CN108245656A - 一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及动物模型领域，具体涉及一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法及应用；包括以下步骤a、选取健康的模型豚鼠，通过豚鼠灌胃给予复方热药水煎剂，连续四周获得血热证豚鼠模型；b、取步骤a获得的血热证豚鼠模型双耳均涂抹心得安乳剂，连续三周，获得人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型；本发明改变单纯证候模型及西医病因病理模型相对单一的特点，能提供比单纯证或病模型更多的信息，在豚鼠耳部出现典型的寻常型银屑病样改变；为疾病的辨证论治提供实验动物模型，使中医辨证施治、新药药理实验有相应的动物模型采用，避免银屑病病症结合动物模型实用的缺陷，加速中医疾病证候研究的进展与新药开发，为药物评价提供技术服务。

Description

一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法及 应用

技术领域

本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法及应用。

背景技术

银屑病是一种常见的发病率较高、反复发作、宜诊难治的红斑鳞屑性慢性炎性、增殖性皮肤病，中医学称之为“白疕、松皮癣”。在自然人群的患病率约为1％～3％，临床以寻常型银屑病最为常见，其发病率约占银屑病的95％，初期为红色丘疹或斑丘疹，以后逐渐扩大或融合成片，鲜红或深红色，高出皮肤，底部浸润明显，边缘清楚，周围有炎症红晕，表面覆盖多层灰白色或银白色鳞屑。

中医认为银屑病的主要根源是血热，血热又可以由很多的因素形成：可以由七志过极导致气机内乱，气机壅滞又可久郁化热化火，以致火热亢盛，热毒伏于营血；或因嗜食辛辣厚味，肥甘油腻，腥膻动风之物，导致脾胃失和，不能运化气机，久儿郁热化火复感风热毒邪而发病；或因外感风热，风寒之邪，失治误治，表邪入里化热或素体热盛，表邪郁扼卫阳，久之郁而化热。寻常型银屑病无论在进行期、静止期还是退行期，证候类型中出现频率最多的是血热证、血燥证和血虚风燥证；旧皮损扩大，新皮损出现，鳞屑数量多、鳞屑厚呈银白色，浸润肥厚经久不退，瘙痒等是共同的临床症状。研究表明，银屑病是与遗传、环境因素、感染性因素、内分泌紊乱和细胞免疫紊乱等因素失常的免疫性疾病。

鳞屑、薄膜、出血点是诊断银屑病的重要特征，称为三联征。银屑病的发病主要涉及三个相互依赖的生物学过程：炎症、表皮过度增殖和伴有角化不全的表皮的分化。组织学特征为表皮过度增殖，颗粒层不完整，棘层显著增厚，表皮突下延，乳突伸长呈杵状，毛细血管不同程度增多且血管充血，伴炎细胞浸润。

目前较为常用的银屑病动物模型主要包括诱发性动物模型、银屑病皮损移植模型、自发性或基因突变鼠模型和转基因动物模型。这些模型主要关注某一症状的改善，评价指标相对单一，未考虑整体性。例如豚鼠耳部涂抹心得安乳剂，可出现结痂和白色银屑的症状及颗粒层变薄、棘层肥厚、基底层细胞增殖活跃炎细胞浸润的病理变化。但是缺乏寻常型银屑病热证的特点。

可见单纯运用病因病理反映中医的证候特征值得商榷，对此为改变单纯证候模型及西医病理模型难以应用的特点，病症结合模型的建立受到关注并取得一定的成就，病症结合动物模型既有西医疾病的特点，又有中医证候的特征，对于探讨疾病病理生理变化与中医证候特征之间的关系方面显示出了明显的优势。

发明内容

本发明为解决现有银屑病模型缺乏寻常型银屑病热证的特点，现有银屑病模型只是主要关注某一症状的改善，评价指标相对单一，未考虑整体性，现有的单纯证候模型及西医病理模型难以应用及反映中医的证候特征的技术问题，提供一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，包括以下步骤：

a、选取健康的模型豚鼠，通过豚鼠灌胃给予复方热药水煎剂，1次/天，连续四周获得血热证豚鼠模型；

b、取步骤a获得的血热证豚鼠模型双耳均涂抹心得安乳剂，每日早晚各一次，连续三周，即可获得人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型。

本发明所述人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型，是基于豚鼠血热证的基础上建立的耳部银屑病，体现了西医“病”与中医“证”的紧密联系。上述方法采取中医病因结合西医病理因素造模，系统地观察模型出现的证候，体现中医证的表征和西医病的指标，使动物在生物表征上模拟人的表现，构建寻常型银屑病的病证结合模型。

步骤a中所用的复方热药水煎剂为取重量份比为1:1:1的附子、干姜和肉桂用水煎成150％浓度(即1.5g生药/ml)的复方热药水煎剂。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果：

本发明公开了一种人寻常型银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型，本发明的豚鼠血热证耳部银屑病模型，改变单纯证候模型及西医病因病理模型相对单一的特点，能提供比单纯证或病模型更多的信息,符合临床实践，在豚鼠耳部出现典型的寻常型银屑病样改变。

本发明提供了一种更符合临床寻常型银屑病的豚鼠模型，本发明方法建立是基于豚鼠体温升高、口渴喜饮、精神萎顿的热证基础上，在豚鼠耳部涂抹心得安乳剂得到与临床相似的白色银屑、结痂形成、角化不全、毛细血管充血及炎细胞浸润等的血热证银屑病病症模型。

本发明的豚鼠血热证豚鼠耳部银屑病模型方法简单、经济，为疾病的辨证论治提供实验动物模型，特别是使中医辨证施治、新药药理实验有相应的动物模型采用，避免银屑病病症结合动物模型实用的缺陷，加速中医疾病证候研究的进展与新药开发，为药物评价提供技术服务，极具应用价值。

附图说明

图1为实施例1的模型组豚鼠耳背临床症状照片。

图2为实施例1的阴性组豚鼠耳背临床症状照片。

图3为实施例1的模型组组织病理学检查图像。

图4为实施例1的阴性组组织病理学检查图像。

图5为实施例2的对照组的豚鼠耳背临床症状照片。

图6为实施例2的治疗组的豚鼠耳背临床症状照片。

图7为实施例2的对照组的组织病理学检查图像。

图8为实施例2的治疗组的组织病理学检查图像。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，包括以下步骤：

a、选取健康的模型豚鼠，通过豚鼠灌胃给予复方热药水煎剂，1次/天，连续四周获得血热证豚鼠模型；

b、取步骤a获得的血热证豚鼠模型双耳均涂抹心得安乳剂，每日早晚各一次，连续三周，即可获得人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型。

步骤a中所用的复方热药水煎剂为取重量份比为1:1:1的附子、干姜和肉桂用水煎并浓缩成1.5g生药/ml的复方热药水煎剂。

所述复方热药水煎剂每次用量为15g生药/kg，给予体积为10ml/kg。

步骤b中所用的心得安乳剂为取5ml的甘油，2ml的tween80，加蒸馏水至100ml，加5g心得安粉剂，得5％心得安乳剂。

涂抹心得安乳剂的量为0.1ml/耳，厚度为1.0mm。

所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法制备获得的人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型在制备或筛选银屑病治疗药物及药物评价中的应用。

所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法制备获得的人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型在银屑病的中医辨证施治中的应用。

实施例1

人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型构建的试验例：

1)试验材料

普通级Hartley豚鼠；数量及性别：雌性10只，雄性10只；动物体重：购入体重300～350g；给药开始各组体重差异小于平均体重的20％；动物来源：北京市昌扬西山养殖场，动物生产许可证号：1140230002679，动物合格证号：SCXK(京)-2016-0007。实验动物使用许可证号：SYXK(晋)2014-0001。

2)试验方法

(1)血热证模型构建

取健康豚鼠20只，雌雄各半，按性别及体重随机分为阴性组和模型组，每组10只。血热证豚鼠每天灌胃复方热药水煎剂(附子、干姜、肉桂以1:1:1比例取药用水煎成1.5g生药/ml的复方热药水煎剂，1次/天，每次15g/kg，10ml/kg，连续用药4周，豚鼠经灌服热性药后出现萎顿、口渴喜饮、饮水增多等现象，每周检测一次体温，体温升高且与阴性组比较差异显著，表明热证成功。

(2)豚鼠血热证耳部银屑病模型

取肛温符合条件的豚鼠耳部涂抹心得安乳剂，阴性组不涂药，其余各剂量组豚鼠双耳背部均涂抹质量体积比为5g/100ml心得安乳剂(5％心得安乳剂：乳剂基质：甘油5ml，tween80 2ml，加蒸馏水至100ml即可)0.1ml/耳，厚度约1.0mm(1ml＝1cm3即0.1ml/耳，10mg/只心得安)，每日2次，连续3周，每天观察豚鼠耳组织临床症状；给药结束后，取豚鼠耳组织以10％的中性福尔马林液充分固定(不少于48h)，修取耳组织，经冲洗→酒精梯度脱水→二甲苯透明→石蜡包埋→切片(厚度不超过5μm)→展、烤片→HE染色→封片，光镜下观察耳组织病理变化，并在10(目镜)×20(物镜)视野下，随机选取5个视野采集图像，按照按Baker法对耳组织进行积分评估和炎细胞计数，评分标准如下：角质层中见有Munro小脓疡计2.0分；过度角化计0.5分；焦化不全计1.0分。表皮层中见有颗粒层变薄或消失计1分；棘层肥厚计1.0分；皮突延长、起伏，根据轻、中、重分别计0.5，1.0，1.5分；真皮层见有单核及多核细胞浸润，根据轻，中，重程度分别计分0.5，1.0，2.0分；乳突上顶计0.5分；毛细血管扩张计0.5分。

3)实验结果

(1)豚鼠血热证模型

豚鼠通过经口灌胃给予复方热药水煎剂后，肛温随着给药时间的进行，逐渐出现精神萎顿、口渴喜饮的症状，肛温升高，给药3周时模型组肛温与阴性组比较差异显著p＜0.05，给药4周时差异极显著p＜0.01，表明血热证模型构建成功，检测结果见表1。

表1给予复方热药4周后豚鼠肛温检测结果(mean±SD)

注：与模型组相比*p<0.05，**p<0.01。

(2)豚鼠血热证耳部银屑病病症模型

耳部给予心得安乳剂后，耳部潮红，耳背部出现丘疹，白色银屑随着心得安给予时间的延长逐渐增多，基底鲜红，表面粗糙、质地变硬、厚度增加，如图1所示；阴性组耳部未见异常，如图2所示；组织病理学结果可见皮肤角化过度形成较厚的结痂，颗粒层不完整，棘层显著增厚，表皮突下延，乳突伸长呈杵状，新生毛细血管不同程度增多且血管充血，炎细胞浸润及水肿等病变，如图3所示；阴性组豚鼠耳部皮肤可见菲薄的角质层、颗粒层、棘细胞层、肌层及软骨，并可见毛囊及皮脂腺等结构，各层形态正常，结构清楚未见病理变化，如图4所示。耳组织Baker评分结果显示，模型组4.41显著高于阴性组0.98，差异极显著p<0.01，见表2。

表2豚鼠耳组织Baker评分检测结果(mean±SD)

注：与阴性组相比**p<0.01。

实验分析：通过肛温检测、耳部皮肤临床症状及组织病理学分析，可以发现豚鼠血热证耳部银屑病模型同时具有疾病和证候的特征，与临床银屑病皮损以丘疹、斑丘疹为主，浸润明显，鳞屑较多，基底皮色鲜红，可见点状出血，或有不同程度瘙痒，伴有心烦口渴或口干等症状极其吻合，进一步证实了本模型的可行性。

实施例2

人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型在筛选治疗银屑病药物的应用：

1)实验对象：选择实施例1构建的血热证豚鼠8只，雌雄各4只。

实验药物：银消散

2)方法：将血热证豚鼠分为治疗组和对照组，两组豚鼠耳部涂抹心得安乳剂并当天开始按体重同时经口灌胃给药，治疗组给予银消散(给药剂量：2.0g/kg，给药体积10ml/kg，给药时间：3周)；对照组给予灭菌生活饮用水(给予体积10ml/kg，给予时间：3周)，末次给药结束后24h采集豚鼠耳组织样本进行检测。

2实验结果

1)血热证豚鼠肛温变化见表3

表3给予复方热药4周豚鼠肛温检测结果(mean±SD)

2)豚鼠耳组织Baker评分检测结果见表4

表4豚鼠耳组织Baker评分检测结果(mean±SD)

3)豚鼠耳背临床症状及组织病理学检查见图5～8。

实施例2结果显示，给予银消散治疗后与模型组比较，豚鼠耳部病变明显改善，Baker评分降低，耳背部银屑病的症状减轻，镜检结果显示棘层厚度变薄，乳突变短，炎细胞浸润有所减轻，而模型组较为严重。证明模型可行性和适用性好，可以对中药新药的研究提供更有效、更完善的技术服务。

Claims (7)

1.一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤

a、选取健康的模型豚鼠，通过豚鼠灌胃给予复方热药水煎剂，1次/天，连续四周获得血热证豚鼠模型；

b、取步骤a获得的血热证豚鼠模型双耳均涂抹心得安乳剂，每日早晚各一次，连续三周，即可获得人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型。

2.根据权利要求1所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，其特征在于：步骤a中所用的复方热药水煎剂为取重量份比为1:1:1的附子、干姜和肉桂用水煎并浓缩成1.5g生药/ml的复方热药水煎剂。

3.根据权利要求1或2所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，其特征在于：所述复方热药水煎剂每次用量为15g生药/kg，给予体积为10ml/kg。

4. 根据权利要求1所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，其特征在于：步骤b中所用的心得安乳剂为取5ml的甘油，2ml的 tween80，加蒸馏水至100ml，加5g心得安粉剂，得5%心得安乳剂。

5.根据权利要求1或4所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法，其特征在于：涂抹心得安乳剂的量为0.1ml/耳，厚度为1.0mm。

6.根据权利要求1所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法制备获得的人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型在制备或筛选银屑病治疗药物及药物评价中的应用。

7.根据权利要求1所述的一种人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病病症模型的构建方法制备获得的人银屑病豚鼠血热证耳部银屑病模型在银屑病的中医辨证施治中的应用。