JP5590649B2 - 変異体ピロリジル−tRNA合成酵素及びこれを用いる非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、日本国特許出願:特願2007−243574号(2007年9月20日出願)の優先権主張に基づくものであり、同出願の全記載内容は引用をもって本書に組み込み記載されているものとする。
本発明は、変異体ピロリジル−tRNA合成酵素及びこれを用いる非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法に関する。より詳細には、メタノサルシナ属由来の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素とサプレッサーtRNAとを用いてNε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体を部位特異的に目的タンパク質へ導入する方法に関する。
TyrRS/tRNATyr系を用いてタンパク質の所望の位置にチロシンアナログを導入する方法は、芳香族環を有するチロシンアナログの固い構造から位相決定のための重原子含有アミノ酸の導入方法として有用である。一方、クロスリンカー、三重結合、二重結合などを有する反応性アミノ酸をタンパク質に導入し、当該タンパク質と細胞内で相互作用するターゲットを探すためには、導入される非天然アミノ酸の構造の柔軟性が必要である。このため、チロシンアナログよりもアミノ酸側鎖の構造が柔軟なリジン誘導体の方が優れていると考えられる。一般的に、リジン誘導体をタンパク質に導入するためには、リジル−tRNA合成酵素(LysRS)の基質特異性を改変する方法がある。しかしながら、LysRSはリジンに対する認識が厳密であるため、様々な大きさ、形の官能基を有するリジン誘導体を部位特異的にタンパク質に導入することはこれまで困難であった。本発明は、重原子、セレン、反応性官能基、蛍光基、クロスリンカー等、有用な官能基を有する非天然アミノ酸として好適なリジン誘導体、特にNε−ベンジルオキシカルボニル−リジン(Z−Lys)誘導体を所望のタンパク質に部位特異的に導入する方法を提供することを目的とする。
本発明に係るピロリジル−tRNA合成酵素(PylRS)は、古細菌、特に、メタン生成古細菌から取得した野生型PylRSを基に、種々の方法で変異を導入して作製することができる。野生型PylRSとしては、例えば、メタン生成古細菌であるメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、メタノサルシナ・バルケリ(Methanosarcina barkeri)、及びメタノサルシナ・アセチボランス(Methanosarcina acetivorans)等から取得することできるがこれらに限定されない。これらの古細菌を含む多くの細菌ゲノム塩基配列及びこれに基づくアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBank等の公共データベースから塩基配列やアミノ酸配列の相同性検索を行って、他の相同なPylRSを取得することも可能である。典型的な例として、メタノサルシナ・マゼイ由来のPylRSは、アクセッションNo.AAM31141として、メタノサルシナ・バルケリ由来のPylRSは、アクセッションNo.AAL40867として、及びメタノサルシナ・アセチボランス由来のPylRSは、アクセッションNo.AAM03608として登録されている。特に好ましくは、上記メタノサルシナ・マゼイ由来のPylRSであり、その遺伝子の塩基配列を配列番号1に、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号2に示した。これらメタノサルシナ属のPylRS相同体の配列はよく保存されており、例えば、アミノ酸配列の相同性は、凡そ70%以上である。これらの野生型PylRSの立体構造を解析し、以下に詳細に説明する方法に従って本発明の変異体PylRSを作製する。
本発明は、PylRSの触媒活性ドメインの立体構造の解析及びランダム変異導入法に基づいて作製した変異体PylRSを提供する。PylRS、基質アミノ酸(ピロリジン又はBoc−Lys)及びATPアナログであるAMPPNPとの複合体の結晶化及びそのX線構造解析の具体的な方法は、以下の実施例に記載したとおりである。メタノサルシナ・マゼイ由来のPylRS活性ドメインとピロリジンとAMPPNPとの複合体結晶の単位格子パラメーターは、空間群がP64であり、単位格子がa=b=104.88Å、c=70.43Å、α=β=90及びγ=120°である。ここで、単位格子とは、結晶の最も小さく単純な体積要素を意味し、空間群とは単位格子の対称性を意味する。PylRSの触媒活性ドメインの結晶化及びX線構造解析方法については、すでに本発明者らにより報告されており(上掲の非特許文献3参照)、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明に用いられる非天然アミノ酸としては、例えばNε−ベンジルオキシカルボニル−リジン(Z−Lys)誘導体を用いることができる。Z−Lys誘導体は、非天然のアミノ酸であり、リジン側鎖のアルキル部分がリンカーとして働くのでチロシンアナログに比べ柔軟性の高い反応性骨格をもつアミノ酸として適している。Z基はペプチド合成の保護基として一般的に知られているが、ベンゾイル(Bz)基よりも可変性が高いうえ側鎖に酸素を含むため水溶性が比較的高く水溶液条件下でも扱いやすい。またZ基は接触水素還元という温和な条件で脱保護できることから、クロスリンカー型Z−Lys誘導体によって架橋化したタンパク質同士を安定な状態で分離すること、また反応性官能基を介してタンパク質に結合させた蛍光プローブなどを必要に応じてタンパク質から切り離すことができる。
上記ピロリジル−tRNA合成酵素(PylRS)と組み合わせて使用されるtRNAは、通常20種類のアミノ酸に割り当てられたコドンではないナンセンスコドンに割り当てられ、かつ、上記変異体PylRSにのみ認識され、宿主の通常のアミノアシルtRNA合成酵素には認識されない(orthogonal tRNA)という要件を備え、かつ真正細菌内又は哺乳動物細胞内で発現しなければならない。このようなtRNAとしては、古細菌由来のサプレッサーtRNAが挙げられる。
tRNApyl:5'-GGAAACCUGAUCAUGUAGAUCGAAUGGACUCUAAAUCCGUUCAGCCGGGUUAGAUUCCCGGGGUUUCCGCCA-3'(配列番号3)
本発明はまた、上記のようにして得られる変異体PylRSをコードするDNAを包含する。好ましい実施形態において本発明のDNAは、配列番号1で表される野生型PylRSをコードするDNAにおいて、306位及び384位のチロシンに対応するコドン(TAC)及び(TAT)がそれぞれアラニンに対応するコドン(GCT、GCC、GCA又はGCG)及びフェニルアラニンに対応するコドン(TTT又はTTC)に置換されたDNAが含まれる。さらに306番目のアミノ酸のコドンがグリシンに対応するコドン(GGT、GGC、GGA又はGGG)であり、384番目のアミノ酸のコドンがヒスチジンに対応するコドン(CAT又はCAC)であってもよい。
こうして得られた変異体PylRSは、古細菌又は真核生物のサプレッサーtRNAと組み合わせて、インビトロ又はインビボでのZ−Lys誘導体組み込みタンパク質の製造に用いることができる。すなわち、(a)Z−Lys誘導体に対するアミノアシルtRNA合成酵素と、(b)前記アミノアシルtRNA合成酵素の存在下でZ−Lys誘導体と結合可能なサプレッサーtRNAと、(c)所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、をZ−Lys誘導体の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とするZ−Lys誘導体組み込みタンパク質の製造方法が提供される。ここで、PylRSやサプレッサーtRNAの合成系としては特に制限されることはなく、任意の発現系を用いることができる。例えば、無細胞タンパク質合成系や真正細菌細胞内におけるタンパク質合成系、或いは、真核細胞、好ましくは動物細胞、特に好ましくは哺乳動物細胞である。
L−ピロリジン:N6−[(2R,3R)−3−メチル−3,4−ジヒドロ−2H−ピロール−2−イルカルボニル]−L−リジン(図1A参照)は化学的に合成し、1H−NMRにてその化学構造を確認した。種々のL−リジン誘導体は、Bachem AG(スイス)から購入した。メタノサルシナ・マゼイ由来のtRNAPylは、インビトロ転写により合成し、リソースQカラムクロマトグラフィー(アマシャムバイオサイエンス社)にて精製した。
C末端側プライマー:5'-ACATGGTCCAGAGCTCTTACAGGTTGGTAGAAATCCCGTT-3'(配列番号6)
X線結晶構造解析用データは、上述の非特許文献3に記載の方法により行い、PylRS(c270)/ピロリジン/AMPPNP複合体結晶からの1.8Åデータセット、及びPylRS(c270)/Boc−Lys/AMPPNP複合体結晶からの1.79ÅデータセットをSPring−8のビームラインBL41XUで収集した。
MAD法を用いて位相を決定した。7つのセレン置換部位のうち5つはSnBを用いて局在化し、初期位相はSOLVEにより計算した。初期位相は、続いてRESOLVEによる密度修飾で改善した。部分的なモデルはRESOLVEにより自動的に構築され、残りは主にプログラムOで構築しCNSで精密化した。立体構造モデルの質はPROCHECKで解析した。
野生型PylRSへの突然変異導入はQuikchange変異導入キット(ストラタジーン社)を用いて行った。完全長の変異体PylRSを大腸菌で過剰発現させた後、HisTrapカラム(アマシャムバイオサイエンス社)を用いて精製した。アミノアシル化反応は、37℃にて1時間行った。アミノアシル化反応溶液は、2.83μMのメタノサルシナ・マゼイ由来精製PylRS(又は9μMのPylRS(c270))、10mMのMgCl2、2mMのATP、4mMのDTT、2.11μMのメタノサルシナ・マゼイ由来tRNAPyl転写物、及び100mMのHEPES緩衝液(pH7.2)に溶解した種々のアミノ酸濃縮溶液の適当量である。tRNAのアミノアシル化の有無は、酸−尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した。
メタノサルシナ・マゼイのPylRSは454個のアミノ酸残基からなり、メタノサルシナ・バルケリのPylRSと相同性が高い(74%の同一性)。PylRSは、主に2つのドメインからなる。約250アミノ酸残基のC末端側ドメインは、クラス−IIアミノアシル−tRNA合成酵素と配列の相同性があるが、約140アミノ酸残基のN末端側ドメインは独特である(図1B参照)。アミノアシル−tRNA合成酵素様ドメインに対応するPylRS(c270)は、ピロリジンでtRNAPylをエステル化しうる(図1C参照)。このPylRS(c270)の結晶が成長するためにはATPアナログの添加が必要であり、ATPがPylRS(c270)に固く結合しその構造を安定化すると考えられる。
次に、ピロリジン及びAMPPNPと複合体を形成したPylRS(c270)の結晶構造から、PylRSのアミノ酸結合部位は正規のアミノアシル−tRNA合成酵素のそれよりもはるかに大きいことが分かった。ピロリジン分子は、クラス−IIアミノアシル−tRNA合成酵素に特徴的な7個のアンチパラレルβ−シートの表面に結合していた。嵩高い4−メチル−ピロリン環は、Ala−302、Leu−305、Tyr−306、Leu−309、Cys−348、Val−401、Leu−407、Ile−413及びTrp−417を含む主として疎水性の残基によって形成されるトンネルに収容されている(図3A及び図3C参照)。Asn−346側鎖のアミド部分は、基質アミノ酸の方に向いており2.82Åの距離でピロリジンの側鎖カルボニル基と水素結合を形成し、その位置を固定している。なお、ピロリジンがアキシアル型の立体異性体の場合、Asn−346側鎖のアミド部分とピロリジンの側鎖カルボニル基との間の距離は2.81Åであった(図3E及び図3F参照)。また、Asn346の側鎖のカルボニル基は水を介してピロリジンのα−アミノ基と間接的に水素結合している。高度に保存されたArg−330のグアニジウム基は、ピロリジンのα−カルボニル基と水素結合している。Asn−346及びArg−330によるこれら3つの水素結合以外に他の水素結合は存在せず、PylRSのこのようなアミノ酸認識様式は極めて特徴的である(図3C参照)。上記ピロリジンを収容するトンネルを形成する夫々のアミノ酸残基をアラニンに置換した変異体PylRSのアミノアシル化活性を測定すると、305位のロイシン、306位のチロシン、346位のアスパラギン、401位のバリン及び417位のトリプトファンを夫々アラニンに置換した5つの変異体は著しく活性が低下していた(図3B参照)。
PylRSの構造及び基質結合様式について、大腸菌のLysRSのそれらと比較した。大腸菌LysRSの活性部位においては、高度に保存された残基(Glu−240、Arg−262、Glu−278、Tyr−280、Asn−424、Phe−426及びGlu−428)が、L−Lysの認識に関与している(図3D参照)。これらの残基に変異を導入するとLysRSの基質であるL−Lysに対するKm値が顕著に増大する。これに対し、メタノサルシナ・マゼイPylRS(c270)では、Arg−262が保存されているだけであり、その他の部位はより小さな、非荷電アミノ酸残基で占められている(夫々Ala−302、Asn−346、Cys−348、Ser−399、Val−401及びGly−403)。これらのアミノ酸置換によって、PylRSのアミノ酸結合部位(トンネル)はLysRSにおけるL−Lys結合ポケットよりも8〜9Å深くなっている(図3A参照)。上述したように、ピロリジンとPylRS(c270)との間では3つの水素結合のみが形成されているのに対し、L−LysとLysRSとの間には少なくとも7つの水素結合が形成されている。リジン部分と相互作用する水素結合が少ないことは、PylRSがL−Lysを基質として活性化することを困難にしている。実際、PylRSは1mMの濃度のピロリジンでtRNAPylを活性化するが、0.5Mの濃度でもリジンを含む20種類の正規のアミノ酸を活性化することができない。興味深いことに、PylRSによるピロリジンの認識は、リジンの側鎖に対応する部分が主鎖とメチルピロリンカルボニル部分との間のスペーサーとして働いている。疎水的な深いトンネルとリジン部分に対する弱い認識とがPylRS及びLysRSの基質認識における大きな違いである。
PylRSの基質結合部位の立体構造から、PylRSはピロリジン以外の非天然アミノ酸を活性化しうることが推測された。この仮説に基づいて、PylRSが図4Aに示した6種類のNε−リジン誘導体を活性化しうるかどうかを調べた。その結果を図4Bに示す。各レーンは、PylRSの存在下、左から順に次のような条件でアミノアシル化反応を行ったものである。アミノ酸無添加;0.5MのLys;100mMのAc−Lys;1mMのBoc−Lys;1mMのAloc−Lys;10mMのNic−Lys;7mMのNma−Lys;3.5mMのZ−Lys;1mMピロリジン;及びコントロールtRNAPylである。図4Bに示したように、tert−ブトキシカルボニル−リジン(Boc−Lys)及びアリルオキシカルボニル−リジン(Aloc−Lys)については、1mMの濃度においてピロリジンと同程度の効率で活性化した。さらに、効率は多少低下するが、野生型PylRSは、Nε−アセチル−L−リジン(Ac−Lys)、Nε−ニコチニル−L−リジン(Nic−Lys)、Nε−ベンジルオキシカルボニル−L−リジン(Z−Lys)及び蛍光アミノ酸であるNε−(N−メチル−アントラニロイル)−L−リジン(Nma−Lys)等のNε−修飾リジン誘導体でtRNAPylをエステル化することが分かった。一方、野生型PylRSは、メチル、ジメチル、トリメチル、イソプロピル、ダンシル、o,p−ジニトロフェニル、p−アジドベンゾイル、ビオチニル、9−フルオレニルメトキシカルボニル、及びp−トルエンスルホニル基でNε−連結したリジン誘導体を活性化することはできなかった。従って、PylRSは、ある程度の嵩高さを有するNε−置換体を認識することが分かった。
インビトロにおけるアミノアシル化アッセイの結果、野生型PylRSはBoc−Lys等のリジン誘導体をアミノアシル化したにもかかわらず、大腸菌細胞内ではこれらの誘導体を効率的にタンパク質に組み込むことができなかった。そこで、インビボにおいてタンパク質へBoc−Lysを効率的に組み込むことのできる変異体PylRS(Y384F)を以下のような方法にてスクリーニングした。
大腸菌内においてアンバーサプレッション(アンバー変異抑制)が起こるか否かを確認するために、N末端から25番目のチロシンコドンがアンバーコドン(TAG)に変異したグルタチオンS−トラスフェラーゼ(GST)遺伝子をpET系プラスミドにクローン化した。一方、野生型及び種々の変異体PylRS遺伝子、並びにtRNAPyl遺伝子をpACYX系プラスミドにクローン化した(図6参照)。これら2つの発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)に形質転換し、カナマイシンとアンピシリンを含むLB寒天培地にて一晩静置培養した。生育したコロニーをリジン誘導体の存在又は非存在下でカナマイシンとアンピシリンを含むLB液体培地に接種し、37℃で培養して培地の吸光度が0.6になったとき最終濃度が1mMとなるようにIPTGを添加した。一晩培養して発現を誘導した後、大腸菌を回収して発現されたGSTをSDS−PAGEにて確認した。その結果、夫々4mMのBoc−Lys及びAloc−Lysの存在下に変異体PylRS(Y384F)とtRNAPylとを発現させたときに28kDaのGSTタンパク質の発現が認められた(図7参照)。5mMのZ−Lys存在下において、二重変異体PylRS(Y384F/Y306A)とtRNAPylとを発現させたときにも完全長のGSTタンパク質の産生が認められた(図8参照)。培養液10mlから回収した大腸菌に緩衝液A(リン酸カリウム(pH7.4)、0.15MのNaCl、10mMのβ−メルカプトエタノール)1mlを加えて超音波破砕し、遠心分離して得られた上清にグルタチオンアフィニティーカラム(GSTrap、アマシャムバイオサイエンス社)200μlを加え、4℃にて1時間攪拌後、緩衝液Aで3回洗浄し、20mMグルタチオンを含む緩衝液AでGSTタンパク質を溶出した。このようにして精製したGSTの収率は培養液1Lあたり1〜2mgのタンパク質であった(図9参照)。精製したGSTタンパク質をトリプシン分解後、MALDI−TOF質量分析法にて解析した。トリプシン消化により生ずるペプチドNSXSPIGYWK(Xは夫々Boc−Lys、Aloc−Lys及びZ−Lysを表す)に対応する検出ピークはm/z=1392.74、1376.79及び1426.70Daであり、何れも理論値とよく一致し、野生型トリプシンペプチドNSYSPILGYWK(m/z=1327.72Da)よりも夫々65.02、49.07及び98.98だけ大きかった(図10参照)。図10に示した質量スペクトルからの配列情報は、これらの非天然アミノ酸が部位特異的にGSTタンパク質へ導入されたことを示す。
PylRS(c270)が、tRNAのアミノアシル化活性を維持することは注目に値する(図1C参照)。これは、tRNAPylがN末端ドメインを欠失したPylRSに結合し得ることを示す。tRNAAspと複合体を形成した大腸菌アスパラギン酸−tRNA合成酵素の立体構造に、PylRS(c270)の触媒活性部位を重ね合わせ、tRNAAspを酵母のtRNAPheと置換したドッキングモデルを作成した。これによれば、PylRS(c270)はtRNAのアクセプターステム及びD−アームと接触する。α1及びα2ヘリックスは、1つのtRNAプロトマーのD−アームに隣接し、PylRS(c270)とT−アーム及びアンチコドンアームとの間には相互作用が認められなかった。tRNAPylの構造は、正規のtRNAPheと比べて著しく異なった特徴を示し、例えば図11Aに示したようにたった5塩基からなる小さなD−ループを有する。PylRS(c270)のN末端ヘリックスがT−アームの方向に向けて突き出していることから、メタノサルシナ・マゼイの完全長PylRSは、tRNAPylのT−アームと接触しているかもしれない。さらに、tRNAPylのアンチコドンの配列を異なる配列に変えた変異体を作製したところ、これらの何れもPylRSの酵素活性に影響を与えなかったことから、PylRSは、tRNAのアンチコドンループとは相互作用せず、アンチコドンをほとんど認識する必要がないことが分かった(図11B参照)。
Boc−Lys及びAMPPNPと複合体を形成したPylRS(c270)の立体構造に基づいて、Z−Lys特異的な変異体PylRSを以下の方法によりスクリーニングした。当該複合体の立体構造から、Boc−Lysの側鎖と近接した位置にあるPylRSのアミノ酸残基を選択し、飽和突然変異誘発(saturation mutagenesis)を行った。大きなZ−Lys基を認識するためには、PylRSのアミノ酸認識ポケットの末端部が伸長及び拡張しなければならない。PylRSとBoc−Lys複合体の構造において、Tyr306、Leu309、Cys348及びTrp417がポケットの末端部を構成する。しかし、PylRSのTrp417を他のアミノ酸に置換した場合には酵素活性が失われることから、残りの3つのアミノ酸残基のコドンをNNK(Nは4種類の任意の塩基を表し、KはG又はTを表す。)で置換した変異体酵素のライブラリーを作製した(2.3×106個の独立した形質転換体を含む。)。
Y306A及びY384Fの二重アミノ酸置換を有するPylRS変異体とtRNAPylを大腸菌で発現させるために、実施例1と同じプラスミドpTK2−1を使用した。このプラスミドを用いたN末端から25番目にアンバーコドンを持つGSTへのリジン誘導体の導入は、実施例1と同じ方法によって行った。更に、同じプラスミドを用いたGSTのアンバー部位へのAzZLys[新成化学(大阪)から購入]の特異的導入も、実施例1と同じ方法によって行った。次いで、GSTのアンバー遺伝子を発現させた大腸菌から得られた粗抽出液をSDS−PAGEで分離し、染色した。その結果、1mMのAzZLys存在下(+)の場合にのみ、完全長GSTの発現が検出された(そのバンドの位置は図14に矢印GSTで示した)。なお、GSTの精製も実施例1と同じ方法で行った。
PylRS(Y306A、Y384F)変異体とtRNAPylをHEK c−18細胞で発現するために、上掲非特許文献7に記載されたシステムを用いた。同様に、該非特許文献7に記載されたlacZ遺伝子及びGRB2遺伝子のコード領域にアンバー・コドンを導入した変異遺伝子並びにそれらの発現システムを用いた。
本発明の全開示(請求の範囲を含む)の枠内において、さらにその基本的技術思想に基づいて、実施形態ないし実施例の変更・調整が可能である。また、本発明の請求の範囲の枠内において種々の開示要素の多様な組み合わせないし選択が可能である。
Claims (12)
- 配列番号2に示したピロリジル−tRNA合成酵素のアミノ酸配列においてピロリジン結合部位を構成する306位のチロシンがグリシン又はアラニンへ置換されたアミノ酸配列、又は309位のロイシンがアラニンへ置換されるとともに348位のシステインがバリンへ置換されたアミノ酸配列を含む、変異体ピロリジル−tRNA合成酵素。
- 306位のアミノ酸がアラニンである請求項1に記載の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素において、さらに384位のチロシンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換を含む、変異体ピロリジル−tRNA合成酵素。
- 309位のアミノ酸がアラニンであり、348位のアミノ酸がバリンである請求項1に記載の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素において、さらに384位のチロシンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換を含む、変異体ピロリジル−tRNA合成酵素。
- 野生型のピロリジル−tRNA合成酵素であって、配列番号2に示したアミノ酸配列と70%以上のアミノ酸同一性を有する、配列番号2に示したアミノ酸配列の相同体であるメタノサルシナ属由来のピロリジル−tRNA合成酵素において、前記相同体のアミノ酸配列と配列番号2に示したアミノ酸配列とをアライメントしたとき、配列番号2に示したアミノ酸配列の306位に対応するチロシンがアラニンに置換され、又はアミノ酸配列の306位に対応するチロシンがアラニンに置換されるとともに384位に対応するチロシンがフェニルアラニンに置換されてなる変異体ピロリジル−tRNA合成酵素。
- 請求項1〜4何れか1項に記載の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素をコードする単離されたDNA。
- 宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で請求項1〜4何れか1項に記載の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素を産生し得る発現ベクターであって、該発現ベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合された、請求項5に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする真正細菌。
- 請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする大腸菌。
- 請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする哺乳動物培養細胞。
- (a)請求項1〜3何れか1項に記載の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素と、
(b)前記変異体ピロリジル−tRNA合成酵素の存在下でNε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体と結合可能なサプレッサーtRNAと、
(c)前記サプレッサーtRNAに割り当てられたナンセンスコドン又はフレームシフトコドンを含む、非天然アミノ酸組み込みタンパク質をコードする遺伝子と、
を前記Nε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。 - 前記Nε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体が、Nε−オルト−ヨード−ベンジルオキシカルボニル−リジン、ベンジルオキシカルボニル−アミノエチル−セレノシステイン、Nε−オルト−エチニル−ベンジルオキシカルボニル−リジン、Nε−オルト−アジド−ベンジルオキシカルボニル−リジン、又はNε−オルト−ジアジリル−ベンジルオキシカルボニル−リジンである請求項10に記載の方法。
- (a)細胞抽出液と、
(b)請求項1〜4何れか1項に記載の変異体ピロリジル−tRNA合成酵素と、
(c)前記変異体ピロリジル−tRNA合成酵素によって活性化され得るNε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体からなる非天然アミノ酸と、
(d)前記変異体ピロリジル−tRNA合成酵素の存在下でNε−ベンジルオキシカルボニル−リジン誘導体と結合可能なサプレッサーtRNAと、を含む非天然アミノ酸組み込みタンパク質合成キット。
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