CN104335970A - 一种构建人银屑病小鼠模型的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种构建人银屑病小鼠模型的方法，以及其在药物筛选中的应用。本发明构建人银屑病小鼠模型的方法，采用的是条件性基因打靶技术，通过同源重组的方法构建IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠，并将所述标记小鼠与在组织特异性启动子SM22的控制下表达Cre重组酶的小鼠杂交，筛选，获得银屑病小鼠模型。本发明的人银屑病小鼠模型具有构建方法简便、经济，与人银屑病表现高度相似等优点，并且动物模型使用方便，极具市场价值和医药用途的前景。
Description
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种构建人银屑病小鼠模型的方法，以及其在药物筛选中的应用。
背景技术
银屑病是人类最常见的一种皮肤疾病。典型的皮肤表现是境界清楚的具有银白色鳞屑的红色斑块。轻者可表现为几个银币大小的肘膝部位斑块，重者也可以全身皮肤受累。难于根治，易复发是该病在临床上的一个重要特征。银屑病的病因十分复杂。到目前为止，该病的具体病因还没有定论，研究提示该病的发生主要与遗传因素，感染，代谢障碍，免疫功能障碍，以及内分泌障碍等多种因素的共同作用有关。
该病的组织病理表现为表皮角化过度伴有角化不全，角质层内或棘层上部可见中性粒细胞聚集，分别称为Munro微脓肿和Kogoji海绵状微脓肿，棘层增厚，表皮突下延，末端常增宽，真皮乳头呈杵状，顶部变薄，血管扭曲扩张，真皮上部慢性炎细胞浸润。
银屑病的病理生理的特点在于各种细胞间非常复杂的相互作用，特别是表皮细胞与各种免疫细胞之间的相互影响。几十年来，关于是表皮细胞还是免疫细胞缺陷引起银屑病的争论还在继续。
由于极少有自发的动物银屑病，如何制备人银屑病动物模型长期以来都是该病研究的一个主要挑战。目前最可靠的动物模型是将患者受累皮肤移植到联合免疫缺陷的小鼠。该模型虽然忠实地模拟了银屑病的局部表现，但却排除了全身免疫系统的影响。另外，该模型制备方法复杂，材料来源有限，保存时间短，因此难以大规模地使用。
近来，Van der Fits L等博士发现表皮涂抹TLR7/8激动剂Imiquimod可引起明显的银屑病样的皮肤病理表现，并有证据提示与人银屑病相似，Th17和树突状细胞在引起这些病理方面有非常重要的作用（J Immunol182：5836-45）。然而，该模型虽然制备方便，但最近发现，成功用于人银屑病治疗的TNF抑制剂反而可能促进Imiquimod引起的皮肤病理表现（Int J Immunopathol Pharmacol.24:509-15.），说明该模型与人银屑病在致病机理上可能有很大的不同。通过基因改造，目前已建立了多种银屑病的小鼠模型。然而根据 Martha-Estrella Garcia-Perez等博士(Recent Patents on Inflammation&Allergy Drug Discovery2012,6,3-21)以及Frank O.Nestle等博士（New England Journal of Medicine2009，361：496-509）最近所作的综述，这些模型都有一些不同的缺陷。
例如，转录因子NF-κB在慢性炎症反应中发挥非常关键的作用。IKK2是NF-κB信号通路被胞外刺激激活所必需的一种蛋白激酶。正常情况下，NF-κB与抑制蛋白IκB结合而被留在细胞浆中。当细胞受到刺激后，IKK2被激活进而磷酸化IκB，并引起后者被泛素系统识别和降解。因而导致NF-κB被释放出来，进入细胞核发挥其转录因子功能引起一系列的炎症因子的表达，引起或放大炎症反应。现有技术分别改造IKK2/NF-κB信号通路上多个不同的基因都出现了银屑病样的病理表现（Vet Pathol45：563-575），充分说明了该信号通路在银屑病中的关键作用。Haase博士的实验室首先发现表皮特异的IKK2基因敲除小鼠可以引起全身性的银屑病样病灶（Nature.417:861-6）。组织学分析显示这些病灶与人银屑病的病理改变非常相似：表皮细胞增生，颗粒层缺失，局部角化不全，真皮中巨噬细胞，T细胞，肥大细胞以及粒细胞的浸润，粒细胞也侵入表皮并形成微脓肿。然而，这些小鼠在出生后不久就死亡，限制了该小鼠作为银屑病动物模型的应用。这个实验室还培育出了可诱导的表皮特异IKK2基因敲除小鼠（J Invest Dermatol.126:614-20.）。但这些小鼠有明显的非特异性的基因敲除，给这些小鼠作为银屑病动物模型带来了一个非常不利的因素。
可见，人们需要更多的其它简便、经济、与人银屑病表现高度相似的动物模型，用于研究该病的发病机制和筛查对治疗这种疾病的可能有效的候选药物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简便、经济的人银屑病小鼠模型的建立方法，并采用本发明构建的人银屑病小鼠模型用于银屑病治疗药物的筛选，可以简便、快速和高效的实现对抗银屑病药物的定性和/或定量评价。
本发明首先公开了一种构建人银屑病小鼠模型的方法，采用的是条件性基因打靶技术，将IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠，与在组织特异性启动子SM22的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得银屑病小鼠模型。
以Cre/LoxP系统与基因打靶技术相结合的条件性基因打靶(conditional gene targeting)策略主要是运用DNA重组方法来构建打靶基因置于同向LoxP之内的打靶载体,经在ES细 胞（胚胎干细胞）上同源重组及筛选,将携带该载体的小鼠与受控于组织特异性启动子的Cre基因的转基因小鼠交配,经Cre介导重组,即可获得靶基因在某一组织器官上缺失的基因敲除小鼠。
进一步的，所述人银屑病小鼠模型的构建步骤如下：
1）构建标记小鼠：通过同源重组的方法构建IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠；
2）构建Cre小鼠：构建在组织特异性启动子SM22的作用下表达Cre重组酶的Cre小鼠；
3）将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选，获得剔除IKK2基因的纯合子小鼠即为人银屑病小鼠模型。
本发明所述剔除IKK2基因的纯合子小鼠并不是在小鼠所有细胞基因组上都存在基因的缺失，而只是在受SM22启动子调控的特定组织中缺失，是IKK2基因被条件性敲除的纯合子小鼠。
较优的，所述人银屑病小鼠模型的构建步骤具体为：
1）构建标记小鼠：将含有Lox-IKK2-Lox基因片段的载体转化胚胎干细胞，使其与胚胎干细胞的IKK2基因组发生同源重组；然后将同源重组后的阳性胚胎干细胞植入胚胎，产生IKK2基因两侧带有loxP位点的后代即为标记小鼠；
2）构建Cre小鼠：通过转基因技术将表达Cre重组酶的基因引入基因组中，并位于组织特异性基因启动子SM22的控制下，获得在组织特异性启动子SM22的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠；
3）将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选头部出现银屑病样病灶并剔除了IKK2基因的纯合子小鼠，即为人银屑病模型小鼠。
较优的，所述启动子SM22含有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
Cre是来源于P1噬菌体cre基因所编码的一个38ku蛋白,属于Int家族。它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为LoxP的特异靶位点,并根据LoxP的方向性,可在各种底物上介导三种不同的重组事件：a.同向位点之间序列的缺失；b.插入序列；c.两个反向位点之间序列颠倒。
靶基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠的构建，以及组织特异性启动子控制下的Cre 小鼠的构建均属于现有技术。本发明所针对的靶基因为IKK2基因，Cre重组酶受启动子SM22的控制特异性表达，条件性剔除小鼠体内特定部位的IKK2基因。本发明实施例中，标记小鼠采用的是IKK2Flox/Flox转基因小鼠，Cre小鼠为SM22-Cre小鼠，均为现有的已构建小鼠。
本发明其次公开了一种人银屑病小鼠模型，由前述方法制备获得。
本发明的人银屑病小鼠模型，其体内受SM22启动子控制的IKK2基因的表达被选择性的抑制，小鼠在头部出现人银屑病样病灶。
银屑病样的病理表现：典型的皮肤表现是境界清楚的具有银白色鳞屑的红色斑块。
本发明还公开了前述构建人银屑病小鼠模型的方法，以及前述人银屑病小鼠模型在制备或筛选银屑病治疗药物中的应用。
本发明最后一方面公开了一种筛选银屑病治疗药物的方法，为将银屑病治疗备选药物施用于前述人银屑病小鼠模型的病灶部位；通过比较用药前后小鼠头部的银屑病面积严重指数（Psoriasis Area Severity Index，PASI）的变化，筛选出使小鼠头部的银屑病面积严重指数减小的药物做为银屑病治疗药物。
所述银屑病面积严重指数的计算方法如下：
PASI=发红面积×发红严重程度+增厚面积×增厚严重程度+多鳞面积×多鳞严重程度
其中，发红面积为发红病灶面积占头部总面积的百分比×100；增厚面积为增厚病灶面积占头部总面积的百分比×100；多鳞面积为多鳞病灶面积占头部总面积的百分比×100；发红严重程度、增厚严重程度、多鳞严重程度分别根据病灶的病变严重程度对每个类型的病灶进行打分，包括：1（分）为轻微，2（分）为严重。
计算发红面积、增厚面积、以及多鳞面积的方法可以为：对小鼠进行腹腔注射戊巴比妥钠（67μg/g小鼠体重），待小鼠完全麻醉后，摄取头部照相，然后，利用Image J程序计算出病灶面积占头部总面积的百分比。
本发明的提供了一种简便、经济、与人银屑病表现高度相似的皮肤炎症小鼠模型。本发明方法的建立是基于SM22-Cre只在小鼠特殊部位的皮肤表达的最新发现。SM22-Cre的表达被认为是平滑肌特异的；但是本发明却发现SM22-Cre在皮肤中只在小部分地方表达。 由于全部皮肤IKK2的敲除会引起小鼠在出生后不久死亡，因而极大地限制了它们作为一个动物模型在机理研究和药物筛选方面的应用，目前现有技术尚未发现有很好的只在局部皮肤表达的Cre重组酶。而本发明基于SM22-Cre只在小鼠特殊部位的皮肤表达的最新发现开发出能长期存活的人银屑病小鼠模型。
本发明利用现有的已成熟的条件性基因敲除技术，培育出SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠。该小鼠在头部有着与人银屑病非常相似的病灶；并且在头部病灶部位，有明显地角质形成细胞异常的分化和增殖表皮细胞增生，颗粒层缺失，局部角化不全，真皮中有大量免疫细胞的浸润，以及明显的毛细血管的扩张；组织学上与人银屑病极为相似。
综上所述，本发明的人银屑病小鼠模型具有构建方法简便、经济，与人银屑病表现高度相似等优点，并且由于本发明中小鼠银屑病样病灶的形成是自发的，不需要特别的处理，因此，相对于已有的模型如皮肤移植或药物诱导，小鼠的使用更为方便，极具市场价值和医药用途的前景。
附图说明
图1：SM22-CreIKK2Flox/Flox转基因小鼠与IKK2Flox/Flox小鼠杂交谱系
图2：小鼠基因型的PCR基因定型结果
图3：IKK2基因在不同组织中敲除的情况
图4：SM22-CreIKK2Flox/Flox模型小鼠表观与基因型的验证（N指正常皮肤，L指病灶部位）
图5：SM22-Cre转基因小鼠在特定部位皮肤表达（A.SM22-Cre阴性ROSA2阳性小鼠全身半乳糖苷酶染色；B.SM22-Cre阳性ROSA2阳性小鼠全身半乳糖苷酶染色；C.SM22-Cre阴性ROSA2阳性小鼠头部皮肤切片后半乳糖苷酶染色；D.SM22-Cre阳性ROSA2阳性小鼠头部皮肤切片后半乳糖苷酶染色）
图6：IKK2Flox/Flox对照小鼠和SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠摄影分析（空心箭头所指为银屑病样病灶；实心箭头所指为溃疡型病灶）
图7：小鼠头部病灶皮肤的免疫荧光分析（K14，基底角质形成细胞标志；K10，分化中角质形成细胞标志；Loricrin，终末期分化的角质形成细胞的标志；K6，皮肤 炎症标志）
图8：小鼠头部皮肤组织学分析
图9：小鼠头部皮肤组织化学分析
图10：代表性的各种银屑病样病变病灶
图11：SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠经抗TNF处理前后，头部病灶的代表性照片（A）和PASI值（B）
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
实施例1SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠的构建
1.实验材料
SM22-Cre转基因小鼠，购自Jackson Laboratory（品系号004746）；该品系小鼠的Cre酶表达序列位于组织特异性启动子SM22的控制之下。
IKK2Flox/Flox小鼠，购自Michael Karin实验室，为基因工程小鼠；该品系小鼠在IKK2基因中插入了Cre酶识别序列，当存在Cre酶时，细胞的IKK2基因部分片段就会被敲除，从而使IKK2基因彻底失活。
2.实验方法及分析
1）实验小鼠的构建：
通过SM22-CreIKK2Flox/Flox与IKK2Flox/Flox配对来生产实验用小鼠，如图1所示，通过两代的杂交，我们得到了SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠，并同时得到可作为对照的同窝IKK2Flox/Flox小鼠。
2）小鼠的基因型检测
通过标准的PCR基因定型方法，检测小鼠的基因型。实验对象为前一步骤制备的随机 的两只野生型小鼠和随机的两只杂合子小鼠；小鼠基因组DNA通过标准程序从小鼠尾巴分离，作为PCR扩增的模板。PCR扩增试剂为Roche Applied Science所提供的FastStart PCR Master试剂盒，并按照该试剂盒提供的方法进行扩增。在每个扩增反应中，加入了三个引物，可以扩增所有的基因型。所用引物序列如表1。
表1引物序列
实验结果见图2，可以清楚地看出野生型、Flox插入和敲除IKK2基因后的基因有不同大小的PCR扩增片段，很容易通过琼脂糖黏胶电泳加以分离。图2显示，野生型小鼠仅含有野生型IKK2基因；而杂合子体内则含有Flox插入标记的IKK2基因和敲除IKK2基因后的基因。
3）SM22-CreIKK2Flox/Flox模型小鼠的基因水平验证
通过标准的PCR基因定型方法（同上一方法），检测IKK2基因在不同组织中敲除的情况。实验对照为纯合子的SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠的不同组织，例如主动脉、肺、心脏、脾、尾巴、肾、肝脏以及脂肪等，以及杂合子SM22-CreIKK2Flox/Wt小鼠的尾巴；PCR扩增试剂为Roche Applied Science所提供的FastStart PCR Master试剂盒，并按照该试剂盒提供的方法进行扩增。在每个扩增反应中，加入了三个引物，可以扩增所有的基因型。
实验结果见图3所示，在SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠中，IKK2基因主要在主动脉被敲除的比例最高，其次是肺和心脏。这些结果与以前报道的SM22-Cre的表达完全一致。
4）SM22-CreIKK2Flox/Flox模型小鼠的表观验证
A．通过大量实验发现，步骤1）培育获得的SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠总是在特定部位出现炎性皮肤病灶。因此，采用前述的PCR基因定型方法检测这些特定部位皮肤的IKK2基因敲除情况，实验结果见图4：相对于炎性皮肤病灶邻近正常皮肤的低水平IKK2基因敲除，病灶部位皮肤的IKK2几乎被完全敲除，显示出IKK2基因敲除与炎性皮肤病灶形成之间的因果关系。
B．将SM22-Cre转基因小鼠与ROSA26报道小鼠ROSA26报道小鼠（ROSAβgeo26， 由美国Fred Hutchinson癌症中心的Philippe Soriano博士实验室构建）杂交，取新生小鼠对报道基因半乳糖苷酶进行染色，实验结果见图5。
ROSA26与在特殊启动子控制下的CRE重组酶的小鼠杂交，产生的F1代可以被表达的CRE切掉阻碍LACZ翻译的终止子，从而起始LACZ表达。因此某些特殊的组织或细胞就可以被LACZ染色追踪。由图5可知，报道基因半乳糖苷酶确实只在特定的局部皮肤表达。
实施例2IKKA基因选择性敲除的人银屑病小鼠模型的表型分析
1.小鼠表型观察
在三周龄时，对同一窝的IKK2Flox/Flox对照小鼠和SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠麻醉后，进行摄影分析。
结果如图6所示，空心箭头所指为银屑病样病灶，实心箭头所指为溃疡型病灶。SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠出现了两种不同的病灶：在头部和尾巴，病灶在头部的小鼠有着与人银屑病非常相似的病灶；而在臀部则表现为溃疡型的病灶。可见本发明的IKK2基因选择性敲除的人银屑病小鼠模型（SM22-CreIKK2Flox/Flox）确实能够在小鼠的特定部位，包括头部及尾部表现出银屑病样病灶。
2.免疫荧光分析
1）组织处理：小鼠经麻醉褪毛后，相关部位的皮肤被小心取下来，并用4%中性甲醛进行固定。标本经石蜡包埋处理后，用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。经60℃烘片2-8小时，室温保存待用。
2）切片处理：二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟，二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。梯度酒精复水：100%酒精3分钟，100%酒精3分钟，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟,75%酒精3分钟，50%酒精3分钟，蒸馏水3分钟，蒸馏水3分钟，PBS5分钟。
3）抗原修复：将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。
4）封闭处理：PBS3分钟，加入0.3%Triton X10030分钟，PBS清洗5min×3。用滤纸擦去标本外的PBS，滴加1%牛白蛋白，在湿盒中室温封闭30分钟。
5）抗体处理：用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加一抗置湿盒中4℃孵育过夜（购自美国Abcam公司），再用PBS3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。除检测Loricrin（该抗体为荧光标记抗体，购自美国Abcam公司）外，其他检测都滴加荧光二抗（Cell Signaling Technology公司，Alexa488标记，1：1000）室温置湿盒中避光孵育1小时，用PBS3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加DAPI避光孵育2分钟。用PBS1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS。最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察
实验结果见图7，免疫荧光分析清楚地表明，在头部病灶部位，有明显地角质形成细胞异常的分化和增殖,，具体表现为角质形成细胞终末期分化标志Loricrin表达得缺失，角质形成细胞分化标志K10表达的降低，以及基底角质形成细胞标志K14表达的升高；与人银屑病相类似，皮肤炎症标志K6在病灶局部明显升高。
3.头部皮肤组织学分析
1）H&E染色和组织学分析
组织处理：小鼠经麻醉褪毛后，相关部位的皮肤被小心取下来，并用4%中性甲醛进行固定。标本经石蜡包埋处理后，用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。经60℃烘片2-8小时，室温保存待用。切片处理：二甲苯Ⅰ，10分钟；二甲苯Ⅱ，10分钟；无水乙醇Ⅰ，5分钟；无水乙醇Ⅱ，5分钟；95%乙醇，5分钟；95%乙醇，5分钟；85%乙醇，5分钟；75%乙醇，5分钟；自来水，2分钟。染色：苏木精染色，5分钟；自来水，1分钟；1%盐酸乙醇分化，数秒；自来水，1分钟；0.2%氨水返蓝，30s；自来水，1分钟；伊红染色，2分钟；自来水，速洗。脱水、透明、封固：80%乙醇，1分钟；90%乙醇，1分钟；95%乙醇Ⅰ，1分钟；95%乙醇Ⅱ，1分钟；无水乙醇Ⅰ，1分钟；无水乙醇Ⅱ；1分钟；二甲苯Ⅰ，3分钟；二甲苯Ⅱ，3分钟；二甲苯Ⅲ，3分钟；中性树胶封固。
2）免疫组化分析
组织处理：小鼠经麻醉褪毛后，相关部位的皮肤被小心取下来，并用4%中性甲醛进行固定。标本经石蜡包埋处理后，用切片机切石蜡切片(5微米)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上。经60℃烘片2-8小时，室温保存待用。切片处理：二甲苯Ⅰ脱蜡30分钟，二甲苯Ⅱ脱蜡10分钟。梯度酒精复水：100%酒精3分钟，100%酒精3分钟，95%酒精3分钟，85%酒精3分钟,75%酒精3分钟，50%酒精3分钟，蒸馏水3分钟，蒸馏水3分钟，PBS5分钟。抗原修复：将切片置于0.1mol/L且ph=6.0的枸橼酸液修复液中，用微波炉100火力三分钟至微微沸腾，再用50火力维持7分钟，停止加热后自然冷却20-30分钟。封闭处理：PBS3分钟，加入0.3%Triton X10030min，PBS清洗5min×3。用滤纸擦去 标本外的PBS，滴加1%牛白蛋白，在湿盒中室温封闭30分钟。抗体处理：用滤纸擦去封闭液，勿洗。滴加一抗置湿盒中4℃孵育过夜（AbD Serotec公司，1:10），再用PBS3分钟×5次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS。滴加碱性磷酸酶标记的二抗（Cell Signaling Technology公司，1：1000）室温置湿盒中孵育1小时，用PBS3分钟×3次洗去二抗，用滤纸擦去标本外的PBS。加入显色液（Sigma公司），进行免疫组织化学显色。可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入PBS终止反应。细胞核负染，梯度酒精脱水，封片，拍照。
实验分析：通过H&E染色和组织学分析，可以发现病灶部位表现与人银屑病极为相似：表皮细胞增生，颗粒层缺失，局部角化不全，真皮中有大量免疫细胞的浸润，以及明显的毛细血管的扩张（图8）；其中大量巨噬细胞的浸润已利用细胞表面标志抗体F4/80所证实（图9）。
实施例3人银屑病小鼠模型的遗传分析
1.实验方法
将实施例1构建的出生后三周的SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠与IKK2Flox/Flox小鼠杂交，杂交获得的子一代的基因型分布如表2所示；病灶发生时间与小鼠生长周期的关系如表3所示；对杂交子一代的模型小鼠在20周时进行摄影分析，图10为有代表性的各种银屑病样病变病灶。
表2子一代的基因型分布
表3病灶与小鼠生长周期的关系
2.实验结果分析
由表2子代基因型以及性别的分布可知，SM22-CreIKK2Flox/Flox基因型小鼠发育与正常小鼠没有显著性差异；并且分析本发明构建的人银屑病模型小鼠的子代基因型以及性别的分布发现，其完全吻合孟德尔遗传规律，表明本发明中所用的基因改造对小鼠发育没有致命的影响，小鼠可正常繁殖，因此可以把制备动物模型的成本降到最低。
通过观察头部病灶在新生小鼠中出现的时间，发现绝大部分小鼠在出生后两周内即出现明显的银屑病样病灶（表3）。这些病灶在被观察的小鼠中都是持续终生。病灶的出现和持续与小鼠的性别没有关系；因此，出生两周后的SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠，无论性别，都可以用作银屑病动物模型，进一步保证了本模型的经济性。
实施例4人银屑病小鼠模型筛选药物的应用
抗TNF生物制剂是目前临床上治疗银屑病最为有效的一类药物，本发明通过抗TNF生物制剂对银屑病小鼠模型用药，并通过PASI公式进行筛选，证实SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠在抗银屑病药物筛选中的应用，具体实验方法如下。
1.实验方法：
1）实验对象：选择实施例1构建的头部显示银屑病病灶的8-10周雄性SM22-CreIKK2Flox/Flox小鼠六只。
实验药品：抗TNF生物制剂
2）方法：
将小鼠分为两组，每组三只，作为治疗组和对照组，分别给予腹腔注射抗TNFα抗体（治疗组，CNTO5048，300微克/只/3天，总共21天）和生理盐水溶液（对照组，25微升/只/3天，共21天）。用药21天后，小鼠被腹腔注射戊巴比妥钠（67μg/g小鼠体重），待完全麻醉后，摄取头部照相，然后，利用Image J程序计算出每只小鼠的PASI，PASI计算方法的公式如下：
PASI=发红面积×发红严重程度+增厚面积×增厚严重程度+多鳞面积×多鳞严重程度。
其中，发红面积为发红病灶面积占头部总面积的百分比×100；增厚面积为增厚病灶面积占头部总面积的百分比×100；多鳞面积为多鳞病灶面积占头部总面积的百分比×100。 并根据病灶的病变严重程度对每个类型的病灶进行打分，病变严重程度包括1分和2分，1（分）为轻微，2（分）为严重。图11提供了各种类型严重病变的典型图片。由于同一病灶可同时具有不同类型的特征，因此，不同类型间并不相互排斥。
2.实验结果
图11A显示了两组小鼠中有代表性的图片，可以明显看出经抗TNFα抗体治疗的小鼠（治疗组）其头部银屑病样病变的面积和严重程度较对照组明显降低；图11B显示的是这两组小鼠的治疗前与治疗后的PASI值。由图11B可知，治疗组的PASI值，治疗后较治疗前显著降低；而对照组的银屑病症状则进一步发展并趋于严重。证明确实可以通过PASI值的计算，筛选银屑病治疗药物。
Claims (8)
1.一种构建人银屑病小鼠模型的方法，利用条件性基因打靶技术，其特征在于，将IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠，与在组织特异性启动子SM22的控制下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得人银屑病小鼠模型。
2.如权利要求1所述构建人银屑病小鼠模型的方法，其特征在于，所述人银屑病小鼠模型的构建步骤如下：
1）构建标记小鼠：通过同源重组的方法构建IKK2基因两侧带有同向loxP位点的标记小鼠；
2）构建Cre小鼠：构建在组织特异性启动子SM22的作用下表达Cre重组酶的Cre小鼠；
3）将标记小鼠与Cre小鼠杂交，筛选，获得剔除IKK2基因的纯合子小鼠即为人银屑病小鼠模型。
3.如权利要求1或2任一权利要求所述构建人银屑病小鼠模型的方法，其特征在于，所述启动子SM22含有SEQ ID NO：4所示核苷酸序列。
4.一种人银屑病小鼠模型，由权利要求1-3任一权利要求所述方法制备获得。
5.如权利要求4所述的人银屑病小鼠模型，其特征在于，所述小鼠模型体内受SM22启动子控制的IKK2基因的表达被选择性的抑制，小鼠在头部出现人银屑病样病灶。
6.权利要求1-3任一权利要求所述构建人银屑病小鼠模型的方法，以及权利要求4或5任一权利要求所述人银屑病小鼠模型在制备或筛选银屑病治疗药物中的应用。
7.一种筛选银屑病治疗药物的方法，为将银屑病治疗备选药物施用于权利要求4或5任一权利要求所述人银屑病小鼠模型的病灶部位；通过比较用药前后小鼠头部的银屑病面积严重指数的变化，筛选出使小鼠头部的银屑病面积严重指数减小的药物做为银屑病治疗药物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述银屑病面积严重指数的计算方法如下：银屑病面积严重指数=发红面积×发红严重程度+增厚面积×增厚严重程度+多鳞面积×多鳞严重程度；
其中，发红面积为发红病灶面积占头部总面积的百分比×100；增厚面积为增厚病灶面积占头部总面积的百分比×100；多鳞面积为多鳞病灶面积占头部总面积的百分比×100；发红严重程度、增厚严重程度、多鳞严重程度分别根据病灶的病变严重程度对每个类型的病灶进行打分，包括：1分为轻微，2分为严重。
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