｔＣＧＴＶ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ突然変異体の触媒効率が向上したことを示す。
Figure 2024505906000018
（実施形態７．遺伝子情報）
１．ｒａｖＣ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｖｉｄｕｓ（配列番号３７）
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２．ｚｈｕＩＪ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｒ１１２８（配列番号３８）
ａｔｇｃｇｔｃａｔｇｔａｇａｇｃａｔａｃａｇｔｃａｃｃｇｔｔｇｃｇｇｃｃｃｃａｇｃａｇａｃｔｔｇｇｔｔｔｇｇｇａｇｇｔａｃｔｔｇｃｃｇａｔｇｔｃｔｔａｇｇｃｔａｔｇｃｔｇａｃａｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇａｃｇｇａａａａａｇｔｔｇａａａｔｔｃｔｔｇａｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｔａｃｃａｇｇｔａｇｔｇｃｇｃｃｔｔｃａｃｇｔｃｇａｔｇｔｔｇｃｇｇｇｔｇａｇａｔｔａａｔａｃａｔｇｇａｃｃａｇｔｃｇｔｃｇｃｇａｔｔｔａｇａｃｃｃｔｇｃｇｃｇｃｃｇｃｇｔａａｔｔｇｃｔｔａｃｃｇｃｃａａｃｔｔｇａｇａｃｇｇｃｔｃｃｇａｔｃｇｔｇｇｇｃｃａｃａｔｇａｇｃｇｇｇｇａａｔｇｇｃｇｔｇｃｔｔｔｃａｃａｃｔｇｇａｔｇｃｃｇａａｃｇｔａｃｃｃａａｔｔａｇｔｃｃｔｇａｃｔｃａｃｇａｔｔｔｃｇｔａａｃｃｃｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇｇａｔｇａｃｇｇｔｔｔａｇｔｃｇｃｃｇｇａａａａｔｔｇａｃｃｃｃａｇａｔｇａｇｇｃｇｃｇｃｇａａａｔｇｔｔａｇａａｇｃｇｇｔｇｇｔａｇａａｃｇｔａａｃｔｃｔｇｔｃｇｃｃｇａｃｔｔａａａｃｇｃｇｇｔｃｃｔｔｇｇａｇａａｇｃｔｇａｇｃｇｔｃｇｃｇｔｃｃｇｃｇｃａｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｔｇｇｔａｃｃｇｔａａｃｔｇｃｇｔａａｔａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｔｃｃａｔｇｔｃａｇｇｇｃｇｃａａａａｃｃｔｔｔｔｔａｇａｃｔｔａａｇｔｔｔｔｇｃｔａｃｃｃｇｃｇａｃａｃａｃｃｇｔｃｇｇａｇｇｃｇａｃｔｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｇａｔｔｔｇｃｔｇｇａｃｃａｃｇｔａａｃｔｇｇａｇｃｃａｃｃｇｔａｔｔａｇｇａｔｔａｔｃａｃｃｔｇａｇｇａｔｔｔｃｃｃｃｇａｔｇｇｔａｔｇｇｃｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｇａｃｃｇｔｔａｃｇｔｔｇａｃｇａｃｃｃａｃａｃｔｇｇｃａｃｇｃａｃａｔｇｇａｔｇｃｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔａｔｇｇｔｃｃｃｔｔａａｇｔｇｇｇｇｇａｇｔｔｃｃｇｇｃａａａｇｔｃｇａｔｔｇａｃｃａａｇｔｇｃｃｃｔｔｇｇａａｔｇｇｔｇｃｔａｔｇｇａｃｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｔｔｇｇａｔｇｔｔｃｇｃｃａｃｇｔｇｃｃｇｇｃａｇｇａｇａｔｇｇｔａｔｔａｃｔｇｔｃｇａｔｃａｔｔｔｇａａｃｇｃｃｇｃｇｔｔｇｇａｔｇｃａｇｃａｇａｇｃａｃｇａｔｔｔｇｇｃｃｃｃｃｇｇｔｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｇｇｃｇｃｇｇａｃｇｃｔｃｔｇｔｇｇｇｇａａｃｃｃｇｃｇａａｔａｃｔｔｇａｇｃａｃｇｔｔｔｃｃｇｇｇｇｔｔａａｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇａｃａｃａａｔｔｔｔｔｇｇｔｃｇａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｔａａａｇｔｃａｔｔｇｇｃａｔｔｇａｔｇｃａｔｇｇｇｇａｃｔｇｇａｔｃｇｃｃｃｇａｔｇｇｃａｇｃｔａｔｇａｔｃｇａａｇａａｔａｃｃｇｔｃｇｔａｃｇｇｇｃｇａｔａａａｇｇａｇｃａｔｔａｔｇｇｃｃｇｇｃｔｃａｃｇｔｃｔａｔｇｇａｃｇｃａｃａｃｇｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａａｔｔａｇａｇａａｇｃｔｔａａｔａａｔｔｔｇｇｇｃｇｃｔｔｔａｃｃａｇｇａｇｃｔａｃａｇｇｇｔａｔｇａｃａｔｔｔｃａｔｇｃｔｔｔｃｃｇｇｔｔｇｃｇｇｔｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｇｇａｃｔｃｇｔｇｔｇｇｔｃｇｃｃｇｔｔｔｔｃｇａｇｃａａｇａｇｇａａｇａｇｇａｔｔａａｔａａ
３．ｔｒＴＴ７ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号３９）
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４．ＡＴＲ２ ｆｒｏｍ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号４０）
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５．ＵｒｄＧＴ２ （ＳｆＣＧＴ） ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＴＵ２７１７（配列番号４１）
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６．ＤｃＵＧＴ２ （ＤｃＣＧＴ） ｆｒｏｍ Ｄａｃｔｙｌｏｐｉｕｓ ｃｏｃｃｕｓ（配列番号４２）
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７．ＵＧＴ７０８Ａ６（ＺｍＣＧＴ） ｆｒｏｍ Ｚｅａ ｍａｙｓ （配列番号４３）
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８．ＯｓＣＧＴ ｆｒｏｍ Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（配列番号４４）
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９．ＵＧＴ７０８Ｄ１ （ＧｍＣＧＴ） ｆｒｏｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（配列番号４５）
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１０．ＧｔＵＦ６ＣＧＴ１ （ＧｔＣＧＴ） ｆｒｏｍ Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ（配列番号４６）
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１１．ＡｖＣＧＴ ｆｒｏｍ Ａｌｏｅ ｖｅｒａ（配列番号４７）
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１２．ｄｎｒＦ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ ＡＴＣＣ ２９０５０（配列番号４８）
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１３．ａｎｔＤＥＦ ｆｒｏｍ Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（配列番号４９）
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下線部は、ａｎｔＤとａｎｔＥの読み出しフレームが重なる部分を表し（すなわち、開始コドンと終結コドン部位が重なっている）、末端の太文字の小文字は、ａｎｔＥとａｎｔＦの間の配列を示す。
１４．ａｎｔＢ ｆｒｏｍ Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（配列番号５０）
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１５．ａｎｔＧ ｆｒｏｍ Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ（配列番号５１）
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１６．ＳｃｏＭＣＡＴ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（配列番号５２）
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１７．ａｃｔＶＡ－ｏｒｆ５ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（配列番号５３）
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１８．ａｃｔＶＢ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（配列番号５４）
Ａｔｇｇｃａｇｃｃｇａｃｃａｇｇｇａａｔｇｃｔｃｃｇｇｇａｃｇｃｃａｔｇｇｃｃｃｇｇｇｔｇｃｃｇｇｃｃｇｇｇｇｔｇｇｃｇｃｔｃｇｔｃａｃｃｇｃｃｃａｔｇａｃｃｇｃｇｇｇｇｇａｇｔｃｃｃｇｃａｃｇｇｔｔｔｃａｃｃｇｃｃａｇｔｔｃｇｔｔｃｇｔｇｔｃｃｇｔｃｔｃｇａｔｇｇａｇｃｃｇｃｃａｃｔｇｇｃａｃｔｇｇｔｃｔｇｃｃｔｇｇｃｔｃｇｔａｃｇｇｃｃａａｃｔｃｃｔｔｃｃｃｇｇｔｇｔｔｃｇａｃａｇｔｔｇｃｇｇｃｇａｇｔｔｃｇｃｇｇｔｇａｇｃｇｔｇｃｔｇｃｇｃｇａｇｇａｃｃａｃａｃｇｇａｃｃｔｇｇｃｃａｔｇｃｇｃｔｔｃｇｃｇｃｇｃａａｇｔｃｃｇｃｇｇａｃａａｇｔｔｃｇｃｇｇｇｃｇｇｇｇａｇｔｔｃｇｔｃｃｇｔａｃｃｇｃｇｃｇｇｇｇａｇｃｇａｃｃｇｔｇｃｔｃｇａｃｇｇａｇｃｇｇｔｃｇｃｇｇｔｃｇｔｃｇａｇｔｇｃａｃｇｇｔｃｃａｃｇａｇｃｇｃｔａｃｃｃｇｇｃｇｇｇｃｇａｃｃａｃａｔｃａｔｃｃｔｇｃｔｃｇｇｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｃｃｇｔｇｃａｃｇｔｃｇａｇｇａｇａａｇｇｇｃｇｔａｃｃｇｇｃｇｇｔｃｔａｃｇｔｇｇａｃｃｇｃｃｇｇｔｔｃｇｃｃｇｃｃｃｔｇｔｇｃｔｃｇｇｃｇｇｃｇｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃｃｇｔｃｃｇｃｃａｃｃｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｔｇｃｃｃｇｃｇｃａｔｇｃｃｇｇｃｔａａ
１９．ｐｏｂＡ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（配列番号５５）
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２０．ｄｎｒＦ Ｐ２１７Ｋ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ（最終ｄｎｒＦ突然変異）（配列番号５６）
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２１．ＧｔＣＧＴ Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ ｆｒｏｍ Ｇｅｎｔｉａｎａ ｔｒｉｆｌｏｒａ（最終ＧｔＣＧＴ突然変異）（配列番号５７）
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２２．ＡＬＳ ｆｒｏｍ Ｒｈｅｕｍ ｐａｌｍａｔｕｍ（配列番号５８）
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２３．ａｃｃＢＣ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号５９）
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２４．ａｃｃＤ１ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号６０）
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２５．ＧｔＣＧＴ Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ （ＧｔＵＦ６ＣＧＴ１ Ｖ９３Ｑ／Ｙ１９３Ｆ ） ｖａｒｉａｎｔ（配列番号６１）
ＭＧＳＬＴＮＮＤＮＬＨＩＦＬＶＣＦＩＧＱＧＶＶＮＰＭＬＲＬＧＫＡＦＡＳＫＧＬＬＶＴＬＳＡＰＥＩＶＧＴＥＩＲＫＡＮＮＬＮＤＤＱＰＩＫＶＧＳＧＭＩＲＦＥＦＦＤＤＧＷＥＳＶＮＧＳＫＰＦＤＶＷＱＹＩＮＨＬＤＱＴＧＲＱＫＬＰＩＭＬＫＫＨＥＥＴＧＴＰＶＳＣＬＩＬＮＰＬＶＰＷＶＡＤＶＡＤＳＬＱＩＰＣＡＴＬＷＶＱＳＣＡＳＦＳＡＹＹＨＹＨＨＧＬＶＰＦＰＴＥＳＥＰＥＩＤＶＱＬＰＧＭＰＬＬＫＹＤＥＶＰＤＦＬＨＰＲＴＰＹＰＦＦＧＴＮＩＬＧＱＦＫＮＬＳＫＮＦＣＩＬＭＤＴＦＹＥＬＥＨＥＩＩＤＮＭＣＫＬＣＰＩＫＰＩＧＰＬＦＫＩＰＫＤＰＳＳＮＧＩＴＧＮＦＭＫＶＤＤＣＫＥＷＬＤＳＲＰＴＳＴＶＶＹＶＳＶＧＳＶＶＹＬＫＱＥＱＶＴＥＭＡＹＧＩＬＮＳＥＶＳＦＬＷＶＬＲＰＰＳＫＲＩＧＴＥＰＨＶＬＰＥＥＦＷＥＫＡＧＤＲＧＫＶＶＱＷＳＰＱＥＱＶＬＡＨＰＡＴＶＧＦＬＴＨＣＧＷＮＳＴＱＥＡＩＳＳＧＶＰＶＩＴＦＰＱＦＧＤＱＶＴＮＡＫＦＬＶＥＥＦＫＶＧＶＲＬＧＲＧＥＬＥＮＲＩＩＴＲＤＥＶＥＲＡＬＲＥＩＴＳＧＰＫＡＥＥＶＫＥＮＡＬＫＷＫＫＫＡＥＥＴＶＡＫＧＧＹＳＥＲＮＬＶＧＦＩＥＥＶＡＲＫＴＧＴＫ
２６．ｚｈｕＩＪ－ Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅ．ｃｏｌｉ（配列番号６２）
ａｔｇｃｇｔｃａｔｇｔａｇａｇｃａｔａｃａｇｔｃａｃｃｇｔｔｇｃｇｇｃｃｃｃａｇｃａｇａｃｔｔｇｇｔｔｔｇｇｇａｇｇｔａｃｔｔｇｃｃｇａｔｇｔｃｔｔａｇｇｃｔａｔｇｃｔｇａｃａｔｃｔｔｃｃｃａｃｃｇａｃｇｇａａａａａｇｔｔｇａａａｔｔｃｔｔｇａｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇａｔａｃｃａｇｇｔａｇｔｇｃｇｃｃｔｔｃａｃｇｔｃｇａｔｇｔｔｇｃｇｇｇｔｇａｇａｔｔａａｔａｃａｔｇｇａｃｃａｇｔｃｇｔｃｇｃｇａｔｔｔａｇａｃｃｃｔｇｃｇｃｇｃｃｇｃｇｔａａｔｔｇｃｔｔａｃｃｇｃｃａａｃｔｔｇａｇａｃｇｇｃｔｃｃｇａｔｃｇｔｇｇｇｃｃａｃａｔｇａｇｃｇｇｇｇａａｔｇｇｃｇｔｇｃｔｔｔｃａｃａｃｔｇｇａｔｇｃｃｇａａｃｇｔａｃｃｃａａｔｔａｇｔｃｃｔｇａｃｔｃａｃｇａｔｔｔｃｇｔａａｃｃｃｇｔｇｃａｇｃｃｇｇｇｇａｔｇａｃｇｇｔｔｔａｇｔｃｇｃｃｇｇａａａａｔｔｇａｃｃｃｃａｇａｔｇａｇｇｃｇｃｇｃｇａａａｔｇｔｔａｇａａｇｃｇｇｔｇｇｔａｇａａｃｇｔａａｃｔｃｔｇｔｃｇｃｃｇａｃｔｔａａａｃｇｃｇｇｔｃｃｔｔｇｇａｇａａｇｃｔｇａｇｃｇｔｃｇｃｇｔｃｃｇｃｇｃａｇｃｃｇｇｔｇｇａｇｔｔｇｇｔａｃｃｇｔａａｃｔｇｃｇｔａａｔａａｔａａｔｔｔｔｇｔｔｔａａｃｔｔｔａａｇａａｇｇａｇａｔａｔａｔｃｃａｔｇｔｃａｇｇｇｃｇｃａａａａｃｃｔｔｔｔｔａｇａｃｔｔａａｇｔｔｔｔｇｃｔａｃｃｃｇｃｇａｃａｃａｃｃｇｔｃｇｇａｇｇｃｇａｃｔｃｃｇｇｔｇｇｔｇｇｔａｇａｔｔｔｇｃｔｇｇａｃｃａｃｇｔａａｃｔｇｇａｇｃｃａｃｃｇｔａｔｔａｇｇａｔｔａｔｃａｃｃｔｇａｇｇａｔｔｔｃｃｃｃｇａｔｇｇｔａｔｇｇｃｔａｔｔｔｃｃａａｔｇａｇａｃｃｇｔｔａｃｇｔｔｇａｃｇａｃｃｃａｃａｃｔｇｇｃａｃｇｃａｃａｔｇｇａｔｇｃｇｃｃａｃｔｇｃａｃｔａｔｇｇｔｃｃｃｔｔａａｇｔｇｇｇｇｇａｇｔｔｃｃｇｇｃａａａｇｔｃｇａｔｔｇａｃｃａａｇｔｇｃｃｃｔｔｇｇａａｔｇｇｔｇｃｔａｔｇｇａｃｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｔｔｇｇａｔｇｔｔｃｇｃｃａｃｇｔｇｃｃｇｇｃａｇｇａｇａｔｇｇｔａｔｔａｃｔｇｔｃｇａｔｃａｔｔｔｇａａｃｇｃｃｇｃｇｔｔｇｇａｔｇｃａｇｃａｇａｇｃａｃｇａｔｔｔｇｇｃｃｃｃｃｇｇｔｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｇｇｃｇｃｇｇａｃｇｃｔｃｔｇｔｇｇｇｇａａｃｃｃｇｃｇａａｔａｃｔｔｇａｇｃａｃｇｔｔｔｃｃｇｇｇｇｔｔａａｃｔｇｇｇａａｇｇｇｇａｃａｃａａｔｔｔｔｔｇｇｔｃｇａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｔａａａｇｔｃａｔｔｇｇｃａｔｔｇａｔｇｃａｔｇｇｇｇａｃｔｇｇａｔｃｇｃｃｃｇａｔｇｇｃａｇｃｔａｔｇａｔｃｇａａｇａａｔａｃｃｇｔｃｇｔａｃｇｇｇｃｇａｔａａａｇｇａｇｃａｔｔａｔｇｇｃｃｇｇｃｔｃａｃｇｔｃｔａｔｇｇａｃｇｃａｃａｃｇｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａａｔｔａｇａｇａａｇｃｔｔａａｔａａｔｔｔｇｇｇｃｇｃｔｔｔａｃｃａｇｇａｇｃｔａｃａｇｇｇｔａｔｇａｃａｔｔｔｃａｔｇｃｔｔｔｃｃｇｇｔｔｇｃｇｇｔｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｇｔｇｇａｃｔｃｇｔｇｔｇｇｔｃｇｃｃｇｔｔｔｔｃｇａｇｃａａｇａｇｇａａｇａｇｇａｔｔａａｔａａ
ＦＫ：フラボケルメス酸（ｆｌａｖｏｋｅｒｍｅｓｉｃ ａｃｉｄ）
ＫＡ：ケルメス酸（ｋｅｒｍｅｓｉｃ ａｃｉｄ）
ＣＡ：カルミン酸（ｃａｒｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）
本発明によるＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、野生型Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼに比べてグリコシド結合生成能が向上しており、ポリケチド群および類似天然物、特に、タイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩポリケチド、非リボソームペプチド、フェニルプロパノイドおよびその他の芳香族天然物の配糖体生産効果を高めることができる。したがって、本発明に係るＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体は、天然物のポリケチド配糖体生産を通じて、増加するＣ－グリコシド化合物を構成成分とする薬物、食品添加剤、栄養補助剤などの製造に有用に活用することができるであろう。

Claims (26)

  1. 配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼ（Ｃ－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）において、Ｆ１７、Ｖ９３、Ｖ１３２、Ｙ１９３、Ｌ１６４およびＲ３２２からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に変異を含むＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
  2. 前記変異体は、配列番号１で表されるＣ－グリコシルトランスフェラーゼにおいて、以下からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸に変異をさらに含む、請求項１に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
    Ｆ１７、Ｖ４０５、Ｐ１０７、Ｌ２０８、Ｌ１６４、Ｐ４５、Ｉ３０５、Ｌ３１６、Ｆ４０１、Ｙ９４、Ｎ５７、Ｙ１８７、Ｃ１６、Ｐ３１９、Ｆ１６７、Ｖ１３２、Ｎ２０６、Ｒ４０６、Ｑ３８６、Ｖ１２９、Ｌ１２５、Ｌ１９４、Ｉ９５、Ｓ２１５、Ｌ１８４、Ｙ１５８、Ｌ２９、Ｌ２７、Ｆ２０２、Ｈ１５９、Ｓ３７０、Ｈ３６５、Ｖ３２９、Ｍ３０１、Ｖ３１５、Ｖ１９０、Ｃ３６６、Ｗ８０、Ｌ５８、Ｑ２１０、Ｆ３１２、Ｄ６１、Ｉ２０７、Ｌ３６３、Ｐ１９６、Ｌ１０６、Ｖ９３、Ａ３９４、Ｗ３１４、Ｓ１５５、Ｐ８８、Ｄ９９、Ｙ２８４、Ｅ１８９、Ｇ４９、Ｈ３２８、Ｅ３９９、Ｔ３９２、Ｆ３８７、Ａ４４、Ｐ１９９、Ｅ４６、Ｒ２８、Ｖ２８５、Ｉ１２４、Ｒ４１９、Ｌ３０６、Ｙ１５７、Ｙ２００、Ｅ３７３、Ｐ１９１、Ｌ２１４、Ｓ３７６、Ｖ１５、Ｅ３３２、Ｅ５１、Ｉ４１７、Ｌ９８、Ｉ３２３、Ｈ１６１、Ｔ３８３、Ｐ１２７、Ｅ３０９、Ｎ８４、Ｌ３１３、Ｑ１０４、Ｔ３７１、Ｎ２１３、Ｇ７９、Ｌ３３０、Ｎ３０７、Ｋ１０５、Ｌ１２８、Ａ１５２、Ｉ１８、Ｎ５９、Ｗ１４７、Ｓ８６、Ｌ２９３、Ｅ２９６、Ｓ３７７、Ｌ１８５、Ｋ２１６、Ｆ８９、Ｓ２８６、Ｆ３９６、Ｆ２１１、Ｙ３０３、Ｄ２２３、Ｒ４１５、Ｎ９６、Ｖ２２、Ｓ１５３、Ｆ１５４、Ｄ１９２、Ｙ１９３、Ｈ１９５、Ｐ２０１、Ｙ２９２、およびＲ３２２。
  3. 前記アミノ酸変異は、Ｖ９３およびＹ１９３アミノ酸に変異を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
  4. Ｆ１７Ｇ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ１３２Ａ、Ｙ１９３Ｆ、Ｌ１６４ＧおよびＲ３２２Ｄからなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
  5. Ｖ９３ＱおよびＹ１９３Ｆアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項３に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
  6. 以下からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
    Ｆ１７Ｇ、Ｖ４０５Ｍ、Ｐ１０７Ｇ、Ｌ２０８Ｇ、Ｌ１６４Ｇ、Ｐ４５Ｇ、Ｉ３０５Ａ、Ｌ３１６Ｇ、Ｆ４０１Ｈ、Ｙ９４Ｇ、Ｎ５７Ｇ、Ｙ１８７Ａ、Ｃ１６Ｇ、Ｐ３１９Ｇ、Ｆ１６７Ｇ、Ｖ１３２Ａ、Ｎ２０６Ｅ、Ｒ４０６Ｇ、Ｑ３８６Ｈ、Ｖ１２９Ａ、Ｌ１２５Ｖ、Ｌ１９４Ａ、Ｉ９５Ｇ、Ｓ２１５Ｄ、Ｌ１８４Ｇ、Ｙ１５８Ｔ、Ｌ２９Ａ、Ｌ２７Ａ、Ｆ２０２Ｓ、Ｈ１５９Ｇ、Ｓ３７０Ａ、Ｈ３６５Ｇ、Ｖ３２９Ｔ、Ｍ３０１Ｗ、Ｖ３１５Ａ、Ｖ１９０Ａ、Ｃ３６６Ｇ、Ｗ８０Ｙ、Ｌ５８Ｅ、Ｑ２１０Ｇ、Ｆ３１２Ｇ、Ｄ６１Ｇ、Ｉ２０７Ｐ、Ｌ３６３Ｇ、Ｐ１９６Ｇ、Ｌ１０６Ｇ、Ｖ９３Ｇ、Ａ３９４Ｇ、Ｗ３１４Ｃ、Ｓ１５５Ａ、Ｐ８８Ｄ、Ｄ９９Ｇ、Ｙ２８４Ｈ、Ｅ１８９Ａ、Ｇ４９Ｔ、Ｈ３２８Ｇ、Ｅ３９９Ｄ、Ｔ３９２Ａ、Ｆ３８７Ｔ、Ａ４４Ｇ、Ｐ１９９Ｅ、Ｅ４６Ｇ、Ｒ２８Ｇ、Ｖ２８５Ｉ、Ｉ１２４Ｔ、Ｒ４１９Ａ、Ｌ３０６Ｍ、Ｙ１５７Ｔ、Ｙ２００Ｌ、Ｅ３７３Ａ、Ｐ２０１Ｇ、Ｐ１９１Ｇ、Ｌ２１４Ａ、Ｓ３７６Ｇ、Ｖ１５Ｇ、Ｅ３３２Ｐ、Ｅ５１Ｃ、Ｉ４１７Ｌ、Ｌ９８Ｇ、Ｉ３２３Ａ、Ｈ１６１Ｇ、Ｔ３８３Ｃ、Ｐ１２７Ａ、Ｅ３０９Ｎ、Ｎ８４Ｓ、Ｌ３１３Ｔ、Ｑ１０４Ｄ、Ｔ３７１Ａ、Ｎ２１３Ｌ、Ｇ７９Ｓ、Ｌ３３０Ｇ、Ｎ３０７Ａ、Ｋ１０５Ｇ、Ｌ１２８Ｄ、Ａ１５２Ｇ、Ｓ１５３Ｇ、Ｉ１８Ａ、Ｎ５９Ｖ、Ｗ１４７Ｆ、Ｓ８６Ｖ、Ｌ２９３Ｖ、Ｅ２９６Ｄ、Ｓ３７７Ａ、Ｌ１８５Ｖ、Ｋ２１６Ｒ、Ｆ８９Ａ、Ｓ２８６Ｃ、Ｆ３９６Ｌ、Ｆ２１１Ｇ、Ｙ３０３Ａ、Ｄ２２３Ｇ、Ｒ４１５Ｌ、Ｎ９６Ａ、Ｖ２２Ｈ、Ｖ９３Ｑ、Ｖ９３Ｌ、Ｓ１５３Ｃ、Ｆ１５４Ｌ、Ｄ１９２Ｓ、Ｙ１９３Ｆ、Ｈ１９５Ｙ、Ｈ１９５Ｌ、Ｐ２０１Ｔ、Ｙ２９２Ｈ、Ｙ２９２Ｆ、Ｒ３２２ＤおよびＲ３２２Ａ。
  7. 以下からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする、請求項４に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
    Ｉ１８Ｐ、Ｑ２０Ｍ、Ｔ５０Ｎ、Ｔ５０Ｑ、Ｔ５０Ｋ、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｖ、Ｉ９５Ｍ、Ｉ９５Ｔ、Ｖ２９０Ｇ、Ｖ２９０Ａ、Ｉ３２３Ｓ、Ｉ３２３Ａ、Ｉ９５Ｌ、Ｖ２２Ａ、Ｌ２９Ａ、Ｅ４６Ｇ、Ｖ４８Ｇ、Ｅ５１Ｃ、Ａ５５Ｓ、Ｓ８６Ｖ、Ｄ９９Ｇ、Ｒ１０３Ｖ、Ｃ１５１Ｇ、Ｌ１８４Ｇ、Ｌ１９４Ａ、Ｅ３３２Ｐ、Ｉ１８ＡおよびＰ３８５Ａ。
  8. 以下からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸置換をさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体。
    Ｉ３２３Ｓ、Ｔ５０Ｒ、Ｔ５０Ｖ、Ｉ１８Ｐ、Ｉ９５Ｔ、Ｑ２０Ｍ、Ｉ３２３Ａ、Ｐ３８５Ａ、Ｌ１９４ＡおよびＶ４８Ｇ。
  9. 請求項１～８のいずれか一項に記載の変異体をコードする核酸。
  10. 請求項９に記載の核酸が導入された組換え微生物。
  11. 前記組換え微生物は、ＵＴＰ－グルコース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ＵＴＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ－１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、ホスホグルコムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｕｃｏｍｕｔａｓｅ）および／またはヌクレオシド二リン酸キナーゼ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）をコードする遺伝子の発現が強化されていることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
  12. 前記組換え微生物は、ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体生産用であることを特徴とする、請求項１０に記載の組換え微生物。
  13. 前記組換え微生物は、ポリケチド合成酵素またはフェニルプロパノイド合成酵素がさらに導入されていることを特徴とする、請求項１２に記載の組換え微生物。
  14. 前記組換え微生物は、ｐａｂＡ遺伝子の発現が弱化されていることを特徴とする、請求項１２に記載の組換え微生物。
  15. 前記ポリケチドは、
    ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、リファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）、エバーメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）、イベルメクチン（ｉｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、カリケアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、エポチロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）、三酢酸ラクトン（ｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｌａｃｔｏｎｅ）、および６－メチルサリチル酸（６－ｍｅｔｈｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）からなる群から選択されるタイプＩポリケチドと、
    アクチノロージン（ａｃｔｉｎｏｒｈｏｄｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、オキシテトラサイクリン（ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ＳＥＫ４、ＳＥＫ４ｂ、ＳＥＫ３４、ＳＥＫ１５、ＳＥＫ２６、ＦＫ５０６、ＤＭＡＣ、アクラビノン（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ）、アクラノン酸（ａｋｌａｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、イプシロン・ロドマイシノン（ｅｐｓｉｌｏｎ－ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、カルミン酸（ｃａｒｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）およびフレノリシン（ｆｒｅｎｏｌｉｃｉｎ）からなる群から選択されるタイプＩＩポリケチドと、
    アロエシン（ａｌｏｅｓｉｎ）、アロエニン（ａｌｏｅｎｉｎ）、バルバロイン（ｂａｒｂａｌｏｉｎ）、５、７－ジヒドロキシ－２－メチルクロモン（５、７－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－２－ｍｅｔｈｙｌｃｈｒｏｍｏｎｅ）およびアロエソン（ａｌｏｅｓｏｎｅ）からなる群から選択されるタイプＩＩＩポリケチドとからなる群から選択され、
    前記フェニルプロパノイドは、アクチノマイシン（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、バシトラシン（ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ）、ダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、バンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）、テイクソバクチン（ｔｅｉｘｏｂａｃｔｉｎ）、チロシジン（ｔｙｒｏｃｉｄｉｎｅ）、グラミシジン（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ）、ズウィッターマイシンＡ（ｚｗｉｔｔｅｒｍｉｃｉｎ Ａ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、ピオベルジン（ｐｙｏｖｅｒｄｉｎｅ）、エンテロバクチン（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｉｎ）、ミクソケリンＡ（ｍｙｘｏｃｈｅｌｉｎ Ａ）、インジゴイジン（ｉｎｄｉｇｏｉｄｉｎｅ）、シアノフィシン（ｃｙａｎｏｐｈｙｃｉｎ）などからなる非リボソームペプチド、ピノセンブリン（ｐｉｎｏｃｅｍｂｒｉｎ）、ジヒドロケンペロール（ｄｉｈｙｄｒｏｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、エリオジクチオール（ｅｒｉｏｄｉｃｔｙｏｌ）、ジヒドロクェルセチン（ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、コニフェリルアルコール（ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、シリビニン（ｓｉｌｙｂｉｎ）、イソシリビン（ｉｓｏｓｉｌｙｂｉｎ）、シリクリスチン（ｓｉｌｙｃｈｒｉｓｔｉｎ）、シリナイド（ｓｉｌｉｎｉｄｅ）、２、３－ジヒドロシリビン（２、３－ｄｅｈｙｄｒｏｓｉｌｙｂｉｎ）、シリジアニン（ｓｉｌｙｄｉａｎｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、アピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）、ルテオリン（ｌｕｔｅｏｌｉｎ）、ケンペロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）、クェルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）、ペラルゴニジン（ｐｅｌａｒｇｏｎｉｄｉｎ）、シアニジン（ｃｙａｎｉｄｉｎ）、アフゼレチン（ａｆｚｅｌｅｃｈｉｎ）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）、フィセチン（ｆｉｓｅｔｉｎ）、ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ）、ヘスペレチン（ｈｅｓｐｅｒｅｔｉｎ）、タンゲレチン（ｔａｎｇｅｒｉｔｉｎ）、デルフィニジン（ｄｅｌｐｈｉｎｉｄｉｎ）、エピカテキン（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ）、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ）、レスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）およびナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の組換え微生物。
  16. （ｉ）タイプＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子と、
    （ｉｉ）４’－ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（４’－ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をコードする遺伝子と、
    （ｉｉｉ）シクラーゼ（ｃｙｃｌａｓｅ）をコードする遺伝子と、
    （ｉｖ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅｔｙｌ－ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子と、
    （ｖ）アクラビネオン１２－水酸化酵素（ａｋｌａｖｉｎｏｎｅ １２－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子とからなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子がさらに導入され、
    前記ポリケチド配糖体はカルミン酸であることを特徴とする、請求項１２に記載の組換え微生物。
  17. 前記タイプＩＩポリケチド生合成酵素をコードする遺伝子は、ａｎｔＤ（ｋｅｔｏｓｙｎｔｈａｓｅ）、ａｎｔＥ（ｃｈａｉｎ－ｌｅｎｇｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ａｎｔＦ（ＡＣＰ）、ａｎｔＢ（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）およびａｎｔＧ（ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ：ＡＣＰ ｍａｌｏｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）からなる群から選択されるいずれか１つ以上の遺伝子またはそれらの組み合わせであることを特徴とする、請求項１６に記載の組換え微生物。
  18. 前記アクラビネオン１２－水酸化酵素は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、２１７番目のアミノ酸がプロリンからリジンへの変異（Ｐ２１７Ｋ）を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の組換え微生物。
  19. 前記タイプＩＩポリケチド生合成酵素は、Ｐ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来、
    前記４’－ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＰ．ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ由来、
    前記シクラーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来、
    前記アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来、および／または
    前記アクラビネオン１２－水酸化酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ由来であることを特徴とする、請求項１６に記載の組換え微生物。
  20. （ｉ）アロエゾン合成酵素（ａｌｏｅｓｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子が導入されており、
    前記ポリケチド配糖体はアロエシンであることを特徴とする、請求項１２に記載の組換え微生物。
  21. 前記アロエゾン合成酵素は、Ｒ．ｐａｌｍａｔｕｍ由来であることを特徴とする、請求項２０に記載の組換え微生物。
  22. 以下のステップを含むポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の製造方法。
    （ａ）請求項１０に記載の組換え微生物を培養してポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を生成するステップと、
    （ｂ）前記生成されたポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を回収するステップ。
  23. 前記組換え微生物は、ポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の前駆体生産能を有することを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
  24. 前記ステップ（ａ）は、請求項１０に記載の組換え微生物をポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドが添加された培地で培養することを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
  25. 前記ポリケチド配糖体はカルミン酸であり、前記ステップ（ａ）は、培養時に培養培地にアスコルビン酸を添加して微生物を培養することを特徴とする、請求項２２に記載の製造方法。
  26. 以下のステップを含むポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体の製造方法。
    （ａ）請求項１～８のいずれか１項に記載のＣ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体または前記Ｃ－グリコシルトランスフェラーゼ変異体を発現する微生物とポリケチドおよび／またはフェニルプロパノイドとを反応させてポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を生成するステップと、
    （ｂ）前記生成されたポリケチド配糖体および／またはフェニルプロパノイド配糖体を回収するステップ。
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