KR102378462B1 - 비알코올성 간질환 동물 모델 및 비알코올성 간질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

비알코올성 간질환 동물 모델 및 비알코올성 간질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Hippo 신호전달에 의한 AKT 조절을 통한 대사 조절 장애간의 상관관계를 이용한 비알코올성 간질환의 동물 모델의 제조방법과 상기 제조방법으로 제작된 동물 모델 및 이 동물 모델을 활용한 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

비알코올성 간질환 동물 모델 및 비알코올성 간질환의 진단, 예방 또는 치료용 조성물 {Animal model of non-alcoholic liver disease and compositions of diagnosis, prevention or treatment for non-alcoholic liver disease}
본 발명은 Hippo 회로와 AKT 회로간의 상호조절 이상으로 인한 지방대사 조절 장애에서 비롯된 비알코올성 간질환의 동물 모델 및 이 동물 모델을 활용한 치료제의 스크리닝 방법, 상기 상관관계를 이용한 비알코올성 간질환의 진단 및 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
간암은 전세계에서 5번째로 많이 발생하는 종양으로서 사망률이 전체 암 중에서는 2번째로 높다. 간암은 크게 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)과 담관세포암 (Cholangiocarcinoma, CC)으로 나뉘는데, 특히 간세포암은 일차 간암의 70-85%에 해당하는 가장 주요한 조직학적 하위 유형이다. 임상에서는 수술을 동반한 화학적 요법이 시행되고 있지만, 간세포암 환자의 5년 생존율은 전이, 재발 및 화학 및 방사선치료에 대한 저항성으로 인해서 상당히 낮다.
비알코올성 지방간질환(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 간 내 단순 지방침착(simple steatosis)부터 지방간염, 간경변에 이르는 다양한 질환을 포괄하며, 비만 또는 인슐린 저항성으로 인한 간세포 내 지방침착, 유전적 원인 등을 그 이유로 보고 있다. 비알코올성 지방간질환의 진단은 초음파 또는 생검검사를 통해 이루어지고, 특히, 알콜성 지방간과의 구분은 이 질환이 알콜에 기인하지 않았음을 입증하는 것이 중요한데, 현실적으로 환자의 진술에 의존해야 되는 어려움이 있다.
NAFLD의 좀 더 진행된 간질환인 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)은 간경화를 통한 간암으로 진행될 가능성이 높아 그로 인해 사망률이 증가될 것으로 예상된다(Angulo P., Hepatology, 2010; 51:373-375). 비만 인구의 증가로 이러한 질병에 대한 예방의 필요성이 증가하는 반면, 현재 NAFLD나 NASH의 예방 또는 치료를 위한 효과적인 방법은 없는 실정이다.
비알코올성 지방간질환 환자의 대부분은 정상 범위보다 고농도의 인슐린 농도를 보이는 인슐린저항성을 나타낸다. 이로 인해 지방 조직의 지질 분해가 억제되어 유리지방산이 간에 다량 유입되는데, 고농도의 인슐린으로 인해 β-oxidation이 저해되면서 간 밖으로 배출되지 못해 간내 지질 축적이 일어나는 것이다. 한편, 인슐린은 IRS1과 IRS2를 거쳐 AKT 및 스테롤 조절인자 결합 단백질 1c(sterol regulatory element-binding protein 1c, SREBP1c)를 활성화한다. SREBP1c는 세포질 전사인자로서, 체내 지질합성에 관여하는 지방산 신타아제(fatty acid synthase)와 아세틸-CoA 카르복실라제(ACC)를 유도하여 여분의 포도당을 중성 지방 형태로 간으로 저장함으로써 신규 지방합성을 유도, NAFLD를 유발한다고 알려져 있다.
한편, Hippo 신호전달 경로는 세포 증식, 줄기세포기능 조절, 암 발생에 관여한다. Hippo 신호전달 경로의 하위 인자인 YAP과 TAZ의 과활성은 암을 유발하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 목적은, 비알코올성 간질환 동물 모델의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 비알코올성 간질환 동물 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 비알코올성 간질환 동물 모델에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 동물의 간조직에서 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보 물질의 미처리 대조 간조직과 처리된 간조직에서 측정된 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 비교하여 대조 간조직보다 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 낮은 경우, 후보 물질을 간질환의 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 간특이적으로 Pten 및 Sav1 유전자가 결실된 비알코올성 간질환 동물 모델 및 상기 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동물 모델에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 동물의 간조직에서 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보 물질의 미처리 대조 간조직과 처리된 간조직에서 측정된 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 비교하여 대조 간조직보다 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 낮은 경우, 후보 물질을 간질환의 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 Pten 및 Sav1 유전자가 간특이적으로 결실된(더블 녹아웃, DKO), YAP 또는 TAZ 단백질이 활성화되어 IRS2 단백질의 발현을 촉진하고, AKT 단백질이 활성화됨에 따라 나타나는 비알코올성 간질환 동물 모델을 제공한다. 상기 비알코올성 간질환은 비알코올성 간질환, 비알코올성지방간염, 간경화 또는 간암일 수 있다.
본 발명에 따른 동물 모델은 수탁번호 KCTC 13522BP을 갖는 기탁된 수정란을 갖는 동물 모델일 수 있으며, 구체적으로 상기 동물모델은 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 101(신정도)에 주소를 둔 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2018년 5월 9일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13522BP을 받은 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, "비알코올성 간질환"은 알콜섭취와 관계 없이 발생하는 간세포 내의 단순 지방 축적(fatty liver)을 비롯하여, 지방간(steatosis), 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis, NASH)을 통해 간경화와 간암에 이르는 다양한 간질환을 포함한다. 바람직하게는 비알코올성지방간, 비알코올성지방간염, 간경화 또는 간암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, "동물 모델"이란 사람의 질병과 아주 유사한 형태의 질병을 가진 인간을 제외한 동물을 의미한다. 사람과 동물들 간의 생리적 또는 유전적인 유사성에 의해, 질병 연구에 있어 생체의학 질환모델 동물은 질병의 다양한 원인과 발병과정 및 진단에 대한 연구용 재료를 제공한다. 질환모델 동물의 연구를 통해 질병에 관련된 유전자들을 알아내고, 유전자들 간의 상호작용을 이해할 수 있게 하고, 개발된 신약후보물질의 실제 효능 및 독성 검사를 통해 실용화 가능성의 여부를 판단하는 기초 자료를 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, "동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물, 바람직하게는 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 등의 설치류를 의미한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, "결실"은 해당 유전자 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 해당 유전자가 암호화하는 단백질의 발현이 야생형(wild type) 단백질에 비해 현저히 감소 또는 완전히 상실된 경우라면 부분적으로 결실된 것도 포함한다. 상기 유전자 결실은 당업계에 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Pten 및 Sav1 유전자가 동시에 결실된 마우스(DKO)는 모두 간질환 표현형을 가지고 있음을 확인하였다 (참고예 1, 실시예 1). 본 발명에서 제공하는 마우스는 기존 Pten 유전자 결실 마우스에 비해 현저하게 종양 발생이 촉진되므로, 비알코올성 간질환이 유도된 동물 모델로서 적합함을 알 수 있다.
상기 동물 모델은 간세포암종(HCC)과 담관암(CC)을 모두 동반한 종양으로 진행되는 암을 발병하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Pten 및 Sav1 유전자가 동시에 결실된 마우스(DKO)는 Pten 또는 Sav1이 결실된 마우스에 비해 빠른 종양 발생 속도를 보였다. 구체적으로 Pten-/- 또는 Sav1-/- 마우스가 50 내지 60주에 간 종양을 나타낸 반면, 모든 DKO 마우스에서 15주 내에 종양이 발생하였다(도 1b). 이는 고지방식이를 통해 비알콜성 간질환을 유도하고, 이 경우에도 간염 또는 간암까지 진행하지 않던 종래의 기술과 차별화되는 점으로, 본 발명의 DKO 마우스는 고지방식이보다 저렴한 정상 식이를 준 경우에도 자발적으로 지방간, 간염 및 간암으로 진행되어 경제적인 이점을 가진다.
본 발명의 일 실시예에서, Pten-/- 마우스의 간에서 3개월이 되어서야 비알코올성지방간 (NAFLD) 표현형이 나타난 반면, Pten 및 Sav1 유전자가 동시에 결실된 마우스(DKO)는 1개월 된 간에서도 지방산 축적을 나타냈다(도 1c). 따라서 본 발명은 종래 기술에 비해 시간적으로 이점을 가지는 비알코올성 간질환 동물 모델을 제공할 수 있다. CRE를 발현하는 아데노 바이러스를 사용하여 성체에서 Pten과 Sav1을 결실시킨 결과 역시 비알코올성지방간을 발생시켰다(도 11).
본 발명의 일 실시예에서, DKO마우스 간은 생후 1개월에 글리코겐의 과도한 축적을 보이고, 시간이 갈수록 점차 악화되었다(도 1c, 도 11). 3개월 된 DKO 마우스의 간은 세포 사멸과 대식세포 축적을 나타냈다 (도 1c, 도 11). 이들은 더욱 진행된 형태의 비알코올성지방간질환 표현형과 간섬유증을 보이며, 이는 비알코올성지방간염 (NASH)으로의 진행을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, 체중 대비 간의 무게 비율, 각 유전자형을 가진 마우스의 혈청 내 간 효소(AST 및 ALT), 사멸세포 및 대식세포의 정량분석 결과, 3개월령 DKO 마우스는 혈청 내 AST와 ALT가 현저히 증가한 수준을 보임은 물론(도 1d), 5개월령 마우스의 비담관부분(non-ductal regions)에서 panCK-양성을 보이는 간 전구세포의 증가(도 11)를 보인다. 종합적으로, 이러한 결과는 Pten-/- 간에서 보이는 NAFLD, NASH, 간경화를 거쳐 암으로 진행되는 과정이 Sav1의 결손으로 인해 촉진된다는 것을 나타낸다.
상기 결과들을 통해서 본 발명에서 제공하는 마우스 모델은 Pten 또는 Sav1 유전자가 각각 결실된 마우스에 비해 비알코올성 지방간, 비알코올성 지방간염의 진행속도 향상, 모든 개체에서 간질환 표현형이 발생, 암으로의 진행이 촉진되는 특징을 보이므로, 비알코올성 간질환이 유도된 동물 모델로서 적합함을 알 수 있다.
본 발명이 제공하는 비알코올성 간질환 동물 모델은, 기존의 비알코올성 간질환 동물 모델에 비해, 하기와 같은 장점을 가진다:
(1) 기존 비알콜성 간질환 유발법인 고가인 고지방식 급여와는 달리 정상식이로 유발가능
(2) 비알코올성 간질환 발병시기 단축뿐만아니라 이로부터 진행된 간암 발병까지 걸리는 시간이 단축됨
(3) 간염, 간경화 및 간암으로의 진행이 자발적으로 이루어져, 인간에서의 간질환 진행을 모사하는 능력이 뛰어남
(4) 질병 메커니즘이 밝혀져있으며, 기존 임상시험중인 약물에도 효과를 보여 신약 개발 스크리닝에 중요한 동물 모델로 사용될수 있음.
본 발명의 일 예는 간 특이적으로 Pten 유전자 및 Sav1 유전자가 결실된 동물을 제조하는 단계를 포함하는, 비알코올성 간질환 동물 모델의 제조 방법을 제공한다.
상기 간 특이적으로 Pten 유전자 및 Sav1 유전자가 결실된 동물을 제조하는 단계는, 인간을 제외한 동물 개체에서 조직 특이적으로 특정 유전자를 결실 또는 녹아웃(Knockout)시키기 위한 목적 범위에서 제한 없이 이용될 수 있으며, 예를 들어, 조직 특이적으로 발현되는 Cre 재조합효소, 또는 아데노바이러스를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은아니다.
간 특이적으로 Pten 및 Sav1 유전자를 결실시키기 위해 상기 조직 특이적으로 발현되는 Cre 재조합효소를 이용하는 경우, Albumin-Cre 유전자형을 가지는 동물 개체가 이용될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 Albumin-Cre 유전자형을 가지는 동물 개체를 이용하여 간 특이적으로 Pten 및 Sav1 유전자를 결실시킴으로써 비알코올성 간질환 동물 모델을 제조하는 방법은 하기의 3가지 단계를 포함할 수 있다:
(1) Pten f/f 유전자형을 포함하는 동물을 CRE를 발현하는 Albumin-Cre 유전자형을 포함하는 동물과 교배하여 제1세대 개체를 얻는 단계;
(2) 상기 제1세대 개체를 Sav1f/f 유전자형을 가지는 동물과 교배하여 제2세대 개체를 얻는 단계; 및
(3) 상기 제2세대 개체간의 교배를 통해 Ptenf/f;Sav1f/f;Albumin-Cre 유전자형을 포함하는 제3세대 개체를 얻는 단계.
상기 Albumin-Cre 유전자형을 포함하는 동물은, 간 특이적으로 Cre 재조합 효소가 발현되는 특성이 있어, 간 특이적 유전자 녹아웃(Knockout)에 유용하다.
상기 제1세대 개체를 Sav1f/f 유전자형을 가지는 동물과 교배하여 제2세대 개체를 얻는 단계에서 얻어지는 제2세대 개체는 Ptenf/+;Sav1f/+;Albumin-Cre 또는 Ptenf/+;Sav1f/+ 유전자형을 포함하는 개체일 수 있다.
상기 제3세대를 얻는 단계는, 상기 제2세대 개체 중 Ptenf/+;Sav1f/+;Albumin-Cre 유전자형을 포함하는 제2세대 개체와 Ptenf/+;Sav1f/+ 유전자형을 포함하는 제2세대 개체를 교배하여 얻는 단계일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, Ptenf/f;Sav1f/f;Albumin-Cre를 획득하여 이를 double knock-out (DKO) 마우스로 이용하였다. DKO 유전자형을 가지는 마우스는 암수 모두 100% 간질환 표현형을 나타내었으나, 본 발명의 실시예에서는 수컷마우스만을 이용하였다.
본 발명이 제공하는 비알코올성 간질환 동물 모델의 제조 방법은, 상기 제3세대의 동물에게 고가인 고지방식이를 급여하지 않고 정상 식이를 급여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명이 제공하는 동물 모델의 제조 방법은, 고지방식이보다 저렴한 정상 식이를 준 경우에도 자발적으로 지방간, 간염 및 간암으로 진행되는 동물 모델을 제공할 수 있는 경제적 이점을 가진다.
또한 본 발명의 동물 모델 제조 방법은, 비알코올성 간질환의 발병률이 100%로 높은 동시에 질병의 진행 속도가 빠르고, 간암으로의 질병 진행 모사가 뛰어난 동물 모델을 제공할 수 있는 장점을 가진다.
본 발명의 일 예는 상기 동물 모델에 후보 물질을 처리하는 단계; 상기 후보 물질이 처리된 동물의 간조직에서 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보 물질의 미처리 대조 간조직과 비교하여, 측정된 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 비교하여 대조 간조직보다 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 낮은 경우, 후보 물질을 간질환의 치료제로 결정하는 단계를 포함하는, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 발현 또는 활성 수준 측정의 대상이 되는 단백질은 YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질일 수 있으며, 바람직하게는 YAP 및 TAZ로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질로 구성되는 제1그룹 및 IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질로 구성된 제2그룹의 단백질일 수 있다.
상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 mRNA 전사량 수준을 측정하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 mRNA는 상기 단백질을 암호화하는 유전자로부터 전사된 mRNA 또는 상기 단백질이 조절하는 목적 유전자로부터 전사된 mRNA일 수 있다. 바람직하게는 YAP/TAZ 단백질은 Irs2 유전자를, IRS2 단백질은 Akt 유전자를, AKT 단백질은 Yap/Taz 유전자를 조절하는 것일 수 있다. 상기 mRNA의 전사량 수준 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 mRNA의 전사량 수준 측정법으로 수행하는 것일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법으로 수행하는 것일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 후보 물질은 AKT 단백질의 활성을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 "후보물질"은 비알코올성 지방간질환 치료제로서 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 등의 임의 분자를 포함할 수 있다. 상기 후보 물질은 프라이머, 프로브, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 고분자 화학물질, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 바이러스 또는 항체를 포함할 수 있다. 상기 후보물질은 또한 천연물질 외에 합성물질도 포함한다.
본 발명에 따른 동물 모델은 Hippo 및 AKT 회로의 상호작용을 이용함으로써 모두 간질환 표현형을 나타내며, 기존 각 회로 결실 동물 모델에 비해 질병 진행 속도가 빠르므로, 경제적, 시간적인 이점을 가지며, 비알코올성 간질환의 진단 방법, 치료제 스크리닝 및 신약 개발 등에 유용하게 사용할 수 있다. 또한 Hippo 신호전달 경로와 대사 경로 사이의 상관관계가 밝혀짐에 따라 비알코올성 간질환에 대한 효과적인 치료제 및 진단 방법, 치료제의 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.
도 1a는 표시된 유전자형을 가진 5개월 된 마우스의 간을 나타낸다. DKO(Pten-/-;Sav1-/-)에서 암 발병이 진행된 것을 볼 수 있다.
도 1b는 표시된 유전자형에서의 종양 미발생 비율(상)과 생존율(하)이다.
도 1c는 1개월 된 마우스 간의 Oil Red O(1번 레인), PAS(2번 레인) 염색 결과와 3개월 된 마우스 간의 H&E(3번 레인), Sirius red(4번 레인), TUNEL(5번 레인), F4/80(6번 레인) 염색 결과이다. 스케일 바는 위에서부터 100, 50, 100, 200, 200, 100um를 나타낸다.
도 1d의 그래프는 각각 2개월 및 4개월 된 마우스의 체중대비 간의 무게비율(E), 각 유전자형을 가진 마우스의 혈청 내 간 효소(AST와 ALT, F), 위 TUNEL과 F4/80 염색 샘플의 사멸세포(apoptotic cell) 및 대식세포의 정량분석(G) 결과이다.
도 2a는 3개월 된 마우스의 간에서 마이크로어레이 분석으로 밝힌, 발현량의 차이를 보인 유전자들의 히트맵이다.
도 2b는 Pten-/-;Sav1-/-(DKO) 간과 Pten-/- 간 사이의 GSEA 결과를 비교한 것이다. DKO 마우스 간에서의 상향 조절된 유전자의 각 그룹은 MSigDB(Broad Institute)에서 제공되었다. NES는 normalized enrichment score를, NOM p-val은 nominal P value를, FDR q-val은 false discovery rate q value를 의미한다.
도 2c는 3개월 된 마우스의 간에서, AKT신호전달 경로의 구성요소와 지질합성 관련 단백질의 면역블롯 분석 결과이다.
도 2d는 3개월 된 마우스 간의 p-AKT의 면역조직화학염색 및 PIP3의 면역형광염색 결과이다. 좌측 스케일 바는 50um, 우측은 100um를 나타낸다.
도 2e는 3개월령 마우스의 지질합성 관련 또는 염증 관련 유전자의 상대적mRNA양을 qPCR 분석한 결과이다.
도 3a는 표시된 각 유전자형을 가진 3개월 된 마우스의 간에서 Hippo 회로 구성요소를 면역블롯 분석한 결과이다.
도 3b는 YAP/TAZ의 면역조직화학염색 결과를 나타낸다. 스케일 바는 50um를 의미한다.
도 3c는 도 3b에서 나타난 YAP/TAZ의 위치를 정량 분석한 것이다. C는 세포질(cytoplasm), N은 핵(nucleus)을 나타낸다.
도 3d는 각 표시된 유전자형을 가진 1개월령 마우스 간에서 핵과 세포질을 분획한 후 YAP과 TAZ의 발현결과이다. LaminB와 GAPDH는 각각 핵과 세포질의 control로 사용되었다.
도 3e는 6주 된 정상(WT) 마우스와 Pten-/- 마우스 각각에 GFP, TAZ4SA, 그리고 YAP5SA를 발현하는 아데노바이러스를 주입 후 4일 경과 후에 얻은 간을 각각 육안 관찰, H&E 염색, Oil Red O 염색한 결과를 나타낸다. 화살표는 지질 방울이 과형성 된 간세포를 표시한다.
도 3f와 3g는 도 3e에 나타낸 간의 면역블롯 결과를 보여준다.
도 4a는 3개월 된 마우스 간의 인슐린 신호전달 분자를 면역블롯 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 도 4a에서 사용한 것과 동일한 간의 Irs2 mRNA양을 qPCR 분석한 결과를 보여준다.
도 4c는 마우스 정상 간세포주인 AML12 세포에서 shPten 및/또는 shSav1를 이용하여 Pten 및/또는 Sav1 발현을 저해한 경우의 면역블롯을 통한 IRS2 분석 결과를 나타낸다.
도 4d는 도 4c에서 제작된 AML12 세포에서 인슐린에 의해 유도되는 AKT 활성을 면역블롯으로 확인한 결과이다.
도 4e는 IRS2의 발현을 증가시킨 AML12세포에서의 AKT 활성을 면역블롯으로 확인한 결과이다.
도 4f는 도 4c에서 보인 Pten 및 Sav1 발현 감소된 AML12 세포에 siRNA를 이용하여 Irs2의 발현 억제시킨 결과 AKT 활성화가 감소함을 면역블롯으로 분석한 결과이다.
도 4g는 TAZ4SA 또는 TAZ4SA/S51A을 과발현 시킨 AML12세포에서의 IRS2의 증가여부를 대조군 (CTL)과 비교한 면역블롯 결과이다.
도 4h는 Irs2의 프로모터 상단(distal promoter)과 첫 인트론 부위의 TEAD 부착부위를 포함하거나(TBSs) 또는 삭제된 부분(TBSsΔ)를 포함하는 루시퍼라제(Luc) 리포터 구조물의 모식도이다. Ex는 엑손을 나타낸다.
도 4i는 CTL, TAZ4SA 또는 TAZ4SA/S51A을 과발현시켰을때 도 4h에서 보여준 Luc의 발현양상을 루시퍼라제 리포터 분석한 결과이다.
도 4j는 TAZ가 도 4i에서 분석된 Irs2 프로모터 상단 또는 인트론에 결합하는지 여부에 대한 ChIP-qPCR 분석 결과를 나타낸 그림이다. AML12 세포에서 컨트롤 또는 TAZ4SA를 과발현시킨후 후 TAZ 또는 IgG를 인식하는 항체를 이용해 면역침강 후 qPCR을 진행하였다.
도 5a는 각 유전자형의 1개월 된 마우스의 간을 H&E 염색 또는 Oil red O 염색한 결과이다. 스케일 바는 100um(위), 50um(아래)를 나타낸다.
도 5b는 IRS2/AKT 신호전달 회로및 YAP/TAZ 신호전달 회로의 면역블롯 결과를 보여준다.
도 5c는 도 5a에 나타낸 마우스의 간에서 상대적 Irs2 mRNA양을 qPCR 분석한 결과이다.
도 6a는 육안으로 관찰한 2달된 Pten-/-, Pten-/- MSTWTTg 마우스의 간이다.
도 6b는 도 6a에 나타낸 마우스 간의 H&E 염색과 Oil red O 염색, TAZ 및 YAP IHC 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바는 50um(위 2행), 100um(아래 2행)이다.
도 6c는 도 6a에 나타낸 마우스 간을 면역블롯 분석한 결과이다. 대조군으로 b-actin을 사용했다.
도 7a는 간암(HCC), 간경화 또는 간경화와 HCC를 모두 동반한 환자 조직에서mRNA를 얻어 IRS2대 TAZ 또는 YAP1을 log2 값으로 하여 그린 산포도이다.
도 7b는 도 7a와 같은 시료에서 IRS2 대 CTGF 또는 CYR61 값으로 같은 방식으로 산포도를 그린 것이다.
도 7c는 HCC 환자의 시료에서 TAZ와 IRS2의 면역조직화학염색 결과이다. χ2 테스트를 이용해 각 발현량을 비교하였다. 스케일 바는 100um를 나타낸다. ND는 탐지되지 않았음을 의미한다.
도 7d는 HCC 환자의 시료에서 YAP와 IRS2의 면역조직화학염색 결과를 보인다. χ2 테스트를 이용해 각 발현량을 비교하였다. 스케일 바는 100um를 나타낸다. ND는 탐지되지 않았음을 의미한다.
도 7e는 NAFLD와 관련 있는 HCC 환자 시료를 NAFLD와 관련 없는(non-NAFLD) HCC 환자의 것과 비교했을 때, 전자에서 TAZ, YAP, IRS2, 및 p-AKT 발현양이 증가함을 보여준 것이다. 스케일 바는 50um이다.
도 7f는 도 7e의 결과를 정량화한 그래프이다.
도 8a는 3주된 DKO마우스를 2주간 MK-2206 또는 위약(대조군)으로 치료하는 실험 디자인이다. 육안 관찰 결과뿐 아니라 H&E, Oil red O 염색 결과를 나타내었다. 스케일 바는 50um를 나타낸다.
도 8b는 대조군과 MK-2206에서, 체중에 대비 간 무게의 비율을 백분율로 나타낸 그래프이다.
도 8c는 대조군과 MK-2206에서, 혈청 내 간 효소 분석 결과를 표시한 그래프이다.
도 8d는 대조군(흰색 막대)과 MK-2206(붉은 색 막대)에서, 간에서의 지질합성 관련 유전자의 발현을 qPCR로 분석한 결과 그래프이다.
도 8e는 12주 된 DKO마우스를 2주간 MK-2206 또는 위약으로 치료하는 실험 디자인(상)과 그 결과 육안으로 관찰되는 간(하)을 나타내었다. 검정색 화살표는 종양 결절을 표시한다.
도 8f는 도8e에서 나타낸 실험을 통해 체중 대비 간 무게의 비율(F), 간 종양의 수와 크기(G), 혈청 분석(H)한 결과이다. Chol은 콜레스테롤(Cholesterol), TG는 트리글리세라이드(triglycerides)를 의미한다.
도 8g는 H&E, Picrosirius red, Ki-67, 그리고 TAZ 면역조직화학 염색법을 수행한 결과이다. 스케일 바는 위로부터 각각 300, 400, 100, 100um이다.
도 8h는 도 8g의 방법으로 실험한 샘플의 Ki-67+ 간세포의 정량분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8i는 도 8e에서 실험한 샘플의 섬유증(Acta2, Desmin, Tgfb), 세포사멸 또는 상해(Hmox1, Gadd153) 또는 염증(Tnfa) 관련 유전자의 각 발현을 qPCR 분석한 그래프이다.
도 9a는 Cas9과 IRS2에 대한 sgRNA(sgIrs2)를 코딩하는 AAV 바이러스를 5주 된 DKO마우스에 주입한 후 7주 후에 분석한 결과이다. 간의 육안 사진에서 검정색 화살표는 종양 결절을 나타낸다.
도 9b는 도 9a 실험의 면역블롯 결과 그림이다.
도 9c는 상기 도 9a 실험의 체중 대비 간 무게의 비율과(좌) 간종양의 수와 크기를(우) 나타낸 그래프이다.
도 9d는 상기 도 9a 실험 결과 간을 H&E 염색한 결과이다. 배율은 x40이다.
도 10은 DKO(Pten-/-;Sav1-/-) 마우스의 간에서 Hippo/YAP/TAZ와 IRS2/AKT 신호의 양성 피드백 루프의 모식도이다. Hippo 신호전달 회로는 IRS2의 발현을 조절하면서 AKT 신호전달 회로와 교차하게 되고 이는 지방간 및 간암 발병을 억제하는데 작용한다.
도 11은 간 특이적 DKO 마우스에서 간 기능부전 발병이 가속화 된 모습을 보여준다. A는 간 특이적 DKO 마우스의 제작 방법을 도식화 한 것이다. B는 간세포암종(HCC)과 담관암(CC)이 동반된 DKO 마우스의 간을 H&E 염색한 것을 나타낸다. 스케일 바는 50um이다. C는 각 연령별 마우스의 간을 PAS, Sirius red, panCK 면역조직화학 염색 결과이다. 스케일 바는 PAS는 50um, Sirius red는 200um, panCK는 100um이다. D와 E는 성체 마우스에서 Pten과 Sav1을 짧은 기간동안 결손시킨 경우에도 지방간을 유발함을 보인다. D는 6주 된 Ptenf/f;Sav1f/f 마우스에게 CRE와 GFP(대조군)을 발현하는 아데노바이러스를 주입하여 그 간을 육안 관찰한 결과이고, E는 그 간을 H&E 염색한 결과이다.
도 12는 단기간 YAP 또는 TAZ를 증가시킨 경우 섬유증이나 염증 없는 지방간 발달이 촉진되는 것을 보여준다. 6주 된 야생형 또는 Pten-/- 마우스에게 GFP, TAZ4SA 또는 YAP5SA를 발현하는 아데노바이러스를 주입하고 4일 후의 체중 대비 간무게 비율을 나타낸 그래프는 A에, 간의 Sirius Red와 F4/80 면역형광 염색(초록색 형광) 결과는 B와 C에 각각 나타내었다. B와 C에서 핵은 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(4'6-diamidino-2-phenylindole, 푸른색 형광)로 염색했다. 스케일 바는 200um(위), 100um(아래)를 나타낸다.
도 13은 Pten-/-;Sav1-/-;Yap-/-;Taz-/- 뚜렷한 간섬유증의 발병을 보여준다. A는 Pten-/-;Sav1-/-;Yap-/-;Taz-/- 마우스의 제작 방법을 도식화 한 것이다. B는 1개월 된 각 마우스의 체중 대비 간무게 비율을 나타낸 것이고, C는 그 간을 Sirius red와 CK19 면역조직화학 염색한 결과이다. 스케일 바는 200um(위), 100um(아래)이고, 검정색 화살표는 담관(ducts)을 나타낸다. D는 각 마우스에서 추출한 혈청의 색을 나타낸다.
도 14는 Yap과 Taz 모두를 제거하면 담관의 이상발생(ductal malformation) 및 심한 섬유증을 유발함을 보인 그림이다. A는 1개월 된 야생형 또는 간 특이적 Yap-/-;Taz-/- 마우스의 간을 육안 관찰한 것이다. B는 혈청 색상을, C는 각 마우스의 체중 대비 간무게 비율을 나타낸다. D와 E는 혈청 분석 결과를 나타내고, F는 각 간을 H&E, Sirius red, CK19 면역조직화학 염색한 결과이다. 스케일 바는 위로부터 각각 100um, 200um, 100um를 의미한다. 화살표는 담관을 나타낸 것이다. G는 면역블롯 결과이다.
도 15는 MST1의 kinase-dead form을 과발현시킨 경우에 Pten-/- 마우스에서의 지방간 형성을 억제하지 못한다는 것을 보여준다. A는 Pten-/-;MSTwtTg 또는 Pten-/-;MSTkdTg 마우스의 제작 방법을 도식화 한 것이다. B는 2개월 된 각 마우스에서의 체중 대비 간무게 비율을 나타낸다. C는 각 간의 육안 관찰 형태를 보여주며 D는 간에서 면역블롯 분석한 결과를 나타낸다.
도 16은 NAFLD로부터 유래된 HCC와 그렇지 않은 HCC 사이에서 TAZ, YAP, IRS2 및 pAKT(S473) 단백질량을 면역조직화학 염색 강도로 비교한 것이다. A는 NAFLD로부터 유래된 HCC와 그렇지 않은 HCC 시료에서의 TAZ, YAP, IRS2, pAKT(S473)의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다. B는 위 시료에서의 TAZ, YAP, IRS2, pAKT의 면역조직화학 신호 강도를 정량한 것이다. 발현이 없을시 -, 낮은 발현은 +, 중간 발현은 ++, 높은 발현은 +++로 나타냈다. C는 각 시료에서 TAZ, YAP, IRS2, pAK의 염색 강도를 정량하여 나타낸 시료의 수이다.
도 17은 DKO 마우스의 간에서 MK-2206을 처리한 효과를 보여준다. A는 3주 된 마우스에 MK-2206 또는 위약을 2주간 처리한 후 Sirius red 염색을 한 결과이다. 스케일 바는 200um이다. B는 12주 된 DKO 마우스에 2주간 MK-2206 또는 위약을 투여한 후 YAP 염색한 결과이다. 스케일 바는 100um를 나타낸다.
이하 본 발명을 참고예 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
<참고예 1> 간특이적 녹아웃 마우스 및 형질전환 마우스 제작
(1) 간특이적 녹아웃 마우스 및 DKO 마우스의 제작
Sav1f/f(PNAS, May 4, 2010. 107 (18) 8248-8253), Ptenf/f(The journal of Clinical Investigation, 2004;113(12):1774-1783), Yapf/f(Science Signaling, 2011 Oct 25;4(196):ra70), Tazf/f(PNAS, August 20, 2013. 110(34) 13839-13844), MSTwtTg, 및 MSTkdTg(PLoS One. 2009 Nov 24;4(11):e8011) 마우스는 표시된 논문에 기재된 방법에 의해 제작되었다. 상기 마우스를 교배시켜 원하는 유전자형의 마우스를 얻었다.
예를 들어, DKO(PTEN-/-, Sav1-/-) 마우스는 Ptenf/f;Albumin-Cre 마우스와 Sav1f/f 의 교배로 통해 얻는 첫 세대 (Ptenf/+;Sav1f/+;Albumin-Cre와 Ptenf/+;Sav1f/+)간의 교배를 통해서 얻은 두번째 세대에서 Ptenf/f;Sav1f/f;Albumin-Cre 를 획득하여 이를 DKO으로 이용하였다. 이때, 모든 실험은 수컷마우스만을 이용하였으며, 이 유전형을 갖고 있는 마우스는 100%로 간질환 표현형을 갖고 있었다.
각 마우스는 표 1에 나열된 프라이머(마우스 유전자형 확인)를 이용한 PCR 분석을 통해 유전자형을 확인하였다.
(2) 형질전환 마우스의 제작
마우스의 간에서 CRE, YAP5SA, TAZ4SA, 또는 GFP (대조군) 및 AAV-saCas9-sgIrs2 또는 sgCt1의 과발현을 위한 아데노바이러스 또는 AAV를 각각 6 주 및 5 주된 생쥐의 꼬리 정맥에 주입 하였다. 마우스는 분석을 위해 아데노바이러스 주사 후 4 일 (YAP5SA, TAZ4SA 및 GFP) 또는 4 주 (CRE 및 GFP) 후에 살처분되었으며, 살처분 전 16 시간 동안 금식했다. 30 % Captisol (Cydex, RC-0C7)를 이용하여 MK-2206 (Selleckchem, S1078)을 녹여서 준비하고 3 주 또는 12 주의 DKO 마우스에 2 주 간격으로 66mg/kg의 양을 복강 투여하였다.
RT-qPCR
유전자 센스 서열
번호		 안티센스 서열
번호
Srebp1a 5'-GGCCGAGATGTGCGAACT-3' 1 5'-TTGTTGATGAGCTGGAGCATGT-3' 2
Srebp1c 5'-GGAGCCATGGATTGCACATT-3' 3 5'-CAGGAAGGCTTCCAGAGAGG-3' 4
Srebp2 5'-GCGTTCTGGAGACCATGGA-3' 5 5'-ACAAAGTTGCTCTGAAAACAAATCA-3' 6
Fasn 5'-GCCTACACCCAGAGCTACCG-3' 7 5'-GCCATGGTACTTGGCCTTG-3' 8
Acc1 5'-CAACGAGATTTCACTGTGGCT-3' 9 5'-TTCTGCATTGGCTTTAAGGTCT-3' 10
Scd1 5-CCGGAGACCCCTTAGATCGA-3' 11 5'-TAGCCTGTAAAGATTTCTGCAAACC-3' 12
Tnfa 5'-CATCTTCTCAAAATTCGAGT-3' 13 5'-TGGGAGTGACAAGGTACAA-3' 14
Il6 5'-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3' 15 5'-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3' 16
Irs2 5'-CAAGAGCCCTGGCGAGTACA-3' 17 5'-CCGCGGATGCCAGTAGTG-3' 18
Acta2 5'-ATGCTCCCAGGGCTGTTTTCCCAT-3' 19 5'-GTGGTGCCAGATCTTTTCCATGTCG-3' 20
Desmin 5'-CTAAAGGATGAGATGGCCCG-3' 21 5'-GAAGGTCTGGATAGGAAGGTTG-3' 22
Tgfb 5'-CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3' 23 5'-GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3' 24
Hmox1 5'-GCTCGAATGAACACTCTGG-3' 25 5'-GTTCCTCTGTCAGCATCAC-3' 26
Gadd 153 5'-CTGGAAGCCTGGTATGAGGAT-3' 27 5'-CAGGGTCAAGAGTAGTGAAGGT-3' 28
루시퍼라제리포터구조물
구역 센스 서열
번호		 안티센스 서열
번호
TBS1 5'-CTTATCTGGCAGCAGGAAGGAGAG-3' 29 5'-CACACCCTCGCACACATATCCCTC-3' 30
TBS2 5'-CACCCTTGCACACGTAGAGACGCT-3' 31 5'-ACCGTGTTCACCCAGCACCCGGG-3' 32
TBS3 5'-CCTGGCAGTGTCCCATAGTTGA-3' 33 5'-CAGCTGCTGCTTCTTTAGGGG-3' 34
TBS4 5'-GCAGCAGCTGAAGTGCTAAAGA-3' 35 5'-GCTGCTTTCCTCTCATTGCTC-3' 36
TBS5 5'-GCCTCTGAGCCAACATCTCTCT-3' 37 5'-TATGACCTCCCACCCACTTCA-3' 38
TBS6 5'-CATGGCTCGTTTCTCCTTCTGG-3' 39 5'-GAGTACTCAGGCCCAGGATGC-3' 40
ChIP-qPCR
구역 센스 서열
번호		 안티센스 서열
번호
TBS1 5'-ATCTATGGTCTTCAGAATCACAC-3' 41 5'-CCAGAGTTTATCTTACAATTTAACCT-3' 42
TBS2 5'-CACAGTTTACACAAAGGGTAAAGCA-3' 43 5'-GCTCTGGATGCGTAAACAAAACA-3' 44
TBS4 5'-GCAGCAGTTGATTCCCATCCT-3' 45 5'-ACAATGGGGCAGGGAAGGTA-3' 46
TBS5 5'-GTAAAACCCAGAAACCCCACTTTC-3' 47 5'-TGCTCTGCTTCTCTCACTAGGA-3' 48
마우스유전자형확인
유전자 센스 서열
번호		 안티센스 서열
번호
Sav1 5'-TGGTTTGCTTTTTAGTGGCC-3' 49 5'-TGCTGGTTTTGTCTCACTAA-3' 50
Pten 5'-CTCCTCTACTCCATTCTTCCC-3' 51 5'-ACTCCCACCAATGAACAAAC-3' 52
Yap1 5'-ACATGTAGGTCTGCATGCCAGAGGAGG-3' 53 5'-AGGCTGAGACAGGAGGATCTCTGTGAG-3' 54
Taz 5'-GGCTTGTGACAAAGAACCTGGGGCTATCTGAG-3' 55 5'-CCCACAGTTAAATGCTTCTCCCAAGACTGGG-3' 56
Cre 5'-GTGTTGCCGCGCCATCTGC-3' 57 5'-CACCATTGCCCCTGTTTCACTATC-3' 58
MSTTg 5'-GCTCTAGAGCCTCTGCTAACCA-3' 59 5'-CCAGGGACCAGATGTCTGC-3' 60
아데노바이러스
구역 센스 서열
번호		 안티센스 서열
번호
Ex1-1 5'-CACCGATCGCCCTCTACACCAAGG-3' 61 5'-AAACCCTTGGTGTAGAGGGCGATC-3' 62
Ex1-2 5'-CACCGCCGCCGCAGCCTCCGCGGC-3' 63 5'-AAACGCCGCGGAGGCTGCGGCGGC-3' 64
<참고예 2> 조직학, 면역염색 및 TUNEL 염색
면역조직화학염색을 위해 4 um 두께의 간절편이 올려진 슬라이드를 연속 자일렌과 에탄올로 재수화한 후, 열 유도 항원 회복(heat-induced antigen retrieval) (10 mM Sodium Citrate (Duchefa), pH 6.0) 을 시행하였다. Anti-IRS2 항체로 염색 된 슬라이드에 대해서는 항원 회복 단계를 생략했다. 블로킹은 pAKT 항체에 대해서는 0.3 % BSA이 포함된 PBS로, 다른 모든 항체에 대해서는 0.3 % Triton-X를 포함하는 3 % BSA와 5 % 염소 혈청으로 수행 하였다. 세포내 퍼옥시다아제를 과산화수소(Merck)로 무력화시킨 후, 시료를 1 차 항체가 들어있는 블로킹 용액으로 반응시켰다. HRP-결합 항 토끼 이차 항체(Jackson Immunoresearch, 1 : 500)로 반응한 후, 항원 검출을 위해 DAB(Vector laboratories)를 첨가하였다. 마지막으로 슬라이드를 헤마톡실린으로 핵을 염색하였다. 면역 조직 화학 염색 및 면역 조직 형광 염색에 사용 된 항체는 Ser473-인산화 AKT (Cell Signaling, 4060), TAZ (Sigma, HPA007415), YAP (Cell signaling, 4912), Ki-67 (Abcam, 16667), panCK (Dako (Abcam, 105155), PIP3 (Echelon, Z-P345) 및 IRS2 (Abcam, 84906)를 포함한다. Oil Red O 염색을 위해 차가운 10 %(v/v) 포르말린으로 cryosection (두께 10 μm)을 고정하고 100 % 프로필렌글리콜 (Sigma, 398039)으로 탈수시킨 후 85 %(v/v) 프로필렌글리콜로 씻고 0.5 %(v/v) Oil Red O (Sigma, O0625)으로 지방 염색 및 Mayer의 헤마톡실린(Sigma, MHS1)으로 핵을 염색하였다. 시리우스 레드 (Sirius red)로 염색하는 것은 0.1 %(w/v) 다이렉트 레드 (Sigma, 365548) 및 0.1 %(w/v) 패스트 그린 (Sigma, F7252)이 포함된 픽크릭산 용액으로 수행 한 후 0.5 %(v/v) 아세트산에서 반응하였다. PAS 염색을 위해, 절편을 0.5 %(w/v)과요오드 산 (period acid)과 함께 시프 (Schiff) 시약 (시그마, 3952016)으로 반응 하였다. TUNEL은 In Situ Cell Death Detection Kit (Roche, 11 684 795 910)로 수행 하였다.
<참고예 3> 면역 블롯 분석
간 또는 AML12 세포 용해물은 각각 Proprep 버퍼 (Intron Biotechnology) 및 NETN 버퍼 (20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5 %(v/v) Nonidet P-40)로 용해된 산물이다. 핵/세포질 분획 분석을 위해 세포질 추출을 위해 냉동 간 조직을 용해 완충액 (10 mM HEPES pH 7.8, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM DTT 및 프로테아제 억제제)에 첨가 하였다. 막자로 조직을 간 후, 조직을 5 초 동안 볼텍싱 (vortexing)하여 0.3 %(v/v) NP-40과 혼합하고, 원심 분리 후 상층액으로부터 세포질 파편을 수득 하였다. PBS로 2 회 세척 후, 펠릿을 시료 완충액에서 끓여 핵 분획으로 사용 하였다. 면역 블롯 분석을 위한 일차 항체는 Cell signaling으로부터의 pAKT (S473, 4051), pAKT (T308, 4056), AKT2 (3063), pGSK3b (9336), pS6K (9205), FAS (3189), pACC (3661), PTEN (9559), MST1 (3682), pYAP (4911), YAP (4912), TAZ (4883), LATS2 (5888), pLATS (8654) 및 pERK (4376); MilliporeSigma의 IR (07-724), PI3K의 p85 서브 유닛 (06-195), IRS1 (06-248), IRS2 (06-506) 및 bActin (A5316); Abcam의 SREBP1 (28481), FAS (196854), ACC (45174) 및 GAPDH (125247); Santa Cruz Biotechnology의 LaminB (6217, M-20), CTGF (14939) 및 CYR61 (13100); Abfrontier의 α-Tubulin (LF-PA0146)를 포함한다. SAV1 특이적 항체는 본 실험실에서 제작하였다.
<참고예 4> 아데노바이러스와 AAV 준비
CRE, 인간유래의 TAZ4SA 및 YAP5SA의 cDNA를 pAdtrack-CMV-GFP 벡터에 각각 클로닝하였다. 생성된 벡터를 pAdEasy-1 벡터가 들어있는 BJ5183-AD-1 컴피턴트세포 (Agilent, 240005, 200157)내에서 둘을 재조합시켰다. 재조합 DNA를 PacI로 선형화하고 폴리에틸렌이민 (Polyscience, 23966)으로 293AD 세포에 도입 하였다. GFP 발현 여부 검사 후, 원심 분리기로 세포 펠렛을 얻고 10 %(v/v) 글리세롤 PBS로 재현탁하여 4회 냉동-해동주기 (LN2 및 37 °C 수조)를 거쳐 세포를 용해했다. 아데노바이러스 증폭을 위해 세포 수를 증가시키며 이 단계를 반복했다. 아데노바이러스는 10 mM HEPES(Sigma)에서 2.2-4.0 M CsCl (Amresco)의 다른 농도 구배에서 4
Figure 112019062364814-pat00001
에서 2 시간 동안 25,000 x rpm으로 원심분리하여 최종 정제하였다. 아데노바이러스 함유층을 주삿바늘로 분리하고, Amicon 울트라 원심 필터 (Millipore, UFC810024)를 이용하여 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 2 mM MgCl2를 함유하는 용액에서 바이러스를 2 회 세척 하였다. 바이러스 적정은 형광 현미경으로 GFP 양성인 293AD 또는 타겟세포를 계수하여 수행 하였다. 1 Υ 109 ~ 1 Υ 1010 pfu 의 바이러스를 꼬리 정맥 주사에 사용 하였다. Irs2에 대한 인코딩 saCas9-sgRNA를 발현하는 AAV를 생성하기 위해, Addgene (plasmid # 61593)로부터 pX602-AAV-TBG :: NLS-SaCas9-NLS-HA-OLLAS-bGHpA 벡터 (U6 :: BsaI- 39)를 구입하였다. AAV 생성, 농축 및 정제를 위한 단계는 Nature, v.520, p.186-191dp 기재된 방법과 동일하게 수행하였다. AAV의 2 Υ 1010 내지 2 Υ 1011 게놈 카피를 생후 5 주된 마우스 꼬리 정맥 주사에 사용하여 7 주 후에 분석하였다. sgIrs2의 올리고 서열을 표 1에 나타내었다.
<참고예 5> 안정적인 녹다운 또는 과발현 세포주의 제작
녹다운을 위해, plko.1 벡터를 EcoRI 및 AgeI로 절단하고, SAV1 또는 PTEN shRNAs (각각 5'-CCGGCGGCTACATCTCTAGGGAATTCTCGAGAATTCCCTAGAGATGTAGCCGTTTTT-3 ' (서열번호 65), 및 5'-CCGGCAACCGATACTTCTCTCCAAACTCGAGTTTGGAGAGAAGTATCGGTTGTTTTT-3'(서열번호 66))를 암호화하는 어닐링된 올리고뉴클레오티드와 연결하였다. shRNA 구조물을 psPAX2 및 pMD2G와 함께 293T 세포에 형질전환시켰다. 2일 후, 바이러스 입자를 배양 배지로부터 수확한 후 여과하였다. 그런 후 바이러스를 polybrene(6μg/ml) (Sigma, H9268)을 이용하여 AML12 세포에 감염시켰으며, 바이러스에 감염된 세포주 분리는 10μg/ml 퓨로마이신(Gibco, A11138-03) 또는 50μg/ml 하이그로마이신 B (Thermo, 10687010)을 이용하였다. IRS2, TAZ4SA, TAZ4SA/S51A 또는 YAP5SA 발현하는 AML12 세포를 생성하기 위해, 인간 IRS2 cDNA (MRC PPU Reagents), TAZ4SA, TAZ4SA/S51A 또는 YAP5SA를 pMSCV-puro 벡터에 각각 클로닝하였다. 그 후 위 결과물을 사용하여 레트로바이러스를 제조한 후 타겟세포에 감염시킨 후, 감염된 세포의 선별을 위해 퓨로마이신을 이용하였다.
<참고예 6> siRNA 를 이용한 AML12 세포에서의 IRS2 녹다운
shPten 및 shSav1을 안정하게 발현하는 AML12 세포주를 제조사의 프로토컬에 따라 RNAiMAX (Invitrogen, 13778-150)를 사용하여 20 nM siRNA (ST Pharm oligo center)로 형질 감염시켰다. 이틀 후에, 세포는 혈청이 제거된 미디어에 16 시간 동안 배양 후, 지시 된 시간 동안 100nM 인슐린을 처리하였다. 올리고 서열 정보는 Calvin J Kuo (Kevin Wei et al., Nature Medicine, 2013;19(10):1331-1337)로부터 제공받았다. AML12 세포주를 ATCC에서 구입하여 10 %(w/v) 소 태아 혈청 (Gibco, 12483020), 1 %(w/v) 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco, 15140122), 0.005mg/ml 인슐린(Gibco, 12100046), 0.005mg/ml 트랜스페린 (Sigma T8158), 5ng/ml 셀레늄 (Sigma, S5261) 및 40 ng/ml 덱사메타 존 (Sigma, D4902) CO2를 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium으로 배양하였고 습도 조절 환경 (온도37℃ 습도 5%)에서 유지되었다. Mycoplasma PCR 검출 키트 (Intron, 25233)를 사용, 세포주에 마이코플라스마가 없는 것을 확인했다.
<참고예 7> 루시퍼라제 분석
6 개의 잠재적 TEAD 결합 부위(TBS)를 포함한 Irs2 게놈 유전자 위치의 표시된 부분을 pGL3-베이직 벡터(Promega)에 클로닝하였다. 각각의 돌연변이체는 특정 TBS의 결손로 생성되었다. 293T 세포를 Renilla 플라스미드, TEAD- 암호화 플라스미드 및 constructs of interest로 함께 형질전환시켰다. 24시간 후, 세포를 수거하고, 용해시키고, Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega, E1960)으로 분석하였다.
<참고예 8> ChIP-qPCR 분석
레트로바이러스 감염 2일 후, AML12 세포를 1%(v/v) 포름알데히드로 10분간 고정시킨 후 실온에서 5분간 125 mM 글리신으로 중화시켰다. 세포를 인산염 완충 식염수로 세척한 후, 1%(w/v) SDS를 함유한 ChIP 희석 완충액(50mM HEPES (pH 7.5), 155mM NaCl, 1%(v/v) Triton X-100, 0.1% 나트륨디옥시콜레이트, 1mM EDTA)으로 용해시켰다. 세포 용해물의 DNA는 bioruptor sonicator를 사용하여 초음파 처리하여 해리시켰다. 세포 용해물을 4°C에서 13000rpm으로 15분간 원심 분리하고 상등액을 ChIP dilution buffer로 희석하였다. 그런 후 TAZ 항체 (Sigma, HPA007415) 또는 IgG (Santa Cruz Biotechnology)와 함께 4°C에서 밤새 반응했다. 다음날, 단백질 A/G 비드 (Gendepot)를 첨가하고 샘플을 3 시간 동안 추가로 반응했다. 이어서, 비드를 원심 분리하고, ChIP 세척 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 250 mM LiCl, 0.5 %(w/v) Nonidet P-40, 0.5 %(w/v) 나트륨 디옥시 콜레이트, 1 mM EDTA)으로 세척하고 SDS 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 1 %(w/v) SDS)으로 65
Figure 112019062364814-pat00002
에서 밤새 반응 하였다. 그 후 비드를 제거하고 남아있는 물질을 protenase K (20mg/ml) 및 글리코겐 (20mg/ml)과 함께 55
Figure 112019062364814-pat00003
에서 2 시간 동안 배양했다. 37
Figure 112019062364814-pat00004
에서 RNaseA와 함께 마지막 1 시간 배양한 후, 표준 과정을 사용하여 DN를 정제하고 표 1에 나열된 프라이머를 사용하여 qPCR로 분석하였다.
<참고예 9> 유전자 발현 프로파일링과 GSEA
간에서 mRNA를 Ribo-EX(GeneAll)로 추출하고 MouseRef-8 v2.0 칩 (Illumina)으로 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 차별적으로 발현된 유전자를 확인하기 위해, 모든 쥐 군의 원시값을 각 유전자 세트의 평균값으로 정규화하고 log2- 형질 전환시켰다. 히트맵의 경우 25,697개의 유전자 값이 Pten-/-; Sav1-/- 표본의 평균값에 따라 순위가 매겨졌으며 상위 500개 및 하위 값 500개가 선택되었다. Multi-Experiment Viewer 프로그램을 사용하여 히트맵을 작성하고, Broad Institute의 signature database(MSigDB)로부터 GO_Insulin 수용체 신호 전달 경로, KEGG_Insulin 신호 전달 경로, GO_Glucose 항상성, 탄수화물의 Reactom_Mababolism 또는 Cordenonsi_YAP conserved signature gene cluster의 대표 유전자를 선별했다. Gene set enrichment analysis(GSEA)는 Broad Institute의 GenePattern 도구를 사용하여 분자 DNA 데이터베이스 라이브러리 버전 5.2 (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)를 사용하여 수행했다. Pten-/-; Sav1-/- 마우스를 Pten-/- 마우스와 비교하였고, 명목 P 값이 0.05 미만이고 발견 확률이 q <0.25 인 대표적인 상향 조절 유전자를 제시하였다.
<참고예 10> 통계
마우스 간의 개체차로 인해 모든 실험 (예 : 면역 검사, RT-qPCR, H&E 염색, Oil Red O 염색, Sirius Red 염색, 면역조직화학염색 등)에 대해 그룹당 적어도 3-5 마리의 마우스를 사용했다. 마이크로어레이 분석에는 그룹당 2마리의 마우스만을 사용했다. 그룹 크기는 이전의 연구에 따라 결정되었으며, 제외된 마우스는 없다. 간 특이적 돌연변이 마우스와 야생형 마우스의 비교를 위해 모든 실험에서 한배 새끼를 사용했다. 마우스 실험은 무작위 추출되지 않았다. H&E 염색 실험 및 마이크로어레이 분석은 마우스 유전자형 정보에 대해 알지 못하는 연구자에 의해 수행되었다. 모든 데이터는 각 통계 테스트의 가정을 충족했으며 그룹 간의 변화는 유사했다. 모든 시험관내 실험은 5회 반복된 루시퍼라제 분석을 제외하고 모두 3회 반복되었다. 데이터는 평균값± s.e.m.로 나타냈고 일원분산분석 직후 다중 비교를 위한 Tukey's test, two-tailed Student's t test 혹은 chi-square test로 적절히 분석되었다. P <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다. 모든 그래프는 Grahpad Prism 7로 제작했다.
실시예 1: 간에서 Pten과 Sav1의 결실에 의한 NAFLD, NASH 및 Tumorigenesis 촉진
생체 내에서 Hippo 및 AKT 경로 간의 상호작용 여부를 조사하기 위해, 본 발명자는 먼저 참고예 1에 기재된 방법으로 간 특이적 PTEN 및 SAV1 더블 녹아웃 (PTEN-/-Sav1-/-, DKO) 마우스를 제작하였다(도 11, A). 도 11에 상기 더블 녹아웃 마우스(DKO) 제작 방법(A), 간세포암종(HCC)과 담관암(CC)이 동반된 DKO 마우스의 간의 H&E 염색 결과(B), 각 연령별 마우스의 간을 PAS, Sirius red, panCK 면역조직화학 염색 결과(C), 6주 된 Ptenf/f;Sav1f/f 마우스에서 CRE와 GFP(대조군)을 발현하는 아데노바이러스를 주입하여 Pten과 Sav1을 짧은 기간동안 결손시킨 경우에도 지방간을 유발함을 보인, 육안 관찰 결과(D), 및 H&E 염색 결과를 나타내었다. 상기 제작된 마우스 모델의 수정란을 대한민국 전라북도 정읍시 입신길 101(신정도)에 주소를 둔 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 2018년 5월 9일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC 13522BP을 받았다.
도 1a에 각 유전자형의 5개월 된 마우스의 간을 나타내었다. 이전의 연구와 마찬가지로, SAV1 결핍(Sav1f/f;Albumin-Cre, or Sav1-/-) 마우스는 간의 크기가 다소 증가한 반면, PTEN 결핍 (Ptenf/f;Albumin-Cre, or Pten-/-) 마우스에서는 지방간이 발생했다(도 1a). 하지만, DKO 마우스는 생후 2개월에서 4개월에 확연히 간 중량이 증가하여, 5개월에 고도로 진행된 간 종양을 보였다(도 1a). 도 1b에는 각 유전자형의 시간에 따른 종양 발생률과 생존율을 그래프로 나타냈다. Sav1-/- 또는 Pten-/-마우스가 50-60 주에 간 종양이 나타난 반면, 모든 DKO 마우스는 15 주 내에 종양이 발생하였다 (도 1b). 따라서 DKO 마우스는 현저하게 종양 발생이 촉진되어 생존율이 감소한다 (도 1b). 또한 Pten-/- 마우스는 주로 HCC로 진행되지만, Sav1-/- 마우스와 DKO 마우스는 HCC와 CC를 모두 동반한 종양으로 진행된다 (도 11).
Pten-/- 간암이 NAFLD와 NASH를 통해 진행되는 점을 고려하여, 종양이 발생하기 전 간의 표현형 변화를 관찰했다. 도 1c에 각 유전자형의 연령별 조직 염색 결과를 나타내었다. 1개월 된 DKO 간은 과도한 지방산 축적(Oil Red O)을 나타내며, 이는 NAFLD 표현형을 의미한다. 그러나 Pten-/- 간에서는 3 개월(H&E)이 되어서야 이 표현형이 나타난다 (도 1c, 1 및 3번 레인).
CRE를 발현하는 아데노 바이러스를 사용하여 성체에서 Pten과 Sav1을 결실시켰을 때에도 역시 NAFLD의 발생으로 이어진다(도 11). 또한 DKO 간은 생후 1 개월(도 1c, 2번 레인)에 글리코겐 (PAS)의 과도한 축적을 보이고, 시간이 갈수록 점차적으로 악화된다(도 11). 또한 3개월 된 DKO 간은 세포 사멸(TUNEL)과 대식세포 축적 (F4/80)을 나타낸다 (도 1c, lane 5와 6, 도 11의 G). 이들은 더욱 진행된 형태의 NAFLD (H&E) 표현형과 간섬유증(Sirius red)을 (도 1c, lane 3과 4) 보이며, NASH 로의 진행을 의미한다.
도 1d에는 2개월 및 4개월 된 마우스의 체중 대비 간의 무게 비율(왼쪽), 각 유전자형을 가진 마우스의 혈청 내 간 효소(AST 및 ALT) (오른쪽 위), 위 TUNEL과 F4/80염색 샘플의 사멸세포 및 대식세포의 정량분석 결과 그래프(오른쪽 아래)를 나타내었다. 3개월령 DKO 마우스는 혈청 내 AST와 ALT가 현저히 증가한 수준을 보임은 물론(도 1d), 5개월령 마우스의 비담관부분(non-ductal regions)에서 panCK-양성을 보이는 간 전구세포의 증가(도 11)를 보였다. 종합적으로, 이러한 결과는 Pten-/- 간에서 보이는 NAFLD, NASH, 간경화를 거쳐 암으로 진행되는 과정이 Sav1의 결손으로 인해 촉진된다는 것을 나타낸다. 따라서 본 연구진은 NAFLD의 발생으로부터 간 종양 형성이 유발되므로, NAFLD의 발생에 초점을 맞추기로 하였다.
실시예 2: 증가된 AKT 신호 전달은 Pten-/-;Sav1-/- 마우스에서 지방간의 발생을 촉진
본 발명자는 DKO 생쥐에 대한 유전자 발현 프로파일링 실험을 참고예 9에 기재된 방법으로 수행하여 초기 NAFLD 발달의 기전을 탐구했다. 그 결과로서 도 2a에 3개월 된 마우스 간에서의 마이크로어레이 분석 결과 발현량 차이를 보인 유전자들의 히트맵을 나타내었다. DKO 간은 인슐린 시그널링과 관련된 유전자(즉, Pdk4, Igfbp1 및 Irs2)의 발현 증가 및 탄수화물 또는 포도당 대사와 관련된 유전자(즉, Pygb, Slc2a2, Pklr 및 Aacs)의 발현 감소를 나타내었다 (도 2a). Pten-/- 간과 비교하여 DKO 간 조직의 유전자 세트 농축 분석(Gene set enrichment analysis; GSEA)을 참고예 9에 기재된 방법으로 수행한 결과를 도 2b에 나타내었다. 본 발명자는 IRS 표적과 스테로이드 생합성, 지질 생합성 및 지방산 대사와 관련된 유전자 집합을 포함하여 지방 생성 및 인슐린 신호 전달과 관련된 유전자 표지의 농축을 발견했다(도 2b 및 표 2).
Pten-/-;Sav1-/-에서 상향조절 된 유전자 ES NOM (P value) FDR (q value) Collection
TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB 2.72 0 0 Hallmark
ACYL_COA_METABOLIC_PROCESS 2.49 0 0.029 C5.BP:GO
STEROID_BIOSYNTHETIC_PROCESS 2.43 0 0.039 C5.BP:GO
GUO_TARGETS_OF_IRS1_AND_IRS2 2.37 0 0.015 C2.CGP
LIPID_BIOSYNTHETIC_PROCESS 2.34 0 0.058 C5.BP:GO
REGULATION_OF_CELL_GROWTH 2.29 0.004 0.069 C5.BP:GO
REGULATION_OF_TOR_SIGNALING 2.29 0 0.067 C5.BP:GO
AKT_UP.V1_UP 2.26 0.006 0.042 C6:OS
FATTY_ACID_METABOLIC_PROCESS 2.09 0.002 0.119 C5.BP:GO
LIPID_HOMEOSTASIS 2.00 0.010 0.165 C5.BP:GO
PHOSPHATIDYLINOSITOL_3_PHOSPHATE_BINDING 1.85 0.023 0.244 C5.MF:GO
CHOLESTEROL_HOMEOSTASIS 1.82 0.013 0.035 Hallmark
IL6_JAK_STAT3_SIGNALING 1.69 0.029 0.060 Hallmark
CORDENONSI_YAP_CONSERVED_SIGNATURE 1.58 0.042 0.243 C6:OS
이러한 관찰을 바탕으로, 본 발명자는 DKO 마우스에서 관찰된 간 대사의 조절 장애에서 AKT가 중요 인자로 작용하는지 여부를 연구했다.
도 2c에 3개월 된 마우스의 간에서 AKT 신호전달 경로의 구성요소와 지질합성 관련 단백질의 면역블롯 분석 결과를 나타내었다. 예상대로, Pten 결손은 AKT의 활성화를 유도함을 pAKT농도의 증가로 입증하였다(도 2c). 놀랍게도, DKO 간은 Pten-/- 간보다 더 큰 AKT 활성화를 보여 주었다. 하지만, Sav1-/- 간과 WT 간은 그러한 AKT 활성화를 보이지 않는데, PTEN의 존재 때문이다(도 2c). 이 결과와 일치하여, DKO 간은 또한 글리코겐 신타아제 키나아제 3 베타 (glycogen synthase kinase 3 beta; pGSK3b)의 인산화 증가, SREBP1c의 프로세싱 증가 및 FAS 및 ACC의 상향 조절을 포함하여, Pten-/- 간보다 AKT 신호 전달 하류의 더 큰 증가를 나타낸다 (도 2c). DKO 간에서의 pGSK3b 증가는 글리코겐의 과도한 축적과도 일치한다 (도 1c, PAS 염색).
도 2d에서 3개월 된 마우스 간의 p-AKT 면역조직화학염색 및 PiP3의 면역형광염색 결과를 나타내었다. 면역조직화학염색법을 통해 DKO 간세포에서는 pAKT와 PIP3가 증가함을 관찰하였지만 담관 세포나 침윤된 면역 세포(infiltrating immune cells)에서는 증가하지 않았다(도 2d). 이것은 DKO 생쥐에서 간 대사의 조절 장애가 간세포의 내부 신호전달 이상임을 시사한다.
도 2e에서 3개월 된 마우스의 지질합성 관련 또는 염증 관련 유전자의 상대적 mRNA양을 qPCR 분석하여 나타내었다. DKO 간은 지방 형성 관련 유전자 (즉, Fasn, Acc1 및 Scd1) 및 SREBP 계통 유전자 (즉, Srebp1a, Srebp1c 및 Srebp2)의 발현 증가를 보인다(도 2e). 또한 인터루킨 6(Il6) 및 종양 괴사 인자 알파(Tnfa)와 같은 염증 관련 유전자의 발현이 증가하여 만성 NAFLD인 NASH 로의 진행을 시사한다 (도 2e). 요약하면, DKO 간은 AKT 활성 증가로 인한 간세포내 지방 형성, glycogenesis 및 염증현상을 보인다.
실시예 3 : YAP/TAZ는 PTEN이 없는 상태에서 AKT 활성화 및 지방간의 진행을 향상
DKO 간에서 관찰된 강화된 AKT 활성화의 기전을 확인하기 위해 다양한 Hippo 경로 구성 요소의 상태를 연구했다. 도 3a에 각 유전자형의 3개월 된 마우스의 간에서 Hippo 회로 구성요소를 면역블롯한 결과를 나타내었다.
LATS의 상류 조절제로서의 SAV1이 결핍된 간 (Sav1-/- 및 DKO 마우스 모두)은 감소된 LATS 활성 (pLATS)을 나타내며 이는 또한 증가된 YAP과 감소된 pYAP의 결과로 이어진다 (도 3a). Pten-/-와 Sav1-/- 마우스 모두 WT에 비해 TAZ 수치가 증가하지만 DKO 마우스의 TAZ 증가폭이 더 크다 (도 3a).
도 3b는 YAP/TAZ의 면역조직화학염색 결과이다. 면역조직화학염색법을 이용하여 본 발명자는 DKO 간에서 YAP와 TAZ의 증가 된 수준을 확인했다 (도 3b).
도 3c에는 도 3b에서 나타난 YAP/TAZ 위치를 정량 분석한 결과를, 도 3d에는 1개월 된 마우스 간에서 핵과 세포질을 분획한 후 YAP과 TAZ의 발현 결과를 나타내었다. 흥미롭게도, 다른 그룹에 비해 DKO 마우스 간세포에서, YAP은 주로 핵에서만 높은 수준의 발현을 보였고, TAZ는 세포질과 핵 모두에서 풍부한 발현을 보였다(도 3c 및 3d).
YAP/TAZ 타겟단백질인 CTGF 및 CYR61의 DKO 간에서의 증가는 YAP/TAZ 활성의 상향 조절을 추가로 확인하였다 (도 3a).
YAP와 TAZ가 AKT 활성화를 통해 지방간 발달을 직접적으로 촉진하는지 여부를 확인하기 위해 참고예 4에 기재된 방법으로 얻은 LATS에 의해 억제 될 수 없는 활성 TAZ(TAZ4SA) 또는 YAP (YAP5SA)를 과발현하는 아데노바이러스를 이용했다. 아데노바이러스 주입 후 육안 관찰 및 염색 결과를 도 3e에, 도 3e에 나타낸 간의 면역블롯 결과를 도3f와 3g에 나타냈고, 도 12에 아데노바이러스 주입으로 단기간 동안 YAP 또는 TAZ를 증가시킨 마우스에서의 지방간 발달을 나타내었다. WT 마우스에서 TAZ4SA 또는 YAP5SA의 발현을 유도하는 바이러스를 주입 후 4 일간은 간 크기와 형태에 영향이 없었다(도 3e, 도 12 A와 B).
반면에 동일한 실험 조건에서 Pten-/- 마우스에서 TAZ4SA 또는 YAP5SA의 발현은 간 비대를 유도하고 섬유화나 염증이 없는 NAFLD의 발달을 촉진시키고(도 3e, 도 12 A와 C) pAKT와 FAS의 증가가 나타났다 (도 3f와 3g). TAZ4SA 및 YAP5SA가 WT 간에서 pAKT에 영향을 미치지 않는다는 사실 (도 3f 및 3g)은 PTEN이 PIP3을 PIP2로 신속하게 전환시켜 AKT 활성화를 억제할 수 있음을 시사한다. 이것은 AKT 관련 대사 기능 장애에서 YAP/TAZ의 역할을 연구하는데 PTEN 결핍이 적합한 유전적 배경임을 시사한다. 이 결과는 또한 YAP/TAZ의 상향 조절이 AKT 활성을 증가시킴으로써 Pten-/- 조건 하에서 지방간 발달을 촉진한다는 사실을 뒷받침한다.
실시예 4: YAP/TAZ에 의한 Irs2의 전사 조절
다음으로 YAP와 TAZ가 Pten-/- 간에서 AKT 활동을 강화시키는 기작을 알아보았다. 도 4a에 3개월 된 마우스 간의 인슐린 신호전달 분자를 면역블롯한 결과를, 도 4b에 동일한 간의 Irs2 mRNA 양을 qPCR 분석한 결과를 나타내었다. DKO 간에서 AKT를 직접 활성화하는 PIP3가 현저하게 증가한 것을 관찰하였다(도 2d). 또한 PIP3의 다운스트림 표적인 pERK의 증가도 관찰되었다(도 4a). 따라서 YAP와 TAZ가 AKT의 상류 조절자를 조절할 것이라는 가설을 세울 수 있다. DKO 마우스는 IRS2가 급격히 증가하나 IR, IRS1 또는 PI3K는 증가하지 않았다 (도 4a).
또한 DKO 마우스에서 관찰된 Irs2 mRNA의 증가폭은 Sav1-/- 또는 Pten-/- 마우스에서 관찰된 증가폭보다 더 컸다 (도 4b). 이것은 동일샘플(도 3a, 3b)에서 YAP/TAZ 발현과 활동성이 증가된 패턴과 유사하며, DKO 마우스가 Pten-/-보다 더 높은 수준의 Irs2 mRNA 및 IRS 표적 유전자를 발현한다는 것을 보여주는 마이크로어레이 분석과 일치한다(도 2a). 종합하면, 이러한 결과는 DKO 간의 과도활성화된 YAP/TAZ 가 IRS2를 상향 조절하여 인슐린 신호를 증가시킨다는 것을 암시한다.
다음으로, 정상적인 마우스 간세포 세포주인 AML12에서 면역블롯을 통해 YAP/TAZ와 IRS2 사이의 분자적 관계를 시험관내(in vitro)에서 더 명확히 했다. 도 4c에는 shPten 및/또는 shSav1를 이용하여 Pten 및/또는 Sav1 발현을 저해한 경우의 면역블롯을 통한 IRS2 분석 결과를 나타냈다. 본 발명자는 이 세포주에서 PTEN 또는 SAV1의 결핍된 경우IRS2 발현이 약간 증가하지만 PTEN과 SAV1의 동시 녹다운과 관련된 IRS2 발현이 훨씬 더 증가한 것을 발견했다 (도 4c).
도 4d에는 상기 AML12 세포에서 인슐린에 의해 유도되는 AKT 활성을 면역블롯으로 확인한 결과를 나타냈다. SAV1 결핍은 인슐린 유도에 의한 AKT 활성화에 영향을 미치지 않지만 SAV1과 PTEN 모두의 결핍은 IRS2 발현을 극적으로 증가시킴으로써 AKT 활성화를 향상시킨다 (도 4d).
도 4e는 IRS2의 발현을 증가시킨 AML12 세포에서의 AKT 활성을 면역블롯으로 확인한 결과를, 도 4f는 도 4c의 Pten 및 Sav1 발현 감소된 AML12 세포에 siRNA를 이용하여 Irs2의 발현을 억제시킨 후의 AKT 활성 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 본 발명자는 또한 IRS2의 과발현이 AKT 활성화를 유도하고(도 4e) PTEN 및 SAV1 결핍 세포에서 IRS2의 녹다운은 인슐린 유도 AKT의 활성화를 약화시키는 것을 발견했다(도 4f).
전사 인자 TEAD가 표적 유전자 전사를 위해 YAP/TAZ에 결합하기 때문에, YAP/TAZ가 TEAD를 통해 Irs2 발현을 직접 조절할 수 있는지 문제되었다. 대조군(CTL), TAZ4SA 또는 TAZ4SA/S51A을 과발현 시킨 면역블롯 결과를 도 4g에 나타내었다. TAZ4SA는 IRS2 발현 및 AKT 인산화를 증가시킬 수 있는 반면, TEAD-비결합 돌연변이체 (TAZ4SA/S51A)는 그렇지 않았다(도 4g).
도 4h는 Irs2의 프로모터 상단(distal promoter)과 첫 인트론 부위의 TEAD 부착부위를 포함하거나(TBSs) 또는 삭제된 부분(TBSsΔ)를 포함하는 루시퍼라제(Luc) 리포터 구조물의 모식도이다. 프로모터상단(distal promoter) 과 Irs2의 첫 번째 인트론 사이에 6 개의 잠재적인 TEAD 결합 부위(TBS)가 있다 (도 4h).
대조군, TAZ4SA 또는 TAZ4SA/S51A을 과발현했을 때 상기 루시퍼라제 발현 양상 분석 결과를 도 4i에 나타내었다. TAZ4SA / S51A와 달리, TAZ4SA는 TBS2, TBS4 또는 TBS5를 포함하는 리포터 구조를 활성화하지만, 이러한 결합 부위가 제거한 리포터 (TBSsΔ)는 활성화될 수 없다 (도 4i).
도 4j는 TAZ가 상기 도 4i에서 분석된 Irs2 프로모터 상단 또는 인트론에 결합하는지 여부를 확인하기 위한 ChIP-qPCR 분석 결과를 나타낸 그래프이다. ChIP-qPCR 분석을 통해 TAZ는 Irs2의 TBS2와 TBS5에 결합한다는 것을 발견했다 (도 4j). 이러한 결과는 YAP/TAZ-TEAD 복합체가 Irs2의 전사를 직접 유도함으로써 AKT 신호 전달을 촉진한다는 것을 나타낸다.
실시예 5: Yap/Taz의 제거 또는 Hippo 신호전달의 활성화는 IRS2의 하향 조절로 지방간으로의 진행을 억제
DKO 마우스 표현형에서 YAP/TAZ의 역할을 확인하기 위해, Yap 및 / 또는 Taz 결손 유전자를 보유하는 DKO 마우스를 제작했다. 도 13의 A패널에서 Pten-/-;Sav1-/-;Yap-/-;Taz-/- 마우스의 제작 방법을 도식화하여 나타내었다.
각 유전자형의 1개월 된 마우스의 간을 염색한 결과를 도 5a에, 각 유전자형에서의 IRS2/AKT 신호전달 회로및 YAP/TAZ 신호전달 회로의 면역블롯 결과를 도 5b에, 각 유전자형 마우스의 간에서 상대적 Irs2 mRNA양을 qPCR 분석한 결과를 도 5c에 나타내었다. 4주 된 Pten-/-;Sav1-/-;Taz-/- (PST triple-knockout, 또는 TKO) 또는 Pten-/-;Sav1-/-;Yap-/- (PSY TKO) 의 지방간 표현형이 DKO 마우스에 비해 경미한 개선을 보인 반면(도 5a), DKO 마우스에서 Yap과 Taz를 모두 제거한 경우(PSYT quadruple-knockout, QKO)는 지방간을 보이지 않았다(도 5a).
또한 QKO 마우스는 DKO 마우스에 비해 IRS2, pAKT, pGSK3b 및 FAS가 감소하고(도 5b), Irs2 mRNA가 감소(도 5c) 되었다. DKO와 PST 또는 PSY TKO 간은 pAKT 농도에서 차이를 보이지 않는데(도 5b), TKO 간에서의 YAP 또는 TAZ가 일종의 보상 조절을 하기 때문으로 추측된다. 그 예로, PST TKO 마우스에서 DKO 마우스보다 낮은 pYAP/YAP 비율이 관찰되어, YAP이 더 활성화 됨을 의미한다. 반대로, PSY TKO 마우스에서는 DKO 마우스에 비해 다량의 TAZ가 관찰된다(도 5b).
도 13에서 각 유전자형을 가지는 체중 대비 간무게 비율(B), 해당 간의 Sirius red 및 CK19 면역조직화학 염색 결과(C) 및 각 마우스에서 추출한 혈청의 색(D)을 나타내었다. 예상 외로 PSYT QKO 생쥐의 체중 대비 간무게 비율은 DKO 생쥐에 비해 감소하지는 않았고, QKO 생쥐는 심한 간 섬유화를 나타내며 혈청은 WT 생쥐보다 훨씬 더 노랗다(도 13). 도 14는 Yap과 Taz를 모두 제거하였을 때 담관의 이상 발생 및 심한 섬유증이 유발됨을 나타낸 그림이다. 이전의 연구와 같이, Yap-/-;Taz-/- 마우스는 담관을 형성하지 않고 (CK19 음성) 만성 간 손상과 섬유증을 보인다(도 14, A-F). 본 발명자가 PSYT QKO 간에서 관찰한 섬유성 변화는 YAP/TAZ 결손으로 인한 담관 세포의 기형으로 인해 발생하는 독성 때문일 수 있다 (도 13). 이런 복잡함을 뛰어넘어서, 본 발명자의 결과는 YAP/TAZ의 손실이 DKO 마우스의 간세포에서 NAFLD 표현형을 억제하는데 작용함을 나타낸다.
다음으로는 YAP/TAZ의 상위 억제자인 Hippo 회로가 AKT 신호 전달을 억제하는지 찾기 위해 Pten-/- 마우스를 인간 wild type MST1를 과발현하는 마우스와 교배 (MSTwtTg) 또는 kinase-dead 돌연변이를 과발현하는 마우스와 교배(MSTkdTg)하여 각 그룹간 비교·대조하였다.
도 15의 A패널에 상기 교배 방법을 도식화하였다. 도 15의 B패널은 각 2개월 된 마우스의 체중 대비 간 무게 비율을, C패널과 도 6a는 각 간의 육안 관찰 모습을, 도 6b는 도 6a에 나타낸 마우스 간의 각 염색 결과를, 도 15의 D패널과 도 6c는 각 간에서의 면역블롯 분석 결과를 나타낸다. MST1은 SAV1의 결합 파트너이자 Hippo 회로를 구성하는 kinase이다.
Pten-/-;MSTkdTg와 달리, Pten-/-;MSTwtTg 간은 Pten-/- 간보다 작고, 간세포내 지방소립 축적량도 더 적다 (도 6a, 6b, 도 15, B와 C). 이는 Pten-/- 간에 비해Pten-/-; MSTwtTg 간이 보다 낮은 AKT 활성화 및 IRS2 발현 양상을 보이기 때문이다(도 6c, 도 15). 또한, MST1wtTg의 과발현은 LATS 활성화를 증가시키고 YAP/TAZ 를 감소시키지만 MSTkdTg에서는 이런 현상을 관찰할 수 없다 (도 6b 및 6c).
종합하면, 이 데이터는 자발적으로 지방간이 유도되는 Pten-/- 간에서 Hippo 회로가 활성화 되면 YAP/TAZ 매개 IRS2의 조절을 억제함으로써 AKT 신호 전달을 억제하고 결과적으로 NAFLD의 발달을 억제하는 것을 보여준다.
실시예 6 : HCC 환자 표본에서 YAP/TAZ와 IRS2/pAKT의 양의 상관관계 확인
마우스 모델에서의 연구 결과를 인간으로 확장하기 위해 HCC 환자 샘플에서 YAP, TAZ 및 IRS2의 mRNA 발현을 조사했다. 도 7a에 각 환자 조직에서 얻은 mRNA 발현 데이터를 IRS2 대 TAZ 또는 YAP1을 log2 값으로 하여 그린 산포도를 나타냈다. HCC 및 간경변 데이터베이스는 IRS2와 YAP 또는 TAZ mRNA 농도간 양의 상관 관계를 보인다 (도 7a).
또한, 도 7b에는 상기와 동일한 시료에서 IRS2 대 CTGF 또는 CYR61을 log2 값으로 하여 그린 산포도를 나타냈다. IRS2와 YAP/TAZ 의 타겟 mRNA (예 : CTGF 및 CYR61)과의 유의미한 양의 상관 관계를 발견했다(도 7b).
HCC 환자 시료에서 TAZ와 IRS2의 면역조직화학염색 결과를 도 7c에, YAP와 IRS2의 면역조직화학염색 결과를 도 7d에 나타냈다. HCC 샘플에서 IRS2 단백질 발현은 TAZ/YAP 단백질 발현과 양의 상관 관계를 가진다. 각각, TAZ 발현이 높은 표본의 77%가 IRS2의 발현도 높고, YAP도 마찬가지로, YAP 발현이 높은 표본의 88%가 IRS2의 발현도 높고 88% YAP 수준을 갖는다 (도 7c 및 7d).
앞선 NAFLD-HCC 마우스 결과를 좀더 환자조직에서 확인하고자 NAFLD 유래 또는 상관없는 HCC샘플을 얻어 타겟단백질의 발현양을 확인한 결과를 도 7e에, 그 정량화한 그래프를 도 7f에 나타냈다.
도 16에는 NAFLD로부터 유래한 HCC와 그렇지 않은 HCC 사이에서 TAZ, YAP, IRS2 및 pAKT(S473) 단백질량을 면역조직화학 염색 강도로 비교한 결과를 나타냈다. NAFLD이 원인이 되는 HCC는 NAFLD와 관련 없는 HCC보다 TAZ, YAP, IRS2 및 pAKT (S473)의 면역조직화학염색 강도가 유의하게 높다는 것을 확인하였다(도 7e 및 7f, 도 16, A-C). 이러한 결과는 YAP와 TAZ가 지방간의 발생 및 그것의 간암으로의 진행에 있어 IRS2의 발현 증가에 의한 AKT 활성화시키는데 결정적인 역할을 한다는 것을 시사한다.
실시예 7: AKT 활성화 억제나 IRS2의 발현 억제는 간암 발생을 감소
NASH에 대한 치료법이 없다는 점을 감안하여 본 발명자는 DKO 마우스에서 AKT의 약리학적 억제가 지방간을 완화시키고 암 진행을 지연시킬 수 있는지를 살폈다. 이를 위해 본 발명자는 3주령 DKO 마우스에 pan-AKT 억제제 MK-2206 (2상 임상 시험)을 복강 내 투여했다. 구체적인 실험 방법을 도 8a에 도식화하여 나타내었다(도 8a, 위).
도 8a에는 상기 실험의 육안 관찰 결과(가운데) 및 H&E, Oil red O 염색 결과(아래)를 나타내었다. 도 8b 내지 d는 각 샘플에서 체중 대 간 무게의 비율, 혈청 내 간 효소 분석, 및 간에서의 지질합성 관련 유전자의 발현을 qPCR로 분석한 결과 그래프를 나타낸 것이다. 도 17에서는 각 마우스에서 Sirius red, YAP 염색 결과를 나타내었다. 본 발명자는 MK-2206 투여 DKO 마우스가 위약 투여 DKO 마우스에 비해 적은 지방간, 간 중량 감소, 간 섬유화 감소 및 간 기능 개선뿐 아니라 간기능 향상 및 지방합성 관련 유전자 (즉, Fasn, Acc1 및 Srebp1c)의 발현을 감소시키는 것을 발견했다 (도 8a-8d, 도 17).
더 나아가, 간암 억제 효과를 보고자, 80%의 마우스가 종양을 갖고 있는 12 주 된 DKO를 이용하여 (도 1b), MK-2206를 주입하였다. 실험 방법과 그 육안 관찰 결과를 도 8e에 나타내었다. 도 8f는 각각 체중 대비 간 무게 비율(F), 간 종양 수와 크기(G), 혈청 분석 결과(H) 그래프이고, 도 8g는 도 8e의 실험 후 면역조직화학염색법을 수행한 결과이다. 도 8h에는 도 8e에 나타낸 실험의 Ki-67+ 간세포의 정량분석 결과 그래프를, 도 8i에는 섬유증(Acta2, desmin, Tgfb), 세포사멸 또는 상해(Hmox1, Gadd153) 또는 염증(Tnfa) 관련 유전자의 각 발현을 qPCR 분석한 그래프를 나타냈다. 그 결과 간 색 및 혈청 화학치 정상화, 종양 결절과 간경화 정도의 감소로 알 수 있듯, 지방간과 종양 형성이 감소한 것으로 나타났다(도 8e 내지 8f). MK-2206 처리 된 DKO 간은 과도한 지방 방울 (H&E), 섬유증 감소(Sirius red), 적은 Ki-67- 양성 세포 및 보다 낮은 수준의 간세포 TAZ 발현을 보이는 반면, YAP 발현에는 변화가 없다(도 8g 내지 8h, 도 17B).
이러한 효과는 또한 섬유화 (즉, Acta2, Desmin 및 Tgfb), 세포 사멸 또는 손상 (즉, Hmox1 및 Gadd153) 및 염증 (즉, Tnfa (도 8i))과 관련된 유전자의 감소 된 발현을 동반하였다. 종합하면, Hippo 경로 활성화 (도 6a 내지 6c)와 마찬가지로 AKT 억제제 치료는 DKO 생쥐에서 NAFLD와 간암의 발병을 현저하게 약화시킨다.
생체 내 DKO 마우스에서 NAFLD와 암의 발달에 IRS2가 하는 역할을 명확히 하기 위해 본 발명자는 DKO 마우스에서 IRS2 발현을 억제하기 위해 saCas9을 이용하여 Irs2를 타겟하는 sgRNA (sgIrs2)를 간에 전달하는 AAV를 생성했다. Cas9과 IRS2에 대한 sgRNA(sgIrs2)를 코딩하는 AAV 바이러스를 5주 된 DKO마우스에 주입한 후 7주 후에 분석한 결과를 도 9a 내지 9d에 나타냈다.
도 9a는 간의 육안 관찰 사진, 도 9b는 면역블롯 결과, 도 9c는 체중 대비 간 무게의 비율 및 간 종양의 수와 크기를 나타낸 그래프, 도 9d는 간의 H&E 염색 결과를 나타낸다. 중요한 것은, DKO 간에서 Irs2를 억제하면 대조 바이러스 (sgCtl)를 주입한 DKO 마우스의 암 표현형을 완화한다는 것이다. sgIrs2가 주입된 DKO 간은 pAKT 수준을 감소시킴으로써 암 결절의 수와 크기를 현저히 감소시켰다 (도 9a 내지 9c). 그러나 이미 NAFLD가 진행된 5 주된 생쥐에서 sgIrs2 주사에 의한 NAFLD 진행의 감소는 관찰되지 않았다 (도 9d). DKO 간에서의 급속한 종양 형성 진행은 지방간의 증가에 기인하기 때문에 IRS2의 억제는 NAFLD에서 암으로의 질병 진행을 유의하게 예방한다. 종합적으로, 이러한 결과는 DKO 간에서 증가된 IRS2 발현이 간암 진행을 촉진시키는 주요 인자임을 시사한다. 도 10에 DKO 간에서 나타나는 Hippo와 AKT 신호전달 회로간의 양성 피드백 루프의 모식도를 나타내었다.
한국생명공학연구원 KCTC13522BP 20180509
<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Animal model of non-alcoholic liver disease and compositions of diagnosis, prevention or treatment for non-alcoholic liver disease <130> DPP20183048KR <150> KR 10-2018-0070298 <151> 2018-06-19 <160> 66 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Srebp1a_Sense) <400> 1 ggccgagatg tgcgaact 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Srebp1a_Antisense) <400> 2 ttgttgatga gctggagcat gt 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Srebp1c_Sense) <400> 3 ggagccatgg attgcacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Srebp1c_Antisense) <400> 4 caggaaggct tccagagagg 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Srebp2_Sense) <400> 5 gcgttctgga gaccatgga 19 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial 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<400> 13 catcttctca aaattcgagt 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Tnfa_Antisense) <400> 14 tgggagtgac aaggtacaa 19 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Il6_Sense) <400> 15 tccacgattt cccagagaac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Il6_Antisense) <400> 16 agttgccttc ttgggactga 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Irs2_Sense) <400> 17 caagagccct ggcgagtaca 20 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Irs2_Antisense) <400> 18 ccgcggatgc cagtagtg 18 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Acta2_Sense) <400> 19 atgctcccag ggctgttttc ccat 24 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (RT-qPCR_Acta2_Antisense) <400> 20 gtggtgccag atcttttcca tgtcg 25 <210> 21 <211> 20 <212> 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(RT-qPCR_Gadd 153_Antisense) <400> 28 cagggtcaag agtagtgaag gt 22 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS1_Sense) <400> 29 cttatctggc agcaggaagg agag 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS1_Antisense) <400> 30 cacaccctcg cacacatatc cctc 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS2_Sense) <400> 31 cacccttgca cacgtagaga cgct 24 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS2_Antisense) <400> 32 accgtgttca cccagcaccc ggg 23 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS3_Sense) <400> 33 cctggcagtg tcccatagtt ga 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS3_Antisense) <400> 34 cagctgctgc ttctttaggg g 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS4_Sense) <400> 35 gcagcagctg aagtgctaaa ga 22 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS4_Antisense) <400> 36 gctgctttcc tctcattgct c 21 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS5_Sense) <400> 37 gcctctgagc caacatctct ct 22 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS5_Antisense) <400> 38 tatgacctcc cacccacttc a 21 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS6_Sense) <400> 39 catggctcgt ttctccttct gg 22 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Luciferase Reporter construct_TBS6_Antisense) <400> 40 gagtactcag gcccaggatg c 21 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS1_Sense) <400> 41 atctatggtc ttcagaatca cac 23 <210> 42 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS1_Antisense) <400> 42 ccagagttta tcttacaatt taacct 26 <210> 43 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS2_Sense) <400> 43 cacagtttac acaaagggta aagca 25 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS2_Antisense) <400> 44 gctctggatg cgtaaacaaa aca 23 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS4_Sense) <400> 45 gcagcagttg attcccatcc t 21 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS4_Antisense) <400> 46 acaatggggc agggaaggta 20 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS5_Sense) <400> 47 gtaaaaccca gaaaccccac tttc 24 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (ChIP-qPCR_TBS5_Antisense) <400> 48 tgctctgctt ctctcactag ga 22 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Sav1_Sense) <400> 49 tggtttgctt tttagtggcc 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Sav1_Antisense) <400> 50 tgctggtttt gtctcactaa 20 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Pten_Sense) <400> 51 ctcctctact ccattcttcc c 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Pten_Antisense) <400> 52 actcccacca atgaacaaac 20 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Yap1_Sense) <400> 53 acatgtaggt ctgcatgcca gaggagg 27 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Yap1_Antisense) <400> 54 aggctgagac aggaggatct ctgtgag 27 <210> 55 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Taz_Sense) <400> 55 ggcttgtgac aaagaacctg gggctatctg ag 32 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Taz_Antisense) <400> 56 cccacagtta aatgcttctc ccaagactgg g 31 <210> 57 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Cre_Sense) <400> 57 gtgttgccgc gccatctgc 19 <210> 58 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_Cre_Antisense) <400> 58 caccattgcc cctgtttcac tatc 24 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_MSTTg_Sense) <400> 59 gctctagagc ctctgctaac ca 22 <210> 60 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Mouse genotype check_MSTTg_Antisense) <400> 60 ccagggacca gatgtctgc 19 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Andenovirus sgIrs2_Ex1-1_Sense) <400> 61 caccgatcgc cctctacacc aagg 24 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Andenovirus sgIrs4_Ex1-1_Antisense) <400> 62 aaacccttgg tgtagagggc gatc 24 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Andenovirus sgIrs3_Ex1-2_Sense) <400> 63 caccgccgcc gcagcctccg cggc 24 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (Andenovirus sgIrs5_Ex1-2_Antisense) <400> 64 aaacgccgcg gaggctgcgg cggc 24 <210> 65 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (SAV1 shRNA) <400> 65 ccggcggcta catctctagg gaattctcga gaattcccta gagatgtagc cgttttt 57 <210> 66 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic (PTEN shRNA) <400> 66 ccggcaaccg atacttctct ccaaactcga gtttggagag aagtatcggt tgttttt 57

Claims (13)

  1. 간특이적으로 Pten 및 Sav1 유전자가 결실되고, IRS2 단백질의 발현이 증가된, 비알코올성 간질환 동물 모델.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 비알코올성 간질환은 비알코올성 지방간, 비알코올성지방간염, 간경화 또는 간암인, 비알코올성 간질환 동물 모델.
  4. 제1항에 있어서, 상기 동물 모델은 수탁번호 KCTC 13522BP인 수정란으로부터 수득한 것을 특징으로 하는, 비알코올성 간질환 동물 모델.
  5. 제1항에 따른 동물 모델에, 비알코올성 간질환 치료제의 후보 물질을 처리하는 단계;
    상기 후보 물질이 처리된 동물의 간조직에서, YAP, TAZ, IRS2 및 AKT 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 후보 물질의 미처리 대조 간조직과 처리된 간조직에서 측정된, YAP, TAZ, IRS2 및 AKT로 이루어지는 군에서 선택된 적어도 하나의 단백질의 발현 또는 활성 수준을 비교하여 대조 간조직보다 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준이 낮은 경우, 후보 물질을 간질환의 치료제로 결정하는 단계를 포함하는,
    비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는 mRNA 전사량 수준을 측정하여 이루어지는 것인, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 mRNA의 전사량 수준 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 mRNA의 전사량 수준 측정법으로 수행하는 것인, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하는 단계는, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법으로 수행하는 것인, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  9. 제5항에 있어서, 상기 후보 물질은 프라이머, 프로브, 압타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 고분자 화학물질, 단백질, 펩타이드, 핵산 분자, 바이러스 또는 항체를 포함하는 것인, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제5항에 있어서, 상기 후보 물질은 AKT 단백질의 활성을 억제하는 것인, 비알코올성 간질환 치료제의 스크리닝 방법.
  11. 간특이적으로 Pten 유전자 및 Sav1 유전자가 결실되고, IRS2 단백질의 발현이 증가된 동물을 제조하는 단계를 포함하는, 비알코올성 간질환 동물 모델의 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 간특이적으로 Pten 유전자 및 Sav1 유전자가 결실되고, IRS2 단백질의 발현이 증가된 동물을 제조하는 단계는, Cre 재조합효소 또는 아데노바이러스를 이용하여 이루어지는 것인, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 간특이적으로 Pten 유전자 및 Sav1 유전자가 결실되고, IRS2 단백질의 발현이 증가된 동물을 제조하는 단계는 하기의 3가지 단계를 포함하는 것인, 방법:
    (1) Pten f/f 유전자형을 포함하는 동물을 CRE를 발현하는 Albumin-Cre 동물과 교배하여 제1세대 개체를 얻는 단계;
    (2) 상기 제1세대 개체를 Sav1f/f 유전자형을 가지는 동물과 교배하여 제2세대 개체를 얻는 단계; 및
    (3) 상기 제2세대 개체간의 교배를 통해 Ptenf/f;Sav1f/f;Albumin-Cre 유전자형을 포함하는 제3세대 개체를 얻는 단계.
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