JP7432489B2 - アシルアミノ酸の生成 - Google Patents

Description

関連出願の引用
本願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７８８，３４６号の優先権を主張する。この出願の内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。

アシルアミノ酸は、商業上重要な化合物である。多くは、有利な特徴を有し、かつ界面活性剤、抗生物質、抗昆虫剤として、および種々の他の重要な薬剤として販売される。

伝統的には、アシルアミノ酸は、化学的に製造されている。このような化学的製造方法は、種々の欠点、例としては、出発材料を得ることおよび貯蔵することのしやすさ、製造過程で有害であり時には危険な化学的試薬を用いる必要性、合成自体の困難性および効率、化学的副産物の廃棄の会計的および環境的なコストなどによって妨害される。したがって、アシルアミノ酸の効率的でかつ費用効果的な合成、および商業的規模での製造のための新規な組成物および方法が有益である。
近年、操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドによるアシルアミノ酸の生成を可能にする重要な技術が開発された（２０１１年７月１９日発行、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７９８１６８５号を参照のこと）。このような技術に対する改善および／または補完が望ましく、かつ有益である。

米国特許第７９８１６８５号明細書

特定の実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸の生成で有用な組成物および方法を包含する。特定の実施形態では、本発明は、ペプチドシンテターゼドメインを含む操作されたポリペプチドを提供し；いくつかのこのような実施形態では、操作されたポリペプチドは、単一のペプチドシンテターゼドメインのみを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、チオエステラーゼドメイン、および／またはレダクターゼドメインを実質的に含まない操作されたペプチドシンテターゼを提供する。

特定の実施形態では、本発明は、複数の異なる形態のアシルアミノ酸を含むアシルアミノ酸組成物を提供する。いくつかのこのような組成物では、組成物内のアシルアミノ酸の実質的に全てが、同じアミノ酸部分を含み、かつアシル部分に関しては異なる。本発明者らはまた、例えば、９５％の脂肪酸が１つの長さ（Ｃ１４、ミリスチン）である集団も記載した。

いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたペプチドシンテターゼと、操作されたペプチドシンテターゼのためのアミノ酸基質およびアシル実体基質とを、アシルアミノ酸組成物を作製するために十分な条件下および時間の間、接触させることによって、アシルアミノ酸組成物を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、操作されたペプチドシンテターゼを発現するように操作された細胞を提供するステップを含む。いくつかの実施形態では、この操作されたペプチドシンテターゼは、チオエステラーゼドメインを含まず；いくつかの実施形態では、この操作されたペプチドシンテターゼ（synthestase）は、レダクターゼドメインを含まない；いくつかの実施形態では、この操作されたペプチドシンテターゼは、チオエステラーゼドメインもレダクターゼドメインも含まない。

いくつかの実施形態では、アミノ酸基質は、本明細書に記載されるアミノ酸であるか、またはそれらのアミノ酸を含む。

いくつかの実施形態では、アシル実体基質は、脂肪酸部分であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、アシル実体基質は、脂肪酸であるか、またはそれを含む。

本発明は、アシルアミノ酸を合成する少なくとも１つの操作されたペプチドシンテターゼを発現するように操作された細胞を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、操作されたペプチドシンテターゼによって産生されるアシルアミノ酸組成物を含む。

本発明は、ある生成物を調製する方法であって、操作された宿主（例えば、微生物）細胞中で調製されたアシルアミノ酸組成物を用意する、または得るステップ；必要に応じて、アシルアミノ酸組成物を特定のアシルアミノ酸について富化するステップ；およびいくつかの実施形態では、この富化されたアシルアミノ酸組成物と、少なくとも１つの他の成分とを組み合わせて、ある生成物を生成するステップを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、単一のペプチドシンテターゼドメインを含み、かつチオエステラーゼドメイン、および／またはレダクターゼドメインのいずれかを欠く、操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドと、（ｉ）ペプチドシンテターゼポリペプチドのアミノ酸基質；および（ｉｉ）ペプチドシンテターゼポリペプチドのアシル部分基質（substate）、とを接触させるステップを含み、この接触は、操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドが、アシル部分をアシル部分基質からアミノ酸へ共有結合し、その結果アシルアミノ酸が生成される条件下でかつ十分な時間行われる、方法を提供する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
操作されたペプチドシンテターゼと、前記操作されたペプチドシンテターゼのためのアミノ酸基質およびアシル実体基質とを、アシルアミノ酸組成物を作製するために十分な条件下および時間の間、接触させることによって、アシルアミノ酸組成物を作製する方法。
（項目１Ａ）
前記操作されたペプチドシンテターゼが、アデニル化（Ａ）ドメイン、チオール化（Ｔ）ドメイン、および縮合（Ｃ）ドメインを含む、項目１に記載の方法。
（項目１Ａ１）
前記操作されたペプチドシンテターゼが、チオエステラーゼドメイン、および／またはレダクターゼドメインを欠く、項目１または項目１Ａに記載の方法。
（項目１Ａ１ａ）
前記操作されたペプチドシンテターゼが、単一のペプチドシンテターゼドメインのみを含有する、項目１または項目１Ａ１に記載の方法。
（項目１Ａ２）
前記操作されたペプチドシンテターゼが、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ中で第１のドメインとして見出されるペプチドシンテターゼドメインであるか、またはそれを含む、項目１または項目１Ａ１ａに記載の方法。
（項目１Ｂ）
アシルアミノ酸組成物が、顕著な成分としてアシルアミノ酸を含み、そのアミノ酸部分がグリシンまたはグルタミン酸からなる群から選択されるアミノ酸由来であり、かつそのアシル部分が、ミリスチン酸および／またはラウリン酸からなる群から選択される脂肪酸由来である、項目１または項目１Ａに記載の方法。
（項目１Ｃ）
前記接触させるステップが、少なくとも１つの操作されたペプチドシンテターゼを発現するように操作された細胞を提供するステップを含む、先行する項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２）
アシルアミノ酸を合成する少なくとも１つの操作されたペプチドシンテターゼを発現するように操作された細胞。
（項目３）
操作されたペプチドシンテターゼによって産生されたアシルアミノ酸組成物。
（項目３Ｂ）
前記組成物中の前記アシルアミノ酸の実質的に全てが、同じアミノ酸成分を含有する、項目３に記載の組成物。
（項目３Ｃ）
前記組成物中のアシルアミノ酸が異なるアシル部分を含む、項目３～３Ｂのいずれか１項に記載の組成物。
（項目４）
生成物を調製する方法であって：
操作された微生物細胞中で調製されるアシルアミノ酸組成物を用意する、または得るステップと；
前記アシルアミノ酸組成物を特定のアシルアミノ酸について富化するステップと；
前記富化されたアシルアミノ酸組成物と少なくとも１つの他の成分とを組み合わせて生成物を産生するステップと；
を含む、方法。
（項目５）
単一のペプチドシンテターゼドメインを含み、かつチオエステラーゼドメイン、および／またはレダクターゼドメインを欠く、操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドと：
前記ペプチドシンテターゼポリペプチドのアミノ酸基質；および
前記ペプチドシンテターゼポリペプチドのアシル部分基質と
を接触させるステップを含み、
前記接触させるステップが、前記操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドが、前記アシル部分基質からのアシル部分を前記アミノ酸へ共有結合し、その結果アシルアミノ酸が生成される条件下でかつ十分な時間行われる、方法。
（項目５Ａ）
前記操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドが細胞によって産生される、項目５に記載の方法。
（項目５Ａ１）
前記細胞が微生物細胞である、項目５Ａに記載の方法。
（項目５Ａ１ａ）
前記細胞が細菌細胞である、項目５Ａ１に記載の方法。
（項目５Ａ２）
前記接触させるステップが、前記細胞と前記基質とを接触させるステップを含む、項目１Ａ、１Ａ１、または１Ａ１ａのいずれか１項に記載の方法。
（項目５Ｂ）
前記細胞が操作された細胞である、項目５に記載の方法。
（項目１Ｃ）
前記ペプチドシンテターゼポリペプチドが操作されたペプチドシンテターゼポリペプチドであるという点で、前記細胞が遺伝子操作されている、項目５Ｂに記載の方法。

陰イオン性界面活性剤を示す。 両イオン性界面活性剤を示す。 ベタインを示す。 陰イオン性界面活性剤を示す。

特定の実施形態の説明
定義
アシルアミノ酸：「アシルアミノ酸」という用語は、本明細書において用いる場合、脂肪酸部分に対して共有結合されているアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸および脂肪酸は、脂肪酸のカルボン酸基とアミノ酸のアミノ基との間で形成されたアミド結合を介して共有結合されている。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸中に利用されるかまたは含まれる脂肪酸部分または実体は、β－ヒドロキシル基を含み；いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸中に利用されるか、または含まれる脂肪酸部分または実体は、β－ヒドロキシル基を含まない。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸中で利用されるかまたは含まれる脂肪酸部分は、β－アミノ基を含み；いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸中に利用されるかまたは含まれる脂肪酸部分または実体は、β－アミノ基（aminno group）を含まない。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸中に利用されるかまたは含まれる脂肪酸部分は、β位で未修飾である。

アミノ酸：本明細書において用いる場合、「アミノ酸」という用語は、その広義の意味では、ペプチド合成（例えば、リボソームまたは非リボソーム合成）で利用され得る、任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、例えば、１つまたは複数のペプチド結合の形成を通じてポリペプチド鎖中に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ペプチドシンテターゼの基質である任意の化合物および／または物質である；いくつかのこのような実施形態では、アミノ酸は、その上でペプチドシンテターゼがアシル実体を、例えば、アミド結合の形成を通じて連結し得る、任意の化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般的構造Ｈ_２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、合成のアミノ酸である；いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸である；いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準的なアミノ酸」とは、天然に存在するペプチド中で共通して見出される任意の２０個の標準的なＬアミノ酸を指す。「標準的でないアミノ酸」とは、それが合成的に調製されるか、または天然の供給源から得られるかにかかわらず、標準的なアミノ酸以外の任意のアミノ酸のことを指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドにおけるカルボキシ末端および／またはアミノ末端のアミノ酸を含むアミノ酸は、上記の一般的構造と比較して構造的な修飾を含有してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般的構造と比較して、メチル化、アミド化、アセチル化、および／または置換によって修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、このような修飾は、例えば、それ以外では同一の未修飾のアミノ酸を含有しているものと比較した場合、修飾されたアミノ酸を含有しているポリペプチドの循環半減期を変更し得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、それ以外は同一の未修飾のアミノ酸を含有しているものと比較した場合、修飾されたアミノ酸を含有しているポリペプチドの関連の活性を有意に変更しない。文脈上明らかであるとおり、いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、遊離のアミノ酸を指して用いられる；いくつかの実施形態では、この用語は、ポリペプチドのアミノ酸残基を指して用いられる。いくつかの実施形態では、「天然に存在する」アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンを含む、ほとんどの生物のポリペプチドの構築ブロックである２０個のアミノ酸の標準的な群のうち１つである。特定の実施形態では、「天然に存在する」アミノ酸とは、用いられる頻度が低く、かつ通常は、２０個の標準的な群には含まれないが、にもかかわらず１つまたは複数の生物によってなお用いられ、特定のポリペプチドに組み込まれるアミノ酸であり得る。例えば、コドンＵＡＧおよびＵＧＡは正常には、ほとんどの生物中の終止コドンをコードする。しかし、いくつかの生物では、コドンＵＡＧおよびＵＧＡは、アミノ酸セレノシステインおよびピロリジンをコードする。したがって、特定の実施形態では、セレノシステインおよびピロリジンは天然に存在するアミノ酸である。

関連した（associated with）：２つの事象または実体は、一方の存在、レベルおよび／または形態が、もう一方のものと相関している場合に、その用語が本明細書で用いられるように、お互いと「関連している（associated）」。例えば、特定の実体（例えば、ポリペプチド）は、その存在、レベルおよび／または形態が疾患、障害または状態の発生率および／または感受性と相関している場合（例えば、関連の集団にまたがって）、その特定の疾患、障害または状態と関連しているとみなされる。いくつかの実施形態では、２つまたはそれ超の実体は、それらがお互いと物理的に近接しており、かつ近接したまま直接または間接的に相互作用する場合、お互いと物理的に「関連している、会合している（associated）」。いくつかの実施形態では、お互いと物理的に会合している２つまたはそれ超の実体は、お互いに共有結合している；いくつかの実施形態では、お互いと物理的に会合している２つまたはそれ超の実体は、お互いと共有結合はしていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁力およびそれらの組合せによって非共有結合的に会合している。

β－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメイン：「β－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメイン」という用語は、本明細書において用いる場合、β－ヒドロキシ脂肪酸をアミノ酸に共有結合して、アシルアミノ酸を形成するポリペプチドドメインを指す。種々のβ－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメインが、当業者に公知である。しかし、異なるβ－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメインは、１つまたは複数のβ－ヒドロキシ脂肪酸について特異性を示す場合が多い。１つの非限定的な例として、サーファクチンシンテターゼ由来のβ－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメインは、脂肪酸鎖中に１３～１５個の炭素を含有する、β－ヒドロキシミリスチン酸に特異的である。したがって、サーファクチンシンテターゼ由来のβ－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメインは、脂肪酸β－ヒドロキシミリスチン酸を含むアシルアミノ酸の生成に有用な操作されたポリペプチドを構築するために本発明によって用いられ得る。

β－ヒドロキシ脂肪酸：「β－ヒドロキシ脂肪酸」という用語は、本明細書において用いる場合、脂肪酸鎖のβ位でヒドロキシ基を含む脂肪酸鎖を指す。当業者によって理解されるとおり、β位は、脂肪酸鎖の第３の炭素に相当し、第１の炭素は、カルボキシレート基の炭素である。したがって、本発明のアシルアミノ酸に対する言及で用いる場合、脂肪酸のカルボン酸部分は、アミノ酸の窒素に共有結合されている場合、β位は、エステル基を有している炭素から除去された２つの炭素の炭素に相当する。本発明によって用いられるべきβ－ヒドロキシ脂肪酸は、脂肪酸鎖中に任意の数の炭素原子を含有してもよい。非限定的な例として、β－ヒドロキシ脂肪酸は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、３、１４、１５、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれまたはそれ超の炭素原子を含有してもよい。本発明によって用いられるべきβ－ヒドロキシ脂肪酸は、直鎖の炭素鎖を含有してもよく、ここで鎖の各々の炭素は、アミノ酸の末端の炭素原子および窒素に結合した炭素を除いて、２つの他の炭素原子に直接共有結合されている。さらにまたはあるいは、本発明によって用いられるべきβ－ヒドロキシ脂肪酸は、分岐した炭素鎖を含有してもよく、ここでこの鎖の少なくとも１つの炭素が３つまたはそれ超の他の炭素原子に直接共有結合されている。本発明によって用いられるべきβ－ヒドロキシ脂肪酸は、隣接する炭素原子の間に１つまたは複数の二重結合を含んでもよい。あるいは、本発明によって用いられるべきβ－ヒドロキシ脂肪酸は、隣接する炭素原子の間に単結合のみを含有してもよい。本発明によって用いられ得る非限定的な例のβ－ヒドロキシ脂肪酸は、脂肪酸鎖の中に１３～１５個の炭素を含有するβ－ヒドロキシ酸であるか、またはそれを含む；いくつかの実施形態では、本発明によって用いられ得る例示的なβ－ヒドロキシ脂肪酸は、ミリスチン酸であるか、またはそれを含み、ミリスチンとは、通常１４個の炭素を意味して用いられる。当業者は、本発明によって用いられ得る種々のβ－ヒドロキシ脂肪酸を承知している。他のβヒドロキシ脂肪酸（例えば、天然に存在するか、または天然には存在しないβ－ヒドロキシ脂肪酸）について特異性を示す異なるβ－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメインを、本発明によって用いて、実施者の選ぶ任意のアシルアミノ酸を生成してもよい。

特徴的な配列エレメント：本明細書において用いる場合、「特徴的な配列エレメント」という句は、ポリマーの特徴的な部分を表すポリマー（例えば、ポリペプチドまたは核酸）中で見出される配列エレメントを指す。いくつかの実施形態では、特徴的な配列エレメントの存在は、ポリマーの特定の活性または特性の存在またはレベルと相関する。いくつかの実施形態では、特徴的な配列エレメントの存在（または非存在）は、このようなポリマーの特定のファミリーまたは群のメンバーとして（またはメンバーではない）特定のポリマーを規定する。特徴的な配列エレメントは通常は、少なくとも２つのモノマー（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的な配列エレメントは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、またはそれ超のモノマー（例えば、隣接して連結されたモノマー）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的な配列エレメントは、その長さが配列エレメントを共有するポリマーにまたがって変化してもしなくてもよい、１つまたは複数のスペーサー領域ずつ離れている連続のモノマーの少なくとも第１および第２のストレッチを含む。

併用療法：本明細書において用いる場合、「併用療法」という用語は、対象が、２つまたはそれ超の治療剤に連続して曝される状況を指す。いくつかの実施形態では、このような薬剤は、同時に投与される；いくつかの実施形態では、このような薬剤は、連続して投与される；いくつかの実施形態では、このような薬剤は、重複する投与計画で投与される。

匹敵する：「匹敵する」という用語は、本明細書において用いる場合、観察された相違または類似性に基づいて結論が合理的に導かれ得るように、お互いに同一でなくてもよいが、その間の比較を可能にするように十分に類似している、２つまたはそれ超の薬剤、実体、状況、条件のセットなどのことを指す。当業者は、文脈上、匹敵すると考えられる２つまたはそれ超のこのような薬剤、実体、状況、条件のセットなどについて任意の所定の状況でどの程度の同一性が必要とされるかを理解する。

～に対応する、～相当する：本明細書中で使用される場合、「～に対応する」という用語は、核酸中のポリペプチドまたはヌクレオチド残基中のアミノ酸残基など、ポリマー中の残基の位置／同一性を指定するために用いられる場合が多い。当業者は、単純にするために、このようなポリマー中の残基が、参照の関連のポリマーに基づいて正準のナンバリングシステムを用いて指定される場合が多く、その結果、例えば、参照ポリマー中の１９０位の残基「に対応する」第１のポリマー中の残基は、実際に第１のポリマーにおける１９０番目の残基である必要はなく、参照ポリマーにおいて１９０番目の位置に見られる残基に対応することを認識する；当業者は、ポリマー配列比較のために特に設計された１つまたは複数の市販のアルゴリズムの使用を通じることを含めて、どのようにして「対応する」アミノ酸を同定するかを容易に理解する。

ドメイン、ポリペプチドドメイン：「ドメイン」および「ポリペプチドドメイン」という用語は、本明細書において用いる場合、一般には、他のポリペプチドまたはポリペプチドドメインから単離された（例えば、切断された）場合でさえ、特定の活性を示すポリペプチド部分を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドドメインは、三次元空間で特定の個別の構造に折り畳まれる。いくつかの実施形態では、さらに長い方のポリペプチド中のポリペプチドドメインは、例えば、アミノ酸の実質的に構造化されていないストレッチを含んでもよい、リンカーエレメントのおかげで、長いポリペプチド内の１つまたは複数の他のポリペプチドドメインから分離される。いくつかの実施形態では、この用語は、より長いポリペプチド中に天然に存在するドメインを指す；いくつかの実施形態では、この用語は、このような天然に存在するポリペプチド部分に対して、または他の参照ポリペプチド部分（例えば、歴史的な操作された部分）に対して、有意な相同性および／または同一性に対応するかおよび／または示す操作されたポリペプチド部分を指す。いくつかの実施形態では、天然に存在するかまたは他の参照部分に対して有意な相同性および／または同一性に相当するかおよび／または示す操作されたドメインは、特徴的な構造（例えば、一次構造、例えば、ドメインのアミノ酸配列、および／または二次、三次、四次などの構造など）を共有する；あるいは、またはさらに、このような操作されたドメインは、その参照ポリペプチド部分と共有する１つまたは複数の別個の機能を示し得る。当業者によって理解されるとおり、多くの場合、ポリペプチドは、モジュールであり、１つまたは複数のポリペプチドドメインを含む；いくつかのこのような実施形態では、各々のドメインは、ポリペプチドの全体的機能に寄与する１つまたは複数の別個の機能を示す。いくつかの実施形態では、多くのこのようなドメインの構造および／または機能は、当業者に公知である。

操作された：「操作された」（engineered）という用語は、本明細書において用いる場合、人の手で創出した天然には存在しない部分を指す。例えば、ポリペプチドに関連して、「操作されたポリペプチド」とは、人の手で設計されるか、および／または産生されたポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然には存在しない１つまたは複数の配列エレメントを含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドは、天然に存在するが、天然に存在するものとは異なる配列状況では（例えば、天然に連結されているか、および／または天然に連結されていない少なくとも１つの配列エレメントと連結されている少なくとも１つの配列から分離される）操作されたポリペプチド中に存在する、１つまたは複数の配列エレメントを含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、操作されたポリペプチドとは、天然に存在する配列エレメント（単数または複数）が、それらが天然に会合されている（例えば、連結されている）少なくとも１つの配列から分離されているか、および／またはそうでなければ天然には存在しないポリペプチドを含むように操作されているものである。種々の実施形態では、操作されたポリペプチドは、２つまたはそれ超の共有結合されたポリペプチドドメインを含む。典型的には、このようなドメインは、ペプチド結合を介して連結されるが、本発明は、ペプチド結合を介して連結されたポリペプチドドメインを含む操作されたポリペプチドに限定されず、当業者に公知の他の共有結合を包含する。操作されたポリペプチドの１つまたは複数の共有結合されたポリペプチドドメインは、天然に存在し得る。したがって、特定の実施形態では、本発明の操作されたポリペプチドは、２つまたはそれ超の共有結合されたドメインを含む（そのうちの少なくとも１つは天然に存在する）。特定の実施形態では、２つまたはそれ超の天然に存在するポリペプチドドメインは、共有結合されて、操作されたポリペプチドを生成する。例えば、２つまたはそれ超の異なるポリペプチド由来の天然に存在するポリペプチドドメインは、操作されたポリペプチドを生成するために共有結合されてもよい。特定の実施形態では、操作されたポリペプチドの天然に存在するポリペプチドドメインは、天然に共有結合されるが、ドメインが自然に連結されるのとは異なる方法で操作されたポリペプチド中で共有結合される。例えば、同じポリペプチド中に天然に存在するが、１つまたは複数の介在するアミノ酸残基で分離される２つのポリペプチドドメインを、直接共有結合して（例えば、介在するアミノ酸残基を除去することによって）、本発明の操作されたポリペプチドを生成する。さらにまたはあるいは、一緒に直接共有結合される同じポリペプチド中に天然に存在する２つのポリペプチドドメイン（例えば、１つまたは複数の介在するアミノ酸残基によって隔てられない）は、本発明の操作されたポリペプチドを生成するために間接的に共有結合されてもよい（例えば、１つまたは複数の介在するアミノ酸残基を挿入することによって）。特定の実施形態では、操作されたポリペプチドの１つまたは複数の共有結合されたポリペプチドドメインは、天然には存在しなくてもよい。例えば、このようなポリペプチドドメインは、それ自体遺伝子操作されてもよい。

脂肪酸連結ドメイン：「脂肪酸連結ドメイン」という用語は、本明細書において用いる場合、脂肪酸をアミノ酸に共有結合して、アシルアミノ酸を形成するポリペプチドドメインを指す。いくつかの実施形態では、脂肪酸連結ドメインは、縮合ドメインである；いくつかの実施形態ではこのような脂肪酸連結ドメインは、単一のポリペプチドまたは少なくともまたは唯一のアデニル化ドメイン、チオール化ドメインまたはその両方とのポリペプチド複合体の一部である。種々の脂肪酸連結ドメイン、例えば、リポペプチドを生成する種々のペプチドシンテターゼ複合体に存在する脂肪酸連結ドメインなどは、当該分野で公知である。特定の実施形態では、脂肪酸連結ドメインは、β－ヒドロキシ脂肪酸をアミノ酸に連結する；いくつかの実施形態では、脂肪酸連結ドメインは、β－アミノ脂肪酸をアミノ酸に連結する；いくつかの実施形態では、脂肪酸連結ドメインは、β位で未修飾の脂肪酸をアミノ酸に連結する。いくつかの実施形態では、脂肪酸連結ドメインは、脂肪酸およびアミノ酸の縮合を触媒し、その結果、例えば、脂肪酸上のカルボン酸部分とアミノ酸上のアミノ部分との間でアミド結合（amide both）が形成される。

相同性：本明細書において用いる場合、「相同性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性のことを指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である場合、互いに「相同」であるとみなされる。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％類似である場合、互いに「相同」であるとみなされる（例えば、対応する位置で関連の化学特性を有する残基を含有する）。例えば、当業者に周知であるとおり、特定のアミノ酸は、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、および／または「極性」または「非極性」側鎖を有するとしてお互いに類似であると通常は分類される。１つのアミノ酸の同じ種類の別のアミノ酸との置換は、「相同」置換とみなされる場合が多い場合もある。典型的なアミノ酸の分類を下にまとめる：

当業者に理解されるとおり、異なる配列中でお互いに対して残基が「対応する」ことを考慮する場合、それらの相同性の程度を決定するための配列比較を可能にすることを含めて（例としては、一方に対して１つの配列中の指定の長さのギャップを可能にすることによって）、種々のアルゴリズムが利用可能である。例えば、２つの核酸配列の間の相同性パーセントの計算は、最適比較の目的のために２つの配列を整列させることによって行われ得る（例えば、最適アラインメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップが導入されてもよく、対応しない配列は、比較目的に関しては無視されてもよい）。特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチドの位置でヌクレオチドが、比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められている場合、その分子は、その位置において同一である；第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と類似のヌクレオチドで占められているならば、その分子はその位置で類似である。２つの配列の間の相同性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮したとき、その配列によって共有される同一である位置および類似の位置の数の関数である。２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントの決定に有用な代表的なアルゴリズムおよびコンピュータープログラムとしては、例えば、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（weight residue table）、１２というギャップ長ペナルティ（gap length penalty）および４というギャップペナルティ（gap penalty）を用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、MeyersおよびMillerのアルゴリズム（CABIOS、１９８９年、４巻：１１～１７頁）が挙げられる。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントは、例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定され得る。

同一性：本明細書において用いる場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）間および／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性のことを指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなされる。当業者によって理解されるとおり、異なる配列中でお互いに対して残基が「対応する」ことを考慮する場合、それらの相同性の程度を決定するための配列比較を可能にすることを含めて（例としては、一方に対して１つの配列中の指定の長さのギャップを可能にすることによって）、種々のアルゴリズムが利用可能である。例えば、２つの核酸配列の間の同一性パーセントの計算は、最適比較の目的のために２つの配列を整列させることによって行われてもよい（例えば、最適アラインメントのために第１および第２の核酸配列の一方または両方にギャップが導入されてもよく、対応しない配列は、比較目的に関しては無視されてもよい）。特定の実施形態では、比較目的で整列される配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または実質的に１００％である。次いで、対応するヌクレオチドの位置におけるヌクレオチドが、比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドによって占められているならば、その分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮したとき、その配列によって共有される同一である位置の数の関数である。２つのヌクレオチド配列間の相同性パーセントの決定に有用な代表的なアルゴリズムおよびコンピュータープログラムとしては、例えば、ＰＡＭ１２０重み付き残基表、１２というギャップ長ペナルティおよび４というギャップペナルティを用いる、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれた、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（CABIOS、１９８９年、４巻：１１～１７頁）が挙げられる。あるいは、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを用いる、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラムを用いて決定され得る。

単離された：本明細書中で用いる場合、「単離された」という用語は、（１）最初に産生されたときに関連していた成分の少なくともいくつかから分離された物質および／もしくは実体（天然に存在するかおよび／または実験環境に存在するかにかかわらず）、ならびに／または（２）人の手によって設計、生産、調製および／もしくは製造された物質および／もしくは実体のことを指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に関連していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９％超純粋である。本明細書中で用いる場合、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者によって理解されるとおり、ある物質は、例えば、１つまたは複数の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）のような特定の他の成分を合わされた後に、「単離された」またはさらに「純粋」であるとさらにみなされ得る；このような実施形態では、物質の単離または純度のパーセントは、担体または賦形剤などを含むことなく計算される。いくつかの実施形態では、単離は、共有結合の破壊を含むか、または必要とする（例えば、長いポリペプチドからポリペプチドドメインを単離するか、および／または長いオリゴヌクレオチドもしくは核酸からヌクレオチド配列エレメントを単離するために）。

天然に存在する：「天然に存在する」という用語は、本明細書において用いる場合、自然に存在することが公知である薬剤または実体を指す。

核酸：本明細書中で用いる場合、「核酸」という用語は、その最も広い意味では、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるかまたは組み込まれ得る任意の化合物および／または物質のことを指す。いくつかの実施形態では、核酸とは、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているかまたは組み込まれ得る化合物および／または物質である。文脈上明らかであるとおり、いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）のことを指す；いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖のことを指す。いくつかの実施形態では、「核酸」はＲＮＡであるか、またはＲＮＡを含む；いくつかの実施形態では、「核酸」はＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数の天然の核酸残基であるか、天然の核酸残基を含むか、または天然の核酸残基からなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数の核酸アナログであるか、核酸アナログを含むか、または核酸アナログからなる。いくつかの実施形態では、核酸（nuclic acid）アナログは、それがホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、当該分野で公知であり、かつ骨格中でホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有しており、本発明の範囲内であるとみなされる、１つまたは複数の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、またはそれからなる。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数のホスホロチオエートおよび／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト連結を、ホスホジエステル結合ではなく有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシンおよびデオキシシチジン）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数のヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレートされた塩基、およびそれらの組合せ）であるか、それらを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然の核酸中の糖と比較して、１つまたは複数の修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノースおよびヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはタンパク質のような機能的な遺伝子生成物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つまたは複数のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然の供給源からの単離、相補的なテンプレートに基づく重合化による酵素的合成（インビボまたはインビトロ）、組み換え細胞または組み換え系の中での再生、および化学的合成のうちの１つまたは複数によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、またはそれ超の残基長である。

ペプチドシンテターゼ複合体：「ペプチドシンテターゼ複合体」という用語は、本明細書において用いる場合、ペプチドの非リボソーム生成物を触媒する酵素を指す。当業者によって理解されるとおり、ペプチドシンテターゼ複合体は、モジュールであって、最終的なペプチドの合成中で異なるステップを行う個々のペプチドシンテターゼモジュールを含む；通常は、各々のモジュールは、１ステップを行う（例えば、単一のアミノ酸を追加する）。ペプチドシンテターゼ複合体は、単一の酵素的サブユニット（例えば、単一のポリペプチド）を含んでもよいし、または２つまたはそれ超の酵素的サブユニット（例えば、２つまたはそれ超のポリペプチド）を含んでもよい。ペプチドシンテターゼ複合体は通常は、少なくとも１つのペプチドシンテターゼドメインを含み、かつさらに、例えば、脂肪酸連結ドメイン、チオエステラーゼドメイン、レダクターゼドメインなどのような、１つまたは複数の追加のドメインを含んでもよい。ペプチドシンテターゼ複合体のペプチドシンテターゼドメインは、２つまたはそれ超のペプチドシンテターゼドメインが所定の酵素的サブユニット中に存在する、２つまたはそれ超の酵素的サブユニットを含んでもよい。例えば、サーファクチンペプチドシンテターゼ複合体（また、本明細書では、単に「サーファクチンシンテターゼ複合体」とも呼ばれる）は、３つの別個のポリペプチド酵素的サブユニットを含み、その最初の２つのサブユニットは、３つのペプチドシンテターゼドメインを含むが、その三番目のサブユニットは、単一のペプチドシンテターゼドメインを含む。

ペプチドシンテターゼドメイン：「ペプチドシンテターゼドメイン」という用語は、本明細書において用いる場合、最小で以下の３つのドメインを含むポリペプチドドメインを指す：アデニル化（Ａ）ドメイン（特定のアミノ酸を選択的に認識し、かつ活性化することを担う）、チオール化（Ｔ）ドメイン（この活性化されたアミノ酸を補因子に対してチオエステル連結を介してテザリングする）、および縮合（Ｃ）ドメイン（アミド結合の形成によって、ペプチドシンテターゼの連続単位に接合されたアミノ酸を連結する）。ペプチドシンテターゼドメインは通常、単一の、特異的なアミノ酸を認識して活性化し、かつペプチドシンテターゼドメインがこの経路で第１のドメインでない状況では、特定のアミノ酸を、成長しているペプチド鎖に連結する。

ポリペプチド：「ポリペプチド」という用語は、本明細書において用いる場合、ペプチド連結で一緒に接合された一連のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」は、天然に存在する生物中でリボソーム機構による合成を通じて達成される構造を有する。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」は、化学合成（例えば、インビトロ）を通じて達成される構造を有する。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」は、非限定的な例としては、ペプチドシンテターゼによって合成されたポリペプチドなどの手段による、非リボソーム機構によって一緒に接合された一連のアミノ酸の接合を通じて達成される構造を有する。このような非リボソーム的に生成されたポリペプチドは、リボソームによって合成されたポリペプチドよりも共有結合で大きい多様性を示す（しかし、当業者は、リボソームとして生成されたポリペプチドのアミノ酸が、ジスルフィド結合を介するシステインの連結などのペプチド結合ではない共有結合によっても連結されてもよいことを理解する）。いくつかの実施形態では、この用語を用いて、例えば、自己抗原ポリペプチド、ニコチン性アセチルコリン受容体ポリペプチド、同種抗原ポリペプチドなどのようなポリペプチドの特定の機能的な分類を指す。各々のこのようなクラスに関しては、本明細書は、この分類内の公知の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列のいくつかの例を提供する；いくつかの実施形態では、このような公知のポリペプチドは、このクラスの参照ポリペプチドである。このような実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、関連の参照ポリペプチドと有意な配列相同性または同一性を示すクラスの任意のメンバーを指す。多くの実施形態では、このようなメンバーはまた、参照ポリペプチドと有意な活性を共有する。例えば、いくつかの実施形態では、あるメンバーのポリペプチドは、少なくとも約３０～４０％であり、かつ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ超の、参照ポリペプチドとの全体的な程度の配列相同性もしくは同一性を示すか、および／または９０％超、もしくは９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％でさえある場合が多い、極めて高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（すなわち、特徴的な配列エレメントを含む場合が多い保存された領域）を含む。このような保存された領域は通常は、少なくとも３～４、およびしばしば最大２０またはそれ超のアミノ酸を包含する；いくつかの実施形態では、保存された領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれ超の連続アミノ酸の少なくとも１つのストレッチを包含する。ポリペプチドは、２つまたはそれ超のアミノ酸長であってもよいが、リボソームおよびペプチドシンテターゼによって産生されるほとんどのポリペプチドは、２アミノ酸よりも長い。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００またはそれ超のアミノ酸長であってもよい。

レダクターゼドメイン：「レダクターゼドメイン」という用語は、本明細書において用いる場合、ペプチドシンテターゼ複合体からペプチドシンテターゼ複合体によって産生されるアシルアミノ酸の放出を触媒するポリペプチドドメインを指す。特定の実施形態では、レダクターゼドメインは、ペプチドシンテターゼドメインおよび脂肪酸連結ドメイン、例えば、β－ヒドロキシ脂肪酸連結ドメインに対して共有結合されて、アシルアミノ酸の合成に有用な操作されたポリペプチドを生成する。種々のレダクターゼドメインが、種々の種由来の非リボソームペプチドシンテターゼ複合体中で天然に見出される。本発明によって用いられ得るレダクターゼドメインの非限定的な例としては、直鎖状グラミシジン（ＡＴＣＣ８１８５）由来のレダクターゼドメインが挙げられる。しかし、ペプチドシンテターゼ複合体からペプチドシンテターゼ複合体によって産生される、アシルアミノ酸を放出する任意のレダクターゼドメインが本発明に従って用いられてもよい。いくつかの実施形態では、レダクターゼドメインは、以下の連続配列：［ＬＩＶＳＰＡＤＮＫ］－ｘ（９）－｛Ｐ｝－ｘ（２）－Ｙ－［ＰＳＴＡＧＮＣＶ］－［ＳＴＡＧＮＱＣＩＶＭ］－［ＳＴＡＧＣ］－Ｋ－｛ＰＣ｝－［ＳＡＧＦＹＲ］－［ＬＩＶＭＳＴＡＧＤ］－ｘ－｛Ｋ｝－［ＬＩＶＭＦＹＷ］－｛Ｄ｝－ｘ－｛ＹＲ｝－［ＬＩＶＭＦＹＷＧＡＰＴＨＱ］－［ＧＳＡＣＱＲＨＭ］（配列番号１）の存在によって特徴付けられ、ここで角括弧（「［］」）は、その位置に通常存在するアミノ酸を示し、波括弧（squiggly bracket）（「｛｝」）は、その位置に通常は存在しないアミノ酸を示し、「ｘ」は、任意のアミノ酸またはギャップを示す。Ｘ（９）は例えば、９連続位置についての任意のアミノ酸またはギャップを示す。当業者は、所定のポリペプチドドメインがレダクターゼドメインであるか否かを決定する方法を承知している。

低分子：本明細書において用いる場合、「低分子」という用語は、生物学的過程の酵素基質または調節因子として役割を果たし得る、低分子量の有機化合物を意味する。一般には、「低分子」とは、サイズが約５キロダルトン（ｋＤ）未満の分子である。いくつかの実施形態では、提供されるナノ粒子はさらに、１つまたは複数の低分子を含む。いくつかの実施形態では、低分子は、約４ｋＤ、３ｋＤ、約２ｋＤ、または約１ｋＤ未満である。いくつかの実施形態では、低分子は、約８００ダルトン（Ｄ）、約６００Ｄ、約５００Ｄ、約４００Ｄ、約３００Ｄ、約２００Ｄ、または約１００Ｄ未満である。いくつかの実施形態では、低分子は、約２０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満、または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の低分子が、ナノ粒子内にカプセル化される。いくつかの実施形態では、低分子は非ポリマーである。いくつかの実施形態では、本発明によれば、低分子は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、多糖類、糖タンパク質類、プロテオグリカンなどではない。いくつかの実施形態では、低分子は治療剤である。いくつかの実施形態では、低分子はアジュバントである。いくつかの実施形態では、低分子は薬物である。

サーファクチン：サーファクチンは、グラム陽性の内生胞子形成細菌のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを含む特定の細菌によって天然に産生される環状のリポペプチドである。サーファクチンは、両親媒性分子（疎水性の特性および親水性の特性の両方を有する）であり、したがって、有機溶媒および水の両方に可溶性である。サーファクチンは、優れた界面活性剤特性を示し、これによって商業的に価値のある分子となっている。その界面活性剤特性に起因して、サーファクチンはまた、抗生物質としても機能する。例えば、サーファクチンは、抗菌、抗ウイルス、抗真菌、抗マイコプラズマ、および溶血性の化合物として有効であることが公知である。サーファクチンは、その膜の組成が異なる、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の両方を含む、全種類の細菌の細胞膜に浸透し得る。グラム陽性細菌は、それらのリン脂質二重層の外側に厚いペプチドグリカン層を有する。対照的に、グラム陰性細菌は、それらのリン脂質二重層の外側に比較的薄いペプチドグリカン層を有し、さらに追加して外側にリポ多糖膜を含む。サーファクチンの界面活性剤活性によって、脂質二重層に浸透性の環境を創出することが可能になり、両方の種類の細菌の膜を溶解する破壊が生じる。サーファクチンが最小抗菌効果を実行するためには、最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１２～５０μｇ／ｍｌの範囲である。その抗菌特性に加えて、サーファクチンもまた、抗菌特性を示し、ＨＩＶおよびＨＳＶのようなエンベロープウイルスを破壊することが公知である。サーファクチンは、ウイルスの脂質エンベロープを破壊するだけでなく、それらのキャプシドもイオンチャネル形成を通じて破壊する。１４または１５個の炭素原子を有する脂肪酸鎖を含有するサーファクチンアイソフォームは、ウイルスエンベロープの破壊の改善に起因すると考えられる、ウイルス不活化の改善を示した。サーファクチンは、７つのアミノ酸ペプチドループ、および疎水性脂肪酸鎖（β－ヒドロキシミリスチン酸）（１３～１５炭素長である）からなる。脂肪酸鎖によって、サーファクチンは細胞膜に浸透することが可能になる。ペプチドループは、アミノ酸Ｌ－アスパラギン、Ｌ－ロイシン、グリシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリンおよび２つのＤ－ロイシンを含む。グリシンおよびアスパラギン残基は、それぞれ１位および６位でマイナーな極性ドメインを構成する。反対側では、バリン残基は、４位で、脂肪酸鎖に面して下に伸びて主な疎水性ドメインを形成する。サーファクチンは、３つのサーファクチンシンテターゼポリペプチドサブユニットＳｒｆＡ－Ａ、ＳｒｆＡ－Ｂ、およびＳｒｆＡ－Ｃを含む、サーファクチンシンテターゼ複合体によって合成される。サーファクチンシンテターゼポリペプチドサブユニットＳｒｆＡ－ＡおよびＳｒｆＡ－Ｂは各々が、３つのペプチドシンテターゼドメインを含み、その各々が、単一のアミノ酸を、成長しているサーファクチンペプチドに追加するが、モノモジュールのサーファクチンシンテターゼポリペプチドサブユニットＳｒｆＡ－Ｃは、単一のペプチドシンテターゼドメインを含み、かつ最後のアミノ酸残基をヘプタペプチドに追加する。さらに、ＳｒｆＡ－Ｃサブユニットは、チオエステラーゼドメインを含み、このチオエステラーゼドメインは、ペプチドのＣ末端Ｌｅｕのカルボニル上の脂肪酸のβヒドロキシの求核性攻撃を介して生成物の放出を触媒し、エステルの形成を介して分子を環化する。β－ヒドロキシ脂肪酸のスペクトルは、イソ、アンテイソＣ１３、イソ、ノーマルＣ１４およびイソ、アンテイソＣ１５として解明され、近年の研究では、界面活性剤がＣ－βでＲ構成を保持することが示された（Nagaiら、Study on surfactin,a cyclic depsipeptide.2.Synthesis of surfactin B2 produced by Bacillus natto KMD 2311.Chem Pharm Bull(Tokyo)、４４巻：５～１０頁、１９９６年）。

サーファクチンは、サーファクチンシンテターゼ複合体によって合成されたリポペプチドである。サーファクチンは、７つのアミノ酸（これは最初にペプチド結合によって接合される）、および第１のアミノ酸、グルタミン酸に共有結合されたβ－ヒドロキシ脂肪酸を含む。しかし、最終のアミノ酸（ロイシン）の付加の際、ポリペプチドが放出され、ＳＲＦＣタンパク質のチオエステラーゼドメインは、ペプチドのＣ末端Ｌｅｕのカルボニル上の脂肪酸のβヒドロキシの求核性攻撃を介して生成物の放出を触媒し、エステルの形成を介して分子を環化し、脂肪酸のｂ－ヒドロキシル（b-hydroxyl）基に結合したラクトンを介して結合されたロイシンのＣ末端カルボキシル基を生じる。

チオエステラーゼドメイン：「チオエステラーゼドメイン」という用語は、本明細書において用いる場合、ペプチドシンテターゼ複合体からペプチドシンテターゼ複合体によって産生されたアシルアミノ酸の放出を触媒するポリペプチドドメインを指す。種々のチオエステラーゼドメインが、種々の種に由来する非リボソームペプチドシンテターゼ複合体中で天然に見出される。本発明によって用いられ得るチオエステラーゼドメインの非限定的な例としては、Ｓｒｆ－Ｃサブユニットに存在するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓサーファクチンシンテターゼ複合体由来のチオエステラーゼドメインが挙げられる。しかし、ペプチドシンテターゼ複合体からペプチドシンテターゼ複合体によって産生されたアシルアミノ酸を放出する任意のチオエステラーゼドメインが、本発明によって用いられてもよい。いくつかの実施形態では、チオエステラーゼドメインは、以下の連続配列：［ＬＩＶ］－｛ＫＧ｝－［ＬＩＶＦＹ］－［ＬＩＶＭＳＴ］－Ｇ－［ＨＹＷＶ］－Ｓ－｛ＹＡＧ｝－Ｇ－［ＧＳＴＡＣ］（配列番号２）の存在によって特徴付けられ、ここで角括弧（「［］」）は、その位置に通常存在するアミノ酸を示し、波括弧（「｛｝」）は、その位置に通常は存在しないアミノ酸を示す。当業者は、所定のポリペプチドドメインがチオエステラーゼドメインであるか否かを決定する方法を承知している。

アシルアミノ酸の生成に有用な操作されたポリペプチド
本発明は、アシルアミノ酸の生成のための組成物および方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、アシルアミノ酸の産生に有用な操作されたポリペプチドを含む。特定の実施形態では、本発明の操作されたポリペプチドは、ペプチドシンテターゼドメインを含む。

一態様では、本発明は、例えばペプチドシンテターゼ複合体で通常見出される別のドメイン（例えば、脂肪酸連結ドメイン、チオエステラーゼドメイン、レダクターゼドメインなどおよび／またはそれらの組合せ）と関連していない（例えば、共有結合していないか、および／または他でも会合していない）単一のペプチドシンテターゼドメインが、本明細書に記載されるようなアシルアミノ酸を産生するのに十分であり得るという認識を包含する。

本発明の多くの実施形態によれば、本明細書に記載のアシルアミノ酸の産生のために有用なペプチドシンテターゼドメインは、天然に存在するペプチドシンテターゼ複合体で見出される第１のペプチドシンテターゼドメインに対して、相当するか、ならびに／または有意な相同性および／もしくは同一性を示す。すなわち、当該分野で公知のとおり、いくつかのペプチドシンテターゼドメイン（すなわち、アデニル化（Ａ）、チオール化（Ｔ）、および縮合（Ｃ）のドメインを含むいくつかのポリペプチド）は、脂肪酸とアミノ酸との縮合を触媒し、そしていくつかは、２つのアミノ酸の互いとの縮合を触媒する。本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のアシルアミノ酸の産生のために有用なペプチドシンテターゼドメインは、アミノ酸と脂肪酸との縮合を触媒するドメインである；このようなペプチドシンテターゼドメインは通常は、本明細書では、別のペプチドシンテターゼドメインとは隔てられているか、および／または別のペプチドシンテターゼドメインを含まない形態で（例えば、ポリペプチドの一部として）利用される。多くの天然に存在するペプチドシンテターゼドメインは、天然には、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ複合体内に見出される。このようなペプチドシンテターゼ複合体は、原核生物および真核生物の両方で見出される多酵素的複合体であり、種々のペプチドの非リボソーム産生を触媒する１つまたは複数の酵素的サブユニットを含む（例えば、Kleinkaufら、Annu.Rev.Microbiol.、４１巻：２５９～２８９頁、１９８７年を参照のこと；また米国特許第５，６５２，１１６号、および米国特許第５，７９５，７３８号も参照のこと）。非リボソーム合成はまた、チオテンプレート合成としても公知である（例えば、Kleinkaufらを参照のこと）。ペプチドシンテターゼ複合体は通常は、特定のアミノ酸を認識し、かつポリペプチド鎖に対するアミノ酸の付加を触媒することを担う１つまたは複数のペプチドシンテターゼドメインを含む。

アミノ酸の追加における触媒ステップは通常は、以下を含む：ペプチドシンテターゼドメインによるアミノ酸の認識、アミノ酸の活性化（アミノ－アシルアデニレートの形成）、アミノ酸のカルボキシル基と酵素的な補因子のＳＨ基との間のチオエステル結合を介する酵素への活性化アミノ酸の結合（この補因子は、それ自体が、各々のペプチドシンテターゼドメインの内側の酵素に結合される）、およびアミノ酸の間のペプチド結合の形成。

ペプチドシンテターゼドメインは、ペプチド生成物を形成するためにこれらのステップで特別な役割を実行するサブドメインを含む。１つのサブドメインであるアデニル化（Ａ）ドメインは、ペプチドシンテターゼの特定のユニットによって組み込まれるべきであるアミノ酸を選択的に認識して活性化することを担う。この活性化されたアミノ酸は、別のサブドメインであるチオール化（Ｔ）ドメイン（一般には、Ａドメインに隣接して位置する）の酵素的作用を通じてペプチドシンテターゼに接合される。ペプチドシンテターゼの連続単位に接合されるアミノ酸は、別のサブドメインである縮合（Ｃ）ドメインによって触媒されるアミド結合の形成によってその後に一緒に連結される。

Ｄアミノ酸の付加を触媒するペプチドシンテターゼドメインはまた、Ｄアミノ酸へのＬアミノ酸のラセミ化（recemization）を触媒する能力も有する。ペプチドシンテターゼ複合体は通常は、成長中のアミノ酸鎖を終わらせて、生成物を放出する保存されたチオエステラーゼドメインを含む。

ペプチドシンテターゼ複合体をコードする遺伝子は、複合体の機能的なドメイン構造と並行するモジュール構造を有する（例えば、Cosminaら、Mol.Microbiol.、８巻：８２１頁、１９９３年；Kratzxchmarら、J.Bacteriol.、１７１巻：５４２２頁、１９８９年；Weckermannら、Nuc.Acids res.、１６巻：１１８４１頁、１９８８年；Smithら、EMBO J.、９巻：７４１頁、１９９０年；Smithら、EMBO J.、９巻：２７４３頁、１９９０年；MacCabeら、J.Biol.Chem.、２６６巻：１２６４６頁、１９９１年；Coqueら、Mol.Microbiol.、５巻：１１２５頁、１９９１年；Diezら、J.Biol.Chem.、２６５巻：１６３５８頁、１９９０年を参照のこと）。

数百のペプチドがペプチドシンテターゼ複合体によって産生されることが公知である。このような非リボソーム的に産生されたペプチドは、非直線性の構造を有する場合が多く、この構造としては、ペプチドサーファクチン、サイクロスポリン、チロシジン、およびミコバシリンで例示される環状構造、またはペプチドポリミキシンおよびバシトラシンで例示される分岐した環状構造が挙げられる。さらに、このような非リボソーム的に産生されたペプチドは、例えば、ノルロイシン、β－アラニンおよび／またはオルニチンなどのリボソーム的に産生されたポリペプチド中に通常は存在しないアミノ酸、ならびにＤ－アミノ酸を含んでもよい。さらにまたはあるいは、このような非リボソーム的に産生されたペプチドは、ペプチドに共有結合される１つまたは複数の非ペプチド部分を含んでもよい。１つの非限定的な例としては、サーファクチンは、リポペプチドの第１のグルタミン酸に共有結合されたβ－ヒドロキシ脂肪酸を含む環状リポペプチドである。ペプチドシンテターゼ複合体によって産生されるペプチドに共有結合される他の非ペプチド部分は、当業者に公知であり、これには、例えば、糖、塩素または他のハロゲン基、Ｎ－メチルおよびＮ－ホルミル基、グリコシル基、アセチル基などが挙げられる。

通常は、非リボソーム的に産生されたペプチドの各々のアミノ酸は、別個のペプチドシンテターゼドメインによって特定される。例えば、リポペプチドサーファクチンの重合化を触媒するサーファクチンシンテターゼ複合体は、３つの酵素的サブユニットからなる。この第１の２つのサブユニットは各々が、３つのペプチドシンテターゼドメインを含むが、三番目は１つしか有さない。これらの７つのペプチドシンテターゼドメインは、サーファクチン中に存在するアミノ酸であるＬ－Ｇｌｕ、Ｌ－Ｌｅｕ、Ｄ－Ｌｅｕ、Ｌ－Ｖａｌ、Ｌ－Ａｓｐ、Ｄ－ＬｅｕおよびＬ－Ｌｅｕの認識、活性化、結合および重合化を担う。

個別の反復されるペプチドシンテターゼドメイン中の類似の組織化が、細菌および真菌、を含む、種々の種の種々のペプチドシンテターゼ遺伝子、例えば、ｓｒｆＡ（Cosminaら、Mol.Microbiol.、８巻、８２１～８３１頁、１９９３年）、ｇｒｓＡおよびｇｒｓＢ（Kratzxchmarら、J.Bacterial.、１７１巻、５４２２～５４２９頁、１９８９年）、ｔｙｃＡおよびｔｙｃＢ（Weckermannら、Nucl.Acid.Res.、１６巻、１１８４１～１１８４３頁、１９８８年）、ならびに種々の真菌種由来のＡＣＶ（Smithら、EMBO J.、９巻、７４１～７４７頁、１９９０年；Smithら、EMBO J.、９巻、２７４３～２７５０頁、１９９０年；MacCabeら、J.Biol.Chem.、２６６巻、１２６４６～１２６５４頁、１９９１年；Coqueら、Mol.Microbiol.、５巻、１１２５～１１３３頁、１９９１年；Diezら、J.Biol.Chem.、２６５巻、１６３５８～１６３６５頁、１９９０年）の中で生じる。遠い種のペプチドシンテターゼドメインでさえ、高い相同性の配列領域（そのいくつかは、全てのペプチドシンテターゼについて保存されておりかつ特異的である）を含有する。さらに、ペプチドシンテターゼドメイン内の特定の配列領域は、同じアミノ酸を認識するペプチドシンテターゼドメインの中でもさらに高度に保存されている（Cosminaら、Mol.Microbiol.、８巻、８２１～８３１頁、１９９２年）。

自然にペプチドシンテターゼ複合体によって合成される例示的なリポペプチドを、下の表１に列挙する（また、ＮＯＲＩＮＥデータベースも参照のこと、ここでは、ペプチドシンテターゼ酵素によって産生されることが公知であるか、またはいくつかの場合には、産生されると考えられる、ペプチドおよびリポペプチド上での情報に対するアクセスが提供される（さらには、Segoleneら（引用文献４）を参照のこと）。

本発明は、通常、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ複合体中で、第１の活性なペプチドシンテターゼドメインが、アミノ酸に脂肪酸を連結するものであるということを認識する；その後のペプチドシンテターゼドメインは、通常、追加のアミノ酸を付加する。本発明の特定の実施形態によれば、アシルアミノ酸は、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ複合体中で見出される第１のペプチドシンテターゼドメインを含む操作されたペプチドシンテターゼの使用を通じて調製され、そして、ペプチドシンテターゼ複合体中で見出される少なくともいくつかの他のドメインから分離されているという点で遺伝子操作されている。

天然に存在するペプチドシンテターゼによって利用される脂肪酸は、β－ヒドロキシ脂肪酸（例えば、サーファクチンおよび表１に記載される他のβ－ヒドロキシリポペプチド中で見出される）であってもよい。他の場合には、利用される脂肪酸は、β－アミノ脂肪酸（例えば、イツリン；表１を参照のこと）である。特定の場合には、利用される脂肪酸は、β位で未修飾である（例えば、ダプトマイシンおよび表１に記載の特定の他のリポペプチドの中のように）。

本明細書に記載されるとおり、本発明は、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼによって利用される３種の全ての脂肪酸について、関連のペプチドシンテターゼ複合体の第１のモジュールの第１のタンパク質ドメインが、通常、リポ－開始（lipo-initiation）に重要な役割を果たすという見解を包含する。しかし、リポ－開始の正確な機序は、３種の脂肪酸の各々について異なる。一般論として、リポ－ペプチドを天然に創出する、ペプチドシンテターゼ酵素の第１のモジュールは、特定の機構を有する。各々のモジュールはリポ－開始反応に必要な縮合ドメインで始める。縮合ドメインには、アデニル化ドメインが続き、これには、チオール化ドメイン（ペプチジルキャリアタンパク質（ＰＣＰ）ドメインとしても公知）が続く。このアデニル化ドメインは、リポ－ペプチド中に組み込まれる第１のアミノ酸を選択し、アミノ酸アデニレートを創出する。アデニル化の後で、アミノ酸は、チオール化ドメインに結合される、ホスホパンテチオン部分に対する連結を介して酵素にテザリングされる。アミノ酸のテザリングを生じる化学反応は、副産物としてＡＭＰを放出する。

結合されたアミノ酸に対してβ－ヒドロキシ脂肪酸を結合するシンテターゼについて、第１のモジュールの縮合ドメインは、β－ヒドロキシ脂肪酸ＣｏＡを基質として利用し、かつ脂肪酸をチオール化ドメインにテザリングされている、アミノ酸基質のＮ末端に移す。Ｃドメイン自体の活性以外に、この特定の反応に必要な酵素活性はないが、ｓｒｆＤタンパク質が、リポ－開始反応を刺激するということが報告された（７，９８１，６８５号に引用されたStellerら、を参照のこと）（引用文献５）。

脂肪酸にβアミノ酸を結合するシンテターゼについて、縮合ドメインは、いくつかのサブドメインを有し、その各々が特定の機能を有する（Duitmanらの図６を参照のこと）（引用文献６）。イツリンシンテターゼ（マイコスブチリンシンテターゼとしても公知）を特異的な実施例として考慮すれば、リポ－開始の機序は以下である（詳細については、Hansenら、（引用文献７）およびAronら、（引用文献８）を参照のこと）：アシルリガーゼドメインは、長鎖脂肪酸（この場合、ミリスチン）をアデニル化し、次いで、脂肪酸を、酵素連結４－ホスホパンテテインに移し、ＡＭＰが放出され、別の反応では、ｆｅｎＦ遺伝子生成物は、マロン酸塩（マノニル－ＣｏＡから）の第二のアシルキャリアドメイン（モジュール１内に位置する）への移動を触媒する。β－ケトアシルシンテターゼドメインは、マロニルおよびアシルチオエステルの縮合を触媒し、β－ケトチオエステルを創出し、Ｂ－ケトチオエステルは、アミノ酸トランスフェラーゼに対して相同なトランスアミナーゼドメインによってβ－アミノ脂肪酸に変換され、βアミノ脂肪酸は、チオール化ドメインに移され、次いで、モジュール１アデニル化ドメインの作用を介して酵素に以前に連結された基質アミノ酸（この場合、アスパラギン）に接合される。この反応の系列は、アミノ酸へのβ－アミノ脂肪酸の接合を生じる。

β位で未修飾の脂肪酸に結合するシンテターゼについては、第１のモジュールの縮合ドメインは、チオール化ドメインにテザリングされる、アミノ酸基質のＮ末端への脂肪酸の移動を触媒する。ダプトマイシンシンテターゼを例として考慮して、２つの追加のタンパク質が含まれる：アシル－ＣｏＡリガーゼ（ＤｐｔＥ）（配列表ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＸ３１５５５．１）およびアシルキャリアタンパク質（ＤｐｔＦ）（配列表ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＸ３１５５６．１）。ＤｐｔＥは、それをＣｏＡに連結することによって脂肪酸基質を活性化し、次いで、活性化された脂肪酸は、ＤｐｔＦに移され、その後、酵素結合されたアミノ酸基質に移される（Wittmannらを参照のこと）（引用文献９）。インビトロで行われた研究によって、ＤｐｔＥは、脂肪酸をＤｐｔＦに移すことが確認されたが、ＤｐｔＦからアミノ酸基質への脂肪酸のその後の移行における縮合ドメインの関与を実証する目的の実験は、この文献では報告されていないと考えられることに注意のこと。

ペプチドシンテターゼ縮合ドメインの系統発生学的分析は、Roongsawangら（引用文献２）に、およびRauschら（引用文献３）に記載されている。当業者は、本開示によって導かれ、必要に応じてこのような引用文献と連携して、本発明によるアシルアミノ酸の産生のために操作されたペプチドシンテターゼを設計、構築、産生および／またはそうでなければ提供するのにおける使用のために適切なペプチドシンテターゼ縮合ドメインを容易に同定、選択および／または遺伝子操作し得る。

本明細書に記載されるような操作されたペプチドシンテターゼの特定、選択、設計および／または産生において有用なペプチドシンテターゼドメインを含み得るペプチドシンテターゼ複合体の非限定的な例としては、例えば、サーファクチンシンテターゼ、フェンギシンシンテターゼ、アルスロファクチンシンテターゼ、リケナイシンシンテターゼ、シリンゴマイシンシンテターゼ、シリンゴペプチンシンテターゼ、サフラマイシンシンテターゼ、グラミシジンシンテターゼ、シクロスポリンシンテターゼ、チロシジンシンテターゼ、マイコバシリンシンテターゼ、ポリミキシンシンテターゼ、バシトラシンシンテターゼ、およびそれらの組合せが挙げられる。

したがって、本発明は、操作されたペプチドシンテターゼを提供し、これは、いくつかの実施形態では、リポペプチドを合成する参照ペプチドシンテターゼ複合体から単離されたペプチドシンテターゼドメインを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、このような参照ペプチドシンテターゼ複合体は、公知のペプチドシンテターゼ複合体である。いくつかの実施形態では、このような参照ペプチドシンテターゼ複合体は、天然に存在するペプチドシンテターゼ複合体である。いくつかの実施形態では、提供された操作されたペプチドシンテターゼは、単一のペプチドシンテターゼドメインを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、提供される操作されたペプチドシンテターゼは、リポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ複合体由来の第１のペプチドシンテターゼドメインを含むか、またはそれらからなる。

いくつかの実施形態では、操作されたペプチドシンテターゼ、ペプチドシンテターゼドメイン、またはそれらの成分（例えば、アデニル化（Ａ）ドメイン、チオール化（Ｔ）ドメイン、および／または縮合（Ｃ）ドメイン）は、参照ペプチドシンテターゼ、ドメイン、または成分と比較して、１つまたは複数の配列の修飾を含んでもよい。しかし、通常は、操作されたペプチドシンテターゼ、ペプチドシンテターゼドメイン、またはそれらの成分は、その参照ペプチドシンテターゼ、ドメイン、または成分と高い全体的な程度の配列同一性および／または相同性を示す。

いくつかの実施形態では、操作されたペプチドシンテターゼ、ペプチドシンテターゼドメイン、またはそれらの成分は、その関連の参照と比較した場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはそれ超のアミノ酸の挿入、欠失、置換または介入を含む。

特定の実施形態では、このようなアミノ酸置換は、関連の参照における対応するアミノ酸と比較して、その側鎖が構造的に類似の側鎖を含有するアミノ酸を含む、操作されたポリペプチドを生じる。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンを含む、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、お互いに置換されてもよく；セリンおよびトレオニンを含む、脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、お互いに置換されてもよく；アスパラギンおよびグルタミンを含む、アミド含有側鎖を有するアミノ鎖は、お互いに置換されてもよく；フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを含む、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、お互いに置換されてもよく；リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、お互いに置換されてもよく；システインおよびメチオニンを含む、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸は、お互いに置換されてもよい。

特定の実施形態では、アミノ酸置換は、その側鎖が関連の参照中に存在する対応するアミノ酸に対して類似の化学的特性を示すアミノ酸を含む、操作されたポリペプチドを生じる。例えば、特定の実施形態では、疎水性側鎖を含むアミノ酸は、お互いに置換されてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、それらの側鎖が類似の分子量またはバルクである場合、お互いに置換されてもよい。例えば、操作されたドメイン中のアミノ酸は、その側鎖が最小／最大の分子量を示すか、または最小量／最大量の空間をとる場合、関連の参照中に存在するアミノ酸と置換されてもよい。

特定の実施形態では、操作されたポリペプチドは、関連の参照と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％の相同性または同一性を示す（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００またはそれ超のアミノ酸にまたがる部分にわたって）。

特定の実施形態では、本発明の操作されたポリペプチドは、１つまたは複数の天然に存在するかまたは他の公知の参照ポリペプチドに出現するが、ｉ）それらが参照ポリペプチド中で関連する１つまたは複数の配列エレメントとは隔てられている；ｉｉ）それらが参照ポリペプチド（単数または複数）中で関連しない１つまたは複数の配列エレメントと関連しているか；および／またはｉｉｉ）それらが参照ポリペプチド中で関連している１つまたは複数の配列エレメントと異なる手段で（例えば、異なる順序または異なる連結を介して）会合する、２つまたはそれ超のポリペプチドドメインを含む。非限定的な例としては、自然に直接共有結合されている、２つの天然に存在するポリペプチドドメインは、操作されたポリペプチド中で、１つまたは複数の介在するアミノ酸残基で隔てられてもよい。さらにまたはあるいは、自然に間接的に共有結合されている、２つの天然に存在するポリペプチドドメインは、操作されたポリペプチド中で、例えば、１つまたは複数の介在するアミノ酸残基を除去することによって、直接共有結合されてもよい。

特定の実施形態では、異なるペプチドシンテターゼ由来である、２つの天然に存在するペプチドドメインは、本発明の操作されたポリペプチドを生成するために共有結合される。

いくつかの実施形態では、本発明によって提供されるか、および／または本発明による使用のための、操作されたペプチドシンテターゼは、チオエステラーゼおよび／またはレダクターゼドメインを含まない。このようなドメインは、それらを産生する非リボソームペプチドシンテターゼ複合体からのペプチドおよびリポペプチドの放出に機能することが公知である。１つの態様では、本発明は、ペプチドシンテターゼ複合体からのリポペプチドの放出におけるそれらの中心的な役割にかかわらず、このようなドメインは、本明細書に記載の操作されたペプチドシンテターゼからのアシルアミノ酸の放出に必要がない場合が多いという驚くべき知見を提供する。このチオエステラーゼおよび／またはレダクターゼドメインは必要に応じて、本発明のいくつかの実施形態には含まれてもよいが、いくつかの実施形態では特異的に除かれる。

特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、アシルアミノ酸の大規模産生に有用である。特定の実施形態では、アシルアミノ酸は、本発明の組成物および方法を用いて商業的に実行可能な量で産生される。例えば、本発明の操作されたポリペプチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００ｍｇ／Ｌまたはそれ超のレベルまでアシルアミノ酸を産生するために用いられ得る。当業者によって理解されるとおり、本発明の操作されたポリペプチドを用いるアシルアミノ酸の生物学的産生は、アシルアミノ酸を産生する他の方法を上回る特定の利点を達成する。例えば、化学的産生方法と比較して、本発明の組成物および方法を用いるアシルアミノ酸の産生は、より容易に利用可能であり、かつ貯蔵が容易である出発材料を利用し、製造過程において有害で、時には危険な化学試薬を用いる必要性を減じ、バイオリアクターとして宿主細胞を利用することによってその合成の困難性および効率を低下し、化学的な副産物の廃棄の会計的および環境的なコストを低下する。他の利点は、本発明の組成物および方法を利用する実施者には明らかである。

アシルアミノ酸および組成物
本発明は、本明細書に記載のような操作されたペプチドシンテターゼによって産生されるアシルアミノ酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このような組成物は、同じ操作されたペプチドシンテターゼによって各々が合成されるという点でお互いに関連しており、および合成の条件下で（例えば、インビボまたはインビトロで）、関連の操作されたペプチドシンテターゼによって合成される、正確な化学構造が（例えば、アシル鎖の種々の長さおよび／または組成物、このようなアシル鎖内の連結、および／またはアシル鎖とアミノ酸との間などに起因して）変化した、化学物質の分布を一緒になって表す、個々のアシルアミノ酸分子の収集物を含む。いくつかの実施形態では、提供される組成物は、直鎖のアシル部分、分岐したアシル部分、および／またはそれらの組合せを含む。

すなわち、いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸の操作された産生物の１つの特色は、特にインビボで作用する場合、その操作されたペプチドシンテターゼが単一の化学物質の純粋な集団を生成し得ないということであることを当業者は理解する。したがって、上記で注記されるとおり、本発明は、化学物質の分布を含むアシルアミノ酸組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、実質的に全てのアシルアミノ酸が同じアミノ酸部分を含むアシルアミノ酸組成物であって、ただし、この組成物が、アシル部分の分布を含む組成物を提供する。

本明細書において用いる場合、本発明は、広範な種々のアシルアミノ酸および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アミノ酸部分が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、および／またはバリンからなる群から選択されるアミノ酸中で見出されるものであるか、またはそれを含むものを提供する。あるいはまたはさらに、いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、ここでこのアミノ酸部分が、セレノシステインおよび／またはピロリジンからなる群から選択されるアミノ酸中で見出されるものであるか、またはそれを含むものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アミノ酸部分がノルロイシン、β－アラニンおよび／またはオルニチンからなる群から選択されるアミノ酸中で見出されるものであるか、またはそれを含むものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アミノ酸部分がＬ－アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸中で見出されるものであるか、またはそれを含むものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アミノ酸部分がＤ－アミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸中で見出されるものであるか、またはそれを含むものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アミノ酸部分が、アミノ酸Ｄ－ｇｌｕまたはＤ－ジアミノプロピオン酸中で見出されるものであるか、またはそれを含むものを提供する。当業者は、このようなアミノ酸部分を含有しているアシルアミノ酸を生成するための本明細書に記載のペプチドシンテターゼによって（そして特に、本明細書に記載の操作されたペプチドシンテターゼによって）使用可能な、適切なアミノ酸基質を承知している。いくつかの実施形態では、アミノ酸基質は、列挙されたアミノ酸であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基が、酪酸（butryic acid）、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリンアラキジン酸、ベヘン酸、および／またはリグノセリン酸のような飽和脂肪酸中で見出されるものを提供する。本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基が、不飽和脂肪酸、例えば、限定するものではないが、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、および／またはドコサヘキサエン酸中で見出されるものを提供する。他の飽和および不飽和の脂肪酸（そのアシル部分が、本発明によって用いられ得る）は、当業者に公知である。特定の実施形態では、本発明によって提供されるアシルアミノ酸および組成物は、β－ヒドロキシ脂肪酸を脂肪酸部分として含む。当業者に理解されるとおり、β－ヒドロキシ脂肪酸は、脂肪酸鎖の第３の炭素に結合されたヒドロキシ基を含み、この第１の炭素は、カルボキシレート基の炭素である。

いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基がＣ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９、Ｃ３０からなる群から選択される下位の方の長さで、ならびにＣ３０、Ｃ２９、Ｃ２８、Ｃ２７、Ｃ２６、Ｃ２５、Ｃ２４、Ｃ２３、Ｃ２２、Ｃ２１、Ｃ２０、Ｃ１９、Ｃ１８、Ｃ１７、Ｃ１６、Ｃ１５、Ｃ１４、Ｃ１３、Ｃ１２、Ｃ１１、Ｃ１０、Ｃ９、Ｃ８、Ｃ７、Ｃ６、Ｃ５、Ｃ４、Ｃ３、Ｃ２、およびＣ１からなる群から選択される上位の方の長さ（ここで上位の方の長さは、下位の方の長さと同じかまたはそれより長い）で結合される範囲内の長さを有する脂肪酸鎖を含むか、またはそれらからなるものを提供する。いくつかの特定の実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基が、Ｃ１０～Ｃ１４脂肪酸鎖、Ｃ１３～１６脂肪酸鎖、Ｃ１３～１５脂肪酸鎖、Ｃ１６～２４脂肪酸鎖、Ｃ１８～２２脂肪酸鎖、Ｃ１８～２４脂肪酸鎖、Ｃ８～Ｃ１６脂肪酸鎖を含むか、またはそれらからなるものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基が、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、および／またはＣ２０脂肪酸鎖を含むか、主にそれらからなるか、またはそれらからなるものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基が、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、および／またはＣ１６脂肪酸鎖を含むか、主にそれらからなるか、またはそれらからなるものを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸および組成物であって、アシル基が、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、および／またはＣ１６脂肪酸鎖を含むか、主にそれらからなるか、またはそれらからなるものを提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸組成物であって、全てのアシルアミノ酸が同じアミノ酸部分を含む（または同じアミノ酸由来のアミノ酸部分を含む）アシルアミノ酸組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸組成物であって、組成物内の異なるアシルアミノ酸が、異なるアシル部分、（例えば、組成物中で、（１つまたは複数の鎖）の構造、分岐および／または長さが異なるアシル部分）を有するアシルアミノ酸組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このような組成物は、上記のような長さ（または長さの範囲内）のアシル部分を主に含む。いくつかのこのような実施形態では、このような優勢なアシル部分は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％＜９８％、または９９％のレベルで組成物中に存在する。本明細書の図および実施例は、本発明の特定の実施形態によって提供され、かつ調製され得る、特定の特別なアシルアミノ酸および／またはアシルアミノ酸組成物を、描写および／または記載する。いくつかの特定の実施例を挙げれば、本発明は２，４ジアミノ酪酸、（２Ｓ）－２，３－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、β－ヒドロキシミリストイルグルタミン酸、β－ヒドロキシミリストイルジアミノプロピオン酸、ベタイン、ココイルグリシン（cocyl glycinate）、グリシンラウレエート（gycine laureate）、グルタミンラウレエート（glutamine laureate）などを含むか、それらから主になるか、またはそれらからなる特定のアシルアミノ酸および／またはアシルアミノ酸組成物を特異的に例証するか、および／またはそうでなければ提供する。例えば、いくつかの特定の実施形態では、本発明は、アシルアミノ酸組成物であって、組成物中のアシルアミノ酸内のアミノ酸部分が、グリシンまたはグルタミン酸由来であり、かつ脂肪酸部分が主にＣ１２脂肪酸である（すなわち、ラウリン酸由来である）アシルアミノ酸組成物を提供する；いくつかのこのような実施形態では、組成物中の全てのアシルアミノ酸は、同じアミノ酸部分を有する。

宿主細胞
本発明の操作されたポリペプチドは、アシルアミノ酸の産生のための任意の種々の宿主細胞中に導入されてもよい。当業者によって理解されるとおり、操作されたポリペプチドは、通常は、発現ベクター中で宿主細胞に導入される。宿主細胞が、このような発現ベクターを受容および増殖可能であり、かつ操作されたポリペプチドを発現可能である限り、このような宿主細胞は、本発明によって包含される。本発明の操作されたポリペプチドは、目的の宿主細胞中に一過性に導入されても、または安定に導入されてもよい。例えば、本発明の操作されたポリペプチドは、宿主細胞の染色体中に操作されたポリペプチドを組み込むことによって安定に導入され得る。追加して、または代替的には、本発明の操作されたポリペプチドは、操作されたポリペプチドを含むベクターを宿主細胞に導入することによって一過性に導入されてもよく、このベクターは、宿主細胞のゲノム中に統合されないが、それにもかかわらず宿主細胞によって増殖される。

特定の実施形態では、宿主細胞は、細菌である。本発明の宿主細胞として有用な細菌の非限定的な例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓの属、および当業者に公知の種々の他の属の細菌が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の操作されたポリペプチドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ種の宿主細胞に導入される。

本発明の細菌の宿主細胞は、野性型であってもよい。あるいは、本発明の細菌の宿主細胞は、野性型種と比較して１つまたは複数の遺伝子変化を含んでもよい。特定の実施形態では、このような遺伝子変化は、細菌の宿主中へのアシルアミノ酸の産生に有益である。例えば、このような遺伝子変化は、アシルアミノ酸の収率もしくは純度の増大を生じてもよいし、および／またはアシルアミノ酸の産生に有用な種々の利点（例えば、生存度の増大、別のエネルギー源を利用する能力など）を有する細菌の宿主細胞をもたらし得る。

特定の実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。当業者は、例えば、限定するものではないが、金ボンバードメント（gold bombardment）およびアグロバクテリウム形質転換などの、本発明の操作されたポリペプチドを目的の植物細胞へ導入するための標準的な技術を承知している。特定の実施形態では、本発明は、目的のアシルアミノ酸を産生する操作されたポリペプチドを含むトランスジェニック植物を提供する。任意の種々の植物種は、本発明の操作されたポリペプチドの導入によってトランスジェニックにしてもよく、その結果、操作されたポリペプチドが、植物中で発現されて、目的のアシルアミノ酸を産生する。本発明のトランスジェニック植物の操作されたポリペプチドは、全身的に（例えば、各々の組織において全ての時点で）発現されてもよいし、または局在する組織においてのみ、および／または特定の期間の間のみ発現されてもよい。当業者は、操作されたポリペプチドが発現されるとき、および発現される場所を制御するために使用され得る種々のプロモーター、エンハンサーなどを承知している。

農作物に脅威である昆虫を含めて昆虫は、昆虫の生理学に重要であるかまたは必須であると考えられるアシルアミノ酸を産生する。例えば、ペプチドシンテターゼに関する酵素は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｅｂｏｎｙ遺伝子の生成物を産生し、この生成物は、ハエの適切な色素に重要であるが、神経系の適切な機能にも重要である（例えば、Richardtら、Ebony、a novel nonribosomal peptide synthetase for beta-alanine conjugation with biogenic amines in Drosophila、J.Biol.Chem.、２７８巻（４２号）：４１１６０～６頁、２００３年を参照のこと）。アシルアミノ酸はまた、作物に対して脅威である特定のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ種によっても産生される。したがって、本発明の組成物および方法は、このような昆虫を殺傷するか、そうでなければ作物に対するそれらの有害な影響を壊す、目的のアシルアミノ酸を産生するトランスジェニック植物を産生するために用いられてもよい。例えば、このような植物にはびこる昆虫を殺傷するように、所定の昆虫種に対して毒性であるアシルアミノ酸を産生する操作されたポリペプチドを、植物に導入してもよい。さらにまたはあるいは、昆虫の必須の活動（例えば、摂食、交尾など）を乱すアシルアミノ酸を産生する操作されたポリペプチドを、昆虫の侵襲の商業上有害な影響が最小化または排除されるように植物に導入してもよい。特定の実施形態では、植物に対する昆虫の有害な影響を軽減する、本発明のアシルアミノ酸は、このような昆虫によって天然に産生されるアシルアミノ酸である。特定の実施形態では、植物に対する昆虫の有害な影響を軽減する本発明のアシルアミノ酸は、このような昆虫によって天然に産生されるアシルアミノ酸の構造的なアナログである。本発明の組成物および方法は、任意の種々のアシルアミノ酸を産生する、操作されたポリペプチドの構築を可能にするのに極めて強力であり、このアシルアミノ酸は、１つまたは複数の植物種の有害な昆虫の侵襲を制御または排除するのに有用であり得る。

アシルアミノ酸および組成物を産生するステップ
アシルアミノ酸および組成物は、本明細書に記載の操作されたペプチドシンテターゼによって産生され得る。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸は、インビトロで産生される。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸は、インビボで、例えば、操作されたペプチドシンテターゼまたはその成分もしくはドメインを発現するために操作された宿主細胞中で産生される。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸は、細胞の１つまたは複数の成分と、および／または操作されたペプチドシンテターゼと会合して産生される。いくつかの実施形態では、アシルアミノ酸組成物は、例えば、当該分野で公知のような、１回またはそれ超の単離手順に供されて、例えば、産生されたアシルアミノ酸化合物がそれらの産生系の１つまたは複数の成分から（例えば、操作されたペプチドシンテターゼまたはそれらの成分もしくはドメインから、および／または操作された細胞のなど細胞の１つまたは複数の成分から）分離される。

（実施例１）
β－ヒドロキシアミノ酸を用いてアシルアミノ酸を産生するためのペプチドシンテターゼ遺伝子操作
本発明のいくつかの実施形態では、アシルアミノ酸を産生する操作されたペプチドシンテターゼを、公知のペプチドシンテターゼドメインを単離するか、および／もしくはそうでなければ遺伝子操作することによって設計するか、ならびに／または産生して（例えば、リポペプチド合成複合体の他のエレメント、ドメインまたは成分からリポペプチドを合成するペプチドシンテターゼ複合体中で見出される第１のペプチドシンテターゼドメインを分離することによって）、アシルアミノ酸を産生する。

例えば、β－ヒドロキシ脂肪酸を有するアシルアミノ酸は、適切な宿主生物中で、ｓｒｆ（サーファクチン）シンテターゼなどのシンテターゼのモジュール１を発現することによって創出され得る。ｓｒｆＡＡのモジュール１（配列表のｓｒｆＡＡモジュール１）は、グルタミン酸特異的であるので、適切な宿主中のモジュール１の発現は、β－ヒドロキシルミリストイルグルタミン酸の産生をもたらす。

同じアプローチを用いて、脂肪酸を種々の異なるアミノ酸に連結してもよい。なぜならそれらは、公知の（配列決定された）「モジュール１ ＤＮＡセグメント」であって、４つの別個のアミノ酸（Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、ＳｅｒまたはＤｈｂ；表を参照のこと）に特異的なアデニル化ドメインとともに、種々の天然の系からクローニングされ得るからである。さらに、種々の天然に存在するβ－ヒドロキシリポペプチド（ペプチドシンテターゼ酵素によって産生されると考えられる）が報告されており、これについては、それらの産生を担うシンテターゼをコードする遺伝子クラスターは配列決定されていない。新規なβ－ヒドロキシアシルアミノ酸は、これらのシンテターゼのうちの１つの「モジュール１」（これは、まだ配列決定されていない「モジュール１」のセットに属する）を具体的に同定するための標準的な分子生物学的技術を用いること、および適切な宿主中でそのモジュール１を発現することによって、産生してもよい。このアプローチは、β－ヒドロキシアシル：Ｐｈｅ、Ｄ－Ａｌａ、２，３－デヒドロ－２－アミノ酪酸、ＮＭｅ－Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＤ－アロ－トレオニンを含むさらなる新規なβ－ヒドロキシアシルアミノ酸の生成をもたらす。下の表は、それらを天然に合成する、公知のリポペプチドおよびペプチドシンテターゼの種々の性格をまとめており、これには関連のモジュール１のアミノ酸アシル基およびアミノ酸の特異性を含む。

本明細書の実施例に具体的に記載のとおり、追加の新規なβ－ヒドロキシアシルアミノ酸は、特定の所望のアミノ酸を特定するアデニル化ドメインに対して、β－ヒドロキシ脂肪酸の付加を特定する縮合ドメインを、作動可能に連結することによって産生され得る。実施例ＸＸＸでは、縮合ドメインは、グリシンに特異的なアデニル化ドメインに対して作動可能に連結され、適切な宿主中でのキメラの発現の際に、β－ヒドロキシミリスチルグリシンが産生される。所望のアミノ酸に特異的なアデニル化ドメインが利用可能である限りは、このアプローチは、任意の所望のβ－ヒドロキシアシルアミノ酸を創出するのに用いられてもよいことが、当業者には理解される。

標準的な２０個のアミノ酸の各々の使用を特定する、天然に存在するペプチドシンテターゼモジュールが利用可能であり、さらに、約３００の追加のアミノ酸、またはアミノ酸様分子に特異的であるアデニル化ドメインが利用可能である（Kleinkaufら）（引用文献１０）。このアプローチは、β－ヒドロキシ脂肪酸を、任意のこれらのアミノ酸、またはアミノ酸様分子に連結するために用いられてもよい。

（実施例２）
マイコスブチリンモジュール１（ＭｙｃＡ）を含むかまたはそれからなる操作されたペプチドシンテターゼ
上記のストラテジーと同様のストラテジーを用いて、β－アミノ脂肪酸を任意の所望のアミノ酸に連結してもよい。１つのアプローチは、天然に存在する「モジュール１」（例えば、マイコスブチリンシンテターゼのＭｙｃＡ、Duitmanらを参照のこと）（引用文献６）を同定すること、およびそのモジュールを、適切な宿主中で発現することである。この特異的な実施例では、ＦｅｎＦ遺伝子は、望ましくはまた、宿主中で発現される（配列表ＡＡＦ０８７９４．１）。

一般には、特定のβ－アミノ脂肪酸は、宿主生物中で天然には見出されない重要な追加の機能をコードする任意の遺伝子（単数または複数）（例えば、ＦｅｎＦなど）とともに、特定のアミノ酸に対するβ－アミノ脂肪酸の接合を特定するために公知のモジュールを発現することによって、適切な宿主中で産生されてもよい。追加的な新規のβ－アミノアシルアミノ酸は、β－アミノ脂肪酸の付加を特定する縮合ドメインを、特定の所望のアミノ酸を特定するアデニル化ドメインに対して作動可能に連結することによって産生され得る。やはり、追加的な必要な因子（例えば、ＦｅｎＦのホモログ）をコードする遺伝子も、宿主中で発現されてもよい。所望のアミノ酸に特異的なアデニル化ドメインが利用可能である限り、このアプローチを用いて、β－アミノ脂肪酸を任意のアミノ酸に連結してもよい。

（実施例３）
ダプトマイシンシンテターゼモジュール１を含むか、またはそれからなる操作されたペプチドシンテターゼ
上記のストラテジーと同様のストラテジーを用いて、任意の所望のアミノ酸に対して脂肪酸（β位で未修飾）を連結してもよい。１つのアプローチは、天然に存在する「モジュール１」（例えば、ダプトマイシンシンテターゼのＴｒｐ１モジュール、Miaoらを参照のこと）（引用文献１１）を同定すること、およびそのモジュールを、適切な宿主中で発現することである（配列表：ダプトマイシンシンテターゼのｄｐｔＡ１モジュール１）。さらに、この特定の実施例では、ＤｐｔＥおよびＤｐｔＦ遺伝子も、宿主中で発現されるべきである。

一般には、特定のアシルアミノ酸（β位で未修飾）は、宿主生物中で天然には見出されない重要な追加の機能をコードする任意の遺伝子（単数または複数）（例えば、ＤｐｔＥおよびＤｐｔＦなど）とともに、特定のアミノ酸に対する脂肪酸の接合を特定するために公知のモジュールを発現することによって、適切な宿主中で産生されてもよい。追加的な新規のアシルアミノ酸は、脂肪酸の付加を特定する縮合ドメインを、特定の所望のアミノ酸を特定するアデニル化ドメインに対して作動可能に連結することによって産生され得る。例えば、β位で未修飾である脂肪酸は、そのアデニル化に連結されたｄｐｔＡ１モジュール１の縮合ドメイン、およびｄｐｔＡ１モジュール５（配列表ｄｐｔＡ１モジュール５）のチオール化ドメイン（グリシンに特異的である）から構成されるキメラシンテターゼを用いてグリシンに結合されてもよい。

（実施例４）
いくつかの実施形態について有用なまたは必須の追加の遺伝子
カルシウム依存性抗生物質（ＣＤＡ）システムについては、特異的な遺伝子座関連脂肪酸シンターゼが、ヘキサン酸を産生し、これが、ＣＤＡの第１のアミノ酸に接合されると考えられる；詳細には、ＡＣＰ（ＳＣＯ３２４９）、ＦａｂＨ４（ＳＣＯ３２４６）、ＦａｂＦ３（ＳＣＯ３２４８）遺伝子生成物は、ヘキサン酸（これが次に、アミノ酸基質、この場合は、Ｓｅｒに接合される）の産生に重要であると考えられる（引用文献１２）。

（実施例５）
ＦＡ－Ｇｌｕ組成物
いくつかの実施形態では、ＦＡ－Ｇｌｕを合成するために操作されたペプチドシンテターゼを利用する、典型的な操作された株によって産生される脂肪酸の分布は、全てがβ－ヒドロキシルを有するが、変化する鎖長を有する脂肪酸から構成される。いくつかの特定の実施形態では、この鎖長は、以下の方式で変化する：Ｃ１２、１．６％；Ｃ１３、１６．２％；Ｃ１４、５５％；Ｃ１５、２５．９％；Ｃ１６、１．２％およびＣ１７、０．０１％。

いくつかの実施形態では、偶数の脂肪酸のうちのいくつかは分岐されて、いくつかは直鎖である。

いくつかの実施形態では、奇数の脂肪酸のうち直鎖であるものはない（すなわち、それらは全て分岐している）。奇数の鎖は、イソまたはアンテイソのいずれであってもよい；いくつかの実施形態では、本発明は、これらの形態の異なる関連の量（例えば、比）を有する異なる組成物を提供する。分岐の命名法は、引用文献１６の図１に十分示される。Fatty Acids of the Genus Bacillus:an example of branched-chain preference、Toshi Kaneda、Bacteriological Review、１９７７年、４１巻（２号）、３９１～４１８頁。

いくつかの実施形態では、操作されたペプチドシンテターゼを用いてＦＡ－Ｇｌｕを産生する操作された株については、脂肪酸鎖分布は、特定のケト酸が株に供給される場合に変化する（下の表１を参照のこと）。脂肪酸鎖分布における劇的な変化は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で脂肪酸合成を開始するために用いられるケト酸を合成する酵素がノックアウトされ、単一のケト酸が鎖に供給される場合に、生じ得る。いくつかの実施形態では、ケト酸の濃度が変化するにつれて、脂肪酸種のパターンは変更される。

いくつかの実施形態では、変異体に２０ｍＭのイソ酪酸を供給することによって９５％Ｃ１４脂肪酸を有するＦＡ－Ｇｌｕを含有する組成物が提供される。

いくつかの実施形態では、奇数の鎖を有する分岐した脂肪酸を産生するためにのみ用いられ得る、低レベルのケト酸の供給を利用して、Ｃ１４長の脂肪鎖を有する約８０％（１００ｕＭの２－メチル酪酸または１００ｕＭのイソ吉草酸）の界面活性剤を含む脂肪酸の集団を産生する。

有意には、変異体は、偶数の分岐した鎖の脂肪酸鎖合成のためのそれ自体のケト酸スターターを合成できないので、低濃度のこれらのケト酸のいずれか（１００ｕＭの２－メチル酪酸または１００ｕＭのイソ吉草酸）の供給によって、主に偶数であってかつ直鎖である界面活性剤の集団の産生が可能になる。したがって、本発明は驚くべきことに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生される、ほとんど直鎖（分岐ではない）の脂肪酸を含む組成物、組成物を生成するための方法および組成物を提供する。実際、本発明は直鎖脂肪酸を排他的に産生するＢａｃｉｌｌｕｓ株を生成するためのストラテジー（およびそのように生成された株）を具体的に記載する。

（実施例６）
両性界面活性剤の産生
本実施例は、負の電荷を保有する１つの領域（単数または複数）および正の電荷を保有する別の領域（単数または複数）を有する両性界面活性剤を産生する、（操作された宿主細胞中での）操作されたペプチドシンテターゼの使用を記載する。このような界面活性剤を産生するために用いられ得るアミノ酸の例は、下の図に示す。このアミノ酸は全てが２つのアミノ基を有し、かつ：２，４－ジアミノ酪酸、（２Ｓ）－２，３－ジアミノ酪酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、オルニチンおよびリジンを含む。

この種類の界面活性剤の１つの特別な実施例は、下の図に示され、これは、β－ヒドロキシミリストイルジアミノプロピオン酸である：

この界面活性剤は、２，３－ジアミノプロピオン酸のβアミンのｐＫａが９．５７であり、かつαカルボキシルのｐＫａが約２．２であるならば、生理学的ｐＨでは両性イオンである。この界面活性剤を生成するために、アミノ酸に対するβ－ヒドロキシル脂肪酸の連結を指向し得る縮合ドメイン（例えば、ＳＲＦＡＡモジュール１の縮合ドメイン）（配列表ｓｒｆＡＡモジュール１）を、２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）に特異的なモジュールのアデニル化ドメインおよびチオール化ドメインに連結する。Felnagleらは、ＤＡＰを組み込むペプチドシンテターゼを記載している。このシンテターゼは、Saccharothrix mutabilis subsp.capreolus ATCC 23892に見出される。このＤＡＰ特異的なモジュールは、ＣｍｎＡの第２のモジュールである（配列表ＣｍａＡ、Ａ２）。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ １６８は、ＤＡＰを合成しない。セリンをＤＡＰに変換できるには、Ｂａｃｉｌｌｕｓに２つの遺伝子を追加する必要がある。この遺伝子は、下で引用される引用文献に記載されている。この遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよび他の細菌に見出される。この遺伝子は、ｓｂｎＡおよびｓｂｎＢと呼ばれる。例えば、この遺伝子は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの株ＪＨ９に存在し、またＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの株Ｍｕ５０／ＡＴＣＣ ７００６９９にも存在する。ｓｂｎＡ遺伝子（配列表ｓｂｎＡ）は、ＳａｕｒＪＨ９ ０１０３としても公知である。ｓｂｎＢ遺伝子（配列表ｓｂｎＢ）はまた、ＳａｕｒＪＨ９ ０１０４としても公知である。

ｓｂｎＡおよびｓｂｎＢ遺伝子のホモログが、ｓｂｎＡおよびｓｂｎＢの代わりに、またはそれらに加えて用いられてもよい。例えば、ツヴィッターマイシンを合成するＢａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ株は、それぞれ、ＺｍａＵ（配列表ＺｍａＵ）およびＺｍａＶ（配列表ＺｍａＶ）と呼ばれる、ｓｂｎＡおよびｓｂｎＢのホモログをコードする。

上の図に示す界面活性剤の第一級アミンの電荷は、ｐＨに依存し、ｐＨ７．０の付近では正である。ｐＨが上がるにつれて、アミンは水素を失い、電荷が中性になる。ｐＨに依存して正の電荷を有する界面活性剤は、上記で示される界面活性剤をベタイン（第四級アンモニウム基を保有する）に変換することによって産生され得る。下の図を参照のこと。

これは、SimonおよびShokat（引用文献リストの引用文献を参照のこと）に記載の方法
を用いてインビトロで行ってもよい。１００ｍｇの（２－ブロモエチル）トリメチルアンモニウムブロミドを微小遠心管に添加する。脂肪酸－ＤＡＰ（ＦＡ－ＤＡＰ）界面活性剤の１ｍＬの溶液を、この管に添加する。この混合物を５０℃で固体が溶けるまで振盪する。反応を約５時間進行させる。残りのアルキル化剤を消費するために、反応を５０μｌの２０メルカプトエタノールを用いてクエンチし、室温で３０分間インキュベートする。

あるいはまたはさらに、メチルトランスフェラーゼを用いてインビボでメチル化を遂行してもよい。記号のうちの１つは翻訳されず、これはｂｏｘＢａｃｔｅｒｉａｌとして示される。－Ｎ－メチルトランスフェラーゼがＺｈａｎｇらによって記載されている。例として、メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列表Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｒｍＡ）またはＥ．ｃｏｌｉ（配列表Ｅ．ｃｏｌｉ ｐｒｍＡ）から得てもよい。シペマイシンを修飾するメチルトランスフェラーゼを用いてもよい（配列表のシペマイシンメチルトランスフェラーゼ）；この遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＯＨ－４１５６に見出される。類似のタンパク質（７６％同一）をコードする遺伝子は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ ｓｕｂｓｐ．ｇｒｉｓｅｕｓ ＮＢＲＣ １３３５０（配列表Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓメチルトランスフェラーゼ）から得てもよい。

（実施例７）
特別な脂肪酸分岐パターンを有する脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生
生きている生物によって産生される天然に存在する脂肪酸は、通常は、脂肪酸およびそれらの誘導体の溶融温度に影響する２つの種類の修飾を有する。これらの修飾は、分岐および不飽和化（すなわち、特別な二重結合の存在）であって、両方の修飾とも脂肪酸の融点を低くする。

特別なグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含む特定の生物、ならびに酵母のような代表的な真核生物は、脂肪酸の不飽和化によって膜の流動性を制御する。膜に不飽和脂肪酸を導入する能力は、温度が低下する場合の膜流動性の維持に関して重要である。特定の細菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、膜流動性を増大するのに不飽和化に依拠しない。その代わり、これらの細菌は、分岐した脂肪酸の合成を介して膜流動性を制御する（分岐した脂肪酸を合成する代表的な細菌の属のリストに関しては、引用文献１３の表３を参照のこと）。

膜流動性を制御するための生物の一般的な要件を考えれば、生物学的に産生されたオイルは通常は、分岐、二重結合または両方とも含む。脂肪酸およびそれらの誘導体の市販の産生物の展望から、消費者にとって特別な利益をもたらす特別な特徴を有する脂肪酸を産生するには、これらの分岐および不飽和化反応を制御する必要がある。分岐および不飽和化を制御するための方法は下に記載される。

背景情報として、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉを直鎖脂肪酸（すなわち、分岐を欠いている脂肪酸）を合成する生物の例とみなし、脂肪酸合成は、酵素ｆａｄＨ（β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ）がアセチル－コエンザイムＡ（アセチルＣｏＡ）とマロニル－アシルキャリアタンパク質（マロニル－ＡＣＰ）との縮合を触媒する場合に開始する（引用文献１４）。この縮合は、アセトアセチル－ＡＣＰを産生し、これは、次にＥ．ｃｏｌｉの脂肪酸合成機構の相互作用によって延長される。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける脂肪酸合成の開始は、異なっているが類似の機序によって生じる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓは、２つのβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ酵素（ｆａｄＨＡおよびｆａｄＨＢ）をコードする。これらの酵素は、基質としてアセチル－ＣｏＡを利用するが、それらは、分岐した基質、例えば、イソブチリル－ＣｏＡ、２－メチルブチリル－ＣｏＡおよびイソバレリル－ＣｏＡを用いることを選好する（引用文献１５）。これらのＣｏＡ誘導体は、それぞれ、アミノ酸Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシンおよびＬ－ロイシンから産生される（引用文献１６）。

分岐したスターターユニットによる脂肪酸合成の開始は、最終的に分岐した脂肪酸の合成をもたらす。分岐したスターターの正確な化学的組成は、合成された脂肪酸の長さおよび特異的な分岐に影響する。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中のイソブチレートでの開始は、１４個の炭素（Ｃ１４）および１６個の炭素（Ｃ１６）のような偶数の長さを有する「イソ」脂肪酸の産生をもたらす。２－メチルブチレートによる開始では、奇数の「アンテイソ」脂肪酸（例えば、Ｃ１５およびＣ１７）の合成がもたらされる。イソバレレートでの開始。

特別なアミノ酸（Ｌ－バリン、Ｌ－イソロイシンおよびＬ－ロイシン）をそれらのそれぞれのケト酸に変換することを担う酵素活性は、α－ケト酸デヒドロゲナーゼである。α－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く変異体Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞は、成長のために少なくとも１つのケト酸の追加を必要とする（イソブチレート、２－メチルブチレートまたはイソバレエート）（引用文献１７）。βケト酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く株への特定のケト酸の供給は、変異体株の成長不全を救済するだけでなく、細胞の脂肪酸組成物にも特異的に影響する。例えば、変異体へのイソブチレートの供給は、偶数の鎖長を有する脂肪酸の排他的な合成をもたらす。これらの脂肪酸鎖は、イソブチレートスターター由来の脂肪酸（ｉ１４：０、３３％；ｉ１６：０、５１％）およびまたスターターとして新規に合成された酢酸塩を用いて産生された直鎖脂肪酸（１４：０、２％；１６：０、１３％）も含む（引用文献１７を参照のこと）。さらに、奇数の脂肪酸は、β－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く株がイソブチレートを供給される（ただし、２－メチルブチレート、および／またはイソバレエートを供給されるのではない）場合、排除されることに注意のこと。

２－メチルブチレートの供給によって、新規に産生された酢酸塩（１４：０、２％；１６：０、８％）の利用を介してやはり産生された、いくつかの直鎖の偶数の脂肪酸を有するａ１５：０、５１％およびａ１７：０、３９％の産生がもたらされる（引用文献１７）。

イソバレエートの供給は、以下のパターンをもたらす：ｉ１５：０、５６％；ａ１５：０、７％；ｉ１７：０、１２％；ａ１７：０、２％；１４：０、３％および１６：０、１６％）。アンテイソ脂肪酸の存在は、予想されず、この研究で用いられるイソバレレートは、２－メイルブチレートのようなケト酸が混入されることが示唆される。直鎖の偶数の脂肪酸は、新規に産生された酢酸塩を利用して産生される（これらのデータは引用文献１７からとる）。

正確な長さおよび分岐を有する脂肪酸および脂肪酸誘導体を産生する商業的必要性がある。本明細書の実施例では、本発明者らは、アシルアミノ酸界面活性剤のような脂肪酸および脂肪酸誘導体の特別な集団を産生するための方法を記載する。

Ｂａｃｉｌｌｕｓなどの生物中で脂肪酸の分岐を特異的に制御することに加えて、分岐した脂肪酸テールではなく直鎖を有する界面活性剤を産生するために、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓのような生物中での分岐を排除することが特定の場合には有利である。これは、アセチルＣｏＡのような直鎖スタートを用いることを選好する、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中でβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ酵素を発現することによって遂行され得る。この例として、Ｌｉおよび共同研究者は、内因性β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ酵素をＥ．ｃｏｌｉのｆａｂＨで置き換えることによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの株（これは、通常は分岐した脂肪酸を主に合成する）を、８６％の直鎖脂肪酸を合成する株に変換した（引用文献１８）。一般的方法の次には、Ｅ．ｃｏｌｉのｆａｄＨと同様の方式（すなわち、それらは、直鎖脂肪酸の合成を生じるアシルＣｏＡのような主に直鎖のスターターユニットを用いて脂肪酸合成を開始する）で機能する酵素を同定することが続いてもよい。

ガス液体クロマトグラフィーなどの方法を用いて、生物が直鎖脂肪酸を合成するか、または代わりに直鎖および分岐した脂肪酸の混合物を合成するかを決定してもよい。例えば、Kaneda（引用文献１６）は、ガス液体クロマトグラフィーを用いて、１６種類のＢａｃｉｌｌｕｓの脂肪酸を特徴付け、１６種全てが直鎖および分岐した脂肪酸の混合物を合成したことを見出した。対照的に、KanedaおよびSmith（引用文献１９）が報告した類似の研究によって、特定の細菌および酵母が排他的に直鎖脂肪酸を合成することが示され、そして実際にほとんどの生物が排他的に直鎖脂肪酸を合成する。ＫａｎｅｄａおよびSmithは、細菌Ｅ．ｃｏｌｉおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓが直鎖脂肪酸を排他的に合成することを報告した。排他的に直鎖脂肪酸を合成する生物の他の例は、引用文献２０に報告されており、これには種々のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、ならびに他の種が挙げられる。

直鎖脂肪酸を排他的に合成する生物が一旦同定されれば、生物のゲノムが配列決定されていると仮定し、比較の配列分析を用いて、その生物がＥ．ｃｏｌｉ ｆａｂＨと類似のタンパク質をコードするか否かを決定してもよい。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａのｆａｂＨホモログをコードする遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉのｆａｂＨに対して３９％同一である。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｂＨをクローニングし、酵素が産生されてインビトロで研究されたとき、短い直鎖ＣｏＡプライマーを利用すること、および直鎖脂肪酸を合成することが選好されることが見出された（引用文献２１）（配列表ＡＦ３８４０４１を参照のこと）。

特定の場合には、直鎖脂肪酸を排他的にまたは主に合成する生物は、Ｅ．ｃｏｌｉのｆａｂＨに対して機能的に等価であるが、ｆａｂＨに相同性は有さない酵素をコードする。例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＰＡ５１７４遺伝子は、ｆａｄＨに対して相同ではないが、同じ機能を果たし、かつ脂肪酸合成のためのスターターとしてアセチルＣｏＡを用いることを選好するｆａｂＹ酵素をコードする（この引用文献２２「Fatty Acid Biosynthesis in Pseudomonas aeruginosa is initiated by the FabY Class of-Ketoacyl Acyl Carrier Protein Synthases」を参照のこと）。この目的のために用いられ得るＰＡ５１７４に対して相同な遺伝子としては、以下の遺伝子およびそれらのホモログが挙げられる－配列表：Ｐｍｅｎ＿０３９６、ＭＤＳ＿０４５４、Ｐｓｅｆｕ＿４０６８、Ａｖｉｎ＿０５５１０、ＰＳＰＡ７＿５９１４、ＰＬＥＳ＿５５６６１およびＰＡ１４＿６８３６０を参照のこと。

分岐した脂肪酸を産生する株（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を、直鎖脂肪酸を主にまたは排他的に産生する株に変換するために、Ｅ．ｃｏｌｉのｆａｂＨまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡ５１７４などの遺伝子を、それが正確な時間およびレベルで発現されるように、その株に導入する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの特定の場合には、直鎖スターターを選好する異種酵素が正確な時間で、および正確なレベルで発現されることを保証するためには、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｄＨＡの発現を通常制御するプロモーター（ｆａｄｈＡプロモーター、配列表「ｆａｂｈＡプロモーター」を参照のこと）の制御下に、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ酵素をコードする異種遺伝子を置くことが有利である。

異種β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ酵素が一旦、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中で発現されれば、分岐された脂肪酸合成は、β－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を低下、変更または排除することによってさらに低下され得る。さらに、分岐した脂肪酸のレベルは、内因性Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｄＨＡおよび／またはｆａｄＨＢ遺伝子（ｆａｄＨ１またはｆａｄＨ２としても公知）の活性を低下、変更または排除することによって低下され得る。

操作された株が、低レベルの分岐した脂肪酸で発達される場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ中でデサチュラーゼ酵素を発現して、Ｂａｃｉｌｌｕｓが膜の流動性を維持することを可能にするためにＢａｃｉｌｌｕｓの脂肪酸のサブセット中に十分な二重結合を導入することが有利である。用いられ得るデサチュラーゼの例としては、Ｐｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒａｔｉｖｏｒａｎｓ由来の９－脂肪酸デサチュラーゼ（引用文献２３）（配列表ＥＦ６１７３３９）およびＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎｅ由来の９－脂肪酸デサチュラーゼ（引用文献２４）（配列表ＡＢ０１５６１１）が挙げられる。

代替的に、または追加して、内因性のＢａｃｉｌｌｕｓデサチュラーゼ、ｄｅｓ（引用文献２５）（配列表ＡＦ０３７４３０）の構成的発現を生じる遺伝子変化を行ってもよい。例えば、構成的なｄｅｓ発現は、ｄｅｓｋの欠失を介して可能になり得る（配列表ＤｅｓＫ ｇｅｎ）（引用文献２６）。ｌｉｐＡ（ｙｕｔＢ）ノックアウトの株は脂肪酸を合成できず、成長のためにケト酸および酢酸塩の両方を必要とすることが実証された（引用文献２６）。ｄｅｓの構成的発現は、転写活性化因子ＤｅｓＲの過剰発現をもたらし、ｄｅｓの構成的発現を生じる、ｄｅｓＫをノックアウトすることによって達成された。ｄｅｓの過剰発現は、約１３％のＢａｃｉｌｌｕｓ脂肪酸の不飽和化をもたらし、ケト酸の必要性を排除し、これによって、分岐した脂肪酸を産生できないことによって生じる成長欠陥が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ脂肪酸の特定の集団の不飽和化によって克服され得ることが示される。

直鎖脂肪酸を有するアシルアミノ酸界面活性剤を産生するための別のストラテジーは、Ｅ．ｃｏｌｉのような分岐した脂肪酸を産生しない株中でアシルアミノ酸を産生するペプチドシンテターゼ酵素を発現することである。サーファクチンの産生のために必要なｓｒｆＡオペロンは、Ｅ．ｃｏｌｉ中でクローニングされ、発現されたことが報告された（引用文献２７）。しかし、リポペプチドは、直接特徴付けされず、そうではなく、著者らは、操作された株が、新規な疎水性化合物（これを対照としてサーファクチンを用いるＴＣＬによって分析した）を生じることを報告している。サーファクチンのＲｆ値は、０．６３であって、新規な疎水性化合物は、０．５２というＲｆ値を示した。著者らは、Ｒｆ値が異なった理由は推測しなかった。

直鎖脂肪酸を有するアシルアミノ酸は、アシルアミノ酸の合成を指向し得るペプチドシンテターゼ酵素をコードする遺伝子（例えば、ｓｒｆＡＡのモジュール１）を、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターの制御下でＥ．ｃｏｌｉのプラスミド中にクローニングすること、およびこのクローニングされた遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中に導入することによって産生され得る。ペプチドシンテターゼ酵素を改変して、それらの酵素を機能的に活性化するために必要なホスホパンテテイニルトランスフェラーゼである、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｆｐなどの遺伝子をクローニングおよび発現することも必要である（引用文献２８を参照のこと）。産生される界面活性剤の量、および界面活性剤分子の集団に存在する脂肪酸テールの長さは、引用文献２９に記載のＬＣＭＳを用いて決定され得る。

所望のアシルアミノ酸を産生する株が一旦生成されれば、その株をさらに改変して、アシルアミノ酸の収率を増大してもよい。収率を増大するための１つのストラテジーは、アシルアミノ酸の産生を制限する遺伝子を不活性化する（例えば、欠失する）ことである。欠失された場合、アシルアミノ酸の収率を増大する遺伝子が一旦同定されれば、複数のこのような欠失を保有している株を生成してもよい。さらに、界面活性剤収率に影響しない遺伝子、または界面活性剤収率にネガティブに影響する遺伝子のいずれも、アシルアミノ酸産生を刺激する遺伝子で置き換えられてもよい。本明細書の実施例は、ＦＡ－Ｇｌｕと呼ばれる、欠失された場合、アシルグルタミン酸界面活性剤の収率を増大する遺伝子を記載している。

（実施例８）
ファーメンテーションによるβ－ヒドロキシミリストイルグリシネートの産生
米国特許第７，９８１，６８５号に記載のとおり、Ｍｏｄｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｄｕｌａｒ）は、操作されたペプチドシンテターゼ酵素が、アシルアミノ酸（β－ヒドロキシミリストイルグルタミン酸）を産生するのに用いられ得ることを示す。このアプローチは、β－ヒドロキシミリストイルグリシネートを産生するために拡張された。これは、β－ヒドロキシミリストイルグリシネートの産生についての詳細な情報である。

ｓｒｆＡＡモジュール１の縮合ドメインをコードするＤＮＡと、Ｌｉｎｅａｒ Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎのモジュール２のアデニル化ドメインをコードするＤＮＡとの間の融合を用いるＦＡ－ＧＬＹ－ＴＥ構築物の遺伝子操作。

本実施例では、本発明者らは、ＦＡ－ＧＬＵの産生を担う遺伝子をコードするＯＫＢ１０５Δ（ｕｐｐ）ＳｐｅｃｔＲＦＡ－ＧＬＵ－ＴＥ－ＭＧ由来のゲノムＤＮＡを増幅し、この領域は、プライマー３５６６４－Ｃ４：５’－ＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡｔＡＴＣＧＡＣＡＡＡＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＣＧ－３’および３５６６４－Ｄ４：５’－ＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣｔＴＴＡＴＧＡＡＡＣＣＧＴＴＡＣＧＧＴＴＴＧＴＧＴＡＴＴ－３’を用いて増幅した。このフラグメントを、テンプレートｐＵＣ１９、ならびにプライマー３５６６４－Ｂ４：５’－ＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧｔＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧ－３’および３５６６４－Ａ４：５’－ＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡａＴＣＴＧＣＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＡＴＡＧＴＴ－３’から得られたＰＣＲ生成物にアニーリングした。このアニーリングされた混合物を、ＳＵＲＥ細胞中に形質転換して、プラスミドＰｓｒｆ－Ｇｌｕ－ＴＥ－ｐＵＣ１９を産生した。

Ｐｓｒｆ－Ｇｌｕ－ＴＥ－ｐＵＣ１９を、テンプレートとして用いて、このプラスミドの改変体を遺伝子操作し、これにはＬｉｎｅａｒ Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ（このアデニル化ドメインは、アミノ酸グリシンに特異的である）のモジュール２のアデニル化ドメインに対するｓｒｆＡＡモジュール１の縮合ドメインの融合、続いてＴＥを含有した。

Ｌｉｎｅａｒ Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎのモジュール２に対応するＤＮＡ配列を、プライマー３５６６４－Ｇ４：５’－ＧＣＴＴＧＣＴＴＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＴＣＡ－３’および３５６６４－Ｈ４：５’－ＴＣＧＡＡＴＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＧＡ－３’を用いて、株Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（ＡＴＣＣ ８１８５）のゲノムＤＮＡから増幅した。得られたＰＣＲを、プライマー３５６６４－Ｈ２：５’－ＣＡＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＧＡｇＡＡＡＣＧＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＧＧ－３’および３５６６４－Ｆ２：５’－ＣＴＣＣＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＡＡＡＴｃＧＴＣＧＣＧＡＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＧ－３’のためのテンプレートとして用いた。

このフラグメントを、プライマー３５６６４－Ｃ７：５’－ＧＡＴＴＴＣＴＴＴＧＣＧＣＴＣＧＧＡｇＧＧＣＡＴＴＣＣＴＴＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡ－３’および３５６６４－Ｅ７：５’－ＣＴＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＡＴＣＡＧＴｇＴＴＡＡＴＴＣＡＴＣＡＡＴＴＧＴＡＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＧＣ－３’を用いて、テンプレートＰｓｒｆ－Ｇｌｕ－ＴＥ－ｐＵＣ１９から得たＰＣＲ生成物にアニーリングした。このアニーリングされた混合物を、ＳＵＲＥ細胞に形質転換して、プラスミドＰｓｒｆ－Ｇｌｙ－ｌｇｒ＿ｍ２－Ｆ３－ＴＥ－ｐＵＣ１９を産生した。このプラスミドを用いて、２３８４４－ｄ１ ＯＫＢ１０５Δ（ｕｐｐ）ＳｐｅｃｔＲ（Δｍｏｄ（２－７））ｕｐｐ＋ＫａｎＲを形質転換した。得られた株をＯＫＢ１０５Δ（ｕｐｐ）ＳｐｅｃｔＲＦＡ－ＧＬＹ－ＴＥと命名した。

このストラテジー由来の１つの株（ＦＡ－ＧＬＹを産生するために正確な配列を有した）は、３７２３７－ｄ３と命名された。株ＯＫＢ１０５Δ（ｕｐｐ）ＳｐｅｃｔＲＦＡ－ＧＬＹ－ＴＥによるＦＡ－ＧＬＹの産生の分析によって、その株は、検出可能な量のＦＡ－ＧＬＹを産生できたことが示される。データは、ＬＣ－ＭＳ分析を用いて得た。ＯＫＢ１０５Δ（ｕｐｐ）ＳｐｅｃｔＲＦＡ－ＧＬＹ－ＴＥ由来の物質のＭＳ－ＭＳ分析によって、その生成物が実際にＦＡ－ＧＬＹであったことが明らかになった（配列表Ｐｓｒｆ－Ｇｌｙ－ｌｇｒ＿ｍ２－Ｆ３－ＴＥ－ｐＵＣ１９）。

ＦＡ－ＧｌｙのＬＣＭＳ分析。３００ダルトンの種は、１４個の炭素の脂肪酸テールを有するＦＡ－Ｇｌｕである。６００ダルトンの種は、３００ダルトンの種の二量体である。３１４ダルトンの種は、ＦＡ－Ｇｌｕであって、１５個の炭素の脂肪酸テールを有する。６２８ダルトンの種は、３１４ダルトンの種の二量体である。

３１４ダルトンの種および３２８ダルトンの種のＭＳ／ＭＳ分析：３１４の種は、Ｇｌｙ＋ＣＨ_３ＣＯを有する１つの種および残りの脂肪酸の予想サイズである第２の種（「－Ｇｌｙ」と表示）に断片化される。３２８の種は、Ｇｌｙ＋ＣＨ_３ＣＯを有する１つの種および残りの脂肪酸の予想サイズである第２の種（「－Ｇｌｙ」と表示）に断片化される。

（実施例９）
Ｂａｃｉｌｌｕｓのα－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性は、２つの酵素ｂｋｄＡＡおよびｂｋｄＡＢをコードする遺伝子を欠失することによってノックアウトされた。これらの遺伝子は、α－ケト酸デヒドロゲナーゼのＢａｃｉｌｌｕｓＥ１およびＥ１β成分をコードする（分岐した鎖α－オキソ酸デヒドロゲナーゼとしても公知）（引用文献３０を参照のこと）。これらの遺伝子は、アミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）に連結された脂肪酸（ＦＡ）から構成される、ＦＡ－Ｇｌｕと呼ばれるアシルアミノ酸界面活性剤を産生する株ではノックアウトされた。

対照株（α－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を保持する）について表Ａに示されるとおり、界面活性剤は、長さがＣ１２～Ｃ１７で変化し、Ｃ１４が優勢である（５５％）脂肪酸テールを有する分子の集団から構成される。変異体株（これは、α－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を欠く）に２０ｍＭのイソブチレートが供給される場合、界面活性剤集団の脂肪酸組成物は、約９５％のＣ１４に狭まる。Ｃ１４の長さの脂肪酸テールを有する界面活性剤は、特定の適用、例えば、シャンプー、ボディソープおよび他の製品などのパーソナルケア製品における使用に特に有用である。界面活性剤集団の脂肪酸テール長は、変異体株に対して、奇数の分岐した脂肪酸の産生を生じるスターターケト酸を供給することによって特異的に改変され得る。具体的には、Ｃ１３：０、２７％；Ｃ１５：０、６５％という脂肪酸テール組成物を有する界面活性剤分子の集団は、変異体の２０ｍＭの２－メチル酪酸を供給する際に産生された。したがって、この株は、９０％を超える奇数の分岐した脂肪酸テール（おそらく、アンテイソ）を有する界面活性剤を産生した。Ｃ１２：０、３．７１％；Ｃ１４：０、７６．０４％；Ｃ１６：０、２．２０％という脂肪酸テール組成物を有する界面活性剤分子の集団は、変異体１００μＭの２－メチル酪酸を供給した際に産生された。したがって、この株は、８０％超の偶数の脂肪酸テールを有する界面活性剤を産生した。変異体株が、偶数の鎖長を有する分岐した脂肪酸を産生不能であり、かつ奇数の分岐した脂肪酸を産生するためにのみ用いられ得るケト酸を供給されたとすれば、偶数の脂肪酸分子のこの集団は、直鎖（未分岐の）脂肪酸を含む。２０ｍＭのイソ吉草酸の供給では、９０％を超える奇数の分岐した脂肪酸（おそらくイソ）を有する界面活性剤が産生された。１００μＭのイソ吉草酸の供給では、８０％を超える偶数（直鎖）脂肪酸テールを有する界面活性剤が産生された。

本発明者らは、アシラーゼを用いてアシルアミノ酸界面活性剤を特異的に切断して、遊離の脂肪酸およびアミノ酸を生成し得ることを以前に実証した。このアプローチを上記の界面活性剤集団とともに用いて、脂肪酸の特別な精製された集団、例えば、９０％超のＣ１４脂肪酸からなる集団、または９０％超のアンテイソＣ１３およびＣ１５、もしくは９０％超のイソＣ１３およびＣ１５、もしくは８０％超の直鎖（偶数の脂肪酸）からなる集団を産生してもよい。

実験の詳細：
本実施例では、本発明者らは、ｂｋｄＡＡおよびｂｋｄＡＢ遺伝子をコードするＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＯＫＢ１０５のゲノム領域、ならびに上流および下流の隣り合った遺伝子（ｂｕｋ、ｌｐｄＶ、ｂｋｄＢ、ｂｍｒＲ、およびｂｍｒ）を、プライマー４７０１４：５’－ＡＡＴＡＴＣＧＴＡＴＴＧＡＡＴＡＧＡＣＡＧＡＣＡＧＧ－３’および４７０１５：５’－ＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＡＴＴＣＧＴＧＧＡＴ－３’を用いて増幅した。得られたＰＣＲを、テンプレートとして用いて、上流および下流の両方のフラグメントを増幅した。

上流のフラグメントを、プライマー４７０２０：５’－ＧＴＧＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＡＣＧＴＧ－３’および４７０２３：５’－ＡＴＣＡＴＴＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＣＡＧＴＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＴＴＧ－３’を用いて増幅した。下流のフラグメントは、プライマー４７０２６：５’－ＡＡＴＴＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＧＧＣＡＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＧＧＡＴＡＣＡＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＴＴ－３’および４７０２１：５’－ＧＧＴＡＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＣＧＧＴＡＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧ－３’を用いて増幅した。ＵＰＰ／Ｋａｎをコードする遺伝子は、テンプレートｐＵＣ１９－ＵＰＰ－ＫＡＮから、プライマー４７０２４：５’－ＡＣＡＣＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＣＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＡＣＴＣ－３’および４７０２５：５’－ＡＡＴＴＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＡＡＧＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＴＡＡＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＣＣＡＧＴＡＡ－３’を用いて増幅した。

上流、下流およびＵＰＰ／Ｋａｎのフラグメントは全て、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩで完了するように設計した。全ての３つのフラグメントを、その後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼと一緒にライゲーションした。このライゲーションされたＤＮＡミックスを、ＦＡ－Ｇｌｕ産生株４３０７４－Ｂ２中に形質転換して、形質転換体を、カナマイシン（３０ｕｇ／ｍＬ）およびイソ酪酸、イソ吉草酸および２－メチル酪酸（１００ｕＭ）を補充したＬＢ寒天上で成長する能力について選択した。このストラテジーに由来する１つの株（ｂｋｄＡＡおよびｂｋｄＡＢをＵＰＰ／Ｋａｎで置き換えるために正確な配列を有した）を、４７３９２－Ａ６と命名し、続く実験に用いた。

４７３９２－Ａ６を、１０ｍＭの培養物中３７℃に４日間、０、１００ｕＭ、１ｍＭ、５ｍＭまたは２０ｍＭの２－メチル酪酸、イソ吉草酸、イソ酪酸（全てがｐＨ７．５に中性化される）を補充されたＳ７（Ｐｈｏｓ７．５）（１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、２０ｍＭのグルタミン酸ナトリウム（Ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ Ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、２％のグルコースおよび微量金属を含有する最小培地）中で４３０７４－Ｂ２と平行して成長させた。

制限部位を用いるＢＫＤアップ－Ｕ／Ｋ－ダウン配列：

（実施例１０）
以下の遺伝子を、各々の遺伝子のコード配列を、ｕｐｐ／ｋａｎカセットで置き換えることによって欠失させた。ＦＡ－Ｇｌｕ収率に対する効果を表＃に示す：Ｍａｆ、Ａｂｈ、ＲｏｃＧ、ｄｅｇＵ、ＲａｐＣ、ｅｐｓ、ｙｎｇＦ、ｙｈａＲ、ｍｍｇＢ．ｓｐｘＡ。

以下の遺伝子の各々の追加のコピーを、構成用プロモーター（例えば、ＰｇｒｏＥＬ）の制御下で、または通常は、ｓｒｆオペロン（この遺伝子は、サーファクチンの産生に必要である）における遺伝子の発現を正常に制御するＰｓｒｆプロモーターの制御下でＢａｃｉｌｌｕｓ中に導入した。ＦＡ－Ｇｌｕ収率に対する効果は、表Ｂに示す：

配列表
２，３－ジアミノプロピオン酸の合成のためのタンパク質

メチルトランスフェラーゼ

シペマイシンメチルトランスフェラーゼ

直鎖脂肪酸合成の開始のためのタンパク質
直鎖脂肪酸合成の開始のためのｆａｄＨファミリーメンバー

直鎖脂肪酸合成の開始のためのｆａｄＹファミリーのメンバー

ｆａｂＨＡプロモーター

短い直鎖スターターを用いる脂肪酸合成を開始することを選好するタンパク質

デサチュラーゼ酵素（不飽和化酵素）

調節性因子

ペプチドシンテターゼモジュール
ｓｒｆＡＡモジュール１
（縮合ドメイン、アデニル化ドメイン、チオール化ドメイン、これはグルタミン酸特異的である）

ｄｐｔＡ１モジュール５

ＣｏＡリガーゼ
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＸ３１５５５．１

アシルキャリアタンパク質
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＸ３１５５６．１
推定アシルキャリアタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｏｓｅｏｓｐｏｒｕｓ ＮＲＲＬ １１３７９］

マロニル－ＣｏＡアシル基転移酵素

Claims (18)

1. パーソナルケア製品を作製する方法であって、
   チオエステラーゼドメインを欠き、レダクターゼドメインを欠く、アシルアミノ酸を合成する少なくとも1つの操作されたペプチドシンテターゼを発現するように操作された微生物細胞を培養することによって、アシルアミノ酸を含む組成物を生成するステップと、
   前記組成物を、少なくとも１つの他の成分と組み合わせることによって、アシルグリシネートを含むパーソナルケア製品を作製するステップと
   を包含し、ここで前記アシルアミノ酸内のアミノ酸部分は、グリシンである、方法。
2. 前記操作されたペプチドシンテターゼが、アデニル化（Ａ）ドメイン、チオール化（Ｔ）ドメイン、および縮合（Ｃ）ドメインを含み、ここで前記Ａドメインがグリシンに特異的である、請求項１に記載の方法。
3. 前記微生物細胞が細菌細胞である、請求項１に記載の方法。
4. 前記細菌細胞がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である、請求項３に記載の方法。
5. 前記アシルアミノ酸内の脂肪酸部分が、分岐した炭素鎖を有するβ－ヒドロキシ脂肪酸である、請求項１に記載の方法。
6. 分岐した炭素鎖を有する前記β－ヒドロキシ脂肪酸が、β－ヒドロキシミリスチン酸である、請求項５に記載の方法。
7. 前記アデニル化ドメインが、ダプトマイシンシンテターゼのｄｐｔＡ１モジュール５に由来する、請求項２に記載の方法。
8. 前記アデニル化ドメインがＬｉｎｅａｒ Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎのモジュール２に由来する、請求項２に記載の方法。
9. 前記微生物細胞が、内因性のα－ケト酸デヒドロゲナーゼ活性を欠くように操作される、請求項１に記載の方法。
10. 前記微生物細胞が、前記α－ケト酸デヒドロゲナーゼの少なくとも１つまたは複数の機能的サブユニットを欠くように操作される、請求項９に記載の方法。
11. 前記細胞が、前記α－ケト酸デヒドロゲナーゼのそれぞれＥ１およびＥ１βサブユニットをコードする、ｂｋｄＡＡおよびｂｋｄＡＢ遺伝子を欠失するように操作される、請求項９に記載の方法。
12. 前記パーソナルケア製品がシャンプーである、請求項１に記載の方法。
13. 前記パーソナルケア製品がボディソープである、請求項１に記載の方法。
14. 前記アシルグリシネートが、分岐した炭素鎖を有するβ－ヒドロキシ脂肪酸に共有結合した単一のグリシンを含む、請求項１に記載の方法。
15. 分岐した炭素鎖を有する前記β－ヒドロキシ脂肪酸がβ－ヒドロキシミリスチン酸である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記組成物は、前記操作された微生物細胞によって生成されたアシルアミノ酸種の混合物を含み、前記アシルアミノ酸種は、直鎖のアシル部分および／または分岐したアシル部分を含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記分岐したアシル部分は、イソ分岐アシル部分またはアンテイソ分岐アシル部分であるか、またはそれらを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記アシルアミノ酸または前記アシルアミノ酸種の各々は、前記アシル部分においてヒドロキシ基を含む、請求項１または１６に記載の方法。

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