CN103655997A - 一种治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片 - Google Patents

Abstract

本发明涉及治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片，可有效解决治疗卒中后抑郁症的用药问题，方法是，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，提取挥发油，提取后的药渣与药液分离；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；上述药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩成清膏，加入浸膏粉，加入上述挥发油，混匀压制成中药片，本发明原料丰富，组方科学合理，制备方法简单，易于生产，服用方便，疗效好，无毒副作用。

Description

一种治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片

技术领域

本发明涉及医药，特别是一种治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片。

背景技术

卒中后抑郁（PSD）是脑血管疾病常见的并发症之一，主要表现为兴趣减退、易疲劳、思维迟缓、食欲减退、悲观绝望，甚则出现自杀企图和行为等。近年来.随着社会人群的老龄化和脑血管疾病发生率的升膏，卒中后抑郁发病率逐年增加，据文献报道：在脑血管疾病急性期，PSD发生率在40％--50％。研究证明：卒中后抑郁对卒中的康复起到明显的负性作用，对患者的神经功能缺损、日常生活能力、社会活动、生活质量的改善和恢复都不利，且这类病人易发生痴呆。近年来，卒中后抑郁的发病率呈上升趋势，且发病呈现低龄化，给个人、家庭和社会带来严重损失。

卒中后抑郁的发病机理尚不清楚，导致抑郁的危险因素也十分复杂，目前在卒中后抑郁发病机制研究上有两种途径：一是从生物学角度探索卒中后抑郁患者脑形态结构及生理功能的改变，如神经递质学说、遗传学因素、神经免疫、心理社会文化因素、神经生化以及免疫机制研究；另一是从社会心理学的角度来研究环境及个体心理因素对卒中后抑郁的发生所起的作用。但总的来说，卒中后抑郁是心理社会因素和各种生物学因素改变等共同作用的结果。研究显示，脑内定位的神经病理学改变引发神经递质活动和脑内整合调节功能障碍是导致卒中后抑郁发生主要原因，可能与大脑的损害引起这些部位的去甲肾上腺素（NA）和5-羟色胺（5-HT）能神经元通路的损伤，从而使NA和5-HT神经递质合成下降，导致大脑神经元之间的突触部位生物胺的代谢障碍，使神经递质的相对或绝对浓度不足，因而呈现整个精神活动全面性抑制而导致抑郁状态。同时，卒中后抑郁也常常影响神经病理和神经生物化学的变化，导致脑皮层的兴奋与抑制过程的功能紊乱，影响到皮层下植物神经中枢间脑-下丘脑，使植物神经功能失调，引发情绪失常和内分泌系统、消化系统、电解质的功能紊乱，因此，情志变化引起大脑皮层功能改变可加剧抑郁状态的发生，二者常互为影响，形成恶性循环，导致卒中后抑郁状的加重。

在卒中后抑郁的治疗上，虽然现代医药对卒中后抑郁有确定的疗效，但由于药物缺乏选择性而引起严重的毒副作用，加之长期使用西药后产生的依赖性，特别是一些老年患者因年老体弱，对药物较为敏感，耐受性较差，药物副反应较青壮年患者多而且重，已严重制约卒中后抑郁的治疗。而中药具有疗效好、副作用小等优点，因此，发挥中医优势，积极探索中医药治疗卒中后抑郁的方法，筛选高效、安全的治疗卒中后抑郁的中药新药，越来越受到国内外学者的重视，目前，我国已将卒中后抑郁列为中医药现代化“十五”公关重点课题之一。

卒中后抑郁属中医学的“郁证”，“百合病”，“脏躁”，“不寐”等范畴。近年来,虽然中医诸医家从肝、心、脾胃以及脑等不同角度对卒中后抑郁进行了研究,对卒中后抑郁的病机、证型及治疗进行广泛深入研究，提出了以肝气郁结，心不藏神，胆失决断，心肺阴虚，脾失健运等多种病机立论，以此为基础提出了理气解郁，重镇安神，养阴润燥，健脾和中等治法，扩大了卒中后抑郁的临床治疗方法，但由于对卒中后抑郁的病因病机以及辨证分型认识模糊、临床症候学研究、新药开发非常欠缺，对机制的研究多集中在组织、递质水平，不能较好反映中医药治疗卒中后抑郁的内在机制，加之各研究单位和研究者多从自己的经验和体会出发，辨证方法和辨证分型多种多样，没有采用较为统一的辨证分型标准和疗效评定标准，严重障碍中医学对防治卒中后抑郁疗效的提高，因此,完善中医学防治卒中后抑郁理论的创新，是目前中医学者面临的重大技术问题。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片，可有效解决治疗卒中后抑郁症的用药问题。

本发明解决的技术方案是，根据中医学理论，卒中后抑郁属中医学的“郁证”，“百合病”，“脏躁”，“不寐”等范畴，依据“因郁致病”“因病致郁”和“脑为元神之府，主持五神，以调节脏腑阴阳，四肢百骸之用”的理论，从肝脑论治卒中后抑郁，强调肝为起病之源，脑为传病之所，元神病变又加剧肝失疏泄，二者相互为恶，以致情志失常而发病，并在临床上从肝脑同治卒中后抑郁，取得较好的疗效的实际，本发明采用柴胡10-14g、菖蒲10-14g、远志10-14g、当归9-11g、白芍10-14g、白术9-11g、茯苓13-17g、甘草2-4g、薄荷5-7g、丹皮10-14g、栀子10-14g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

本发明原料丰富，组方科学合理，制备方法简单，易于生产，服用方便，疗效好，无毒副作用，是治疗卒中后抑郁症药物上的创新。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

本发明在具体实施中，结合以下实施例作进一步详细说明。

实施例1

本发明在具体实施中，是由柴胡12g、菖蒲12g、远志12g、当归10g、白芍12g、白术10g、茯苓15g、甘草3g、薄荷6g、丹皮12g、栀子12g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

实施例2

本发明在具体实施中，也可由柴胡14g、菖蒲10g、远志14g、当归9g、白芍14g、白术9g、茯苓17g、甘草2g、薄荷7g、丹皮10g、栀子14g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

实施例3

本发明在具体实施中，也可由柴胡10g、菖蒲14g、远志10g、当归11g、白芍10g、白术11g、茯苓13g、甘草4g、薄荷5g、丹皮14g、栀子10g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

实施例4

本发明在具体实施中，也可由柴胡10g、菖蒲10g、远志10g、当归9g、白芍10g、白术9g、茯苓13g、甘草2g、薄荷5g、丹皮10g、栀子10g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

实施例5

本发明在具体实施中，也可由柴胡14g、菖蒲14g、远志14g、当归11g、白芍14g、白术11g、茯苓17g、甘草4g、薄荷7g、丹皮14g、栀子14g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

本发明组分上的有效组合，互相支持，并经过科学制备，具有舒肝健脑、调郁、理气解郁，重镇安神，养阴润燥，健脾和中，调节脏腑阴阳，四肢百骸之功效，有效用于治疗卒中后抑郁症，并经实验取得了满意的效果，有关试验资料如下：

一、动物试验

1、实验材料

1.1实验动物

清洁级成年雄性SD大鼠150只，体重(250士10)g，由河南医科大学动物实验中心提供,（合格证：SCXK(豫)2005-0001），饲养于22℃-25℃明暗各12小时的清洁级动物实验室内(河南中医学院动物实验中心)。

1.2实验药物

试验组：本发明中药片，每粒0.3g。

对照组：氟西汀，20mg／粒,美国iiily公司制造，生产批号208151。

1.3实验试剂

多巴胺(DA)(批号:2005010823)、3、4一二羟基苯乙酸(DOPAC)(批号:2005020118)、5-羟色胺(5-HT)(批号:2005000326)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)试剂盒(批号:2005020325)、以上均由美国Sigma公司进口；

EDTA二钠和抑肽酶(批号:20050050128)，北京东亚免疫技术研究所；

促肾上腺皮质激素(ACTH)放免分析测定盒(批号:20050040618)，北京北方生物技术研究所；

皮质醇放射免疫分析盒(批号:2005070201)，北京市福瑞生物土程公司；

白细胞介素1β(IL-1β)放免试剂盒(批号:20050090211)，解放军总医院科技开发中心放免研究所；

10%福尔马林溶液(批号:2005010408)，沈阳市新化试剂厂；

4％戊二醛溶液(批号:2005010349)，上海荣泰生化工程有限公司；

Trizol核酸提取液(批号:200502061)，大连宝生物有限公司生产；

RT-PCR反应试剂盒(批号:2005057260)，上海生工生物有限公司生产；

DNAMarker(批号:200504057920)，大连宝生物有限公司生产；

焦碳酸二乙酯(批号:2005020320)，大连宝生物有限公司生产；

琼脂糖，大连宝生物有限公司生产；

链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P)盒(批号:20050201254)，北京中山生物技术公司提供；

C-FOS,c-JUN抗体(批号:2005080466)，美国Santa  Cruz公司生产；

1.4、主要仪器设备

凝胶成像分析系统GOS7500型         美国UVP公司

超速离心机                        日本日立公司

超低温冰箱                        日本三洋公司

基因扩增仪                        美国UVP公司

电泳系统                          美国Bio-rad公司

恒冷切片机                        英国Huntingdon公司

Olympus显微镜                     美国Sartorius公司

H-7500型透射电子显微镜            日本日立公司

Waters 510泵高效液相色谱系统      美国Waters公司

Waters464电化学检测器             美国Waters公司

79HW-1恒温磁力搅拌器              江苏金坛市金城国胜实验仪器厂

半自动生化分析仪                  上海分析仪器厂制造

72紫外分光光度计上                上海分析仪器厂制造

182型放射免疫Y计数器              杭州仪表电机厂

低倍放大图像KS400图像分析系统     德国远东蔡氏公司制造

荧光显微镜                        日本OLYMPUS公司制造

电子分析天平                      美国Sartorius公司

2、实验方法

2.1、模型制备:参照Koizumi法：术前禁食12小时，3.5%水合氯醛(1ml/100g体重)腹腔注射麻醉;备皮，常规消毒;颈部正中切口，钝性分离，暴露、分离颈总动脉主干、颈总动脉分叉、颈外动脉、颈内动脉及其分支翼腭动脉;相继结扎CCA主干和ECA近端，用微动脉夹暂时夹闭翼腭动脉;在颈总动脉分叉部剪一小口，将栓线插入，插入的栓线长度约为18mm-20mm，栓线将阻断进入MCA的血流，引起局灶性脑缺血改变;结扎颈内动脉，逐层缝合;青霉素4万u腹腔注射预防感染。

造模术后第8天(神经功能缺损已基本恢复)给予中度不可预测应激处理:电击脚底(电压100伏，电击延迟1秒，每次电击持续1分钟，共3次):寒冷刺激(4℃，每次持续5分钟，共2次)；热刺激(45℃，每次持续5分钟，共2次)；摇晃(速率1次/秒，15分钟，共1次)；夹尾(每次持续1分钟，共2次)；禁水(20小时，共1次)；禁食(20小时，共1次)；昼夜颠倒(共1次)，几种应激因子随机应用，单笼饲养，共刺激21天。

2.2、分组与给药：在造模术后第8天对成活的大鼠随机分为5组，每组18只（以便保证到实验结束取材时每组存活10只，但结束时每组只按10只取材），分别为氟西汀组0.75mg/kg，本发明低剂量组1.8g/kg、高剂量组3.6g/kg，在卒中后大鼠模型第8天时各组均按1.0ml/100g体重给药，正常组和模型组按1.0ml/100g生理盐水灌胃，1次／d，每天应激前灌胃，按实验要求留取标本。

2.3标本的采集和处理

动物断头取血，10％EDTA二钠和抑肽酶，混匀，40℃,3000rpm离心10min,分离血浆，用放射免疫分析法测定血清皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)的含量；另取血2毫升，注入试管中待凝固后，40℃3000rpm/min离心10分钟，分离血清，-70℃保存用于细胞因子的测定。

迅速在冰上剥离大脑，取前额皮质、下丘脑，称重后置组织冷冻管中用液氮快速冷冻后，同时切取下丘脑约100mg组织块，放入预先经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理的冷冻管中，液氮转移，-70℃冰箱保存备用。另分离海马组织，用冰生理盐水清洗后，滤纸吸干，10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜下观察。

取一小块海马组织放入预冷的固定液板上，用双面刀片把样品修成3个2mm3的小块，立即投入4℃预冷的4％戊二醛固定液中固定4小时，常规冲洗后以1％锇酸后固定。在冲洗后用50％、70％、90％和100％乙醇依次脱水，环氧树脂包埋，然后对所有样品用LKB超薄切片机进行超薄切片，片厚50nm，最后切片用醋酸油－柠檬酸铅双染色法染色，日立H-7500型透射电子显微镜观察、拍照。

2.4实验方法：

①采用光镜观察病理学特征，透射电镜观察细胞超微结构变化；

②采用高效液相色谱仪电化学检测法检测大鼠模型下丘脑内多巴胺DA、3、4－二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量变化；

③采用放射免疫分析法测定血清血清皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和白细胞介素1β(IL-1β)的变化；

④通过强迫游泳不动时间、糖水消耗量、旷场测试等方法评价大鼠模型行为学指标及体重变化；

⑤采用RT-PCR技术研究下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因表达的影响；

⑥采用蛋白免疫组化法观察大鼠模型即时反应基因c-fos和c-jun表达的影响。

3、各项指标的测定

3.1行为学指标

①旷场测试

上午8:00-10:00之间进行敞箱实验，记录动物行为，光照为60Lux,室内隔音，每次测定时间为3min。将大鼠放入中心方格内，观察大鼠在中央格停留的时间，穿越底面格数(以四爪均进入方格内计数，为水平活动得分)，后肢直立次数(两个前爪腾空或攀附墙壁为垂直活动得分)，彻底清洁敞箱后再进行下一轮观察。造模前一天测一次，造模后第22天测一次，每只动物每次仅进行一轮行为测定。

②强迫游泳不动时间：大鼠放入内径20cm,高40cm的玻璃圆缸中,缸中水深24cm,水温28～29℃,每缸1只.连续观察5分钟,累计大鼠在水中不动时间(停止挣扎,呈漂浮直立状态,仅有偶尔的肢体运动以保持头部浮在水面的持续时间)，为尽量避免观察的主观性,给药与观察分别由不同的实验者进行。每只大鼠仅实验1次，药物于测试前30分钟灌胃。

③糖水消耗实验：实验前，在安静的房间内，训练动物适用含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第一个24小时，两瓶均装有1%的蔗糖水，随后24小时，一个瓶装1%的蔗糖水，另一个瓶装纯水。24小时禁食禁水后，进行动物的基础糖水/纯水消耗实验：同时给每只大鼠事先定量好的两瓶水，一瓶1%的蔗糖水，一瓶纯水，60分钟后，取走两瓶并称重，计算每只大鼠的总液体消耗，糖水消耗，糖水偏爱(糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗X100%)，造模前一天测一次，造模后22天再进行一次液体消耗实验。

3.2体重变化：

所有动物于实验前和处死前两次称重，前后共21天，计算其差值，比较各组动物实验前后的体重变化。

3.3对3、4－二羟基苯乙酸(DOPAC)、5-羟色胺(5-HT)、5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)含量的影响

测定前根据脑组织重量加入不同体积的溶液：下丘脑100mg以下加入455uL，0.1MHCLO4和25uL的对羟基苯甲酸二聚体(DHBA)，冰浴条件下超声匀浆30s、常温下11000rmin离心10min，取上清液。

采用高效液相色谱系统(HPLC)加电化学检侧器(ECD)检测5-HT、5-HIAA、DA、DIOAC的含量。取各上清液10u1测定，血液中的神经递质以ng/ml.g计算，脑组织中神经递质以ng/g计算。

测定条件：①色谱条件：色谱柱为4×150mm，Nova-pak18，5um；流动相为50mM，pH为3.5的柠檬酸一乙酸钠缓冲液(内含0.6mM的B-8离子对试剂，1.0mM二丁正胺，0.3mM的Na2EDTA，2%甲醇)，流速为1.0mL/min；玻璃碳工作电极，检测电压为+0.75V。

②标准液成分为：10uL的0.1MHCLO4中含有NE5ng，EDHBA1ng，DOPAC5ng，DA5ng，5-HT10ng，HVA10ng，5-HT10ng。

3.4对血清皮质醇（CORT）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和白细胞介素1β（IL-1β）的影响

采用放射免疫分析法测定血清血清皮质醇（CORT）、促肾上腺皮质激素（ACTH）和白细胞介素1β（IL-1β），按试剂盒说明书操作。

促肾上腺皮质激素（ACTH）操作步骤：单位(μl)

充分混匀，室温放置15min，然后在4℃，3500rpm，离心15min，吸弃上清液，测各管沉淀部分的放射性计数(cpm)。

皮质醇(CORT)操作步骤：单位(μl)

混匀，2-8℃放置15分钟，离心（3500转/分）15分钟，吸去上清液，测各管沉淀的放射性计数（cpm）。

白细胞介素1β(IL-1β)操作步骤：

本实验采用平衡法，加液程序(μl)如下：

充分混匀，室温放置20min，然后在4℃，3500rpm，离心25min，吸弃上清液，测各管沉淀部分的放射性计数(cpm)。

3.5下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)基因表达的影响

3.5.1检测原理：

以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA链，再以新合成的cDNA单链作为靶DNA进行PCR扩增，得到相应的DNA片段。

3.5.2实验流程图：

取组织样本--总RNA提取、分离与鉴定--逆转录反应(RT)--聚合酶链式反应(PCR)--凝胶电泳--图像分析。

3.5.3总RNA的提取：

所用实验器材均用1/1000DEPC水处理，所用试剂用无RANase污染的水配置。⑴、取-70℃冻存组织约100mg置于匀浆器中，用无菌眼科剪刀剪碎，按1:10比例加入Trizol核酸提取液，将100mg组织碾磨成粉末，制成匀浆。

⑵、趁液氮尚未挥发光时，取500u1匀浆液转移到1.5mlEP管中。

⑶、加入200ul氯仿，剧烈震荡混匀30秒。

⑷、台式离心机上，12000rpm，4℃离心5分钟。

⑸、在不打动中间层的前提下，将上层水相转移至一个新的1.5mlEP管中，将上清液200ml小心转移到RNase-free1.5-ml离心管里，加入等体积的异丙醇，4℃下放置5分钟，充分振荡。

⑹、台式离心机上，12000rpm，4℃离心5分钟。

⑺、小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失，保留可视白色沉淀。

⑻、70%酒精洗涤和离心2次，每次700ul，12000rpm，4℃离心2分钟。⑼、尽可能彻底地吸走上清液，防止RNA沉淀丢失。

⑽、真空离心干燥3-5分钟，使酒精完全挥发。

⑾、沉淀用50ulDEPC水溶解，得到的总RNA，-70℃存放待用。

3.5.4RNA含量、纯度检测

紫外分光光度计先用无RNA酶污染的双蒸水调零，取4u1RNA提取物加入1.0ml无RNA酶污染的双蒸水，在紫外分光光度计上测定260nm、280nm处吸光度值，计算出OD260/280比值均在1.8-2.0之间，说明提取mRNA较纯，无蛋白质或酚等杂质污染，可作后续实验用。RNA的浓度为0.2-0.5ug/ul。

3.5.5总RNA完整性的鉴定

用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA样品的质量，1%琼脂糖凝胶聚合后，RNA上样量为5u1/样品槽。电泳条件：电压60V，1xTAEbuffer，时间45分钟，电泳结束后，EB染色，置凝胶扫描成像系统下观测，结果能清楚的看到28SrRNA和18SrRNA两条清晰的条带，条带较亮，且没有弥散现象，说明RNA完整无降解。

4、统计学处理

实验结果用均数士标准差

表示，运用SPSS12.0统计软件，采用方差分析和t检验方法进行统计分析。

（二）实验结果与讨论

实验结果：

4.1舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠模型行为学的影响

表1：舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠体重变化的影响

注：与正常组相比,*p<0.05；与模型组相比，#p<0.05。

正常组大鼠在造模的21天里，体重增加较其他组明显，其他各组大鼠体重增加缓慢，在结束21天的应激刺激后，进一步两两比较发现:模型组体重增加缓慢，与正常组比较，有统计学意义p<0.05，舒肝健脑调郁片高剂量组、氟西汀胶囊组能显著对抗抑郁刺激，使大鼠体重增长，但与正常组比较增长缓慢，P<0.05。

表2：舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠行为的影响

注：与正常组相比，*p<0.05；与模型组相比，#p<0.05。

实验显示：模型组的动物在规定时间内水平活动和垂直活动次数均较正常组明显减少，说明模型组动物活动减少，兴趣丧失，快感缺乏；舒肝健脑调郁片高剂量组、氟西汀组大鼠的水平活动和垂直活动次数较多，对大鼠的抑郁行为表现有一定的改善，表明舒肝健脑调郁片能改善大鼠的抑郁状态，起到良好的治疗作用。

表：3舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠糖水消耗量的影响

注：与正常组相比,*p<0.05；与模型组相比，△p<0.05。

试验开始前糖水试验各组无显著性差异，第7、14天发现模型组大鼠糖水的摄入量与正常组比较减低，在21天模型组大鼠糖水的摄入量与正常组比较明显减低，差异具有显著性p<0.05，表现大鼠抑郁情况明显，与模型组相比，舒肝健脑调郁片高量组大鼠糖水摄入量在第7、14天有所增加，在21天与模型组相比差异有显著性p<0.05，表明舒肝健脑调郁片高剂量组可改善抑郁模型大鼠行为表现，能显著增加抑郁模型大鼠蔗糖水的消耗量，有治疗作用明显。

表4：舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠强迫游泳不动时间的影响

注：大鼠强迫游泳不动时间以5分钟内累计不动时间表示。

与正常组相比*p<0.05；与模型组相比△p<0.05。

由表可以看出，各组间游泳不动时间变化明显，与模型组比较，舒肝健脑调郁片高剂量组有效地缩短大鼠游泳不动时间明显减少，有显著差异p<0.05。这可能与舒肝健脑调郁片具有清肝解郁，健脑益智的作用有关，所以大鼠求生欲望强烈，自然表现大鼠游泳不动的时间缩短。

4.2舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠模型脑神经递质的影响

表5：各组大鼠下丘脑内5-HT5-HIAA含量变化比较

注：与正常组相比*p<0.05；与模型组相比#p<0.05。

模型组5-HT、5-HIAA低于正常组，说明一方面模型组大鼠存在着递质含量不足，另一方面5-HT含量相对增强，但5-HIAA与正常组相比仍相对降低。舒肝健脑调郁片高剂量组大鼠下丘脑内5-HT含量增加，而5-HIAA含量降低，与模型组比较差别明显(p<0.05)。氟西汀组大鼠下丘脑内5-HT亦明显增高，与模型组比较差别明显(p<0.05)。提示舒肝健脑调郁片能通过调节5-HT及其代谢产物5-HIAA达到抗抑郁的作用。

表6：各组大鼠下丘脑DA和DOPAC含量变化比较

注：与正常组相比*P<0.05；与模型相比△P<0.05。

舒肝健脑调郁片高剂量组下丘脑内DA含量增加，与模型组比较差别明显(p<0.05)，氟西汀组DA含量明显增高，与模型组比较差别明显(p<0.05)。说明舒肝健脑调郁片调节DA含量而改善卒中后抑郁状。

4.3、舒肝健脑调郁片对大鼠模型CORT、ACTH和IL-1β的影响

表7：对模型CORT、ACTH和IL-1β的影响

注：与正常组比较：＊P<0.05，与模型组比较：﹟P<0.05。

模型组CORT和ACTH高于正常组P<0.05，说明模型动物存在HPA轴的异常亢奋和高皮质醇血症；舒肝健脑调郁片高剂量组能够显著降低大鼠血浆中CORT、ACTH的浓度，改善抑郁模型的神经内分泌的变化，拮抗应激导致的高皮质醇血症的药理作用。发现模型组大鼠血清中IL-1β含量明显高于正常组P<0.05，舒肝健脑调郁片高剂量组IL-1β含量接近正常组，与模型组大鼠血清中IL-1β含量相比明显减低P<0.05，说明舒肝健脑调郁片可通过下调升高的IL-1β，进而调整HPA轴功能，减轻卒中后抑郁状。因此，证实舒肝健脑调郁片可以在多个层次对HPA轴功能双向调节，达到治疗目的。

4.4舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠下丘脑CRH基因表达的影响

表8：舒肝健脑调郁片对大鼠CRH-mRNA相对表达量的影响

注：与模型组比较﹟P＜0.05，与正常组比较＊P＜0.05

模型组下丘脑CRH-mRNA的表达明显高于正常组，差异P＜0.05，氟西汀组和舒肝健脑调郁片组与模型组比较CRH-mRNA的表达所下降，差异有显著性P＜0.05。提示舒肝健脑调郁片对卒中后抑郁大鼠下丘脑CRH-mRNA的表达有显著的下调作用。

5、舒肝健脑调郁片对抑郁大鼠模型病理学及超微结构的影响

5.1光镜观察：

正常组：低倍镜下海马细胞排列规则，细胞层次丰富，海马结构清楚，高倍镜下神经元膜清晰完整，内氏体丰富，胞核形态正常。

模型组：低倍镜下海马细胞则出现细胞层次轻度减少，结构稍有模糊，锥体细胞带和颗粒细胞带略有紊乱、变稀、中断现象。高倍镜下海马细胞则出现轻度肿胀变形，神经细胞核稍微皱缩不规则，部分核膜破裂，内氏体减少。

本发明高剂量组：低倍镜海马细胞排列规则，细胞层次丰富，海马结构清楚。高倍镜神经元膜完整，内氏体丰富，胞核正常，核仁完整。

本发明低剂量组：低倍镜下海马细胞则出现细胞层次与正常组及高剂量组差别不明显，高倍镜下锥体细胞膜完整，形态正常。

氟西汀组：低倍镜下海马细胞则出现细胞层次与正常组及高剂量组差别不明显，高倍镜下锥体细胞膜完整，形态正常。

5.2电镜观察：

正常组：海马区锥体细胞正常，细胞核规则，核膜光滑，染色质均匀分布，线粒体结构完整，胞浆内粗面内质网(Nissl物质)清晰可见。

本发明高剂量组：大鼠海马区锥体细胞轻度损伤，核膜较光滑，少部分线粒体排列不规则，双层体膜完好，部分嵴缺失，鞘板松解。

氟西汀组：大鼠海马区锥体细胞轻度损伤，核膜光滑，线粒体无明显变化，少部分线粒体嵴断裂紊乱，有致密物质沉积，与高剂量组无。

模型组：许多细胞胞膜出现皱褶，细胞体积缩小，线粒体絮状变化和空泡，细胞核不规则，部分核膜破裂，染色质浓聚成环状或新月状，扩张的内质网与胞膜形成泡状突起，有少量凋亡小体形成。

本发明低剂量组：大鼠海马区锥体细胞损伤明显，核不规则，异染色质聚集，内质网扩张明显。

6、卒中后抑郁动物模型的选择

构建动物模型模拟人类抑郁状态是本病研究的关键，慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型模拟了人类抑郁的核心症状即快感缺乏，也模拟了其他重型抑郁障碍的症状表现，具有较高的有效性，并可持续几个月，较好地反映了人类情感活动异常表现的易怒、焦虑、淡漠等卒中后抑郁状，是目前国内外文献中广泛使用的模型。本实验中模型大鼠变得激惹、开拢或触笼时有明显的攻击行为，对新异环境刺激反应淡漠，表明抑郁模型大鼠变得激惹、攻击行为增强，从行为学的角度佐证了抑郁模型的复制成功。而模型大鼠脑组织5-HT含量明显下降(p<0.05)，符合公认的5-HT神经递质学说，从神经生化方面证明抑郁模型的复制成功。

对抑郁大鼠模型行为学的影响

经过21天各种不同方法的刺激，各实验组大鼠与正常组相比，各实验组大鼠从第7天开始动物的活动次数有减少的趋势，进食减少，第14天时表现恐惧，易惊，比正常组大鼠反应慢，对外来攻击逃逸行为减少，与正常组比较活动次数显著减少P<0.05；第21天时抑郁模型大鼠表现为少动、少食，无欲状态，在受到外界攻击时无逃逸。抑郁模型组大鼠的糖水饮用量与正常组比较显著降低，水平活动次数和垂直活动次数也明显减少，自发活动减少，学习能力下降，逃避反应的获得能力欠缺，糖水饮用量下降等症状。氟西汀胶囊组在体重、糖水消耗、敞箱运动等方而均得到了改善。舒肝健脑调郁片高剂量组可改善抑郁模型大鼠的行为表现，能显著增加抑郁模型大鼠蔗糖水的消耗量，与模型组比较P<0.05，舒肝健脑调郁片高剂量组能显著对抗抑郁模型大鼠体重的缓慢增长，与模型组比较，P<0.05，抑郁模型组大鼠的游泳不动时间比正常组大鼠明显增加，这些绝望、抑郁的表现类似卒中后抑郁患者的临床表现。说明应激可使动物的活动次数明显减少和精神状态发生改变，产生抑郁。模型组大鼠水平活动和垂自活动均显著减少(p<0.05)。说大鼠在经历慢性应激刺激和孤养之后，其活动度和好奇程度均较正常组明显降低。给予舒肝健脑调郁片和氟西汀后，模型大鼠的水平活动和垂自活动均显著增加，p<0.05，说明舒肝健脑调郁片和氟西汀能明显改善动物的消极行为。

实验显示造模后的动物在规定时间内水平活动和垂直活动次数均较正常组明显减少，体重增加减慢，糖水消耗量降低，说明模型组动物活动减少，兴趣丧失，食欲减退，快感缺乏。而本发明高剂量组大鼠的水平活动和垂直活动次数较多，并提高抑郁大鼠的蔗糖偏嗜度，表明本发明能改善大鼠的抑郁状态，起到良好的治疗作用。

上述试验表明，本发明中药片有良好的治疗卒中后抑郁之功效，并经临床试验所证明。

二、临床资料

经临床对58例卒中后抑郁症患者进行治疗，每天服用3次，每次3-5片，每片0.3g，连服30-60天后统计疗效，除2人无明显效果外，其余患者都在不同程度上症状得到了改善或好转，有效率高达96%以上，是治疗卒中后抑郁症药物上的创新，有实际的临床意义。

Claims (4)

1.一种治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片，其特征在于，采用柴胡10-14g、菖蒲10-14g、远志10-14g、当归9-11g、白芍10-14g、白术9-11g、茯苓13-17g、甘草2-4g、薄荷5-7g、丹皮10-14g、栀子10-14g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

2.根据权利要求1所述的治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片，其特征在于，由柴胡12g、菖蒲12g、远志12g、当归10g、白芍12g、白术10g、茯苓15g、甘草3g、薄荷6g、丹皮12g、栀子12g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

3.根据权利要求1所述的治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片，其特征在于，由柴胡14g、菖蒲10g、远志14g、当归9g、白芍14g、白术9g、茯苓17g、甘草2g、薄荷7g、丹皮10g、栀子14g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。

4.根据权利要求1所述的治疗卒中后抑郁症的舒肝健脑调郁片，其特征在于，由柴胡10g、菖蒲14g、远志10g、当归11g、白芍10g、白术11g、茯苓13g、甘草4g、薄荷5g、丹皮14g、栀子10g制成，其中，石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮加8倍重量的水，浸泡1-2h，采用水蒸气蒸馏法，提取挥发油，挥发油备用，提取后的药渣与药液分离，分别存放备用；白芍、茯苓、甘草、远志、栀子加体积浓度为60％的乙醇浸泡1-2h，乙醇加入量为白芍、茯苓、甘草、远志、栀子重量的10倍量，回流提取1h，过滤，得滤液，滤液回收乙醇，浓缩，干燥，粉碎成浸膏粉；

提取挥发油后的石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮药渣与白芍、茯苓、甘草、远志、栀子醇提后的药渣合并，加水浸没煎煮2次，每次煎煮1.5h，合并两次水煎液及上述石菖蒲、薄荷、柴胡、当归、白术、丹皮提取挥发油后的药液，混合均匀，过滤，滤液减压浓缩至相对密度1.20-1.30的清膏，加入上述浸膏粉，按常规方法制粒，加入上述挥发油，混匀压制成中药片。