JP2011239686A

JP2011239686A - ペプチド及びペプチド誘導体の製造方法

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Publication number: JP2011239686A
Application number: JP2010111751A
Authority: JP
Inventors: Kuniki Kino; 邦器木野; Daisuke Tateiwa; 大祐立岩
Original assignee: Waseda University
Current assignee: Waseda University
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2011-12-01

Abstract

【課題】ペプチド又はその誘導体どうしをペプチド結合で連結させることができる酵素合成法を開発すること。
【解決手段】本発明は、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体の合成方法を提供する。本発明の合成方法は、（１）アミノ酸と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、これらの誘導体とからなるグループから選択される第１の基質と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、その誘導体とからなるグループから選択される第２の基質と、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼとを含む反応混合液を用意するステップと、（２）前記反応混合液をインキュベーションするステップとを含む。本発明は、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含む触媒組成物を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ペプチド又はその誘導体の合成方法と、該方法に用いられる触媒組成物とに関し、具体的には、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体の合成方法と、該方法に用いられるアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含む触媒組成物とに関する。

酵素反応は反応特異性が高いので、有害な異性体の生成を回避することができる。そこで、医薬品や機能性食品の分野で有用なペプチド及びペプチド誘導体の製造に利用できる酵素の開発が進められている。

酵素を用いるペプチド製造方法としては、プロテアーゼやペプチダーゼの逆反応を利用する方法や、エステラーゼを用いる方法が知られている（非特許文献１及び２）。本発明の発明者らは、最近、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼを用いる画期的な酵素合成法を開示した（特許文献１ないし３）。今堀らは、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを用いて、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を連結して、２個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体を合成する方法を開示した（特許文献４ないし６）。しかし、これらはアミノ酸又はペプチドにアミノ酸を連結させることができるが、ペプチドどうしを連結させるものではない。

Ｍ．Ｂｅｒｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７（１９３７）Ｋ．Ｙｏｋｏｚｅｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１５，２１１（２００５）

国際公開第ＷＯ２００６／１０１０２３号公報国際公開第ＷＯ２００８／０３８６１３号公報国際公開第ＷＯ２００９／０２８２５３号公報特開昭５８−１４６５３９号公報特開昭５９−１０６２９８号公報特開昭６２−２２８２９６号公報

そこで、ペプチド又はその誘導体どうしをペプチド結合で連結させることができる酵素合成法を開発する必要がある。

本発明は、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体の合成方法を提供する。本発明の合成方法は、（１）アミノ酸と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、これらの誘導体とからなるグループから選択される第１の基質と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、その誘導体とからなるグループから選択される第２の基質と、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼとを含む反応混合液を用意するステップと、（２）前記反応混合液をインキュベーションするステップとを含む。

本発明の合成方法において、第１の基質のアミノ酸か、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸かは、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｔＲＮＡと連結するアミノ酸と同じ場合がある。

本発明の合成方法において、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｇ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質と、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。

本発明は触媒組成物を提供する。本発明の触媒組成物は、アミノ酸と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、これらの誘導体とからなるグループから選択される第１の基質と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、その誘導体とからなるグループから選択される第２の基質との間でペプチド結合を形成させて、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体を合成するための触媒組成物であって、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含む。

本発明の触媒組成物において、第１の基質のアミノ酸か、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸かは、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｔＲＮＡと連結するアミノ酸と同じ場合がある。

本発明の触媒組成物において、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｇ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質と、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む場合がある。

本明細書において「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。アミノ酸又はペプチドが、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合には、それぞれ、アミノ酸又はペプチドの誘導体という。

本発明のタンパク質、すなわち、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他のタンパク質か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。また、本発明のタンパク質、すなわち、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、水に不溶性のポリマーその他の固体支持体に不動化される場合がある。

本明細書でアミノ酸を表す場合、アスパラギン、グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、グリシン、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン及びチロシンからなる２０種類のアミノ酸（以下、「リボソームタンパク質合成反応の基質となる２０種類のアミノ酸の単体」という。）と、これらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むが、これらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。

本発明のタンパク質は、そのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明の酵素タンパク質は、活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で、本発明のペプチド又はその誘導体の合成方法に使用される場合がある。本発明の酵素タンパク質を前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系で発現させる場合には、前記タンパク質を発現する宿主生物、例えば本発明の形質転換体が生きた状態で本発明の製造に用いられる場合がある。このとき、本発明のペプチド又はその誘導体の合成は、休止菌体反応系や発酵法によって行うことができる。あるいは、前記タンパク質は、精製された状態で本発明のペプチド又はその誘導体の合成方法に使用されてもよい。

配列番号１のヌクレオチド酸配列と、配列番号２のアミノ酸配列とは、それぞれ、ストレプトミセス・アヴェルミチリス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０株のＶａｌＳ遺伝子のヌクレオチド配列と、カルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質として発現される発現ベクターのインサートのヌクレオチド配列とである。配列番号３及び４に列挙されるヌクレオチド配列は、それぞれストレプトミセス・アヴェルミチリス菌ＭＡ−４６８０株からＶａｌＳ遺伝子をＰＣＲ法で増幅するための順方向及び逆方向プライマーである。配列番号５は、配列番号１のヌクレオチドにエンコードされるタンパク質のアミノ酸配列で、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＣ７３１６３として登録されている。配列番号６は、本発明のタンパク質のカルボキシル末端にヒスチジンタグが連結された融合タンパク質のアミノ酸配列である。

本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。

本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドはアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化される。６×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳからなる溶液で前洗浄される。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応は６×ＳＳＣ及び０．２％ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行われる。その後前記固相は１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄され、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄される。最後に前記固相に残存するプローブの量が前記標識物質の定量により決定される。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。

本発明のタンパク質は、ストレプトミセス・アヴェルミチリス菌ＭＡ−４６８０株のＶａｌＳの遺伝子産物であって、（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、（ｇ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質と、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含む。

本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。

本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質が、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。

本発明のタンパク質の第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性は、アミノ酸と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、これらの誘導体とからなるグループから選択される第１の基質と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、その誘導体とからなるグループから選択される第２の基質と、本発明のタンパク質と、ＡＴＰ、適当な２価イオン及び緩衝液とを含む反応混合液をインキュベーションすることにより生成した反応産物を定量することにより評価される場合がある。第１の基質と第２の基質との両方が少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドの場合もある。したがって、第１及び第２の基質は、ペプチド結合形成に影響がないことを条件として、メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等によって修飾されていてもかまわないし、ガラス、ラテックス、シリコン、プラスチック等の固体や、糖鎖その他のポリマーに共有結合によって連結されていてもかまわない。メトキシ基のような官能基、ビオチンその他の特異的結合パートナーや、蛍光その他の発色団、Ｘ線その他の電磁放射線の透過特性に特徴のある原子団、ＥＳＲ等の生物物理学的な測定用のプローブ原子団等による修飾は、本発明のタンパク質の第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を完全に阻害しないことを条件として、アミノ酸のいずれの原子に結合するものであってもかまわない。

本発明の合成方法で生成されたペプチド又はその誘導体の解析は、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＨＰＬＣ等のような当業者に周知の分析機器の使用により実施される場合がある。

本発明の合成方法においては、本発明の組成物に加えて、ｐＨ調整のための緩衝液成分を含む反応混合液を用いて実施される場合がある。好ましくは前記緩衝液成分としてＴｒｉｓ−ＨＣｌが使用され、ｐＨは８．０〜９．０に調整される場合がある。

本発明の合成方法のステップ（２）において反応混合液が所定の反応時間及び反応温度でインキュベーションされる。本発明の合成方法において、本発明の組成物、基質及び／又はＡＴＰの反応液中における濃度、反応液量、反応時間、反応温度、ｐＨその他の反応条件は、ペプチド又はペプチド誘導体の目標とする製造量及び収率と、製造に要する時間、費用、設備等と、その他の条件との関係で当業者により決定される場合がある。

本発明の製造方法で取得されるペプチド又はペプチド誘導体は、遠心分離、カラムクロマトグラフィー、凍結乾燥等のような当業者に周知の操作の組合せにより回収される場合がある。また、本発明の製造方法で取得されるペプチド又はペプチド誘導体は、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＲＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ等のような当業者に周知の分析技術を使用して、重合度、構造等を評価される場合がある。

本明細書において「組換えベクター」とは、本発明のタンパク質を宿主生物において発現させるために使用される、前記タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターである。

本明細書において「ベクター」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドを組み込み宿主生物へ導入することにより、本発明のタンパク質を該宿主生物において複製及び発現させるために用いられる遺伝因子であり、プラスミド、ウイルス、ファージ、コスミド等を含むがこれらに限定されない。好ましくは、前記ベクターはプラスミドの場合がある。さらに好ましくは、前記ベクターは、ｐＥＴ−２１ａ（＋）プラスミドの場合がある。

本発明の組換えベクターは、制限酵素、ＤＮＡ連結酵素等を使用する当業者に周知の遺伝子工学手法を用いて本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドといずれかのベクターとを連結することにより作製される場合がある。

本明細書において「形質転換体」とは、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入され、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を発現することができるようになった生物である。

本明細書において「宿主生物」とは、形質転換体の作製において、本発明のタンパク質をエンコードするポリヌクレオチドが組み込まれた組換えベクターが導入される生物である。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物は大腸菌の場合がある。

本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターをいずれかの適切な宿主生物に導入することにより作製される。組換えベクターの導入は、電気刺激で細胞膜に空隙を作るエレクトロポレーション法、カルシウムイオン処理と併せて行うヒートショック法等を含む当業者に周知のさまざまな手法により実施される場合がある。

Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物の質量範囲４４０−４５０ｍ／ｚでのイオン交換クロマトグラフィの溶出パターンの波形図。Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物のイオン交換クロマトグラフィの溶出時間６．９６分の質量分析結果を示すスペクトル図。１．２５ｍＭのＡｓｐ−Ｖａｌと、１．２５ｍＭの（Ａｓｐ−Ｖａｌ）_２とを含む標準サンプル（実線）と、Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物（破線）とをＨＰＬＣ分析した結果のクロマトグラム。

以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

ＶａｌＳ遺伝子のクローニング、発現及びタンパク質精製
ストレプトミセス・アヴェルミチリス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＭＡ−４６８０株は独立行政法人製品評価技術基盤機構のＮＢＲＣ（ＮＩＴＥＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ）から購入され、ＮＢＲＣＮｏ．７０７培地を用いて、３０°Ｃ、１５０ｒｐｍで２日間培養された。前記菌体から染色体ＤＮＡが常法により抽出された。順方向及び逆方向プライマー（配列番号３及び４）を用いて、ストレプトミセス・アヴェルミチリス菌のバリルｔＲＮＡシンセターゼ（ＶａｌＳ）のオープン・リーディング・フレーム部分が増幅された。ＶａｌＳのオープン・リーディング・フレーム部分の染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列が配列番号１に列挙される。ＰＣＲ反応の温度条件は、９４°Ｃ、４分間を１回、９４°Ｃ、３０秒間及び６８°Ｃ、３分間を３０回繰り返し、最後に６８°Ｃ、４分間であった。

前記ＰＣＲ反応の増幅産物は、順方向プライマー中のＮｄｅＩと、逆方向プライマー中のＥｃｏＲＩとで切断され、ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターに連結された。こうして、ＶａｌＳのカルボキシル末端にヒスチジンタグペプチドが連結した融合タンパク質を大腸菌で発現するプラスミドコンストラクトｐＥＴＶａｌＳが作成された。配列番号５は、配列番号１のヌクレオチド配列からなるＶａｌＳの染色体ＤＮＡにエンコードされるＶａｌＳのアミノ酸配列である。配列番号６は、配列番号２のヌクレオチド配列からなるＶａｌＳとヒスチジンタグとの融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号５及び６のアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸は異なるが、これは、ＰＣＲ反応の順方向プライマーにＮｄｅＩ切断部位を導入したために、染色体ＤＮＡのヌクレオチド配列と、ベクターに組み込まれたＶａｌＳのヌクレオチド配列とがヌクレオチド１個だけ違うからである。

発現コンストラクトｐＥＴＶａｌＳが形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコロニーは、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加されたＬＢ寒天培地で選択された。単一コロニー由来の大腸菌は５０μｇ／ｍＬのアンピシリンが添加されたＬＢ液体培地３ｍＬ中で、３０°Ｃ、終夜、１２０ｒｐｍの旋回培養により前培養され、その１ｍＬが１００ｍＬのアンピシリン添加ＬＢ液体培地に接種されて、さらに３７°Ｃ、２時間、１２０ｒｐｍの旋回培養が行われた後、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）が最終濃度１０μＭとなるように添加され、２５°Ｃ、終夜旋回培養された。

ＩＰＴＧ誘導された大腸菌からのＶａｌＳタンパク質の精製は常法に従って行われた。簡潔に述べると、前記大腸菌の菌体は結合バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭＮａＣｌ及び２０ｍＭイミダゾール）に懸濁され、懸濁液が調製された。前記懸濁液は酵素処理及び超音波処理が施され、ＨｉｓＴｒａｐＨＰ１ｍＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用された。その後、溶出バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５００ｍＭＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾール）を用いて溶出された。溶出された分画は、脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩処理が施された後、分注された（以下、「精製酵素標品」という。）。精製酵素標品は、−８０°Ｃにて凍結保存された。

ＶａｌＳによるペプチド合成反応の基質特異性の検討
（１）合成反応条件
前記精製酵素標品のペプチド合成反応には、第１及び第２の基質それぞれ２０ｍＭと、３０ｍＭのＭｇＳＯ_４と、３０ｍＭのＡＴＰと、前記精製酵素標品０．１ｍｇ／ｍＬと、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）とからなる反応混合液５００μＬが３０°Ｃでインキュベーションされた。

２）ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ分析条件
前記反応混合液は、孔径０．４５μｍのフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、ミリポア）で濾過された後、５μＬがＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置に適用された。前記ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ装置は、ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス）カラムが装着された、ＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱＤＥＣＡＸＰＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎ社）が用いられた。前記カラムは３５°Ｃに保温された。溶離液として、５０ｍＭギ酸（Ａ液）及びアセトニトリル（Ｂ液）が用いられた。溶出条件は、常に毎分１ｍＬの流速で、最初２分間はＡ液のみ、その後７分間かけてＡ液１００％からＢ液１００％へと移行され、その後６分間はＢ液のみで溶出された。その後０．１分間でＢ液１００％からＡ液１００％へと移行され、５分間Ａ液のみで溶出された。

（３）ＨＰＬＣ分析条件
前記反応反応混合液中の反応産物は、ＦＤＡＡ（Ｎ−（２，４−ジニトロ−５−フルオロフェニル）Ｌ−アラニンアミド）で誘導体化された。すなわち、前記濾過後の反応混合液１００μＬに、０．５％ＦＤＡＡのアセトン溶液５０μＬと、０．５ＭのＮａＨＣＯ_３４０μＬとが混合され、４０°Ｃ、６０分間静置して誘導体化反応が行われた。その後１ＮＨＣｌ４０μＬが添加されて反応が停止され、メタノール７７０μＬで希釈された後、孔径０．２０μｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−１３ＨＰ、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過されてから、１０μＬがＨＰＬＣ装置に適用された。前記ＨＰＬＣ装置は、ＷＨＣ−１８Ａカラムが装着された、ＨＩＴＡＣＨＩＬ−７０００シリーズ（日立）が用いられた。溶離液としては、Ａ液（アセトニトリル１００ｍＬ、メタノール１００ｍＬ、５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．７）；残余：総量２０００ｍＬ）と、Ｂ液（アセトニトリル７００ｍＬ、メタノール１００ｍＬ、５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ２．７）；残余：総量２０００ｍＬ）と、Ｃ液（アセトニトリル６００ｍＬ、テトラヒドロフラン２００ｍＬ、水；残余：総量１０００ｍＬ）が調製された。溶出条件は、最初２４分間は、Ａ液１００％から、Ａ液５５％Ｂ液４５％へと移行され、その後同じ組成で６分間溶出され、２０分間でＡ液５５％Ｂ液４５％からＢ液１００％に移行された。その後５分間でＢ液１００％からＣ液１００％へ移行された。そして、２分間Ｃ液１００％で溶出された後、０．１分間でＣ液１００％からＡ液１００％へと移行され、１８分間Ａ液のみで溶出された。ＨＰＬＣの分析結果は誘導体化された反応産物の蛍光が３４０ｎｍで検出された。

（４）結果
以下の表１に、少なくとも一方の基質はアミノ酸で、もう一方の基質は、アミノ酸か、アミノ酸誘導体か、ジペプチドかの場合についてのＶａｌＳによるペプチド合成反応産物のＬＣ−ＭＳ分析の結果が要約された。ここでＡｌａ−ＮＨ_２及びＰｒｏ−ＮＨ_２は、それぞれアラニン及びプロリンのカルボキシル基がアミノ基の置換された誘導体を表す。

表１において、アミノ酸が「−（ハイフン）」で連結されているジペプチド及びトリペプチドは、左側から右側への記載の順番で連結されていることを示す。アミノ酸が「＋（プラス）」で連結されているジペプチド及びトリペプチドは、連結の順番が特定されていないことを示す。例えば、Ｖａｌ＋Ｐｒｏ−Ｐｒｏは、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏか、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌかであることを示す。また、Ｖａｌ×３はＶａｌのトリペプチドを、Ｖａｌ×４はＶａｌのテトラペプチドを示す。「検出されず」とは、基質が結合した化合物を検出できなかったことをいう。

表１から明らかなとおり、前記精製酵素標品は、アラニン又はバリンを基質として含む反応混合液では、アラニン又はバリンをアミノ末端とするペプチドを合成することができた。ここでバリンだけが基質の場合には、バリン２個からなるジペプチドは形成されたが、３個以上のバリンからなるペプチドは検出されなかった。アラニンと、アラニン又はバリンとのペプチド結合は検出されなかった。アラニン及びチロシンが基質に用いられた場合には、アラニンのカルボキシル基とチロシンのアミノ基との間でペプチド結合が形成された。また、バリン及びチロシンが基質に用いられた場合には、アラニンとチロシンとの間でペプチド結合が形成された。しかし、前記ペプチド結合において、バリンのカルボキシル基とチロシンのアミノ基との間か、チロシンのカルボキシル基とバリンのアミノ基との間かは特定することができなかった。Ａｌａ−ＮＨ_２及びＰｒｏ−ＮＨ_２は、いずれもアラニン又はバリンのカルボキシル基との間でペプチド結合が形成された。アラニン又はバリンと、ジペプチドとの組み合わせでは、該ジペプチドはアラニン又はバリンのカルボキシル基との間でペプチド結合が形成された。ただし、バリンと、バリン２個のジペプチド（Ｖａｌ−Ｖａｌ）とを基質とする反応では、バリン３個のトリペプチドと、バリン４個のテトラペプチドとが形成された。また、アラニン又はバリンと、プロリン２個のジペプチドとが基質に用いられた場合には、アラニン又はバリンと、プロリン２個のジペプチドとの間でペプチド結合が形成された。しかし、前記ペプチド結合において、アラニン又はバリンのカルボキシル基と、プロリン２個のジペプチドのアミノ基との間か、プロリン２個のジペプチドのカルボキシル基と、アラニン又はバリンのアミノ基との間かは特定することができなかった。今回の酵素標品ＶａｌＳは、バリンに対応するｔＲＮＡをバリンでアミノアシル化する活性がある。そこで、ペプチド結合反応においても、カルボキシル末端がバリンとなるペプチドについてはＶａｌＳが基質として認識すると考えられる。

そこで、カルボキシル末端がバリンとなるジペプチドとして、Ｖａｌ−Ｖａｌと、Ａｓｐ−Ｖａｌと、Ａｓｎ−Ｖａｌとが用意された。その実験の結果が図１ないし３と、以下の表２とに示される。

表２において、Ｖａｌ×４はＶａｌのテトラペプチドを示す。（Ａｓｐ−Ｖａｌ）_２は、ジペプチドのアスパラギニルバリン２分子がペプチド結合で連結したテトラペプチドを示す。「検出されず」とは、基質が結合した化合物を検出できなかったことをいう。

図１は、Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物の質量範囲４４０−４５０ｍ／ｚでのイオン交換クロマトグラフィの溶出パターンの波形図である。図２は、Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物のイオン交換クロマトグラフィの溶出時間６．９６分の質量分析結果を示すスペクトル図である。図３は、１．２５ｍＭのＡｓｐ−Ｖａｌと、１．２５ｍＭの（Ａｓｐ−Ｖａｌ）_２とを含む標準サンプル（実線）と、Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物（破線）とをＨＰＬＣ分析した結果のクロマトグラムである。

図１及び２から明らかなとおり、Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物は、イオン交換クロマトグラフィでは溶出時間６．９６分に主要なピークが検出され、その質量は４４７．２であった。これは、（Ａｓｐ−Ｖａｌ）_２にプロトン付加した分子量の理論値４４７．４に非常に近い。また、図３から明らかなとおり、Ａｓｐ−Ｖａｌのみを基質として含む反応混合液の反応産物はほとんどが基質のＡｓｐ−Ｖａｌのままであったが、（Ａｓｐ−Ｖａｌ）_２に対応する溶出時間にピークが認められた。ピークの面積と標準サンプルの量とから、本実施例の実験では、４０ｍＭのＡｓｐ−Ｖａｌを基質として２０時間の反応で生成されたテトラペプチド（Ａｓｐ−Ｖａｌ）_２は３１．２μＭであった。

表２から明らかなとおり、Ａｓｐ−Ｖａｌと同様に、Ｖａｌ−Ｖａｌについても１個のジペプチド分子がペプチド結合で連結したテトラペプチドが生成された。しかし、Ａｓｎ−Ｖａｌについてはテトラペプチドは検出されなかった。

以上の結果から、ＶａｌＳは、バリン及びアラニンと、バリンをカルボキシル末端に含むジペプチドの一部とをカルボキシル基側の基質として認識し、また、一部のアミノ酸誘導体と、ジペプチドとをアミノ基側の基質として認識して、縮重合によるペプチド結合を形成する反応を触媒することが証明された。ＶａｌＳは、バリンに対応するｔＲＮＡをバリンでアミノアシル化する活性がある。そこで、ペプチド結合反応においても、バリンは基質として優占的にＶａｌＳに認識されるので、バリン単体だけでなく、カルボキシル末端がバリンとなるペプチドについてもＶａｌＳは基質として認識してペプチド結合反応を行うと考えられる。

今堀らによって開示されたとおり、さまざまなアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼには、アミノ酸又はアミノ酸誘導体を基質としてペプチド又はペプチド誘導体を合成する活性がある。したがって、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体を合成する本発明の活性も、ＶａｌＳだけでなく、他のさまざまなアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼに共通して認められると考えられる。

Claims

（１）アミノ酸と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、これらの誘導体とからなるグループから選択される第１の基質と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、その誘導体とからなるグループから選択される第２の基質と、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼとを含む反応混合液を用意するステップと、
（２）前記反応混合液をインキュベーションするステップとを含むことを特徴とする、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体の合成方法。
第１の基質のアミノ酸か、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸かは、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｔＲＮＡと連結するアミノ酸と同じであることを特徴とする、請求項１に記載の合成方法。
前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｇ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質と、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の合成方法。
アミノ酸と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、これらの誘導体とからなるグループから選択される第１の基質と、少なくとも２個のアミノ酸からなるペプチドと、その誘導体とからなるグループから選択される第２の基質との間でペプチド結合を形成させて、少なくとも３個のアミノ酸からなるペプチド又はその誘導体を合成するための触媒組成物であって、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含むことを特徴とする、触媒組成物。
第１の基質のアミノ酸か、ペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸かは、前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼがｔＲＮＡと連結するアミノ酸と同じであることを特徴とする、請求項４に記載の触媒組成物。
前記アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼは、
（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにエンコードされるタンパク質と、
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドに１個若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換又は付加されたヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド配列のうち第４番目から最後までのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列にエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質に１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列のうち第２番目から最後までのアミノ酸配列からなるタンパク質と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、第１の基質と第２の基質との間でペプチド結合を形成させる活性を有するタンパク質と、
（ｇ）特異的結合タグペプチドが前記（ａ）ないし（ｆ）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質と、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質とからなるグループから選択される少なくとも１種類のタンパク質を含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載の触媒組成物。