CN112513259A - 肽大环化酶 - Google Patents
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Abstract
一种具有由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其突变序列的肽环化酶，或一种具有由编码由SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列或其突变序列的碱基序列所编码的氨基酸序列的肽环化酶；编码所述肽环化酶的DNA；一种用于产生所述肽环化酶的方法；以及用于使用所述肽环化酶产生环肽的方法。
Description
技术领域
本发明涉及能够产生大环肽的肽环化酶，用于产生所述酶的方法以及用于使用所述酶产生环肽的方法。
背景技术
大环化合物可赋予化合物空间构象的固定、对生物降解酶的抗性等，并且为特别是在从天然产物衍生的生理活性物质和药物中通常存在的结构特征。然而，用于通过有效地连接以1:1的比率存在于分子中且彼此远离定位的官能团来使肽环化的常规有机合成方法非常有限(参见非专利文献1)。寻找有效的环化方法为合成有机化学中尚未解决的问题之一。
引文列表
非专利文献
非专利文献1：C. J. White, A. K. Yudin, Nature Chem. 2011, 3, 509-524
发明概述
本发明要解决的问题
本发明要解决的问题为寻找一种用于通过有效地连接以1:1的比率存在于分子中且彼此远离定位的官能团来使肽环化的方法。
解决问题的手段
本发明人为解决上述问题广泛地进行了研究，并发现衍生自放线菌(Actinomycetes)的肽环化酶能够有效地产生期望的大环肽，从而导致完成本发明。
也就是说，本发明提供以下(1)-(7)。
(1) 一种肽环化酶，其包含：
(a) 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，
(b) 与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更多同一性的氨基酸序列，或
(c) 其中缺失、取代、插入或添加1至数十个氨基酸残基的如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
(2) 一种肽环化酶，其包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA含有：
(a) 如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或
(b) 在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
(3) 一种DNA，其包含：
(a) 编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，
(b) 编码与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更多同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，
(c) 编码其中缺失、取代、插入或添加1至数十个氨基酸残基的如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或
(d) 在严格条件下同与编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
(4) 一种DNA，其包含：
(a) 如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或
(b) 在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
(5) 一种包含(3)或(4)中所述的DNA的载体。
(6) 一种用于产生肽环化酶的方法，其包括培养其中已经引入了(3)或(4)中所述的DNA或(5)中所述的载体的细胞，并然后从培养物中获得肽环化酶。
(7) 一种用于产生环肽的方法，其包括将(1)或(2)中所述的肽环化酶应用于底物肽。
发明效果
根据本发明，提供一种能够有效地产生环肽(特别是大环肽)的酶、用于产生所述酶的方法以及用于使用所述酶产生环肽的方法。本发明的肽环化酶具有广泛的底物特异性，使得有可能获得具有各种组分和长度的环化肽，其难以通过常规有机合成方法获得。根据本发明，可产生各种生理活性物质和药物。
附图简述
[图1] 图1显示本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus) NBRC 12854)的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M表示分子量标志物，和泳道1表示本发明的肽环化酶。
[图2] 图2a显示反应式，其显示通过本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌NBRC 12854)将底物肽(3)转化成环化肽(1)。图2b显示当将本发明的肽环化酶应用于图2a的底物肽时反应溶液的HPLC色谱图。反应混合物+1 (std.)共注射表示通过将反应溶液与图2a中用1指示的surugamide B制备物混合获得的样品的色谱图。Surugamide B1 (std.)表示surugamide B制备物的色谱图。反应混合物表示反应溶液的色谱图。没有酶的反应混合物表示没有添加本发明的肽环化酶的反应溶液的色谱图。没有底物的反应混合物表示没有添加底物肽的反应溶液的色谱图。
[图3] 图3显示反应式，其显示底物肽的非酶促环化反应。
[图4] 图4显示当使用另一种底物肽时，由本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌NBRC 12854)诱导的反应的HPLC分析结果。在HPLC色谱图中，+表示添加本发明的肽环化酶的反应溶液的色谱图，和-表示没有添加本发明的肽环化酶的反应溶液的色谱图。×10意指色谱图的加框部分放大10倍。
[图5] 图5显示本发明的肽环化酶(衍生自Goodfellowiella coeruleoviolaceaNBRC 14988)的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M表示分子量标志物，和泳道E2表示本发明的肽环化酶。
[图6] 图6显示本发明的肽环化酶(衍生自诺尔斯链霉菌(Streptomycesnoursei) NBRC 15452)的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M表示分子量标志物，和泳道E2表示本发明的肽环化酶。
[图7] 图7显示当使用图2中所示的底物肽3 (SB-SNAC)作为底物时，使用衍生自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶和衍生自诺尔斯链霉菌NBRC15452的肽环化酶获得的环化产物的HPLC分析结果。仅有SB-SNAC表示没有添加酶的系统，+14988表示添加衍生自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶的系统，和+15452表示添加衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶的系统。
[图8] 图8显示当使用其中图2中所示的底物肽3 的C-末端的D-Leu用D-Ala取代的肽(SB(L8A)-SNAC)作为底物时，使用衍生自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988的肽环化酶和衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶获得的环化产物的HPLC分析结果。仅有SB(L8A)-SNAC表示没有添加酶的系统，+14988表示添加衍生自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶的系统，和+15452表示添加衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶的系统。
[图9] 图9显示当使用其中图2中所示的底物肽3 的C-末端的D-Leu用D-Phe取代的肽(SB(L8F)-SNAC)作为底物时，使用衍生自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC14988的肽环化酶和衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶获得的环化产物的HPLC分析结果。仅有SB(L8F)-SNAC表示没有添加酶的系统，+14988表示添加衍生自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶的系统，和+15452表示添加衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶的系统。
实施方案的描述
一方面，本发明提供一种肽环化酶，其包含：
(a) 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，
(b) 与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更多同一性的氨基酸序列，或
(c) 通过在如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加1至数十个氨基酸残基形成的氨基酸序列。
在本说明书中，肽环化酶为具有通过使存在于形成肽的一部分(例如一个氨基酸残基)处的氨基与存在于另一部分(例如另一氨基酸残基)处的羧基结合以产生肽键而使该肽环化的作用的酶。本发明的肽环化酶可以头尾相接的方式使肽环化，使得可产生大的环肽。
在本说明书中，氨基酸通常为天然氨基酸和L-异构体，并且可包括非天然氨基酸，比如β-丙氨酸、D-异构体氨基酸和通过经方法比如烷基化、酯化和卤化修饰氨基酸获得的修饰的氨基酸。
除非另外说明，否则本说明书中使用的术语具有在生物学、生物化学、化学、药学、医学等领域中通常理解的含义。
本发明的肽环化酶可含有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
本发明的肽环化酶可含有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的变体序列。例如，本发明的肽环化酶可含有与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更高，例如40%或更高，优选地50%或更高，例如60%或更高，更优选地70%或更高，例如80%或更高或者85%或更高，仍然更优选90%或更高，例如92%或更高、94%或更高、96%或更高或者98%或更高的同一性的氨基酸序列。氨基酸序列的同一性可通过已知的手段比如FASTA检索、BLAST检索等进行检查。
当本发明的肽环化酶含有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的变体序列时，优选的是在变体序列中，对应于SEQ ID NO: 1的第63-第66个氨基酸残基的部分的氨基酸序列为Ser-X1-X2-Lys，和/或对应于SEQ ID NO: 1的第153-第158个氨基酸残基的部分的氨基酸序列为Ser-Tyr-Ser-Asn-X3-Gly，和/或对应于SEQ ID NO: 1的第304-第307个氨基酸残基的部分的氨基酸序列为Gly-His-X4-Gly，和/或对应于SEQ ID NO: 1的第374-第379个氨基酸残基的部分的氨基酸序列为Gly-X5-X6-X7-Asn-Gly。更优选地，对应于SEQ ID NO: 1的第374-第379个氨基酸残基的部分的氨基酸序列为Gly-X5-X6-X7-Asn-Gly。对应部分不需要为与SEQ ID NO: 1的部分具有相同氨基酸编号的部分，并且可为靠近所述部分的部分。通过将氨基酸序列与SEQ ID NO: 1进行比较可发现对应的部分。例如，对应于SEQ ID NO: 1的第63-第66个氨基酸残基的SEQ ID NO: 5的氨基酸序列中的一部分为Ser-Leu-Thr-Lys，其对应于第59-第62个氨基酸残基。X1-X7各自独立地表示氨基酸残基。
例如，本发明的肽环化酶可含有其中缺失、取代、插入或添加1至数个氨基酸残基的如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。然而，在如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中经受缺失、取代、插入或添加的氨基酸残基的数目不限于1至数个，并且可为1至数十个，优选地1-40个，更优选地1-20个，仍然更优选地1至数个。术语“数十个”意指这种氨基酸残基的数目可为例如20、30、40、50、60、70、80或90个。术语“数个”意指这种氨基酸残基的数目可为例如2、3、4、5、6、7、8或9个。蛋白的氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加为本领域技术人员已知的。本发明的肽环化酶的氨基酸序列中氨基酸残基的缺失、取代、插入或添加可通过使用例如位点特异性突变方法或已知的化学方法来引起。在氨基酸残基的取代中，用同源氨基酸进行的取代为优选的。同源氨基酸为本领域技术人员已知的。
含有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的变体序列的本发明的肽环化酶具有含有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的本发明肽环化酶环化活性的优选地50%或更高，更优选地60%或更高，仍然更优选地70%或更高，甚至更优选地80%或更高，最优选地90%或更高的环化活性。
环化活性可通过已知方法进行测量。例如，每单位酶量和单位时间产生的环肽的量可用作环化活性的指标。
另一方面，本发明提供一种肽环化酶，其包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA含有：
(a) 如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或
(b) 在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
在本说明书中，核苷酸序列包括编码目标氨基酸序列的简并序列。
本发明的肽环化酶可含有由含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的DNA编码的氨基酸序列。
本发明的肽环化酶可含有由含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的变体序列的DNA编码的氨基酸序列。例如，本发明的肽环化酶可含有由DNA编码的氨基酸序列，该DNA含有在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
严格条件为本领域技术人员已知的，并且其实例包括以下条件：
在60-68℃，优选65℃，仍然更优选68℃的温度条件下，于含有0.25 M Na2HPO4 (pH7.2)、7% SDS、1 mM EDTA和1 × Denhardt溶液的缓冲溶液中进行杂交16-24小时，并在60-68℃，优选65℃，仍然更优选68℃的温度条件下，于含有20 mM Na2HPO4 (pH 7.2)、1% SDS和1 mM EDTA的缓冲溶液中洗涤两次，每次15分钟；或
在42℃下，于含有25%甲酰胺或50%甲酰胺(作为更严格条件)、4 × SSC (氯化钠/枸橼酸钠)、50 mM HEPES (pH 7.0)、10 × Denhardt溶液和20 μg/ml改性的鲑鱼精子DNA的杂交溶液中进行预杂交过夜，并然后在37℃下于含有1 × SSC和0.1% SDS的缓冲溶液中，在42℃下于含有0.5 × SSC和0.1% SDS 的缓冲溶液中(作为更严格条件)或在65℃下于含有0.2 × SSC和0.1% SDS的缓冲溶液中(作为仍然更严格条件)进行洗涤。
当然，严格条件不限于以上实例。
含有由含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的变体序列的DNA编码的氨基酸序列的本发明的肽环化酶具有含有由含有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的DNA编码的氨基酸序列的本发明肽环化酶环化活性的优选地50%或更高，更优选地60%或更高，仍然更优选地70%或更高，甚至更优选地80%或更高，最优选地90%或更高的环化活性。
在仍然另一方面，本发明提供一种DNA，其包含：
(a) 编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，
(b) 编码与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更多同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，
(c) 编码其中缺失、取代、插入或添加1至数十个氨基酸残基的如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或
(d) 在严格条件下同与编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
氨基酸序列的同一性如上所述。经受缺失、取代、插入或添加的氨基酸残基的数目如上所述。严格条件也如上所述。
在仍然另一方面，本发明提供一种DNA，其包含：
(a) 如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或
(b) 在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
严格条件如上所述。
可通过本领域技术人员已知的方法获得DNA。可通过克隆surE基因或其同源物或直系同源物获得DNA。对用作DNA来源的活生物体没有特别限制，并且优选地为微生物，更优选地为放线菌。例如，可通过本说明书的实施例中描述的方法获得本发明的DNA。放线菌的实例包括(但不限于)链霉菌属(Streptomyces)、放线菌属(Actinomyces)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和Goodfellowiella。
该DNA编码上述本发明的肽环化酶。本发明的肽环化酶可通过基因工程方法使用DNA来产生。例如，本发明的肽环化酶可从通过将本发明的DNA掺入到表达载体中，将载体引入到细胞中并培养细胞而获得的培养物中获得。例如，本发明的肽环化酶可从通过经使用已知方法比如PEG法、电穿孔或粒子枪法将DNA引入到细胞中并培养细胞而获得的培养物中获得。
在仍然另一方面，本发明提供含有上述方面中的DNA的载体。载体优选地为表达载体。各种表达载体为已知的，并且可适当地选择和使用。将本发明的DNA掺入到载体中的方法也为已知的。
在仍然另一方面，本发明提供一种用于产生肽环化酶的方法，其包括培养其中已引入本发明的DNA或载体的细胞，并然后从培养物中获得肽环化酶。用于该方面的方法的细胞没有特别限制，并且可为微生物比如细菌、酵母、丝状细菌或放线菌的细胞、植物细胞或动物细胞。用于该方法的优选细胞的实例包括(但不限于)微生物比如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的细胞。
当使用在细胞内产生本发明的肽环化酶的细胞时，通过已知手段比如超声波、研磨机或匀浆器将细胞破碎以获得液体提取物，从中可通过已知手段比如硫酸铵沉淀或色谱法获得本发明的肽环化酶。当使用在细胞外产生本发明的肽环化酶的细胞时，可通过使培养液经受已知手段比如硫酸铵沉淀或色谱法获得本发明的肽环化酶。
在仍然另一方面，本发明提供用于产生环肽的方法，其包括将本发明的肽环化酶应用于底物肽。
本发明的肽环化酶具有广泛的底物特异性，并且可甚至使大的肽环化。因此，对要用于本发明方法的底物肽的组成和长度没有特别限制。底物肽可为其中已切割任何肽键的目标环肽。底物肽可具有数个或更多个氨基酸，例如7个或更多个氨基酸、9个或更多个氨基酸或者11个或更多个氨基酸的长度。
在其中通过使用本发明的肽环化酶获得环肽的情况下，当底物肽的C-末端和/或N-末端为庞大的氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基时，环化反应被加速。因此，使用本发明的肽环化酶使得能够在庞大的氨基酸残基之间融合，这通过化学合成是困难的。
从提高环化效率的观点出发，优选的是将本发明方法中使用的底物肽的C-末端的羧基衍生化并活化。衍生化的实例包括(但不限于)酯化。酯化的实例包括(但不限于)硫酯化和烷基酯化(例如甲基酯化和乙基酯化)。
通过在适当的条件下温育含有底物肽和本发明的肽环化酶的溶液，可将本发明的肽环化酶应用于底物肽。本领域的技术人员可根据因素比如底物肽的类型和浓度以及所用酶的量来确定适当的条件。适当条件的实例包括(但不限于)在室温至约37℃和pH值为6-9下进行达数小时的反应的那些条件。肽环化酶可在使用中固定于载体。
环肽的产生可通过已知手段确认。例如，可使用高效液相色谱(HPLC)分析反应溶液。可使用质谱检查具有环化的底物肽的分子量的产物。环肽制备物可为商品化产物，或者可通过化学合成获得。
以下将通过实施例以更详细和具体的方式描述本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。
实施例1
在下文中，本发明的肽环化酶称为“SurE”或“SurE蛋白”。
(1) 用于表达重组SurE蛋白的质粒的制备
以微白黄链霉菌NBRC 12854的基因组为模板，通过PCR反应，使用如下所示的引物SurE_Fw/SurE_Rv扩增编码SurE的基因片段。将其用限制酶EcoRI/HindIII处理，并插入到pUC19的多克隆位点(MCS)中。检查插入的序列，并然后将插入的片段重新插入到pET28的MCS的EcoRI/HindIII位点中以制备pET28-surE。
SurE_Fw: CCGGAATTCCATATGGGTGCCGAGGGGGCG (SEQ ID NO: 3)
SurE_Rv: CCCAAGCTTTCAGAGCCGGTGCATGGC (SEQ ID NO: 4)
(2) 重组SurE蛋白的制备
将pET28-surE引入到大肠杆菌(E. coli) BL21中以制备用于表达重组SurE的大肠杆菌。将大肠杆菌的单个菌落接种在含有25 μg/ml卡那霉素(Km)的2xYT培养基中，并在37℃下培养过夜。将其以1.0% (v/v)接种在含有25 μg/ml卡那霉素(Km)的2xYT培养基中，并在37℃下培养直至OD600为约0.5。将其在冰上冷却5分钟，然后加入ITPG至最终浓度为0.1 mM，并在16℃下培养过夜。将培养液以4000 xg离心，并回收细菌细胞。将细菌细胞重悬于缓冲液A (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM, NaCl)中，并再次以4000 xg离心。将细菌细胞再次重悬于缓冲液A中，并超声破碎。将细胞破碎之后的液体以15000 xg离心，并将所得的上清液进行预先用缓冲液B (20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、20 mM咪唑(pH 8.0))平衡的Ni亲和柱色谱。用缓冲液B进一步洗涤树脂，并然后用缓冲液C (20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、500 mM咪唑(pH 8.0))洗脱结合于树脂的重组SurE蛋白。使洗脱的蛋白经受聚丙烯酰胺凝胶电泳。如图1所示，在分子量为47 kDa处观察到单一条带。所得SurE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，和编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO: 2所示。
(3) 通过重组SurE的肽环化反应(i)
使用通过上述程序制备的重组SurE蛋白和底物肽(SNAC主体在图2a中用3指示)制备具有20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM底物肽和9 μg重组SurE的组成的反应溶液。通过使N-乙酰半胱胺与通过固相合成而合成的肽融合来制备底物肽。将反应溶液在30℃下温育2小时，并进行HPLC分析。在此，使用COSMOSIL 5C18-MS-II 4.6 × 250 mm Column(nacalai tesque)作为柱，使用41% MeCN + 0.05% TFA作为流动相，流速为0.8 ml/min。通过吸收具有200 nm波长的UV来监测产物。
图2b显示HPLC分析的结果。重组SurE蛋白和底物肽的反应溶液(图2b中的反应混合物)在约18.4分钟的保留时间处显示来自单一产物的峰。该峰的保留时间与来自Surugamide B制备物(图2中的1)的峰的保留时间相同(图2b中的Surugamide B1 (Std.))。通过将反应溶液与Surugamide B制备物混合而获得的样品在与来自Surugamide B制备物的峰相同的保留时间处显示单峰(图2b中的反应混合物+1 (Std.)共注射)。这些结果表明，本发明的肽环化酶(SurE)使底物肽环化，作为单一产物得到环化的肽1 (Surugamide B)。
在不使用SurE的情况下，将底物肽在存在Et3N (pH 12)的情况下温育2天，并进行HPLC分析。在约16.2分钟的保留时间处观察到峰，该保留时间与图3的化合物4制备物的保留时间相同(数据未显示)。
这些结果表明，通过本发明的肽环化酶获得环化的肽1 (Surugamide B)。
(4) 通过重组SurE的肽环化反应(ii)
将SurE应用于图4所示的底物肽(SNAC主体)，并通过HPLC和质谱(提取离子色谱图)分析反应溶液。未检测到Surugamide F，并且在约13.8分钟的HPLC保留时间处检测到具有对应于Surugamide F的环化产物(环状Surugamide F)的分子量(m/z 1038.8)的分子量的产物。即使当使用与以上使用的肽相比较更短的肽(7个氨基酸残基，SNAC主体)和更长的肽(11个氨基酸残基，SNAC主体)时，也观察到通过本发明的重组SurE获得的环化产物(数据未显示)。这些结果表明，本发明的酶允许广泛范围的底物长度。
实施例2
(1) 使用在C-末端/N-末端具有庞大的氨基酸残基的底物的环化反应
使用其中以图2a的3所示化合物的C-末端的D-Leu用较庞大的D-Phe取代的底物和其中以图2a的3所示化合物的N-末端的IIe用较庞大的L-Trp取代的底物进行实验。将实施例1中获得的重组SurE用作酶。在改变底物浓度的同时进行反应，通过HPLC分析环化产物，并计算KM值和kcat值。通过使用反应速率常数kcat/KM评估催化效率。
当使用上述两种类型的底物时获得的kcat/KM值为当使用图2a中用3所示的化合物作为底物时获得的kcat/KM值的2-5倍。该结果表明，当底物的C-末端和/或N-末端的氨基酸残基为庞大的氨基酸残基和/或具有高疏水性的氨基酸残基时，环化反应被促进。已经表明，使用本发明的SurE使得能够在庞大的氨基酸残基之间发生融合反应，这在化学合成中是困难的。
(2) 使用甲基酯作为底物的重组SurE的环化反应
通过经Fmoc固相合成、使用Mel的甲基酯化和Boc基团的脱保护使肽链伸长，获得甲基酯，其为图2a中用3所示的化合物。确认的是，即使当使用甲基酯作为底物时，也产生了与使用SNAC主体的情况相同的环化产物。由于即使当使用可比SNAC主体更便利和廉价地提供的甲基酯作为底物时本发明的SurE也能够产生环化产物，因此本发明的SurE被认为是经济上有利的酶。
以上实施例中显示的实验结果表明，本发明的肽环化酶为能够环化具有不同组成和长度的底物肽的有用酶。
实施例3
(1) 从除微白黄链霉菌以外的微生物制备重组肽环化酶
以与实施例1中相同的方式，从Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988和诺尔斯链霉菌NBRC 15452获得环化酶。
用于克隆的引物如下：
用于Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的正向引物：ccggaattcgtgcccaacgagcaggatctcggg (SEQ ID NO: 7)和反向引物：cccaagctttcatccggtcacctgccgccgc (SEQ ID NO: 8)；和
用于诺尔斯链霉菌NBRC 15452的正向引物：ccggaattcgtgcacggggactcagcggatcc(SEQ ID NO: 11)和反向引物：cccaagcttttagtgcggccgtgcgccgtgg (SEQ ID NO: 12)。
图5和6显示从上述两种微生物菌株获得的肽环化酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。来自Gooderellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶在49.2 kDa处显示单一条带，而来自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶在49.0 kDa处显示单一条带。
来自Gooderellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示，和该肽环化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6所示。来自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示，和该肽环化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。来自Goodfellowiella coeruleoviolacea NBRC 14988的肽环化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有38%的同一性，和来自诺尔斯链霉菌NBRC 15452的肽环化酶的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有37%的同一性。
(2) 通过重组肽环化酶的肽环化反应
如上所述获得的两种重组肽环化酶和底物肽(SNAC主体：在图2中用3指示的“SB-SNAC”、其中SB-SNAC的C-末端的D-Leu用D-Ala取代的肽“SB(L8A)-SNAC”和其中SB-SNAC的C-末端的D-Leu用D-Phe取代的肽“SB(L8F)-SNAC”)以与实施例1相同的方式反应，并通过HPLC观察到产物。图7、8和9分别显示使用SB-SNAC作为底物、使用SB(L8A)-SNAC作为底物和使用SB(L8F)-SNAC作为底物的HPLC色谱图。
从图7-9显而易见，两种酶从3种底物产生环化肽。在图7中，在约11.7分钟的保留时间处的峰对应于头尾相接的环化肽。在图8中，在约10.3分钟的保留时间处的峰对应于头尾相接的环化肽。在图9中，在约11.8分钟的保留时间处的峰对应于头尾相接的环化肽。在图8和9中，观察到两种环化肽的峰，并且在较长保留时间处的峰对应于在赖氨酸残基和底物肽的C-末端的氨基酸残基之间非酶促环化的异构肽。
从这些结果证实，甚至从除微白黄链霉菌以外的微生物也获得了肽环化酶。
工业应用性
本发明适用于药物和实验室试剂等的生产。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1显示本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌NBRC 12854)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 2显示编码本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌NBRC 12854)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 3显示用于克隆本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌NBRC12854)的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 4显示用于克隆本发明的肽环化酶(衍生自微白黄链霉菌NBRC12854)的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 5显示本发明的肽环化酶(衍生自Goodfellowiellacoeruleoviolacea NBRC 14988)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 6显示本发明的肽环化酶(衍生自Goodfellowiellacoeruleoviolacea NBRC 14988)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 7显示用于克隆本发明的肽环化酶(衍生自Goodfellowiellacoeruleoviolacea NBRC 14988)的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 8显示用于克隆本发明的肽环化酶(衍生自Goodfellowiellacoeruleoviolacea NBRC 14988)的反向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 9显示本发明的肽环化酶(衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 10显示编码本发明的肽环化酶(衍生自诺尔斯链霉菌NBRC 15452)的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 11显示用于克隆本发明的肽环化酶(衍生自诺尔斯链霉菌NBRC15452)的正向引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO: 12显示用于克隆本发明的肽环化酶(衍生自诺尔斯链霉菌NBRC15452)的反向引物的核苷酸序列。
Claims (7)
1.一种肽环化酶，其包含：
(a) 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，
(b) 与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更多同一性的氨基酸序列，或
(c) 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，其中缺失、取代、插入或添加1至数十个氨基酸残基。
2.一种肽环化酶，其包含由DNA编码的氨基酸序列，所述DNA含有：
(a) 如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或
(b) 在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
3.一种DNA，其包含：
(a) 编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，
(b) 编码与如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有35%或更多同一性的氨基酸序列的核苷酸序列，
(c) 编码其中缺失、取代、插入或添加1至数十个氨基酸残基的如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或
(d) 在严格条件下同与编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
4.一种DNA，其包含：
(a) 如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或
(b) 在严格条件下同与如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
5.一种包含权利要求3或4的DNA的载体。
6.一种用于产生肽环化酶的方法，其包括培养其中已经引入权利要求3或4的DNA或权利要求5的载体的细胞，并然后从培养物中获得肽环化酶。
7.一种用于产生环肽的方法，其包括将权利要求1或2的肽环化酶应用于底物肽。
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