WO2018044143A1 - 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스, 이의 제조방법 및 그 용도 - Google Patents

목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스, 이의 제조방법 및 그 용도 Download PDF

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WO2018044143A1
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target protein
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acetyl
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PCT/KR2017/009706
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박희성
양애린
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한국과학기술원
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a mouse ( Mus musclus ) in which time-specific modification of a target protein is controlled in time and space, a method for preparing the same, and a use thereof. It relates to a transgenic mouse controlled in time and space.
  • Posttranslational modifications not only play an important role in expanding the diversity of protein function, but also have a number of important effects on bioactivity (walsh et al., Angew. Chem. Vol. 44, pp. 3742). -7372. 2005).
  • Amber codon suppression techniques based on orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase / tRNA pairs have been developed and used as a means to extend the function of proteins in the laboratory (Liu et al., Annu. Rev. Biochem). Vol. 79, pp. 413-444. 2010). This method has been widely used to study the various functions at the molecular and cellular levels of proteins, and to date the genetics of bacteria, yeast, mammals, stem cells, neurons, primitive animals, insects and plants It was applied to extend the genetic code.
  • mice possess more than 99% of the same genome as the human genome, and are known to have genes corresponding to most human genes or genes that are functionally related (Rosenthal et al., Nat. Cell. Biol. Vol. 9, pp. 993-999. 2007). Mice have a short life cycle, are easy to grow in the lab and easy to handle. More importantly, the mouse genome can be manipulated much more easily to create custom strains that enable in vivo studies of specific genes, as well as to be used as various human disease models (Schvartzman et al. , Nat. Rev. Cancer.Vol 10. pp. 102-115. 2010).
  • Lysine acetylation is a reversible post-translational modification that regulates the function of a wide range of eukaryotic proteins, thus decisively affecting various cell functions (Choudhary et al., Nat. Rev. Mol. Cell). Biol.Vol. 15, pp. 536-550. 2014). Miscellaneous acetylation of various cellular proteins is associated with many human diseases, including cancer.
  • mice capable of temporally and temporally controlling the position-specific modification of a protein of interest including non-natural amino acid-specific tRNA synthetases; TRNAs that recognize unnatural amino acids; And when a mouse is manufactured by introducing a gene encoding a target protein labeled with a amber codon at a specific position of the target protein, the position-specific modification of the target protein according to the injection time and / or the injection position of the non-natural amino acid. It was confirmed that this controlled mouse can be produced, and the present invention was completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a mouse in which the location-specific modification of the protein of interest is controlled in time and space.
  • Another object of the present invention is to provide a use of a mouse in which the location-specific modification of the protein of interest is controlled in time and space.
  • the present invention is a human full length factor alpha 1 promoter (human elongation factor 1 ⁇ promoter); N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase (N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS) encryption (encoding) gene and CMV-grade early enhancer region (CMV immediately early enhancer) that; RNA polymerase III promoter U6; And it provides a tRNA synthetase expression vector comprising a gene encoding tRNA pyl .
  • N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS
  • CMV-grade early enhancer region CMV immediately early enhancer
  • the invention also provides a human elongation factor 1 ⁇ promoter; Genes encoding target proteins containing amber codons at specific positions and CMV immediately early enhancers; RNA polymerase III promoter U6; And a target protein expression vector labeled with amber codon at a specific position including a gene encoding tRNA pyl .
  • the present invention also provides a mouse having the AcKRS / +, target protein-amber / + genotype by introducing the tRNA synthetase expression vector and the target protein expression vector labeled with amber codon at a specific position.
  • the present invention also comprises the steps of (a) linearizing the tRNA synthase expression vector (linearized) microinjection into the fertilized egg of the mouse and transplanted into the surrogate mother, then delivering to prepare a first mouse having the AcKRS / + genotype; (b) a second mouse having the target protein-amber / + genotype by linearizing the target protein expression vector labeled with the amber codon and injecting the fertilized egg into the surrogate mother Preparing a; And (c) producing a mouse having an AcKRS / +, target protein-amber / + genotype by crossing the first mouse and the second mouse, wherein the mouse has an AcKRS / +, target protein-amber / + genotype. It provides a manufacturing method.
  • Figure 1 (a) is a schematic diagram showing the position of the probe for the vector (Pyl :: HA-AcKRS, PylT :: GFP39TAG-FLAG) and the inserted gene for producing a mouse according to an embodiment of the present invention , (b) shows the non-natural amino acid used in one embodiment of the present invention, N- epsilon-acetyl-lysine (N ⁇ -acetyl-lysine, 1.
  • Figure 2 shows the results of the analysis of in-gel trypsin of the GFPuv wild type protein and the mutant protein including the non-natural amino acids (39AcK, 39TfAcK and 39 BrF) at the 39 th position. Refers to each of the peptides cleaved by (bottom column).
  • Figure 3 (a) is the NIH3T3 cells injected with the vector of the present invention, fluorescence image results according to the presence or absence of AcK, (b) immunoprecipitated the cells with an anti-FLAG antibody, and then anti-GFP and Western blot with anti-FLAG antibody, (c) is MALD-TOF mass spectrometry after trypsin cleavage of GFPuv containing wild type GFPuv and AcK.
  • Figure 4 (a) is a PCR and Southern blot confirmed results of the transgenic mouse, both AcK-GFPamber gene is introduced, (b) RT-PCR results using the total RNA extracted from the kidney and brain of the transgenic mouse (C) is a fluorescence image of MEF cells extracted from AcK-GFPamber mouse (AcKRS / +, GFPamber / +) embryos, and (d) immunoprecipitates the MEF cell lysate with anti-FLAG antibody to prevent anti-GFP and Western blot with anti-AcK antibody.
  • 5 is a result of sequencing by analyzing the sequence of genomic DNA extracted from the tail of AcK-GFPamber transgenic mice, (a) shows AcKRS, and (b) shows GFPamber.
  • Figure 6 is a flow cytometry analysis of the amount of acetylated GFP protein in MEF cells, MEF cells were cultured differently depending on the presence or absence of 10mM AcK, after analyzing the amount of GFPuv, the amount of AcK 4.4% It can be seen that the increase of 25.4%.
  • Figure 7 (a) is a result of Rt-PCR confirming the inhibition of Upf2 expression using siRNA and lentivirus in MEF cells, (b) is in the MEF cells or normal MEF cells suppressed the expression of UpF2 by siRNA or lentivirus Fluorescence images according to the presence of unnatural amino acids (AcK, tfAcK or BrF).
  • Figure 8 (a) is a result of confirming the temporal expression control of acetylated GFPuv protein in AcK-GFPamber mice, it was confirmed that fluorescence appeared only in the mice injected with AcK in skeletal muscle, liver and lung tissue, Western blot results for each tissue in the mouse, (c) confirms the spatial expression control in the mouse, when the injection of skeletal muscle AcK, the result was confirmed that fluorescence appears only in the sphincter muscle.
  • 9 is a fluorescence image obtained by injecting a feed containing AcK into the AcK-GFPamber transgenic mouse, collecting tissue, and confirming that fluorescent images only appear after injecting AcK to the heart, intestine, kidney and stomach. .
  • FIG. 10 is a flow analysis result of measuring the amount of acetylated GFP protein in liver cells.
  • protein modification refers to the binding of a specific compound to the residue portion of the synthesized amino acid after synthesis of the protein (the step of translating the mRNA transcribed in the DNA into the amino acid primary chain).
  • it may be post-translational modification (PTM), but is not limited thereto.
  • all of the protein-modifying functional groups can be used as long as the functional group of the PTM of a commonly known protein, preferably acylation (alkylation), amidation (amidation), but is not (butyrylation), carboxylation, glycosylation, formylation, hydroxylation, aodization, oxidation, phosphorylation, Propionylation, succinylation, sulfate, glycolysis, carbonylation, ubiquitination, sumoylation, yes It may be characterized by being generated by a reaction selected from the group consisting of dilation (neddylation) and perfusion (pupylation), but is not limited thereto.
  • the alkylation may be used for all chemical reactions to prepare an atomic group in which one hydrogen atom is removed from an aliphatic saturated hydrocarbon, preferably mono-methylation or di-methylation. ), Tri-methylation, acetylation and ethylation, profiling, amylation, hexylation, heptylation, octylation, nonylation and desylation And, most preferably, it may be characterized by acetylation, but is not limited thereto.
  • mouse-specific orthogonal tRNA synthetase / non-natural tRNA pairs can adjust the position-specific modification of the protein of interest.
  • a human full length factor alpha 1 promoter (human elongation factor 1 ⁇ promoter); N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase (N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS) (encoding) gene and the CMV early region enhancer class (CMV immediately early enhancer) to encrypt; RNA polymerase III promoter U6; And a tRNA synthetase expression vector comprising a gene encoding a tRNA pyl and a human elongation factor 1 ⁇ promoter.
  • N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS
  • CMV early region enhancer class CMV immediately early enhancer
  • GFPuv protein containing amber codon at position 39 and CMV immediately early enhancer RNA polymerase III promoter U6;
  • GFPuv39TAG expression vector comprising a gene encoding a tRNA pyl (FIG. 1), each of which was introduced into different mice, and then hybridized to introduce a tRNA synthase vector and a GFPuv39TAG expression vector to introduce AcKRS / +, GFPamber.
  • GFPuv39TAG expression vector comprising a gene encoding a tRNA pyl (FIG. 1), each of which was introduced into different mice, and then hybridized to introduce a tRNA synthase vector and a GFPuv39TAG expression vector to introduce AcKRS / +, GFPamber.
  • / + Genotype mice were prepared, and the expression of GFP was regulated according to the location and / or time of injection of non-natural amino acids (AcK, tfAcK or BrF)
  • the present invention provides a human full length factor alpha 1 promoter; N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase (N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS) gene and the CMV early region enhancer class (CMV immediately early enhancer) to encrypt; RNA polymerase III promoter U6; And a tRNA synthetase expression vector comprising a gene encoding tRNA pyl .
  • the invention also provides a human elongation factor 1 ⁇ promoter; Genes encoding target proteins containing amber codons at specific positions and CMV immediately early enhancers; RNA polymerase III promoter U6; And a specific protein expression vector labeled with amber codon at a specific position including a gene encoding tRNA pyl .
  • N- epsilon-acetyl-gene coding for lie chamber -tRNA synthetase may be characterized by being represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
  • the present invention is not limited thereto.
  • the gene encoding the tRNA pyl may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the tRNA synthase vector may be represented by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the target protein can be used without limitation as long as the sequence coding for a functional study is known protein, preferably may be a protein that can attach acetylation to a specific position of the target protein, more preferably Preferably histone protein, tau protein, p53, ⁇ -catenin, NF- ⁇ B, MyoD, Rb, tubulin, STAT3, Elp3, North, TGF- ⁇ , p300, MYST protein, AceCS1, LCAD, EHHADH, MDH, SDH, ASL , CPS1, OTC, PDHA1, aconitase, FOXO1, SAGA complex, Myc, SIRT protein, N-CoR1 / 2, PPAR ⁇ / ⁇ / ⁇ , LXR, mTOR, MEF2, PEPCK-C and G6pase It may be, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a human elongation factor alpha 1 promoter; N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase (N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS) gene and the CMV early region enhancer class (CMV immediately early enhancer) to encrypt; RNA polymerase III promoter U6; And a tRNA synthetase expression vector comprising a gene encoding a tRNA pyl and a human elongation factor 1 ⁇ promoter.
  • N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS
  • CMV early region enhancer class CMV immediately early enhancer
  • RNA polymerase III promoter U6 RNA polymerase III promoter U6
  • a target protein expression vector in which a specific position including a gene encoding a tRNA pyl is labeled with amber codon is introduced to a mouse ( Mus musclus ) having an AcKRS / +, target protein-amber / + genotype.
  • the target protein may be characterized in that the non-natural amino acid is incorporated (incorporated) at a specific position.
  • the non-natural amino acid can be used without limitation as long as the amino acid can be detected by a tRNA that recognizes the non-natural amino acid, preferably N- epsilon-acetyl-lysine (N ⁇ -acetyl-lysine), N-epsilon-trifluoroacetyl-lysine (N ⁇ -trifluoroacetyl-lysine) and 3-bromo-phenylalanine (3-bromo-phenylalanine) may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto. .
  • the target protein may be characterized in that the expression is controlled according to the injection time or position of the non-natural amino acid.
  • the target protein when the injection time of the non-natural amino acid is adjusted to the feed, the target protein may be characterized in that after 1 days to 5 days after the feed, it is not limited thereto.
  • the target protein when the injection position of the non-natural amino acid is adjusted by injecting the non-natural amino acid in a specific position by injection, the target protein may be characterized in that position.
  • the specific location can be used as long as it is a living body part of the mouse that can be distinguished from other regions, preferably in the group consisting of skin, brain, muscle, intestine, liver, kidney, lung, stomach and heart. It may be characterized by being selected, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a kit comprising: (a) a human elongation factor 1 ⁇ promoter; N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase (N ⁇ -acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS) gene and the CMV early region enhancer class (CMV immediately early enhancer) to encrypt; RNA polymerase III promoter U6; And a tRNA synthetase expression vector including a gene encoding a tRNA pyl is linearized and microinjected into a fertilized egg of a mouse, transplanted into a surrogate mother, and then delivered to prepare a first mouse having an AcKRS / + genotype.
  • a human elongation factor 1 ⁇ promoter N- epsilon-acetyl-Lai chamber -tRNA synthetase (N ⁇ -acetyl-lysyl-t
  • the present invention also relates to the use of a mouse in which the location-specific modification of the target protein is controlled in time and space.
  • a specific position of a gene encoding the target protein is replaced with an amber codon and is not normally expressed.
  • the translation is abnormally terminated, but has a tRNA that corresponds to the amber codon and recognizes the non-natural amino acid, when the corresponding non-natural amino acid is injected in different time and space, the position where the non-natural amino acid is injected or Since it has a feature of expressing a target protein only in time, it is the world's first model mouse capable of performing in vivo a functional study of post-translational modification of a target protein.
  • the present invention also relates to a method for regulating the expression of a target protein in a mouse in which the position-specific modification of the target protein is controlled in time and space.
  • the expression of the target protein can be controlled in time and space.
  • expression of the target protein in the visceral organs can be confirmed after 1 to 5 days of feeding (FIG. 9), and at a specific position (for example, When injected into the liver or kidneys, the expression of the target protein can be confirmed only at the corresponding position (FIG. 11).
  • N-epsilon-acetyl- lysyl- tRNA synthetase / tRNA pyl pairs were used for bacterial development (Umehera et al., FEBS Lett. Vol. 586, pp. 729-733. 2012).
  • the CMV promoter of pCDNA3 was replaced with a human elongation factor 1 ⁇ promoter. Then, the HA is tagged AcKRS the N- terminus was cloned using the Kpn I and Not I restriction enzyme was prepared pAcKRS.
  • tRNA Pyl RNA polymerase III promoter U6 was synthesized (bioneer, Korea), and the CMV immediately early region enhancer was added to the pCDNA5 frt / TO vector (Invitrogen, USA).
  • the expression cassette was cloned into pAcKRS plasmid using Bam HI and Asc I restriction enzymes to prepare pAcKRS-tRNA plasmid.
  • GFPuv a kind of protein of interest
  • FLG was labeled at the C-terminus, and the GFPuv gene containing amber codon at the 39th position was exchanged for the AcKRS gene position of the plasmid to prepare pGFPamber-tRNA.
  • UAAs Unnatural Amino Acids
  • HEK293 Human embryonic kidney 293 cells (HEK293) (SIgma-Aldrich) were cultured in a 37 ° C. incubator containing Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 10% bovine serum (FBS) and 5% carbon dioxide. Cells were transfected with 25 ug of pAcKRS-tRNA and pGFPamber-tRNA plasmid in a 100 mm dish with Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA), incubated for 8 hours, followed by 10% FBS and 10 mM UAA (N ⁇ -acetyl-lysine). AcK), N ⁇ -trifluoroacetyl-lysine (tfAcK) or 3-bromo-phenylalanine (BrF) was replaced with DMEM medium containing 40 hours of incubation, and then recovered.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS bovine serum
  • C2
  • NIH3T3 cells (ATCC) were seeded in a 100 mm dish with DMEM medium containing 10% FBS and incubated for 24 hours to fill 50% of the dish. ) Transfected with), incubated in overnight, and then changed to DMEM medium containing 10% FBS and 10 mm UAA, followed by 48 hours of incubation.
  • GFPamber the mouse was prepared, each expressing AcKRS mice expressing AcKRS and tRNA Pyl with a stop codon in the positions 39 beonjjyae GFPuv and tRNA Pyl.
  • pAcKRS-tRNA and pGFPamber-tRNA plasmids were linearized with ApaL I and Pvu II restriction enzymes and then microinjected into fertilized eggs of C57BL / 6J mice (Gordon et al., Science. Vol. 214. pp. 1244). -1246. 1981). It was confirmed by PCR using the primers shown in Table 1 that each gene was correctly inserted in AcK mice and GFPamber mice.
  • AcK mice (AcKRS / +) and GFPamber mice (GFPamber / +) were crossed to prepare double heterozygous mice (AcK-GFPamber mice).
  • the genotype of the mice was confirmed by PCR analysis light Southern blot analysis. Genomic DNA of double transfected mice was isolated by phenol / chloroform extraction to perform Southern blots, digested with Bam HI and Sph I restriction enzymes, and electrophoresed on agarose gels. AcKRS and GFPamber genes inserted into the chromosome were transferred using agarose gels to the positron filled nylon membrane and then detected using radiolabeled cDNA probes.
  • mice were produced at Yonsei University Experimental Animal Research Center. All animal experiments were conducted according to the Korea Food and Drug Administration guidelines. The experimental protocol was approved by the Yonsei University Animal Care and Use Committee (YLARC 2012-0087). All mice were administered at specific pathogen-free organs at the Yonsei University Laboratory Animal Research Center.
  • 305 pb cNDA fragments were amplified from RNA using the primers set forth in Table 2 below.
  • the expression level was measured using actin expression as a control.
  • mice Animals were raised with food and water in a typical animal cage on a 12 hour light / dark cycle.
  • 50 mg of AcK (Sigma) was dissolved in PBS, and then injected into the abdominal cavity daily to 8-week dual transgenic mice (AcKRS / +, GFpamber / +).
  • AcKRS / +, GFpamber / + As a control, two 8-week dual transgenic mice were injected with PBS in the same manner. After 5 days of AcK injection, mice were killed and the desired tissues collected. To induce tissue specific expression, 50 mg of AcK was injected directly into the target tissue, and the sex of the mice was mixed.
  • Double transgenic mice (AcKRS / +, GFPamber / +) were killed and immediately harvested, then emedding the tissues in Tissue-Tek O.C.T (Sakura FInetek) and stored at -80 ° C. After freezing the tissue block, the cut surface was prepared to a thickness of 20 ⁇ m, mounted on a glass slide, and detected by the fluorescence microscope (Axiovert 200FI, Zeiss) to detect the fluorescence of GFPuv, and the image was detected using Axovision software. Captured and analyzed.
  • Upf2-specific siRNA SEQ ID NO: 14: 5′-UUUAGGUUGAUUAACCUCCAUUCCC-3 ′. Temporarily transfected.
  • Mouse Upf2-specific siRNA and control siRNA were purchased from Bioner.
  • ShRNA (SEQ ID NO: 15: 5'-TTTAGGTTGATTAACCTCCATTCCC-3 ') for mouse Upf2 was cloned into the lentiviral vector, pLKO.1-TRC (Addgene) to prepare pLKO.10Upf2.
  • the plasmids were transfected with pGag-pol and PVSV-G in 293TN cells (System BIosciences). After 48 hours of transfection, viral particles were obtained and then infected with MEF cells, and infected MEF cells were selected with 1ug / ml of puromycin for 1 week.
  • Protein extract contains ⁇ 100mg of cell and tissue samples in Lysis buffer (50mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% (v / v) Triton X-100, 0.1% NP-40, protease inhibitor) mixed with a cocktail), pulverized with a bead homogenizer (MP Biomedicals), and then subjected to sonication with Bioruptor UCD-200 (Diagenodoe), and the lysate was centrifuged at 12,000xg for 5 minutes at 4 ° C to obtain a supernatant.
  • Lysis buffer 50mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% (v / v) Triton X-100, 0.1% NP-40, protease inhibitor
  • MP Biomedicals pulverized with a bead homogenizer
  • Bioruptor UCD-200 Bioruptor U
  • the supernatant was mixed with 20 ug of anti-FLAG magnetic beads (sigma), incubated at 4 ° C. for 12 hours, washed twice with cold wash buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCL, pH 7.4), and with an illution buffer (0.1 M). GFP was inoculated with Glycine-Hcl, pH 3.0). The solution was neutralized with 1.0M Tris-HCl (pH 8.0), and then, in a general manner, anti-GFP (Abcam, Cat.No. ab6556 at 1: 1,000 dilution), anti-FLAG (Abcam, Cat.No. Western blot was performed using ab1257 at 1: 1,000 dilution) and anti-acetyl-lysine (BioLegend, Cat. No. 623402, at 1: 200 dilution) antibody.
  • cold wash buffer 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCL, pH 7.4
  • an illution buffer 0.1 M
  • Protein samples were electrophoresed on a 15% SDS-PAGE gel, followed by cutting of the protein bands followed by in-gel trypsin cleavage. That is, the cut band was divided into small pieces, decolorized by treatment with 100 mM ammonium bicarbonate / actonitrile (1: 1, v / v) for 30 minutes, and the gel pieces were mixed with 500ul of neat acetonitrol and then incubated at room temperature. The acetonitrile solution was removed and then treated with 10 ng / ul of trypsin (10 mM ammonium bicarbonate, 10% aceonitrile (v / v)), followed by incubation for 2 hours on ice, followed by incubation in a 37 ° C. incubator overnight.
  • the pGFPamber-tRNA plasmid with the gene encoding the FLAG-tagged GFPuv protein modified at the 39th position of the amber stop codon was constructed (FIG. 1A).
  • mice in which PylT :: HA-AcKRS was linearized with pAcKRS-tRNA prepared in Example 1 and PylT :: GFP39TAG-FLAG infused with pGFPamber-tRNA were prepared.
  • the linearized plasmids were microinjected into fertilized eggs of C57BL / 6J mice, transplanted into surrogate mothers, and then delivered to each transgenic mouse. Thereafter, the two mice were crossed to prepare a double heterozygous transgenic mouse (Ack_Gfpamber).
  • Embryonic fibroblasts (MEF) of the mouse prepared in Example 3 were obtained, and then cultured, and it was confirmed that the fluorescent signal was generated only when cultured in the medium containing AcK (FIG. 4C).
  • FEF Embryonic fibroblasts
  • FIG. 4D Western blot analysis of the MEF cells, it was confirmed that GFPuv was expressed only when AcK was present (FIG. 4D).
  • flow cytometry GFPuv protein was confirmed to increase its expression only when AcK is present (Fig. 6).
  • Mammalian cells are known to have a cell surveillance mechanism known as nonsense mediated-decay (NMD), a system that degrades mRNA with abnormal stop codons.
  • NMD nonsense mediated-decay
  • Upf2 which plays an important role in the NMD system
  • siRNA or lentivirus specific thereto it was confirmed that the expression of AcK-based GFPuv was increased in MEF cells (FIG. 7B).
  • AcKRS-Tau-amber mice were prepared by the method of Examples 1 to 3, and it was confirmed whether Tau protein acetylation was possible by position-specific AcK incorporation. To this end, 10 mg of AcKRS-Tau-amber mice were injected with 10 mg of AcK, followed by Western blot of tissue samples from the brain, heart, liver and soybean plate. As a result, acetylated Tau protein was detected only in the brain. It could be confirmed.
  • a mouse capable of temporally and temporally controlling the position-specific modification of the target protein according to the present invention can control the expression of the target protein to which the position-specific modification is attached according to the injection time and / or the injection position of the non-natural amino acid, It is useful for in vivo function research and new drug development.

Abstract

본 발명은 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스(Mus musclus), 이의 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 비천연 아미노산에 시공간적 주입에 따라 특정 위치의 변형이 부착된 목적 단백질의 발현이 조절되는 형질전환 마우스에 관한 것이다. 본 발명에 따른 목적 단백질의 위치 특이적 변형을 시공간적으로 조절할 수 있는 마우스는 위치 특이적 변형이 부착된 목적 단백질의 발현을 비천연 아미노산의 주입 시기 및/또는 주입 위치에 따라 조절할 수 있기 때문에, 목적 단백질의 생체 내 기능 연구, 신약 개발 등에 유용하다.

Description

목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스, 이의 제조방법 및 그 용도
본 발명은 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스(Mus musclus), 이의 제조방법 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 비천연 아미노산의 시공간적 주입에 따라 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 형질전환 마우스에 관한 것이다.
번역후변형(postranslational modifications, PTMs)은 단백질 기능의 다양성을 확장시키는데 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 생체 활동에서 여러 가지 중요한 영향을 미친다(walsh et al., Angew. Chem. Vol. 44, pp. 3742-7372. 2005). 직교성 아미노아실-tRNA 합성효소(orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase)/tRNA 쌍에 기반한 앰버코돈 억제 기술은 실험실에서 단백질의 기능을 확장하기 위한 수단으로 개발되어 이용되었다(Liu et al., Annu. Rev. Biochem. Vol. 79, pp. 413-444. 2010). 이 방법은 단백질의 분자적 및 세포적 레벨에서의 다양한 기능을 연구하는데 널리 사용되어 왔으며, 현재까지 박테리아, 이스트, 포유동물, 줄기세포, 뉴론, 원시 동물(primitive animal), 곤충 및 식물의 유전적 코드(genetic code)를 확장시키는데 적용되었다.
하지만 많은 시도에도 불구하고, 이 강력한 방법을 사람의 생리 및 질병과 가장 가까운 다기관 동물(multiorgan animal)인 마우스(Mus musclus)에 적용하여 성공한 사례는 없었다. 마우스는 인간 유전체와 99%이상 동일한 유전체를 보유하였으며, 대부분의 인간 유전자와 대응하는 유전자 또는 기능적으로 연관된 유전자를 보유하고 있는 것으로 알려져 있다(Rosenthal et al., Nat. Cell. Biol. Vol. 9, pp. 993-999. 2007). 마우스는 짧은 생명 주기를 가졌으며, 실험실에서 키우기 쉬우며 다루기도 용이하다. 보다 중요하게는 마우스 유전체는 훨씬 쉽게 조작이 가능하여 맞춤 제작한 변이주(mouse strain)을 제작하여 특정 유전자의 생체 내 연구를 가능하게 할 뿐만 아니라, 다양한 인간 질병 모델로서 사용할 수 있다(Schvartzman et al., Nat. Rev. Cancer. Vol 10. pp. 102-115. 2010).
한편, 라이신 아세틸레이션은 가역적인 번역후변형의 하나로서 다양한 범위의 진핵 생물 단백질의 기능을 조절하기 때문에, 다양한 종류의 세포 기능에 결정적인 영향을 미친다(Choudhary et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. Vol. 15, pp. 536-550. 2014). 다양한 세포 단백질의 잘못된 아세틸레이션은 암을 비롯한 여러 종류의 인간 질병과 연관되어 있다.
하지만, 동물 세포 내에서 아세틸레이션을 조절할 수 있는 기작의 어려움 때문에 단백질 아세틸레이션에 관한 기능적 분석은 많이 진행되지 못하고 있는 실정이다. 최근 본원 발명자 뿐만 아니라, 다른 연구 그룹에서도 단백질의 선택적인 화학적 변형(modification) - 아세틸레이션 및 인산화를 포함하는- 기술을 개발한 바 있다(Yang et al., Science. Vol 354. pp. 623-626. 2016).
이러한 배경하에 본 발명자들은 목적 단백질의 위치 특이적 변형을 시공간적으로 조절할 수 있는 마우스를 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 비천연 아미노산특이적 tRNA 합성효소; 비천연 아미노산을 인식하는 tRNA; 및 목적 단백질의 특정 위치가 앰버 코돈으로 표지된 목적 단백질을 암호화(encoding) 하는 유전자를 도입하여 마우스를 제작할 경우, 비천연 아미노산의 주입 시기 및/또는 주입 위치에 따라, 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 조절되는 마우스를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스에서 목적 단백질의 발현을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화(encoding)하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 tRNA 합성효소 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); 특정 위치에 앰버코돈을 함유한 목적 단백질을 암호화 하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화(encoding)하는 유전자를 포함하는 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 tRNA 합성효소 발현벡터 및 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터가 도입되어 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스를 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 tRNA 합성효소 발현벡터를 선형화하여(linearized) 마우스의 수정란에 미세주입한 후 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 AcKRS/+ 유전형을 가지는 제1마우스를 제조하는 단계; (b) 상기 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터를 선형화하여(linearized) 마우스의 수정란에 미세주입한 후 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 제2마우스를 제조하는 단계; 및 (c) 제1마우스 및 제2마우스를 교배시켜 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스를 제조하는 단계를 포함하는 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스의 제조방법을 제공한다.
도 1의 (a)는 본 발명의 일 실시예에 따른 마우스를 제작하기 위한 벡터(Pyl::HA-AcKRS, PylT::GFP39TAG-FLAG) 및 삽입된 유전자 확인을 위한 프로브의 위치를 나타낸 모식도 이고, (b)는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 비천연 아미노산을 나타낸 것으로 N-입실론-아세틸-라이신(Nε-acetyl-lysine, 1. AcK), N-입실론-트라이플루오로아세틸-라이신(Nε-trifluoroacetyl-lysine, 2, tfAcK) 및 3-브로모-페닐알라닌(3-bromo-phenylalanine, 3, BrF)를 의미하며, (c)는 비천연 아미노산 AcK, tfAcK 또는 BrF의 존재하에, 본 발명의 벡터를 주입한 HEK293T 세포를 배양한 형광 이미지이고, (d)는 본 발명의 벡터가 주입된 세포의 분해물을 항-FLAG 항체로 면역 침강하여, 항-FLAG 항체 및 항 GFPuv 항체로 웨스턴 블롯한 결과이며, (e)는 비천연 아미노산이 삽입된 목적 단백질의 트립신 절단 이후 MALD-TOF 질량 분석 결과이다.
도 2는 GFPuv 야생형 단백질 및 39번째 위치에 비천연 아미노산(39AcK, 39TfAcK 및 39 BrF)를 포함하는 돌연변이 단백질의 in-gel trypsin 절단 이후, 질향 분석 결과로서, 스펙트럼(위 패널)이 각 피크는 트립신에 의해 절단된 펩타이드 각각(아래 칼럼)을 의미한다.
도 3의 (a)는 본 발명의 벡터가 주입된 NIH3T3 세포에서, AcK의 존재 유무에 따른 형광이미지 결과이고, (b)는 상기 세포를 항-FLAG 항체로 면역 침강한 다음, 항-GFP 및 항-FLAG 항체로 웨스턴 블롯한 결과이며, (c)는 야생형 GFPuv 및 AcK가 함입된 GFPuv의 트립신 절단 이후, MALD-TOF 질량 분석 결과이다.
도 4의 (a)는 AcK-GFPamber 유전자가 둘 다 도입된 형질전환 마우스의 PCR 및 서던 블롯 확인 결과이고, (b)는 상기 형질전환 마우스의 콩팥 및 뇌에서 추출한 전체 RNA를 이용한 RT-PCR 결과이며, (c)는 AcK-GFPamber 마우스(AcKRS/+, GFPamber/+) 배아에서 추출한 MEF 세포의 형광 이미지이고, (d)는 상기 MEF 세포 분해물을 항-FLAG 항체로 면역 침강하여 항-GFP 및 항-AcK 항체로 웨스턴 블롯한 결과이다.
도 5는 AcK-GFPamber 형질전환 마우스의 꼬리에서 추출한 genomic DNA의 서열을 분석하여 시퀀싱한 결과로서, (a)는 AcKRS, (b)는 GFPamber를 나타낸다.
도 6은 MEF 세포에서 아세틸화된 GFP 단백질의 양을 분석한 유동세포 분석결과로서, MEF 세포를 10mM AcK 존재 유무에 따라 다르게 배양한 다음, GFPuv의 양을 분석한 결과, AcK의 양이 4.4%에서 25.4% 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 7의 (a)는 MEF 세포에서 siRNA 및 렌티바이러스를 이용한 Upf2의 발현 억제를 확인한 Rt-PCR 결과이며, (b)는 siRNA 또는 렌티바이러스로 UpF2의 발현을 억제시킨 MEF 세포 또는 정상 MEF 세포에서 비천연 아미노산(AcK, tfAcK 또는 BrF)의 존재에 따른 형광 이미지이다.
도 8의 (a)는 AcK-GFPamber 마우스에서 아세틸화된 GFPuv 단백질의 시기적 발현 조절을 확인한 결과로서, 골격근, 간 및 폐 조직에서 AcK를 주입한 마우스에서만 형광이 나타나는 것을 확인하였고, (b)는 상기 마우스에서 각 조직별 웨스턴 블롯 결과이며, (c)는 상기 마우스에서 공간적 발현조절을 확인한 것으로 골격근에 AcK를 주사할 경우, 괄근육에서만 형광이 나타나는 것을 확인한 결과이다.
도 9는 AcK-GFPamber 형질전환 마우스에 AcK를 함유하는 사료를 주입한 다음, 조직을 채취하여 확인한 형광 이미지로서, 심장, 장, 콩팥 및 위에서 AcK를 주입한 다음에만 형광이미가 나타나는 것을 확인한 결과이다.
도 10은 간 세포에서 아세틸화된 GFP 단백질의 양을 측정한 유동 분석 결과이다.
도 11은 아세틸화된 GFPuv 단백질의 조직 특이적 발현을 확인한 결과로서, 간(a) 또는 콩판(b) 등 특정 조직에 AcK를 주입할 경우, 주입한 부위에서만 형광 이미지가 발생하는 것을 확인한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 용어 “단백질 변형(modification)”은 단백질의 합성(DNA에서 전사된 mRNA가 번역되어 아미노산 1차 사슬로 합성되는 단계) 이후에 합성된 아미노산의 잔기 부분에 특정 화합물이 결합하는 것을 의미하며, 바람직하게는 번역후변형(post-translational modification, PTM)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 변형 작용기(moiety)는 통상적으로 알려진 단백질의 PTM의 작용기이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 아실레이션(acylation), 알킬레이션(alkylation), 아미데이션(amidation), 뷰티릴레이션(butyrylation), 카복실레이션(carboxylation), 클라이코실레이션(glycosylation), 포밀레이션(formylation), 하이드록실레이션(hydroxylation), 아오디네이션(iodination), 옥시데이션(oxidation), 포스포릴레이션(phosphorylation), 프로피오닐레이션(propionylation), 석시닐레이션(succinylation), 설페이션(sulfation), 글라이케이션(glycation), 카보닐레이션(carbonylation), 유비퀴티네이션(ubiquitination), 수모일레이션(sumoylation), 네딜레이션(neddylation) 및 퍼필레이션(pupylation)으로 구성된 군에서 선택되는 반응으로 생성되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 알킬레이션은 지방족 포화 탄화수소에서 수소 원자 1개가 제거된 원자단을 제조하는 화학반응 이면 모두 이용가능하며, 바람직하게는 모노메틸레이션(mono-methylation), 다이메틸레이션(di-methylation), 트라이-메틸레이션(tri-methylation), 아세틸레이션(acetylation) 및 에틸레이션, 프로필레이션,아밀레이션, 헥실레이션, 헵틸레이션, 옥틸레이션, 노닐레이션 및 데실레이션으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 가장 바람직하게는 아세틸레이션인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 마우스에서 직교형 tRNA 합성효소/비천연 tRNA 쌍을 이용하여 목적 단백질의 위치 특이적 변형을 시공간적으로 조절할 수 있는지 확인하고자 하였다.
즉, 본 발명의 일 실시예에서는 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화하는(encoding) 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 tRNA 합성효소 발현벡터 및 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); 39번째 위치에 앰버코돈을 함유한 GFPuv 단백질을 암호화 하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 GFPuv39TAG 발현벡터를 제작하고(도 1), 각각을 서로 다른 마우스에 도입한 다음, 교배시켜, tRNA 합성효소 벡터 및 GFPuv39TAG 발현 벡터가 도입되어 AcKRS/+, GFPamber/+ 유전형을 가지는 마우스를 제작한 다음, 비천연 아미노산(AcK, tfAcK 또는 BrF)을 주입하는 위치 및/또는 시간에 따라 GFP의 발현이 조절되는 것을 확인할 수 있었다(도 8, 9 및 11).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 tRNA 합성효소 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); 특정 위치에 앰버코돈을 함유한 목적 단백질을 암호화 하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화 하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 tRNApyl을 암호화 하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 상기 tRNA 합성효소 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 기능 연구를 위하여 암호화 하는 서열이 알려져 있는 단백질이면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 목적 단백질의 특정 위치에 아세틸레이션을 부착할 수 있는 단백질일 수 있고, 더욱 바람직하게는 히스톤 단백질, tau 단백질, p53, β-카테닌, NF-κB, MyoD, Rb, tubulin, STAT3, Elp3, North, TGF-β, p300, MYST 단백질, AceCS1, LCAD, EHHADH, MDH, SDH, ASL, CPS1, OTC, PDHA1, aconitase, FOXO1, SAGA complex, Myc, SIRT 단백질, N-CoR1/2, PPARα/β/γ, LXR, mTOR, MEF2, PEPCK-C 및 G6pase로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화 하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 tRNA 합성효소 발현벡터 및 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); 특정 위치에 앰버코돈을 함유한 목적 단백질을 암호화 하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화 하는 유전자를 포함하는 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터가 도입되어, AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스(Mus musclus)에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 특정 위치에 비천연 아미노산이 함입되는(incorporated) 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 비천연 아미노산을 인식하는 tRNA에 의해 감지될 수 있는 아미노산이면 제한 없이 이용가능하나, 바람직하게는 N-입실론-아세틸-라이신(Nε-acetyl-lysine), N-입실론-트라이플루오로아세틸-라이신(Nε-trifluoroacetyl-lysine) 및 3-브로모-페닐알라닌(3-bromo-phenylalanine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 비천연 아미노산의 주입 시기 또는 위치에 따라 발현이 조절되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 비천연 아미노산의 주입 시기를 사료로 조절할 경우, 목적 단백질은 사료 급여 이후, 1일 내지 5일 후에 발현되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 비천연 아미노산의 주입 위치는 주사로 특정 위치에 비천연 아미노산을 주입하여 조절할 경우, 해당 위치에선 목적 단백질이 발현되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 특정 위치는 다른 지역과 구별될 수 있는 마우스의 생체 부위이면 모두 이용가능하나, 바람직하게는 피부, 뇌, 근육, 장, 간, 콩팥, 폐, 위 및 심장으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또다른 관점에서, (a) 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화하는 유전자를 포함하는 tRNA 합성효소 발현벡터를 선형화하여(linearized) 마우스의 수정란에 미세주입한 후, 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 AcKRS/+ 유전형을 가지는 제1마우스를 제조하는 단계; (b) 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); 특정 위치에 앰버코돈을 함유한 목적 단백질을 암호화하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화하는 유전자를 포함하는 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터를 선형화하여(linearized) 마우스의 수정란에 미세주입한 후, 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 제2마우스를 제조하는 단계; 및 (c) 제1마우스 및 제2마우스를 교배시켜 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스를 제조하는 단계를 포함하는 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 개발한 마우스는 목적 단백질 암호화 하는 유전자의 특정 위치가 앰버 코돈으로 치환되어 평상시에는 발현되지 않고, 비정상적으로 번역이 종료되지만, 앰버 코돈에 대응하고, 비천연 아미노산을 인식할 수 있는 tRNA를 보유하고 있기 때문에, 해당하는 비천연 아미노산을 시공간적으로 달리 주입할 경우, 비천연 아미노산이 주입된 위치 또는 시간에만 목적 단백질이 발현되는 특징으로 가지고 있으므로, 목적 단백질의 번역후변형의 기능 연구를 생체 내에서 수행할 수 있는 세계 최초의 모델 마우스이다.
본 발명은 또한, 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절되는 마우스에서 목적 단백질의 발현을 조절하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에서 목적 단백질의 위치 특이적 변형이 시공간적으로 조절하기 위해서는 비천연 아미노산의 주입 시기를 시공간적으로 조절할 경우, 목적 단백질의 발현을 시공간적으로 조절할 수 있다. 가령, 비천연아미노산을 사료로 급여할 경우, 급여 1 내지 5일 후에 내장 기관(심장, 장, 콩팥 및 위)에서 목적 단백질의 발현을 확인할 수 있으며(도 9), 특정 위치(예를 들어, 간 또는 콩팥)에 주입할 경우, 해당 위치에서만 목적 단백질의 발현을 확인할 수 있다(도 11).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실험방법>
본 발명의 실시예에서 사용된 실험 방법은 다음과 같다.
플라스미드 제작
N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소/tRNApyl 쌍은 박테리아 개발된 것을 이용하였다(Umehera et al., FEBS Lett. Vol. 586, pp. 729-733. 2012). AcKRS의 폭넓은 발현을 위하여 pCDNA3의 CMV 프로모터를 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter)로 교체하였다. 그리고, N-말단에 HA가 태깅된 AcKRS를 KpnI 및 NotI 제한효소를 이용하여 클로닝하여 pAcKRS를 제작하였다.
tRNAPyl 발현 카세트를 제조하기 위하여, tRNAPyl RNA 중합효소 III 프로모터 U6를 합성하고(bioneer, Korea), CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early region enhancer)를 pCDNA5 frt/TO 벡터(Invitrogen, USA)에 주입하였으며, 상기 발현 카세트를 BamHI 및 AscI 제한효소를 이용하여 pAcKRS 플라스미드에 클로닝하여 pAcKRS-tRNA 플라스미드를 제작하였다.
목적 단백질의 일종인 GFPuv를 발현시키기 위하여, C-말단에 FLAG이 표지되고, 39번째 위치에 앰버코돈을 함유한 GFPuv 유전자를 상기 플라스미드의 AcKRS 유전자 위치에 교환하여 pGFPamber-tRNA를 제작하였다.
포유세포에서 비천연 아미노산들(UAAs)의 위치 특이적 함입
인간 배아 콩팥 293 세포(HEK293)(SIgma-Aldrich)를 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)과 10% 소혈청(FBS) 및 5% 이산화탄소가 함유된 37℃ 배양기에서 배양하였다. 세포들에 25ug의 pAcKRS-tRNA 및 pGFPamber-tRNA 플라스미드를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)로 100mm dish에서 트랜스펙션하고, 8시간 배양한 다음, 10% FBS와 10mM UAA(Nε-acetyl-lysine(AcK), Nε-trifluoroacetyl-lysine(tfAcK) 또는 3-bromo-phenylalanine(BrF))를 함유한 DMEM 배지로 교체하여 40시간 배양한 다음, 회수하였다.
NIH3T3 세포(ATCC)들을 10% FBS가 함유된 DMEM 배지가 있는 100mm dish에 시딩하여 24시간 배양하여 50% 정도 디시가 채워지면, 40ug의 pAcKRS-tRNA 및 pGFPamber-tRNA플라스미드를 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)로 트랜스펙션한 다음, 오버나잇으로 배양한 뒤, 10% FBS와 10mm UAA를 포함한 DMEM 배지로 갈아준 뒤, 48시간 배양한 다음 회수하였다.
형질전환 마우스 제작
AcKRS와 tRNAPyl을 발현하는 AcKRS 마우스와 39번쨰 위치에 스탑코돈이 위치한 GFPuv 및 tRNAPyl을 발현하는 GFPamber 마우스를 각각 제작하였다.
먼저, pAcKRS-tRNA 및 pGFPamber-tRNA 플라스미드를 ApaLI 및 PvuII 제한효소를 이용하여 선형화시킨 다음, C57BL/6J 마우스의 수정란에 미세주입하였다(Gordon et al., Science. Vol. 214. pp. 1244-1246. 1981). AcK 마우스와 GFPamber 마우스에서 각 유전자가 제대로 삽입되었는지는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR로 확인하였다.
Figure PCTKR2017009706-appb-T000001
그 후, 이중 이형접합 마우스(AcK-GFPamber 마우스)를 제작하기 위하여 AcK마우스(AcKRS/+) 와 GFPamber 마우스(GFPamber/+)를 교배시켜 이중 이형접합 마우스를 제조하였다. 상기 마우스의 유전형은 PCR 분석 빛 서던 블롯 분석으로 확인하였다. 서던 블롯을 수행하기 위하여 이중 형질전한 마우스의 genomic DNA를 페놀/클로로폼 추출 방법으로 분리한다음, BamHI 및 SphI 제한효소로 절단한 후, 아가로즈 젤에서 전기영동하였다. 염색체에 삽입된 AcKRS 및 GFPamber 유전자는 상기 아가로즈 젤을 양전자로 충전된 나일론 멤브레인에 트랜스퍼한 다음, 방사능으로 표지된 cDNA 프로브를 이용하여 검출하였다.
모든 형질전환 마우스는 연세대학교 실험동물연구센터에서 제작하였다. 모든 동물실험은 한국식품의약청 가이드라인에 따라 진행하였다. 실험 프로토콜은 연세대학교 동물 케어 및 사용 위원회(YLARC 2012-0087)에서 승인받았다. 모든 마우스는 연세대학교 실험 동물 연구 센터의 특정 병원균 프리 기관에서 관리하였다.
AcKRS 및 GFPamber 유전자의 RT-PCR
AcKRS와 GFPamber유전자의 서로 다른 마우스 조직에서의 발현을 확인하기 위하여 마우스 콩팥 및 뇌에서 RNA를 추출하였다. 305pb의 cNDA 조각을 하기 표 2에서 개시한 프라이머를 이용하여 RNA로부터 증폭하였다.
Figure PCTKR2017009706-appb-T000002
액틴의 발현을 컨트롤로 하여 발현레벨을 측정하였다.
형질전환 마우스 관리
동물들을 12 시간 빛/암흑 사이클로 일반적인 동물케이지에서 음식과 물을 주면서 키웠다. 아세틸화된 GFP의 발현을 유도하기 위하여 50mg의 AcK(Sigma)를 PBS에 녹인 다음, 8주된 이중 형질전환 마우스(AcKRS/+, GFpamber/+)에 매일 복강에 주입하였다. 대조군으로, 두 마리의 8주된 이중 형질전환 마우스에 PBS를 같은 방식으로 주입하였다. 5일의 AcK 주입 후, 마우스를 죽인 다음, 원하는 조직을 수집하였다. 조직 특이적 발현 유도를 위해서는 50mg의 AcK를 타겟 조직에 직접적으로 주사하였으며, 마우스의 성별은 섞어서 사용하였다.
마우스 조직의 형광 현미경 분석
이중 형질전환 마우스(AcKRS/+, GFPamber/+)를 죽이고 곧바로 조직을 수득한 다음, Tissue-Tek O.C.T(Sakura FInetek)에 조직을 emedding 한 후, -80℃에 보관하였다. 티슈 블락을 냉동 절단한 다음, 20um의 두께로 절단면을 준비하고, glass 슬라이드에 마운트 한 다음, 형광 현미경(Axiovert 200FI, Zeiss)를 이용하여 GFPuv의 형광을 검출하였으며, Axovision 소프트웨워를 이용하여 이미지를 캡쳐하고 분석하였다.
마우스 배아 섬유아세포
13.5dpc에 있는 이중 형질전환 마우스의 배야에서 1차 MEF 세포를 수립하였다(Terzioglu et al., CEll Metab. VOl. 17, pp. 618-626. 2013). 간략하게, 전체 배아를 임신한 마우스에서 회수한 다음 으깬 후, 0.05% 트립신으로 37℃에서 15분간 배양하고, 10% FBS(Sigma)를 함유한 DMEM(Life Technologies)에 투입하였다. 수립한 MEF 세포에서 회수한 DNA로 배아의 유전형을 결정하였으며, GFP 발현을 위해서는 10mM AcK를 배양 배지에 주입하였다. 아세틸화된 GFP 단백질의 발현은 24시간 배양 후, 형광 현미경으로 확인하였다.
siRNA를 이용한 마우스 Upf2 발현 억제
MEF 세포에서 Upf2의 발현억제를 위해 2×106개의 MEF 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 배양한 후, 10nM의 Upf2 특이적 siRNA(서열번호 14: 5’-UUUAGGUUGAUUAACCUCCAUUCCC-3’)를 일시적으로 트렌스펙션하였다. 마우스 Upf2 특이적 siRNA와 컨트롤 siRNA는 바이오니어에서 구입하였다.
lentivirus를 이용한 마우스 Upf2 발현 억제
마우스 Upf2에 대한 shRNA(서열번호 15: 5‘-TTTAGGTTGATTAACCTCCATTCCC-3’)를 렌티바이러스 벡터, pLKO.1-TRC(Addgene)에 클로닝하여 pLKO.10Upf2를 제작하였다. 렌티바이러스 파티클을 제작하기 위하여, 상기 플라스미드를 293TN 세포(System BIosciences)에 pGag-pol 및 PVSV-G와 함께 트랜스펙션 하였다. 48시간의 트랜스펙션 이후, 바이러스 파티클을 수득한 다음 MEF 세포에 감염시켰으며, 감염된 MEF 세포는 1주일동안 1ug/ml의 퓨로마이신(puromycin)으로 선별하였다.
면역침강 및 웨스턴 블롯 분석
단백질 추출물은 ~100mg의 세포와 조직 샘플을 라이시스 버퍼(50mM Tris-HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1%(v/v) Triton X-100, 0.1% NP-40, protease inhibitor cocktail)에 섞어 비드 호모지나이저(MP Biomedicals)로 분쇄한 다음, Bioruptor UCD-200(Diagenodoe)로 소니케이션을 수행하였고, 라이세이트를 12,000xg에서 5분간 4℃에서 원심분리하여 상등액을 수득하였다.
상등액을 20ug의 항-FLAG 마그네틱 비드(sigma)와 섞은 다음, 4℃에서 12시간 배양하고, 차가운 세척 버퍼(50mM Tris-HCl, 150mM NaCL, pH 7.4)로 두 번 세척하고, 일루션 버퍼(0.1M Glycine-Hcl, pH 3.0)으로 GFP를 일루션 하였다. 상기 일루션된 용액을 1.0M Tris-HCl(pH 8.0)으로 중성화 시킨 다음, 일반적은 방법으로 항-GFP(Abcam, Cat. No. ab6556 at 1:1,000 dilution), 항-FLAG(Abcam, Cat. No. ab1257 at 1:1,000 dilution) 및 항-아세틸-라이신(BioLegend, Cat. No. 623402, at 1:200 dilution) 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
Mass analysis
단백질 샘플을 15%SDS-PAGE gel에서 전기영동한 다음, 단백질 밴드를 자른 후, in-gel 트립신 절단을 수행하였다. 즉, 자른 밴드를 작은 조각으로 나눈다음, 100mM ammonium bicarbonate/actonitrile(1:1, v/v)으로 30분간 처리하여 탈색한 다음, 젤 조각들을 500ul의 neat acetonitrol과 섞은 후, 실온에서 배양하였다. acetonitrile 용액을 제거한 다음, 10ng/ul 의 트립신(10mM ammonium bicarbonate, 10% aceonitrile(v/v))로 처리한 다음, 얼음에서 2시간 동안 배양한 후, 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 0.5ul의 트립신 절단된 샘플을 1.5ul의 매트릭스 용액(20mg/ml 2,5-dihydoxybenzoic acid(DHB) dissolved in 0.1% TFA in acetonitrile/water, 1:1)과 섞었다. 상기 혼합액 1ul을 MTP384에 spotting한 후, bruker autoflex III MALDI-TOF mass spectometer를 이용하여 질량 분석 데이터를 수득하였다.
실시예 1. AcK 함입 시스템 구축
EF1α프로모터에 의해 발현이 조절되는 HA-태깅된 AcKRS와 RNA 합성효소 III 프로모터U6 및 인간 CMV imeediately early region enhancer에 의해 발현이 조절되는 tRNAPyl을 함유하는 pAcKRS-tRNA 및 상기 벡터의 AcKRS 위치에 GFP 단백질의 39번째 위치가 앰버 스톱 코돈으로 변형된 FLAG-태깅된 GFPuv 단백질을 코딩하는 유전자가 교체된 pGFPamber-tRNA 플라스미드를 제작하였다(도 1a)
실시예 2. 포유동물 세포에서 AcK 함입 확인
실시예 1에서 제작한 두 플라스미드를 HEK293T 세포에 주입한 다음, AcK를 처리한 결과, AcK가 처리되었을 때만, 형광이 발생하는 것을 확인할 수 있었다(도 1 b, c). 다른 두 종류의 비천연 아미노산(tfAcK, BrF) 역시 테스트 하였는데, 그 결과, 각각의 미천연 아미노산이 있을 경우에만 형광이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 항-FLAG 및 항-GFP 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과, 비천연 아미노산이 존재할 경우에만 밴드가 나타나는 것을 확인할 수 있으며(도 1 d), MALDI-TOF MS 분석 결과, 비천연 아미노산이 앰버 코돈 위치에 정확히 함입되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예1에서 제작한 두 플라스미드를 주입한 NIH3T3 세포의 경우에도, AcK가 존재할 경우에만 GFPuv가 발현되는 것을 확인하였다(도 3).
실시예 3. 형질전환 마우스 제작
실시예 1에서 제작한 pAcKRS-tRNA를 선형화 시킨 PylT::HA-AcKRS를 주입한 형질전환 마우스와 pGFPamber-tRNA를 선형화 시킨 PylT::GFP39TAG-FLAG를 주입한 형질전환 마우스를 각각 제작하였다. 즉, 상기 선형화된 플라스미드를 C57BL/6J마우스의 수정란에 미세주입하여 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 각각의 형질전환 마우스를 제조하였다. 그 뒤, 상기 두 마우스를 교배시켜 이중 이종접합 형질전환 마우스(Ack_Gfpamber)를 제조하였다.
AcK-GFPamber 마우스의 유전형을 PCR 및 서던 블롯 분석(도 4)으로 확인하였고, 안정적으로 염색체에 삽입되었는 지는 PCR 산물의 시퀀싱을 통하여 확인하였다(도 5).
실시예 4. 마우스 배아섬유아세포에서 비천연 아미노산 함입 확인
실시예3에서 제작한 마우스의 배아 섬유섬유아세포(MEF)를 수득한 다음, 배양한 결과, AcK가 있는 배지에서 배양할 경우에만 형광 신호가 발생하는 것을 확인할 수 있었다(도 4c). 상기 MEF 세포의 웨스턴 블롯 분석 결과에서도, AcK가 있을 경우에만 GFPuv가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 4d). 유동세포 분석에서도 GFPuv 단백질은 AcK가 존재할 때에만 그 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6).
포유동물 세포는 nonsense mediated-decay(NMD) 라고 알려진 세포 감시 기작을 가지고 있는 것으로 알려져 있는데 이는 비정상적인 종결코돈을 가지고 잇는 mRNA를 분해하는 시스템이다. 이러한 NMD 시스템에서 중요한 역할을 하는 Upf2를 이에 특이적인 siRNA 또는 렌티 바이러스로 억제한 결과, MEF 세포에서 AcK 기반 GFPuv의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 7b).
실시예 5. 마우스에서 단백질 아세틸레이션의 시공간적 조절 확인
실시예 3에서 제작한 AcKRS-GFPamber mouse에서 위치 특이적 AcK 합입이 가능한지를 확인하였다. 이를 위해서는 목적 단백질의 위치특이적 아세틸레이션을 발생 단계나 조직 종류에 관계없이 공간적으로 또는 시간적으로 조절할 수 있어야 한다.
먼저, AcK 50mg 을 PBS에 녹인 다음 5일간 매일 복강 주입한 실험군과 PBS만 주입한 대조군에서 다양한 조직 샘플을 채취한 다음, GFPuv 발현을 형광현미경으로 분석한 결과, AcK가 주사된 마우스의 골격근, 간 및 폐에서만 형광 신호가 검출되는 것을 확인할 수 있었다(도 8a). 또한 AcK 기반 GFPuv의 발현은 항-AcK 항체를 이용한 웨스턴 블롯에서도 확인할 수 있었다(도 8b). 뿐만 아니라 심장, 장, 콩팥 및 위에서도 GFPuv의 발현을 확인할 수 있었다(도 9). 또한, AcK의 양을 늘릴수록 GFPuv의 양도 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 10).
그 다음, AcK 를 ACKRS-GFPamber 마우스의 타겟 조직에 직접적으로 주사할 경우, 공간적으로 아세틸화된 GFPuv 단백질의 발현을 조절할 수 있는지 테스트하였다. 즉, 골격근에 직접적으로 주사할 경우, 다른 조직에서는 형광이 관찰되지 않고, 골격근에서만 형광이 관찰되는 것을 확인할 수 있었다(도 8c). 비슷하게, 간이나, 콩팥에 특이적으로 AcK를 주사하였을 경우에도, 주사한 조직에서만 형광이 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
실시예 6. 마우스에서 Tau 단백질 아세틸레이션의 시공간적 조절 확인
실시예 1 내지 3의 방법으로 AcKRS-Tau-amber 마우스를 제작하고, 위치 특이적 AcK 함입에 따른 Tau 단백질 아세틸레이션이 가능한 지를 확인하였다. 이를 위해 6주령된 AcKRS-Tau-amber 마우스의 머리에 10mg의 AcK를 주입한 다음, 뇌, 심장, 간 및 콩판에서 조직 샘플을 얻어 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 뇌에서만 아세틸화된 Tau 단백질이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 목적 단백질의 위치 특이적 변형을 시공간적으로 조절할 수 있는 마우스는 위치 특이적 변형이 부착된 목적 단백질의 발현을 비천연 아미노산의 주입 시기 및/또는 주입 위치에 따라 조절할 수 있기 때문에, 목적 단백질의 생체 내 기능 연구, 신약 개발 등에 유용하다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (13)

  1. 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화하는 유전자를 포함하는 tRNA 합성효소 발현벡터.
  2. 인간 전장 인자 알파 1 프로모터(human elongation factor 1 α promoter); 특정 위치에 앰버코돈을 함유한 목적 단백질을 암호화하는 유전자와 CMV 급초기 지역 인핸서(CMV immediately early enhancer); RNA 합성효소 III 프로모터 U6(RNA polymerase III promoter U6); 및 tRNApyl을 암호화하는 유전자를 포함하는 특정 위치가 앰버코돈으로 표지된 목적단백질 발현벡터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 N-입실론-아세틸-라이실-tRNA 합성효소(Nε-acetyl-lysyl-tRNA synthetase, AcKRS)를 암호화 하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 tRNA 합성효소 발현벡터.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 tRNApyl을 암호화 하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 tRNA 합성효소 벡터는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  6. 제1항의 벡터가 및 제2항의 벡터가 도입되어 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스(Mus Musclus).
  7. 제6항에 있어서, 상기 목적단백질은 특정 위치에 비천연 아미노산이 함입되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  8. 제7항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 N-입실론-아세틸-라이신(Nε-acetyl-lysine), N-입실론-트라이플루오로아세틸-라이신(Nε-trifluoroacetyl-lysine) 및 3-브로모-페닐알라닌(3-bromo-phenylalanine)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  9. 제6항에 있어서, 상기 목적 단백질은 비천연 아미노산의 주입 시기 또는 위치에 따라 발현이 조절되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  10. 제9항에 있어서, 상기 비천연 아미노산의 주입 시기는 사료로 조절할 경우, 급여 1일 내지 5일 후에 목적 단백질이 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  11. 제9항에 있어서, 상기 비천연 아미노산의 주입 위치는 주사로 특정 위치에 주입할 경우, 해당 위치에서만 목적 단백질이 발현되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  12. 제11항에 있어서, 상기 특정 위치는 피부, 뇌, 근육, 장, 간, 콩팥, 폐, 위 및 심장(추가 가능 시 추가 요망)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 마우스.
  13. 다음의 단계를 포함하는 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스의 제조방법:
    (a) 제1항의 벡터를 선형화하여(linearized) 마우스의 수정란에 미세주입한 후, 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 AcKRS/+ 유전형을 가지는 제1마우스를 제조하는 단계;
    (b) 제2항의 벡터를 선형화하여(linearized) 마우스의 수정란에 미세주입하여 대리모에 이식한 다음, 분만시켜 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스를 제조하는 단계; 및
    (c) 제1마우스 및 제2마우스를 교배시켜 AcKRS/+, 목적단백질-앰버/+ 유전형을 가지는 마우스를 제조하는 단계.
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