CN111304315A - 一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法 - Google Patents
一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法。该方法包括以下步骤：将实验小鼠分成三组，分别尾静脉注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，处死后获取肝脏组织；肝脏组织经过制作石蜡切片进行H&E染色、制作冰冻切片进行油红O染色、提取肝脏组织总RNA进行基因芯片分析；H&E染色和油红O染色后观察肝脏脂肪病变程度；基因芯片分析用于筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因。该方法为PPARγ在肝脏中的作用和肝病的治疗提供了一定的理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及脂质代谢领域，具体涉及一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法。
背景技术
近年来，PPARγ在肝脏中的作用引起了人们的高度关注和广泛研究。在生物信息学方面，已有学者基于RNA-Seq研究了PPARγ在许多动物模型及相关疾病中的作用机制，但外源性表达PPARγ对小鼠肝脏脂肪变性及脂质代谢基因表达的影响一直未见报道。目前，噻唑烷二酮类药物(PPARγ激动剂)已被广泛应用于临床治疗2型糖尿病、代谢综合征、免疫性疾病等，但由于其所引起的水钠潴留、骨质丢失以及心力衰竭风险，限制了PPARγ受体激动剂临床普遍应用。随着生物技术的发展，基因治疗为临床疾病诊治带来了新的曙光。研究外源表达PPAR对肝脏脂肪变性及脂质代谢基因表达的影响，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法。
该研究方法的主要步骤为：
将实验小鼠分成三组，分别尾静脉注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，处死后获取肝脏组织；肝脏组织经过制作石蜡切片进行H&E染色、制作冰冻切片进行油红O染色、提取肝脏组织总RNA进行基因芯片分析；H&E染色和油红O染色后观察肝脏脂肪病变程度；基因芯片分析用于筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因。
其中，提取肝脏组织总RNA获取基因芯片的方法为：用Takara RNA试剂盒提取三组肝脏组织的总RNA，运用生物素标记RNA探针，然后与小鼠Illumina WG-6Bead Chip杂交，得到三组小鼠的全基因转录数据。Takara RNA试剂盒的型号优选为D9108A。
其中，基因芯片分析的方法为：
通过NCBI数据库进行基因查找和比对，筛选出两组PPARγ腺病毒注射组与LacZ腺病毒注射组的差异表达基因，然后用GO基因富集分析、Venn Diagram(维恩图)和HeatMap(热图)研究差异表达基因的分布，从而获取差异基因的富集情况以及差异基因中的脂代谢相关基因的分布情况。
此外，该研究方法还包括验证基因芯片结果的过程，其方法为：
选择四个脂代谢差异表达基因为目的基因，以LacZ腺病毒注射组为对照组、PPARγ腺病毒4d注射组为实验组，使用实时定量PCR验证目的基因的表达情况，表达情况由mRNA相对丰度表示，目的基因的含量与内参基因含量比为目的基因的mRNA相对丰度；
其中，目的基因分别为PPARG、aP2、Lpin1和CideA；四个基因对应的引物分别为：
正向引物，5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3'；反向引物，5'-GTMTCAGCAACCATTGGGTCA-3'；
正向引物，5'-AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3'；反向引物，5'-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3'；
正向引物，5'-CCTCCGCTCCCGAGAGAAA-3'；反向引物，5'-CGTTGTCTCCCAACTTCATGT-3'；
正向引物，5'-TGACATTCATGGGATTGCAGAC-3'；反向引物，5'-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3'；
其中，内参基因为β-actin，其对应的引物为：
正向引物，5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'；反向引物，5’-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3’
石蜡切片和H&E染色均为本领域的常见技术，针对本发明的实验对象，所述石蜡切片的制作方法为：将肝脏组织经4％多聚甲醛固定后，按照以下步骤进行脱水：70％乙醇4h；80％乙醇2h；90％乙醇1h；95％乙醇2次，每次2h；100％乙醇2次，每次1h；二甲苯3次，每次1h；硬蜡2次，每次2h；脱水后石蜡包埋，切片即可。所述H&E染色的方法为：将石蜡切片按以下步骤脱蜡染色：二甲苯3次，每次7min；100％乙醇2次，每次1min；95％乙醇2次，每次1min；80％乙醇1min，70％乙醇1min，流水2min；苏木素染色7min，流水冲洗5min；盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min；伊红染色5min，然后脱水和透明，即80％乙醇15s；95％乙醇2次，每次1min；100％乙醇2次，每次1min；二甲苯3次，每次3min；中性树胶封片。
冷冻切片和油红O染色亦为本领域的常见技术，针对本发明的实验对象，所述冷冻切片的制作方法为：将肝脏组织进行OCT包埋，经冷冻切片机切片，置于-80℃冰箱储藏。所述油红O染色的方法为：将冰冻切片复温干燥10min，50％乙醇稍洗，浸入60％异丙醇溶解的油红O染液10min，60％乙醇分化10s，流水冲洗2min,苏木素复染2s，1％盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min，甘油明胶封片。
本发明的有益效果是：
1)本发明以注射Lac/Z病毒小鼠为对照，注射Ad/PPARγ病毒小鼠为实验组，提取肝脏总RNA进行基因芯片分析,从而筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因，其中包括许多与脂代谢密切相关基因。
2)本发明通过基因富集分析，进一步验证了上述结果，证明了外源注射PPARγ出现表达差异基因主要集中在脂肪代谢、脂滴形成、甘油三脂代谢等生物学过程中。
3)本发明提供了一种有效研究外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的方法，验证了外源表达PPARγ促进肝脏细胞向脂肪细胞的转变，并筛选出受PPARγ影响的脂代谢基因，这为PPARγ在肝脏中的作用和肝病的治疗提供了一定的理论依据。
附图说明
图1为小鼠肝脏H&E染色和油红O染色结果。
图2为GO基因富集分析结果。其中，A为第2d的GO基因富集分析；B为第4d的GO基因富集分析。
图3为注射PPARγ腺病毒第2d或第4d差异基因的Venn Diagram。
图4为注射PPARγ腺病毒第2d或第4d与对照相比表达上调的基因的HeatMap。
图5为注射PPARγ腺病毒第2d或第4d与对照相比表达下调的基因的HeatMap。
图6为注射PPARγ腺病毒第2d或第4d表达的脂代谢相关基因的HeatMap。
图7为注射PPARγ腺病毒第4d的基因mRNA相对表达水平。
具体实施方式
1材料
1.1实验动物
本研究以5～6周龄，体重为20g左右的SPF级C57BL/6J小鼠为动物模型。实验小鼠被饲养在西安交通大学医学部医学实验动物中心SPF级动物房，小鼠给予12h光照/黑暗交替，自由饮水。
1.2重组腺病毒载体
Ad/LacZ(LacZ腺病毒)、Ad/PPARγ(PPARγ腺病毒)，均由美国西北大学Dr.Reddy实验室馈赠。
2实验方法
2.1重组腺病毒的注射
将6周龄C57BL/6J小鼠，分成3组(每组n＝6)，即对照组Ad/LacZ(4d)，实验组Ad/PPARγ(2d)和Ad/PPARγ(4d)，尾静脉注射腺病毒(1×1011vp/mL)后，用异氟烷过量麻醉使小鼠安乐死，分离获取肝脏组织。
2.2肝脏组织的脱水、包埋、切片
小鼠肝脏组织经4％多聚甲醛固定后，按照以下步骤进行脱水：70％乙醇4h；80％乙醇2h；90％乙醇1h；95％乙醇2次，每次2h；100％乙醇2次，每次1h；二甲苯3次，每次1h；硬蜡2次，每次2h；脱水后石蜡包埋，切片(4μm厚)即可。
2.3H&E染色
将石蜡切片，按以下步骤常规脱蜡染色：二甲苯3次，每次7min；100％乙醇2次，每次1min；95％乙醇2次，每次1min；80％乙醇1min，70％乙醇1min，流水2min；苏木素染色7min，流水冲洗5min；盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min；伊红染色5min，然后脱水和透明，即80％乙醇15s；95％乙醇2次，每次1min；100％乙醇2次，每次1min；二甲苯3次，每次3min；中性树胶封片。
2.4肝脏组织的冰冻切片
取2.2中的肝脏组织，进行OCT包埋，经冷冻切片机切片(4μm厚)，置于-80℃冰箱储藏。
2.5油红O染色
取出2.4中的冰冻切片，复温干燥10min，50％乙醇稍洗，浸入60％异丙醇溶解的油红O染液10min，60％乙醇分化10s，流水冲洗2min,苏木素复染2s，1％盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min，甘油明胶封片。
2.6总RNA的提取及基因芯片
根据TakalaRNA提取说明书(型号D9108A)提取对照组、第2d、第4d小鼠的肝脏总RNA，运用生物素标记RNA探针，然后与小鼠WG-6Bead Chip(Illumina)杂交，得到注射Ad/LacZ鼠和注射Ad/PPARγ第2d或第4d小鼠的全基因转录数据。
2.7实时定量PCR
为验证基因芯片结果，本研究选择了4个脂代谢差异表达基因，并使用实时定量PCR验证其在最终4days的表达情况。根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布的Musmusculus的相关基因序列,应用Premier 5.0软件设计引物。β肌动蛋白(β-actin)(正向：5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3',反向：5'-GCCGGACTCATCGTACTCC-3')为内参基因，目的基因的含量与内参基因含量比为此基因的mRNA相对丰度(2-ΔΔCt)。4个脂代谢差异表达基因及其引物入下表所示：
3.统计学分析
实验数据通过NCBI(/www.ncbi.nlm.nih.gov/gene,Mus musculus)进行基因查找和比对，利用Excel2010对数据进行差异分析。
4.结果
4.1肝脏大体形态学及组织病理学分析
参考图1，Ad/LacZ或Ad/PPAR感染肝脏2d或4d后，H&E和油红O染色显示，Ad/LacZ组肝脏颜色正常，肝细胞几乎无脂肪变性(图A，D和G)。相反，Ad/PPAR感染的小鼠在第2d或第4d肝脏逐渐脂肪化、肝细胞中出现大量的脂肪变性(图B，C，E，F，H和I)。这些现象清楚地表明，外源表达PPAR能够诱导肝脏中的肝细胞逐渐出现脂肪变性。
4.2注射Ad/PPAR第2d或4d差异表达基因GO富集分析
基因芯片结果表明，Ad/PPARγ注射后第2d相比对照差异表达的基因有347个，第4d相比对照差异表达的基因有270个，利用Metascape进行GO基因富集分析。结果如图2所示，注射PPARγ第2d差异基因主要富集在脂肪代谢、脂滴形成、甘油三脂代谢等生物过程，第4d的差异基因主要富集在单羧酸代谢、脂滴代谢、甘油三脂代谢及脂滴形成生物过程。
4.3注射Ad/PPAR第2d或4d差异表达基因分析
用基因芯片数据，筛选出差异基因，利用NCBI数据库，查找脂代谢相关基因，用Omicshare Tools绘制注射Ad/PPAR后第2d或第4d差异表达基因Venn Diagram。如图3所示，第2d或第4d差异表达基因分别有347和270个，其中共同基因为158个。
利用Omicshare绘制第2d或第4d受PPARγ影响的共同差异表达基因热图。如图4和5所示，上调的基因共140个，下调的基因共18个，其中脂代谢相关基因56个。其中第2d主要上调的有Adipsin(补体旁路激活)、CideA(脂质储存)、PPARγ、Adipoq(PPARγ信号通路)、Acsm4(脂肪酸合成)、Aacs(乙酰辅酶A合成)、FSP27(脂滴形成)、Hkdc1(葡萄糖稳态),第4d上调的基因有Adipsin、PPARγ、CideA、Adipoq、SMAF1(脂肪细胞分化)、Elovl4(脂肪酸合成)、Acsm4(脂肪酸合成)、Caveolin 1(脂肪酸代谢)、FSP27(细胞凋亡)、Acox1(脂肪酸β氧化)。第2d主要下调的基因有A1bg、Xist、Cyp2b9、Cyp2b13(花生四烯酸代谢)，第4d主要下调的有A1bg、Cyp8b1(氧化代谢)、Ppp1r3c(糖原合成)、Fmo3(氧化代谢)。其中第2d或第4d共同上调的有Adipsin、CideA、Pparg、Sdcbp2、Serpinb9f、Cav1、Adipoq、Ppic(蛋白质折叠)、Elovl4、Clstn3、Wap(泌乳素代代谢)等，共同下调的有A1bg、Cyp8b1、Fmo3(图6)。
4.4RT-PCR结果
RT-PCR结果表明，PPARγ(PPARG)、aP2、Lpin1、CideA等脂代谢相关基因在4d高倍差异表达，这与图6中的热图结果一致。
序列表
<110> 阜阳师范大学
<120> 一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggaagaccac tcgcattcct t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtmtcagcaa ccattgggtc a 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
aaggtgaaga gcatcataac cct 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tcacgccttt cataacacat tcc 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
cctccgctcc cgagagaaa 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cgttgtctcc caacttcatg t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgacattcat gggattgcag ac 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
catggtttga aactcgaaaa ggg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtgacgttga catccgtaaa ga 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gccggactca tcgtactcc 19
Claims (8)
1.一种外源表达PPARγ对肝脏脂肪变性及脂质代谢相关基因影响的研究方法，其特征在于：
将实验小鼠分成三组，分别尾静脉注射LacZ腺病毒4d、PPARγ腺病毒2d、PPARγ腺病毒4d，处死后获取肝脏组织；肝脏组织经过制作石蜡切片进行H&E染色、制作冰冻切片进行油红O染色、提取肝脏组织总RNA进行基因芯片分析；H&E染色和油红O染色后观察肝脏脂肪病变程度；基因芯片分析用于筛选出外源性表达PPARγ引起肝脏中差异表达的基因。
2.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，提取肝脏组织总RNA获取基因芯片的方法为：
用Takara RNA试剂盒提取三组肝脏组织的总RNA，运用生物素标记RNA探针，然后与小鼠Illumina WG-6Bead Chip杂交，得到三组小鼠的全基因转录数据。
3.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，基因芯片分析的方法为：
通过NCBI数据库进行基因查找和比对，筛选出两组PPARγ腺病毒注射组与LacZ腺病毒注射组的差异表达基因，然后用GO基因富集分析、Venn Diagram和HeatMap研究差异表达基因的分布，从而获取差异基因的富集情况以及差异基因中的脂代谢相关基因的分布情况。
4.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，还包括验证基因芯片结果的过程，其方法为：选择四个脂代谢差异表达基因为目的基因，以LacZ腺病毒注射组为对照组、PPARγ腺病毒4d注射组为实验组，使用实时定量PCR验证目的基因的表达情况，表达情况由mRNA相对丰度表示，目的基因的含量与内参基因含量比为目的基因的mRNA相对丰度；
其中，目的基因分别为PPARG、aP2、Lpin1和CideA；四个基因对应的引物分别为：
正向引物，5'-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3'；反向引物，5'-GTMTCAGCAACCATTGGGTCA-3'；
正向引物，5'-AAGGTGAAGAGCATCATAACCCT-3'；反向引物，5'-TCACGCCTTTCATAACACATTCC-3'；
正向引物，5'-CCTCCGCTCCCGAGAGAAA-3'；反向引物，5'-CGTTGTCTCCCAACTTCATGT-3'；
正向引物，5'-TGACATTCATGGGATTGCAGAC-3'；反向引物，5'-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3'；
其中，内参基因为β-actin，其对应的引物为：
正向引物，5'-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'；反向引物，5’-CATGGTTTGAAACTCGAAAAGGG-3’。
5.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，所述石蜡切片的制作方法为：
将肝脏组织经4％多聚甲醛固定后，按照以下步骤进行脱水：70％乙醇4h；80％乙醇2h；90％乙醇1h；95％乙醇2次，每次2h；100％乙醇2次，每次1h；二甲苯3次，每次1h；硬蜡2次，每次2h；脱水后石蜡包埋，切片即可。
6.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，所述H&E染色的方法为：
将石蜡切片按以下步骤脱蜡染色：二甲苯3次，每次7min；100％乙醇2次，每次1min；95％乙醇2次，每次1min；80％乙醇1min，70％乙醇1min，流水2min；苏木素染色7min，流水冲洗5min；盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min；伊红染色5min，然后脱水和透明，即80％乙醇15s；95％乙醇2次，每次1min；100％乙醇2次，每次1min；二甲苯3次，每次3min；中性树胶封片。
7.根据权利要求1的研究方法，其特征在于，所述冰冻切片的制作方法为：将肝脏组织进行OCT包埋，经冷冻切片机切片，置于-80℃冰箱储藏。
8.根据权利要求1的研究方法，其特征在于：所述油红O染色的方法为：
将冰冻切片复温干燥10min，50％乙醇稍洗，浸入60％异丙醇溶解的油红O染液10min，60％乙醇分化10s，流水冲洗2min,苏木素复染2s，1％盐酸乙醇分化15s，流水冲洗5min，甘油明胶封片。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040235019A1 (en) * | 2003-03-06 | 2004-11-25 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Diagnostics and therapeutics for the gene expression signature of PPAR-gamma receptor ligand |
| CN101600715A (zh) * | 2006-12-21 | 2009-12-09 | 辉瑞产品公司 | 具有血管紧张素II受体拮抗作用和PPARγ活化活性的化合物 |
| CN105850867A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-08-17 | 大连大学 | 一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法 |
| US20200024660A1 (en) * | 2018-06-19 | 2020-01-23 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Animal model of non-alcoholic liver disease and composition of diagnosis, prevention or treatment for non-alcoholic liver disease |
-
2020
- 2020-02-25 CN CN202010116257.9A patent/CN111304315A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040235019A1 (en) * | 2003-03-06 | 2004-11-25 | Agouron Pharmaceuticals, Inc. | Diagnostics and therapeutics for the gene expression signature of PPAR-gamma receptor ligand |
| CN101600715A (zh) * | 2006-12-21 | 2009-12-09 | 辉瑞产品公司 | 具有血管紧张素II受体拮抗作用和PPARγ活化活性的化合物 |
| CN105850867A (zh) * | 2016-03-28 | 2016-08-17 | 大连大学 | 一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法 |
| US20200024660A1 (en) * | 2018-06-19 | 2020-01-23 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Animal model of non-alcoholic liver disease and composition of diagnosis, prevention or treatment for non-alcoholic liver disease |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YUTAKA NAKACHI等: "Identification of novel PPARc target genes by integrated analysis of ChIP-on-chip and microarray expression data during adipocyte differentiation", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
| 曹瑞等: "共轭亚油酸对肥胖大鼠肝脏脂质代谢酶及PPARγ基因表达的影响", 《军事医学科学院院刊》 * |
| 白亮等: "PPARγ及其辅激活子MED1重组腺病毒的制备与生物学功能分析", 《西安交通大学学报(医学版)》 * |
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