WO2022176917A1 - ミトカイン混合物を調製するための間葉系幹細胞及び脂肪細胞、並びに治療又は予防用医薬 - Google Patents
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Abstract
脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している非ヒト動物又はその一部；Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞；を提供する。また、上記の間葉系幹細胞若しくは脂肪細胞、又はそれらの培養上清を含有する治療又は予防用医薬；上記の非ヒト細胞、間葉系幹細胞、又は脂肪細胞を用いたミトカイン混合物の調製方法；を提供する。
Description
本発明は、ミトカイン混合物を調製するための間葉系幹細胞及び脂肪細胞、並びに治療又は予防用医薬に関する。
ミトコンドリアアンフォールデッドプロテイン反応（ｍｔＵＰＲ）は、ミトコンドリアストレスに対して、ミトコンドリアプロテオスタシスを維持するために引き起こされるストレス応答である。この応答には、シャペロン、プロテアーゼ、ミトカイン等の遺伝子群が関与している。
ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の代表的なものとして、ＧＤＦ１５（ｇｒｏｗｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－ｔｅｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５）及びＦＧＦ２１（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２１）が知られている。この内、ＧＤＦ１５はトランスフォーミンググロースファクターベータスーパーファミリーのメンバーに属し、健康な動物では肝臓、肺、腎臓で優位に発現しているが、様々なタイプのストレスに対しても複数の組織で発現がみられる。例えば、ＧＤＦ１５は、細菌やウイルスの感染症や敗血症に対する疾患耐性に関与していることが示唆されている（非特許文献１参照）。また、ＧＤＦ１５は心臓において誘導されることで、虚血再灌流傷害に対する防御機能を示すことも明らかにされている（非特許文献２参照）。
他方で、ＦＧＦ２１は内分泌系ＦＧＦスーパーファミリーのメンバーに属し、当初はヘパトカインとして同定されたが、近年では白色脂肪組織、褐色脂肪組織、筋肉、膵臓など他の組織でも発現していることが報告されている。ＦＧＦ２１もストレスに対して関与することが確認されており、例えばＦＧＦ２１を糖尿病マウスや老化マウスに投与すると、ニューロン喪失の阻害や抗酸化酵素の産生増強がみられ、ニューロンのミトコンドリアに対する保護効果が高まることが示されている（非特許文献３参照）。また、ＦＧＦ２１の投与は、ガレクチン－３の発現を調節することにより、低酸素誘発性心臓損傷の治療法となり得ることも報告されている（非特許文献４参照）。
このように、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子は、様々な疾患の治療又は予防との関連性が示唆されている。そのため、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の産物を効率的に調製することが期待されている。
Ｌｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１９，１７８，１２３１－１２４４
Ｋｅｍｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，２００６，９８，３５１－３６０
Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ． Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．，２０２０，１２９，１１０４３９
Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０１９，１２０（１２），１９５２９－１９５４０
本発明は上記に鑑みて提案されたものであり、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の産物を効率的に調製することを目的とする。
本発明者らは、上記目的について鋭意研究した結果、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の機能を欠失させることにより、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現が上昇することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は、以下のものを提供する。
＜１＞ 脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している、非ヒト動物又はその一部。
＜２＞ Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している、間葉系幹細胞。
＜３＞ Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している、脂肪細胞。
＜４＞ Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞、及びミトカインを含む前記間葉系幹細胞又は前記脂肪細胞の培養上清からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、治療又は予防用医薬。
＜５＞ 前記治療又は予防用医薬が、敗血症、虚血再灌流傷害、炎症性疾患、慢性腎臓病、肥満症、粥状硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、及びその他の代謝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療又は予防に用いられるものである、＜４＞に記載の治療又は予防用医薬。
＜６＞ 脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している非ヒト動物、及びＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞からなる群から選択される少なくとも１つから複数種のミトカインを回収することを含む、ミトカイン混合物の調製方法。
本発明によれば、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の産物を効率的に調製することができる。
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において、「ミトカイン」とは、英語では「ｍｉｔｏｋｉｎｅ」と表記されるものであり、「マイトカイン」と呼ばれる場合もある。ミトカインは、ミトコンドリアに生じたストレスを細胞外へと伝達する生理活性物質であり、非細胞自律的な作用を示す。
［非ヒト動物又はその一部］
本実施形態に係る非ヒト動物は、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している。後述する実施例で述べるように、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子を欠失させると、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現が上昇する。
本実施形態に係る非ヒト動物は、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している。後述する実施例で述べるように、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子を欠失させると、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現が上昇する。
ＭＩＰＥＰ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）は、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）にプロセシングされた基質タンパク質の二度目のプロセシングを担うＭｔＳＰａｓｅであり、ＭＰＰにより切断されたタンパク質の、Ｎ末よりオクタペプチドを切断する酵素であることが知られている。なお、本発明者らは、以前、網羅的な遺伝子発現解析により、代謝改善・抗老化・寿命延伸作用を有するカロリー制限が、ＭＩＰＥＰの発現を亢進させること、及びミトコンドリアに局在する脱アセチル化酵素であり、複数のミトコンドリア局在酵素の活性化に関わるＳＩＲＴ３がＭＩＰＥＰの基質であることを報告している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１７，５９１，４０６７－４０７３）。
Ｍｉｐｅｐ遺伝子の塩基配列情報及びアミノ酸配列情報は米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋデータベースから入手可能である。一例として、ヒトＭｉｐｅｐの塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１、２に示す。
Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部又は一部の機能が失われている非ヒト動物とは、該動物のＭｉｐｅｐ遺伝子がその本来の機能を発揮しないように破壊されているか、又は組み換えがなされている動物を意味する。Ｍｉｐｅｐ遺伝子は、ゲノム上の一方のアリルが機能しないように破壊又は変異されていてもよく、両方のアリルが破壊又は変異されていてもよい。非ヒト動物には、このような動物の子孫も含まれる。
「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部の機能が失われた」とは、Ｍｉｐｅｐ遺伝子が完全に失われることを意味し、「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の一部の機能が失われた」とは、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の一部が欠如することによりＭｉｐｅｐ遺伝子の機能が野生型と比較して低下している状態にあることを意味する。このような状態であることにより、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現自体が行われないか、発現してもタンパク質の活性が低下又は喪失している。
Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部又は一部の機能が失われた非ヒト動物は、公知の方法で作製することができる。標準的な方法としては、例えば、以下（ａ）～（ｄ）の工程からなる方法が挙げられる。
（ａ）Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製する。
（ｂ）ＥＳ細胞を非ヒト動物の胚内に移植して出産させて、キメラ非ヒト動物を作製する。
（ｃ）キメラ非ヒト動物を、同種の野生型非ヒト動物と交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製する。
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製する。
（ａ）Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部又は一部の機能を欠損させたＥＳ細胞を作製する。
（ｂ）ＥＳ細胞を非ヒト動物の胚内に移植して出産させて、キメラ非ヒト動物を作製する。
（ｃ）キメラ非ヒト動物を、同種の野生型非ヒト動物と交配してヘテロノックアウト非ヒト動物を作製する。
（ｄ）ヘテロノックアウト非ヒト動物同士を交配して、ホモノックアウト非ヒト動物を作製する。
次に、「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している」とは、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量が抑制され、野生型における発現量と比較して低いことを意味する。Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量の抑制は、例えば、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の転写量を減少させる、あるいは翻訳を阻害するなどにより行うことができる。
Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量を抑制する方法は特に限定されず、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による方法が挙げられる。ＲＮＡｉは、例えば、Ｍｉｐｅｐ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）等を設計及び合成し、これをレトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターに組み込んで、非ヒト動物に導入することにより引き起こすことができる。
非ヒト動物は、ヒト以外の動物であれば特に限定されず、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、ウシ、ミニブタ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ等が挙げられる。これらの内、変異動物の作製に関するプロトコールが確立しており、かつ、繁殖が容易という観点から、非ヒト動物はマウス、ラット等であることが好ましい。
非ヒト動物の一部としては、当該非ヒト動物から取得できるものであれば特に限定されず、例えば当該非ヒト動物由来の組織、細胞、これらの破砕物又は抽出物；体液；などが挙げられる。
［間葉系幹細胞］
本実施形態に係る間葉系幹細胞は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している。間葉系幹細胞ではミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現が認められることが報告されているが（例えば、国際公開第２０１７／１８８４０３号参照）、後述する脂肪細胞と同様に、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の機能が欠失されるなどにより、ミトカインの産生が増強される。そのため、間葉系幹細胞は、例えば、細胞自体を移植する細胞療法に用いることができ、移植された体内では、より多くのミトカインを産生させることができる。
本実施形態に係る間葉系幹細胞は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している。間葉系幹細胞ではミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現が認められることが報告されているが（例えば、国際公開第２０１７／１８８４０３号参照）、後述する脂肪細胞と同様に、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の機能が欠失されるなどにより、ミトカインの産生が増強される。そのため、間葉系幹細胞は、例えば、細胞自体を移植する細胞療法に用いることができ、移植された体内では、より多くのミトカインを産生させることができる。
また、間葉系幹細胞を培養することにより、培養上清を回収することもできる。上述したとおり、間葉系幹細胞はミトカインを産生するため、その培養上清にはミトカインが含まれる。よって、間葉系幹細胞の培養上清を治療又は予防用医薬として用いることで、ミトカインによる作用が有効な疾患に対する治療又は予防効果が期待される。更に、培養上清には、複数種のミトカインがバランスよく含まれ、また、ミトカイン以外の有用成分も含まれていることから、ミトカイン自体を投与する場合と比較して、更なる有効性が期待される。
「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部の機能が失われた」、「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の一部の機能が失われた」、及び「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している」の文言が意味するものは、上記非ヒト動物で述べたものと同様である。
間葉系幹細胞は、間葉に由来し、自己複製能及び分化能を有する体性幹細胞であれば、由来する組織は特に限定されない。由来する組織としては、例えば、脂肪、骨髄、歯髄、血液（末梢血、臍帯血等）、胎盤、臍帯、滑膜、骨膜、軟骨膜、筋肉、靭帯、腱、半月板、皮膚等が挙げられる。これらの内、由来する組織としては脂肪であることが好ましい。
間葉系幹細胞は、上述した非ヒト動物に由来する細胞であってもよいし、ヒトに由来する細胞であってもよい。
間葉系幹細胞は、投与しようとする対象の個体の細胞（自家細胞）に由来するものであってもよく、該個体以外の細胞（他家細胞）に由来するものであってもよい。
間葉系幹細胞は、ＥＳ細胞から分化誘導された細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）から分化誘導された細胞、株化細胞、Ｍｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ－ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｕｄｕｒｉｎｇ Ｃｅｌｌ）等であってもよい。
間葉系幹細胞としては、通常、分化マーカー（ＣＤ２４等）が陰性である未分化状態を維持した細胞が使用される。
間葉系幹細胞の調製方法は特に限定されず、間葉系幹細胞の調製方法として知られる任意の方法を採用できる。例えば、上述した由来組織より得られた間葉系幹細胞が含まれる細胞を培養皿に播種し、培養皿に付着させて増殖させ、得られた細胞の一部を再度培養皿上で増殖させる方法などが挙げられる。
間葉系幹細胞におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させる方法は限定されず、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ等を用いたゲノム編集による方法を用いることができる。また、間葉系幹細胞におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を抑制する方法も特に限定されず、例えば、非ヒト動物において上述したＲＮＡｉによる方法などを用いることができる。
［脂肪細胞］
本実施形態に係る脂肪細胞は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している。後述する実施例で示すように、このような脂肪細胞ではミトカインが多く産生される。そのため、脂肪細胞は、例えば、細胞自体を移植する細胞療法に用いることができ、移植された体内では、より多くのミトカインを産生させることができる。
本実施形態に係る脂肪細胞は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している。後述する実施例で示すように、このような脂肪細胞ではミトカインが多く産生される。そのため、脂肪細胞は、例えば、細胞自体を移植する細胞療法に用いることができ、移植された体内では、より多くのミトカインを産生させることができる。
また、脂肪細胞を培養することにより、培養上清を回収することもできる。上述したとおり、脂肪細胞ではミトカインが多く産生されるため、その培養上清にはミトカインが多く含まれる。よって、脂肪細胞の培養上清を治療又は予防用医薬として用いることで、ミトカインによる作用が有効な疾患に対する治療又は予防効果が期待される。更に、培養上清には、複数種のミトカインがバランスよく含まれ、また、ミトカイン以外の有用成分も含まれていることから、ミトカイン自体を投与する場合と比較して、更なる有効性が期待される。
「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部の機能が失われた」、「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の一部の機能が失われた」、及び「Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している」の文言が意味するものは、上記非ヒト動物で述べたものと同様である。
脂肪細胞は、上述した非ヒト動物から分離した細胞であってもよいし、上述した間葉系幹細胞を分化させた細胞であってもよい。
間葉系幹細胞から脂肪細胞を分化させる方法は特に限定されず、例えば、間葉系幹細胞にデキサメサゾン、インスリン、３－イソブチル－１－メチルキサンチン、ロシグリタゾン、グルココルチコイド、ホスホジエステラーゼ阻害剤等を接触させる方法が知られている。また、例えば「分化誘導剤」として市販されているものを使用することもできる。
脂肪細胞は、上述した非ヒト動物に由来する細胞であってもよいし、ヒトに由来する細胞であってもよい。
脂肪細胞は、投与しようとする対象の個体の細胞（自家細胞）に由来するものであってもよく、該個体以外の細胞（他家細胞）に由来するものであってもよい。
脂肪細胞におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の全部又は一部の機能を欠失させる方法は限定されず、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ等を用いたゲノム編集による方法を用いることができる。また、脂肪細胞におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量を抑制する方法も特に限定されず、例えば、非ヒト動物において上述したＲＮＡｉによる方法などを用いることができる。
［治療又は予防用医薬］
治療又は予防用医薬は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞、及びミトカインを含む前記間葉系幹細胞又は前記脂肪細胞の培養上清からなる群から選択される少なくとも１つを含有する。
治療又は予防用医薬は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞、及びミトカインを含む前記間葉系幹細胞又は前記脂肪細胞の培養上清からなる群から選択される少なくとも１つを含有する。
間葉系幹細胞又は脂肪細胞としては、上述した間葉系幹細胞や脂肪細胞において述べたものと同様の細胞を採用することができる。
ミトカインを含む間葉系幹細胞又は脂肪細胞の培養上清は、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞を培養する過程で得られる培養上清である。培養上清を得る方法は特に限定されないが、以下、一例を説明する。
まず、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している非ヒト動物の脂肪組織を皮下から採取し、必要に応じてコレゲナーゼ処理等を行った後に、適切な培養液の存在下で培養する。培養開始から例えば数日に１回程度、培養上清液を回収する。回収した培養上清液については、適切な滅菌処理（フィルターろ過、ＵＶ滅菌等の非加熱下での滅菌処理が好ましい）を行い、残存ウイルスのチェックを行うのが好ましい。
このようにして作製された間葉系幹細胞又は脂肪細胞の培養上清にはミトカインが多く含まれているが、含まれるミトカインは特に限定されず、例えば、ＧＤＦ１５、ＦＧＦ２１、ＡＮＧＰＴＬ６等が挙げられる。
治療又は予防用医薬は、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子による働きが有効な疾患に対して使用するのが好ましい。そのような疾患の一例としては、敗血症、虚血再灌流傷害、炎症性疾患、慢性腎臓病、肥満症、粥状硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、その他の代謝性疾患等が挙げられる。
治療又は予防用医薬は、間葉系幹細胞、脂肪細胞、又は培養上清に加えて、その機能を損なわない限り、製薬上許容される添加剤（医薬品添加剤）を更に含んでもよい。そのような添加剤としては、安定剤、保存剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、懸濁化剤、着香剤、着色剤、粘稠剤等が挙げられるが、これらに限定されない。治療又は予防用医薬は、培地由来成分を含んでもよい。
治療又は予防用医薬は、間葉系幹細胞、脂肪細胞、又は培養上清が任意の溶媒にそのまま含まれているものであってもよいし、あるいはシート状、管状、層状、固相結合体等の任意の形状で含まれていてもよい。
治療又は予防用医薬が脂肪細胞である場合のヒトへの投与形態（移植方法）の一例としては、生理食塩水や培養液に脂肪細胞を例えば１×１０３～１×１０７個／ｍＬとなるように調整し、腹腔内や皮下などへ注射やカテーテルなどにより局所注入することが挙げられる。治療又は予防用医薬の他の投与形態としては、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、脊髄管腔内移植、関節内移植、歯肉内注射等が挙げられる。
治療又は予防用医薬の適用対象は特に限定されず、哺乳動物等を好ましく挙げることができる。哺乳動物としては、ヒト及び非ヒト動物のいずれであってもよい。
治療又は予防用医薬の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
また、治療又は予防用医薬は投与目的に応じて、他の薬剤と併用して投与してもよい。治療又は予防用医薬とともに併用される薬剤の種類や量等は、得ようとする効果に基づき適宜選択され、治療又は予防用医薬とともに投与してもよく、別々に投与してもよい。
［ミトカイン混合物の調製方法］
後述する実施例で示すように、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の機能を欠失させることで、ミトカインの遺伝子群に含まれる複数種の遺伝子の発現が上昇する。したがって、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している非ヒト動物、及びＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞からなる群から選択される少なくとも１つから複数種のミトカインを回収し、ミトカイン混合物を調製することができる。
後述する実施例で示すように、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の機能を欠失させることで、ミトカインの遺伝子群に含まれる複数種の遺伝子の発現が上昇する。したがって、脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している非ヒト動物、及びＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞からなる群から選択される少なくとも１つから複数種のミトカインを回収し、ミトカイン混合物を調製することができる。
調製されたミトカイン混合物に含まれるミトカインとしては、例えば、上述した治療又は予防用医薬において述べたものと同様のミトカインが挙げられる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［ノックアウトマウスの作製］
Ｍｉｐｅｐ遺伝子のノックアウトマウスは以下の方法により作製した。
Ｍｉｐｅｐ遺伝子のノックアウトマウスは以下の方法により作製した。
＜Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒの作製及びＥＳ細胞への導入＞
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒは、ＤＴ－Ａ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＫＯ ＦＷ ｖｅｃｔｏｒに、マウスゲノムのｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎをｉｎｓｅｒｔすることにより作製した。Ｉｎｓｅｒｔ （５’ ａｒｍ， ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｒｍ， ３’ ａｒｍ）はマウスＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー由来のクローンＲＰ２３－１４２Ｏ１６（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｓ社）を鋳型とし、表１に示したプライマーを使用して、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ （ＴＯＹＯＢＯ社）により増幅した。そこから、５’ ａｒｍをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｒｍをＰｍｅＩ及びＳａｃＩＩ、３’ ａｒｍをＳｗａＩ及びＸｈｏＩで各々処理し、同様の制限酵素で処理済みのＤＴ－Ａ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＫＯ ＦＷ ｖｅｃｔｏｒにライゲーションし、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒを精製した。Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒをＸｈｏＩ処理により線状化した後、エレクトロポレーション法を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ由来のＥＳ細胞に導入した。使用したプライマーは以下のとおりである。
Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒは、ＤＴ－Ａ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＫＯ ＦＷ ｖｅｃｔｏｒに、マウスゲノムのｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎをｉｎｓｅｒｔすることにより作製した。Ｉｎｓｅｒｔ （５’ ａｒｍ， ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｒｍ， ３’ ａｒｍ）はマウスＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ライブラリー由来のクローンＲＰ２３－１４２Ｏ１６（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏ Ｔｅｃｈｓ社）を鋳型とし、表１に示したプライマーを使用して、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏ （ＴＯＹＯＢＯ社）により増幅した。そこから、５’ ａｒｍをＡｓｃＩ及びＮｏｔＩ、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｒｍをＰｍｅＩ及びＳａｃＩＩ、３’ ａｒｍをＳｗａＩ及びＸｈｏＩで各々処理し、同様の制限酵素で処理済みのＤＴ－Ａ／ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＫＯ ＦＷ ｖｅｃｔｏｒにライゲーションし、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒを精製した。Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒをＸｈｏＩ処理により線状化した後、エレクトロポレーション法を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ由来のＥＳ細胞に導入した。使用したプライマーは以下のとおりである。
＜サザンブロッティング＞
ＲＰ２３－１４２Ｏ１６をテンプレートとし、表１に示したプライマーを使用して、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏにより３’ ｐｒｏｂｅを増幅した。その後、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒを導入した上記のＥＳ細胞よりフェノール・クロロホルム法でゲノムＤＮＡを抽出し、ＡｐａＬＩで処理した。そして、０．８０％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌにＡｐａＬＩ処理後のｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ２０μｇをアプライし、泳動後にエチジウムブロマイドにつけ、撮影した。その後、ゲルを酸処理（０．２５Ｍ ＨＣｌを室温で１５ ｍｉｎ浸透）、塩基処理（０．５０Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌを室温で１５ｍｉｎ浸透）、中和処理（０．５０Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１．５Ｍ ＮａＣｌを室温で２０ｍｉｎ浸透）の順で処理した。処理後、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ，１５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）の浸透圧を利用して、ナイロンメンブレン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ社）に転写し、１５０ｍＪのＵＶでＤＮＡをクロスリンクした。クロスリンク後、５×ＳＳＣＰ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，７５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，５．０ｍＭ ＥＤＴＡ），５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１．０％ ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ ｓａｌｍｏｎ ｔｅｓｔｉｓ ＤＮＡを含むバッファーに浸して、４２℃でプレハイブリダイゼーションを一晩行い、３２Ｐで標識した３’ ｐｒｏｂｅをバッファー中に混ぜ、更に４２℃でハイブリダイゼーションを一晩行った。その後、バッファーを除き、２×ＳＳＣ，０．１０ ％ＳＤＳ溶液内で４２℃にて１５ｍｉｎ洗浄し、０．１×ＳＳＣ，０．１０％ＳＤＳ溶液内で６５℃にて１５ｍｉｎ×２回洗浄した。このメンブレンを感光板に乗せ、一晩放置後にＦＬＡ－７０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）で撮影した。
ＲＰ２３－１４２Ｏ１６をテンプレートとし、表１に示したプライマーを使用して、ＫＯＤ ＦＸ Ｎｅｏにより３’ ｐｒｏｂｅを増幅した。その後、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒを導入した上記のＥＳ細胞よりフェノール・クロロホルム法でゲノムＤＮＡを抽出し、ＡｐａＬＩで処理した。そして、０．８０％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌにＡｐａＬＩ処理後のｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ２０μｇをアプライし、泳動後にエチジウムブロマイドにつけ、撮影した。その後、ゲルを酸処理（０．２５Ｍ ＨＣｌを室温で１５ ｍｉｎ浸透）、塩基処理（０．５０Ｍ ＮａＯＨ，１．５Ｍ ＮａＣｌを室温で１５ｍｉｎ浸透）、中和処理（０．５０Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１．５Ｍ ＮａＣｌを室温で２０ｍｉｎ浸透）の順で処理した。処理後、１０×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ，１５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）の浸透圧を利用して、ナイロンメンブレン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ社）に転写し、１５０ｍＪのＵＶでＤＮＡをクロスリンクした。クロスリンク後、５×ＳＳＣＰ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，７５ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ，５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４，５．０ｍＭ ＥＤＴＡ），５０％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，２×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，１．０％ ＳＤＳ，１００μｇ／ｍＬ ｓａｌｍｏｎ ｔｅｓｔｉｓ ＤＮＡを含むバッファーに浸して、４２℃でプレハイブリダイゼーションを一晩行い、３２Ｐで標識した３’ ｐｒｏｂｅをバッファー中に混ぜ、更に４２℃でハイブリダイゼーションを一晩行った。その後、バッファーを除き、２×ＳＳＣ，０．１０ ％ＳＤＳ溶液内で４２℃にて１５ｍｉｎ洗浄し、０．１×ＳＳＣ，０．１０％ＳＤＳ溶液内で６５℃にて１５ｍｉｎ×２回洗浄した。このメンブレンを感光板に乗せ、一晩放置後にＦＬＡ－７０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）で撮影した。
＜マウスの作製＞
サザンブロッティングにより目的の部位にｔａｒｇｅｔ ａｌｌｅｌｅの挿入が確認されたＥＳ細胞を、ＩＣＲマウスの８細胞期の受精卵と混ぜ、一晩培養後、胚盤胞期になった受精卵を偽妊娠マウスの子宮に移植し、キメラマウスを作製した（アグリゲーション法）。キメラマウスとＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌを交配し、導入ＥＳ細胞由来のゲノムを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを作製した。ＣＡＧ－ＦＬＰｅ ｍｉｃｅ （Ｋａｎｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．，２００６，５５，１３７－１４１）と上記マウスとを交配し、ｆｌｉｐｐａｓｅ－ＦＲＴシステムを利用してＥＳ細胞由来ゲノムに残存するネオマイシン耐性配列を削除することで、Ｍｉｐｅｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを作製した。その後、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ－Ｃｒｅマウスと交配し、脂肪組織特異的Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスを作製した。
サザンブロッティングにより目的の部位にｔａｒｇｅｔ ａｌｌｅｌｅの挿入が確認されたＥＳ細胞を、ＩＣＲマウスの８細胞期の受精卵と混ぜ、一晩培養後、胚盤胞期になった受精卵を偽妊娠マウスの子宮に移植し、キメラマウスを作製した（アグリゲーション法）。キメラマウスとＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌを交配し、導入ＥＳ細胞由来のゲノムを有するＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを作製した。ＣＡＧ－ＦＬＰｅ ｍｉｃｅ （Ｋａｎｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．，２００６，５５，１３７－１４１）と上記マウスとを交配し、ｆｌｉｐｐａｓｅ－ＦＲＴシステムを利用してＥＳ細胞由来ゲノムに残存するネオマイシン耐性配列を削除することで、Ｍｉｐｅｐｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスを作製した。その後、Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ－Ｃｒｅマウスと交配し、脂肪組織特異的Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスを作製した。
［試験例１］
試験例１では、Ｍｉｐｅｐノックアウトマウス（本明細書において、「Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウス」ともいう。）におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにて確認した。リアルタイムＰＣＲは以下の方法で行った。
試験例１では、Ｍｉｐｅｐノックアウトマウス（本明細書において、「Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウス」ともいう。）におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲにて確認した。リアルタイムＰＣＲは以下の方法で行った。
脂肪組織からＩＳＯＧＥＮＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅ社）を用いてｍＲＮＡを抽出し、分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ １０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて濃度を測定した。Ｔｏｔａｌ ＲＮＡはＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いた逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ社）を用いたＲｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲをＣＦＸ ｃｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）にて行った。なお、それぞれの反応条件は試薬メーカーの推奨プロトコールに従った。この際に用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
図１に示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスの脂肪組織では、Ｍｉｐｅｐ遺伝子の発現量が減少していることが確認された。
［試験例２］
試験例２では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、脂肪組織でのＭＩＰＥＰ基質の変化をウェスタンブロッティングにて確認した。ウェスタンブロッティングは以下の方法で行った。
試験例２では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、脂肪組織でのＭＩＰＥＰ基質の変化をウェスタンブロッティングにて確認した。ウェスタンブロッティングは以下の方法で行った。
組織を、適量のＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２％ ＳＤＳ，３Ｍ ｕｒｅａ，６％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を加えホモジェナイズ後、更にソニケーションした。得られたライセートを遠心（１２０００×Ｇ，４℃，３０ｍｉｎ）し、上清を回収し、９５℃で５分間インキュベートした。得られた上清に含まれるタンパク質量をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定し、ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒにより１ｍｇ／ｍＬの濃度に調製した。サンプルの１／１０量の０．２５％ ＢＰＢ／５％ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ＝１：１混液を加え、９５℃で５分間還元処理をした。調製したサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥ法にて泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写した。転写後、メンブレンはｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液中（２．５％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ（ＷＡＫＯ）／０．２５％ ＢＳＡ ｉｎ ＴＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ７．４），１４０ｍＭ ＮａＣｌ，２．５ｍＭ ＫＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）＝１：１）にて室温で１時間震盪させた。その後、一次抗体を反応液（Ｉｍｍｎｏ Ｓｈｏｔ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｉ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ，ＩＳ－００１）／ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液＝２：１）中に加え、４℃にてメンブレンと一晩又は二晩反応させた。一次抗体反応後、メンブレンをＴＴＢＳにて洗浄し（５分×２回及び１０分×２回）、二次抗体を反応液（ＩｍｍｕｎｏＳｈｏｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ，ＩＳ－００２）／ｂｌｏｃｋｉｎｇ溶液＝２：１）中に加え、１時間室温にてメンブレンと反応させた。二次抗体反応後、メンブレンをＴＴＢＳにて洗浄し（５分×２回及び１０分×２回）、ＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ ＬＤ（ＷＡＫＯ）を用いた化学発光を行い、ＬＡＳ－３０００ルミノ・イメージアナライザーにて撮影し、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ ３．１を用いて定量した。なお、一次抗体には、抗ＳＩＲＴ３抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社，＃５４９０）、抗ＣＯＸ４抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社，＃４８４４）、抗ＭＤＨ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社，＃８６１０）、抗Ｃｌｐｘ抗体（ａｂｃａｍ社，ａｂ１６８３３８）、抗ＳＰＧ７抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，ＰＡ５－８７１０６）、抗ＭＲＰＬ３２抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，ＰＡ５－１０９９８０）を、二次抗体にはＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ社）を用いた。
図２に示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスにおいて、ＭＩＰＥＰの基質であるＳＩＲＴ３、ＣＯＸ４のタンパク質のバンドは上方にシフトし、それらの発現量は減少した。他方で、同じくＭＩＰＥＰの基質であるＭＤＨ２は、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスにおいて同様にバンドが上方にシフトしたが、タンパク質発現量は増加した。これらのバンドの上方へのシフトは、成熟化不全によるものと考えられる。また、図２に示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスにおいて、プロテアーゼＣｌｐＸＰのサブユニットであるＣｌｐｘ、プロテアーゼｍ－ＡＡＡのサブユニットであるＳＰＧ７の発現量は増加し、ｍ－ＡＡＡの基質であるＭＲＰＬ３２の発現量は減少した。この結果から、ＭＩＰＥＰはプロテアーゼも基質としており、ミトコンドリアプロテオスタシスに重要な役割を果たしていると考えられる。
［試験例３］
試験例３では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる脂肪組織の変化を確認した。まず、脂肪組織の状態を確認後、脂肪組織を１０％中性緩衝ホルマリン溶液（１０％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ＰＢＳ）にて固定し、パラフィン包埋後、５μｍの厚さで薄切し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色を行った。
試験例３では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる脂肪組織の変化を確認した。まず、脂肪組織の状態を確認後、脂肪組織を１０％中性緩衝ホルマリン溶液（１０％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ＰＢＳ）にて固定し、パラフィン包埋後、５μｍの厚さで薄切し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色を行った。
まず、図３Ａに示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスでは、脂肪組織が顕著に減少していることが確認された。
次に、図３Ｂに示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスのＷＡＴでは、成熟異常をきたした未分化な脂肪細胞を示すリポブラスト様の形態を示す細胞が所々で観察された。また、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスのＢＡＴでは、脂肪滴が増加している様子が確認された。
［試験例４］
試験例４では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、マウス生殖器周囲の脂肪組織における内臓脂肪量の変化を確認した。確認は、１９～２０週齢のマウスを使用し、下記の方法によるコンピューター断層撮影により行った。第三世代ＣＴスキャナーであるＬａｔｈｅｔａ ＬＣＴ－２００ （Ｈｉｔａｃｈｉ－Ａｌｏｌａ社）を使用し、管電圧は５０ｋＶ、電流は０．５ｍＡの一定状態で断層撮影を行った。マウスを直径４８ｍｍのホルダー内に入れ、走査機を３６０°回転させ、データを収集し、画素当たり９６μｍの解像度、一枚当たりの幅が１９２μｍ、６００μｍ間隔で撮影をした。－５５０～－１４０ＨＵの密度範囲をＷＡＴとして評価し解析した。マウスの推定Ｘ線被ばくは４０ｍＳｖ未満に維持して撮影を行った。
試験例４では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、マウス生殖器周囲の脂肪組織における内臓脂肪量の変化を確認した。確認は、１９～２０週齢のマウスを使用し、下記の方法によるコンピューター断層撮影により行った。第三世代ＣＴスキャナーであるＬａｔｈｅｔａ ＬＣＴ－２００ （Ｈｉｔａｃｈｉ－Ａｌｏｌａ社）を使用し、管電圧は５０ｋＶ、電流は０．５ｍＡの一定状態で断層撮影を行った。マウスを直径４８ｍｍのホルダー内に入れ、走査機を３６０°回転させ、データを収集し、画素当たり９６μｍの解像度、一枚当たりの幅が１９２μｍ、６００μｍ間隔で撮影をした。－５５０～－１４０ＨＵの密度範囲をＷＡＴとして評価し解析した。マウスの推定Ｘ線被ばくは４０ｍＳｖ未満に維持して撮影を行った。
図４Ａ及び図４Ｂに示されるように、内臓脂肪（ｖＷＡＴ）は野生型マウスでは高脂肪食（ＨＦＤ）摂餌時に増加するのに対し、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスではそのような増加がみられなかった。
［試験例５］
試験例５では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、脂肪組織におけるｍｔＵＰＲ関連遺伝子発現の変化を確認した。確認は、試験例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲにより行った。この際に用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
試験例５では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、脂肪組織におけるｍｔＵＰＲ関連遺伝子発現の変化を確認した。確認は、試験例１と同様の方法でリアルタイムＰＣＲにより行った。この際に用いたプライマーの配列は以下のとおりである。
図５に示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスでは野生型に比べて、ミトカインの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現量が増加していた。他方で、シャペロンやプロテアーゼの遺伝子群に含まれる遺伝子の発現量の増加はみられなかった。また、脂肪細胞分化に関連する遺伝子に関しては、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスにおいて有意に発現量が低いことが確認された。
なお、データは示さないが、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析装置Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００（イルミナ社）を用いて遺伝子発現を網羅的に解析したところ、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスでは野生型に比べて、ミトコンドリア関連遺伝子の発現が有意に抑制されており、ミトコンドリア生合成が抑制されていることが確認された。
［試験例６］
試験例６では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、血漿中のＧＤＦ１５タンパク質量の変化を確認した。確認は、Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ ＧＤＦ－１５ Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。反応については、メーカー提供のプロトコールに従って実施した。
試験例６では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、血漿中のＧＤＦ１５タンパク質量の変化を確認した。確認は、Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ ＧＤＦ－１５ Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。反応については、メーカー提供のプロトコールに従って実施した。
図６に示されるように、血漿においても、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスでは野生型に比べて、ＧＤＦ１５の量が多かった。
［試験例７］
試験例７では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、ＬＰＳ投与後の生存に対する影響を確認した。４０－４５週齢の雄性Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウス及び野生型マウスの各群６匹ずつに、体重１ｋｇあたり１５ｍｇのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腹腔内投与した。投与後からの生存匹数を１日ごとにカウントし、６匹を１００％として生存率を算出して、それを生存曲線にて表した。
試験例７では、Ｍｉｐｅｐノックアウトによる、ＬＰＳ投与後の生存に対する影響を確認した。４０－４５週齢の雄性Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウス及び野生型マウスの各群６匹ずつに、体重１ｋｇあたり１５ｍｇのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を腹腔内投与した。投与後からの生存匹数を１日ごとにカウントし、６匹を１００％として生存率を算出して、それを生存曲線にて表した。
図７に示されるように、Ｍｉｐｅｐ ＫＯマウスでは野生型マウスに比べて、ＬＰＳに対する抵抗性が顕著に高かった。
Claims (6)
- 脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している、非ヒト動物又はその一部。
- Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している、間葉系幹細胞。
- Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している、脂肪細胞。
- Ｍｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞、及びミトカインを含む前記間葉系幹細胞又は前記脂肪細胞の培養上清からなる群から選択される少なくとも１つを含有する、治療又は予防用医薬。
- 前記治療又は予防用医薬が、敗血症、虚血再灌流傷害、炎症性疾患、慢性腎臓病、肥満症、粥状硬化症、非アルコール性脂肪性肝疾患、及びその他の代謝性疾患からなる群から選択される少なくとも１つの疾患の治療又は予防に用いられるものである、請求項４に記載の治療又は予防用医薬。
- 脂肪組織においてＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又は脂肪組織におけるＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している非ヒト動物、及びＭｉｐｅｐ遺伝子の全部若しくは一部の機能が失われ、又はＭｉｐｅｐ遺伝子の発現量が野生型と比較して低下している間葉系幹細胞又は脂肪細胞からなる群から選択される少なくとも１つから複数種のミトカインを回収することを含む、ミトカイン混合物の調製方法。
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|---|---|---|---|
| US18/264,396 US20240100098A1 (en) | 2021-02-17 | 2022-02-16 | Mesenchymal stem cells and adipocytes for preparing mitokine mixture, and therapeutic or prophylactic drug |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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2022
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2017188403A1 (ja) | 2016-04-27 | 2017-11-02 | ロート製薬株式会社 | Ｃｄ２０１、ｃｄ４６、ｃｄ５６、ｃｄ１４７及びｃｄ１６５からなる群より選択される少なくとも１種の細胞表面マーカーを発現する間葉系幹細胞及びその調製方法、並びに上記間葉系幹細胞を含む医薬組成物及びその調製方法 |
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| SUN ET AL., J. CELL BIOCHEM., vol. 120, no. 12, 2019, pages 19529 - 19540 |
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