CN109662986A - 一种柿叶提取物及其制剂的新医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种柿叶提取物在制备用于预防和/或治疗抑郁症的药物中的应用。所述抑郁症是指典型抑郁障碍，尤其是精神性、情感障碍所致的抑郁障碍。

Description

一种柿叶提取物及其制剂的新医药用途

技术领域

本发明属于医药学领域，具体涉及一种柿叶提取物及其制剂的新医药用途。

背景技术

抑郁症(Depression),又称抑郁障碍，是一种慢性、反复性发作的情感精神性疾病，以显著而持久的心境或情绪低落为主要临床特征，常伴有焦虑、思维迟缓、妄想或幻觉、注意力和记忆力下降和睡眠障碍等症状。迄今，抑郁症的病因还不清楚，一般认为生物、心理与社会环境诸多方面因素参与了抑郁症的发病过程。

目前全球抑郁症患者发病率高达21％，约15％的患者伴有自杀倾向。世界卫生组织(WHO)预测抑郁症将会在2020年成为继高血压病之后第二大临床慢性疾病，被认为是精神病学中的“感冒”。据调查显示，在中国仅有5％的抑郁症患者接受过治疗，大部分患者由于缺乏对抑郁症的认知，未能及时诊治，导致病情恶化。随着生活节奏加快，生活的工作压力增大，抑郁症已成为严重危害人类健康的常见疾病之一。

美国精神疾病诊断与统计手册第五版(DSM-5)对抑郁症的分类包括破坏性心境失调、典型抑郁障碍(包括单次、反复发作)、持续抑郁障碍(心境恶劣)、经前期心境恶劣障碍、物质和(或)药物导致的抑郁障碍、由其他躯体问题引起的抑郁障碍、其他特定的抑郁障碍和非特定的抑郁障碍等8种亚型。典型抑郁障碍是抑郁障碍的经典亚型，是现代医学普遍认为的抑郁症，特征为持续至少2周的发作，包括情绪、认知及植物神经系统显著的变化，但是不是由其他躯体问题(如恶性肿瘤、脑血管病等)引起的。

1977年提出的血管性抑郁的概念来自对老年期抑郁症的研究，是一种与脑血管病或血管危险因素密切相关的老年期抑郁综合征。血管性抑郁患者较少有典型的失落感、自罪，抑郁症状较轻，但多易伴注意障碍、淡漠、运动迟滞和以执行功能损害为主的认知损害。因此，血管性抑郁有别于上述典型抑郁障碍，随着血管损伤的减轻，血管性抑郁的抑郁症状也将随之缓解。

药物是目前抑郁症最主要的治疗手段。目前临床上常用的抗抑郁药包括选择性5-羟色胺(5-HT)重摄取抑制剂(SSRIs)、5-HT/去甲肾上腺素(NE)双重重摄取抑制剂(SNRIs)、三环类(TCAs)和单胺氧化酶抑制剂(MAOIs)等化学类药物。由于抑郁症的病因尚未研究清楚，因此对不同类型的抑郁症，这些化学药物的疗效存在较大差异，而且还存在起效延迟(3～8周)、不良反应多、有效率低(50％-70％)、复发率高(35％～60％)、依赖性不强且价格昂贵等亟待解决的问题。化学药物主要存在的副作用包括胃肠道症状(恶心、腹泻、胃出血、消化不良)，肝毒性，体重增加及代谢异常，心血管问题(心率、QT间期延长、高血压、体位性低血压)，泌尿系统症状(尿潴留、尿失禁)，性功能障碍，低钠血症，骨质疏松及骨折风险，出血，中枢神经系统紊乱(癫痫阈降低、锥体外系副作用、认知障碍)，泌汗，睡眠障碍，情感症状(情感平淡、心境转相、反常反应)，眼部症状(青光眼、白内障)，高泌乳素血症。因此，为寻求更安全、有效、低毒、经济的抗抑郁药，越来越多的研究者将目光投向资源丰富的天然植物。

柿叶(Persimmon leaf)为柿科柿属植物柿(Diospyros kaki Thunb)的新鲜或干燥叶，其入药始载于明代《滇南本草》“经霜叶敷臃疮”，而《本草再新》则记载用于“治咳嗽吐血，止渴生津”。对柿叶化学成分的深入研究发现，柿叶中含有黄酮、有机酸、香豆素、三萜类等多种活性成分和营养物质，对心脑血管疾病具有较好的防治作用。现载于《中国药典》的柿叶提取物，以柿的叶为原料，用水煮醇沉、乙酸乙酯萃取等方法提取精制而成，功能以活血化瘀为主，主治气滞血瘀引起的病症。脑心清片即是以柿叶提取物为原料制成的口服片剂，用于冠心病、脑动脉粥样硬化症等心脑血管疾病。前期研究表明，黄酮类成分可能是柿叶提取物发挥药效的物质基础。《中国药典》将槲皮素(Quercetin)和山柰酚(Kaemferol)作为柿叶提取物总黄酮的质控标准，规定总含量规定不得低于8.6％；但是，黄酮类成分在柿叶提取物中仅占很少的部分，显然该提取物的大部分化学成分仍是不清楚的。

严彩英等在《文拉法辛联合中药治疗老年抑郁症的临床研究》(严彩英，裴瑜，等；国际精神病学杂志，2016，43(5)：842-845)一文中报道了文拉法辛和盐酸川芎嗪、银杏达莫、脑心清片等药物联合治疗老年抑郁症患者。经过连续8周的治疗，同时给予文拉法辛、盐酸川芎嗪(静脉滴注)、银杏达莫(静脉滴注)和脑心清片(口服)的观察组仅在治疗第1周末和第2周末的临床总有效率、HAMD24总评分和焦虑/躯体因子评分优于单纯服用文拉法辛的对照组；但是随着治疗时间的延长，观察组的治疗优势逐渐减弱，与对照组的差异没有统计学意义。该篇文章提示，盐酸川芎嗪、银杏达莫和脑心清片联合文拉法辛缓解老年抑郁症引起的焦虑、抑郁症状，仅起效速度优于单一应用文拉法辛治疗，但是长期并没有治疗优势。因此，基于该研究，可以推测，活血化瘀的盐酸川芎嗪、银杏达莫和脑心清片即使合用对老年抑郁没有显著的改善作用。

汪瑾宇等也报道了脑心清片合并艾司西酞普兰治疗血管性抑郁的疗效(汪瑾宇，何影，等；脑心清片合并艾司西酞普兰治疗血管性抑郁临床研究[J]；新中医，2014，46(2)：47-49)。该临床研究纳入标准为：“具有脑血管病和血管危险因素的临床和(或)实验室证据，或者在脑血管事件发生后的6～12月内出现抑郁；Hamilton抑郁量表(HAMD，24项)评分≥20分。”显然，该研究的治疗对象是前述的“由其他躯体问题引起的抑郁障碍”，而不是典型的抑郁障碍。通过8周的观察治疗，该研究发现虽然脑心清片合并艾司西酞普兰组的HAMD评分下降更显著，但是与单用艾司西酞普兰组的有效率差异并不大(P＞0.05)。因此，艾司西酞普兰仍然是治疗抑郁的主要因素。脑心清片在其中的作用更直接的应该在于改善了脑血管病，从而有可能辅助艾司西酞普兰改善抑郁症状。

综合现有技术的报道，柿叶提取物对血管性抑郁或老年性抑郁可能有某种程度的辅助改善作用(实际上并没有明确的证据证明)。但是，至今尚未有发现柿叶提取物可以用于治疗与其他躯体问题无关的典型抑郁障碍的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供柿叶提取物在预防和/或治疗抑郁症，尤其是典型抑郁障碍中的新的医药用途。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

柿叶提取物在制备用于预防和/或治疗抑郁症的药物中的应用。

优选的，所述抑郁症是指典型抑郁障碍，尤其是精神性、情感障碍所致的抑郁障碍。

优选的，所述柿叶提取物作为所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物的唯一活性成分。

优选的，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物包括或不包括药学上可以接受的辅料。

还优选的，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物为口服制剂或非口服制剂。

所述口服制剂选自散剂、普通口服片剂、分散片、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、微丸剂、颗粒剂、口腔崩解片和口腔速溶膜剂中的一种或多种。

所述非口服制剂选自注射剂、冻干粉针和大容量输液剂中的一种或多种。

优选的，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物为口服制剂。

作为一个优选的实施方案，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物为脑心清片或脑心清胶囊。

将所述柿叶提取物，加入或不加入药学上可以接受的辅料，按照本领域常规的方法，即可制备得到上述于预防和/或治疗抑郁症的药物。

上述柿叶提取物通过如下方法制备：

取干燥柿叶，加水煎煮2次，每次1～2小时，合并水煎液，滤过，浓缩至相对密度1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达80～90％；静置过夜，滤取上清液，备用；沉淀物用60～70％乙醇洗涤，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，与备用上清液合并，回收乙醇，加入适量水，混匀，滤过，滤液用醋酸乙酯提取2次以上，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯并浓缩成稠膏，低温干燥，即得。

优选的，上述柿叶提取物通过如下方法制备：

取干燥柿叶，加水煎煮2次，第1次2小时，第2次1小时，合并滤液，滤过，浓缩汁相对密度1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达85％；静置过夜，滤取上清液，备用；沉淀物用65％乙醇洗涤2次，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，与备用上清液合并，回收乙醇，加入适量水，混匀，滤过，滤液用醋酸乙酯提取4次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯并浓缩成稠膏，低温干燥，即得。

本发明所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物施用对象为哺乳动物，优选为人。

本发明所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物施用于有需要的人时，所述柿叶提取物的给药量为每天2～10mg/kg体重。

上述药学上可以接受的辅料，包括但不限于：

稀释剂：例如选自淀粉、糊精、预胶化淀粉、乳糖、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙、氧化镁、碳酸镁、氢氧化铝凝胶、β-环糊精、甘露醇、山梨醇、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟甲基纤维素钠中的一种或多种。

粘合剂：例如选自蒸馏水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素中的一种或多种。

润滑剂：例如选自十二烷基硫酸镁、聚乙二醇、微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉中的一种或多种。

崩解剂：例如选自淀粉(玉米、马铃薯)、微晶纤维素、海藻酸、海藻酸钠、离子交换树脂、泡腾酸-碱系统、羟丙基淀粉、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、低取代羟丙基纤维素、部分α化淀粉和微晶纤维素中的一种或多种。

成膜材料：明胶、虫胶、阿拉伯胶、琼脂、淀粉、糊精、PVA05-88、PVA17-88和乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)中的一种或多种。

矫味剂：例如选自糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊苷以及香精类中的一种或多种。

注射用溶剂：例如选自注射用水、麻油、茶油、花生油、玉米油、橄榄油、棉籽油、豆油、蓖麻油及桃仁油、油酸乙酯、苯甲酸苄酯、丙二醇、聚乙二醇400、二甲基乙酰胺(DMA)、乙醇和甘油中的一种或多种。

本发明通过细胞体外模型和动物整体模型研究发现，所述柿叶提取物具有良好的抗抑郁作用。通过机理研究，认为本发明所述柿叶提取物通过以下几方面起到预防和/或治疗抑郁症的作用：

1)抗神经炎症作用，可抑制脑内神经炎症因子，如TNF-α、IL-1β，IL-6等的释放。

2)具备调控下丘脑-垂体-肾上腺轴的作用，可抑制应激引起的血清皮质酮(醇)和促肾上腺皮质激素的分泌。

3)可调节脑内单胺类神经递质，包括5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素的平衡，起到精神情感调控作用。

虽然现有技术中已经公开柿叶提取物中含有槲皮素、山柰酚和金丝桃苷等黄酮类成分，且这些成分都被报道过具有一定的抗抑郁作用，如①贝伟剑,王德勤，等.HPLC法测定脑心清片浸膏中金丝桃苷的含量[J].广西中医学院学报,2009(02):62-63；②贝伟剑,罗杰，等.HPLC法测定柿叶浸膏中槲皮素和山柰酚[J].中草药,2005(07):59-60；③传娟娟,李燕.贯叶金丝桃(圣约翰草)的国内外研究概况[J].西北药学杂志,2016(03):330-332；④陈箐筠,干信.槲皮素对皮质酮损伤的pc12细胞的保护作用[J].化学与生物工程,2009(01):47-49；⑤刘健翔,方吟荃,等.槲皮素与贯叶连翘提取物合用抗抑郁作用初步研究[J].浙江大学学报(医学版),2013(06):615-619；⑥陈蕾.黄酮类化合物的抗抑郁作用研究[J].江西中医药,2011,42(10):55-57。但是令人意想不到的是，本发明通过实验发现，柿叶提取物抗抑郁的作用不仅显著强于槲皮素、山柰酚、金丝桃苷、芦丁等黄酮单体，而且也明显强于这些黄酮的组合物(模拟柿叶提取物中天然存在的黄酮组合)。说明柿叶提取物中起抗抑郁作用的物质基础不仅仅是槲皮素、山柰酚、金丝桃苷、芦丁及其组合，很有可能是未见报道但是具有抗抑郁活性的其它成分。

以柿叶提取物为有效成分的制剂，如脑心清片在临床已经应用多年，其安全性已经得到证明。本发明为柿叶提取物提供了一种新的医药用途。基于本发明，将为临床治疗典型抑郁障碍提供一种新的安全性高的治疗选择。

附图说明

以下参照附图，对本发明作详细的说明。

图1示出的是实施例1中不同浓度柿叶提取物(3.125～400μg/mL)与正常培养的PC12细胞共同孵育24h后，MTT法检测的细胞存活率。

图2示出的是实施例1中不同浓度皮质酮(Cort,0～800μM)与正常培养的PC12细胞共同孵育24h后，MTT法检测的细胞存活率(图2A)和LDH检测法检测的LDH活性(图2B)，图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Cort(0μM)组(正常对照组)。

图3示出的是实施例1中不同浓度柿叶提取物(6.25,12.5,25,50,100μg/mL)对皮质酮(Cort,200μM)损伤PC12细胞的保护作用，其中图3A示出的是对细胞存活率的影响，图3B示出的是对LDH活性的影响；图中：^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Cort组(皮质酮组)，^##P<0.01vs.Veh组(正常对照组)。

图4示出的是实施例1中不同浓度柿叶提取物(6.25,12.5,25,50,100μg/mL)对皮质酮(Cort,200μM)损伤PC12细胞分泌炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的影响；其中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Cort组(皮质酮组)，^##P<0.01vs.Control组(正常对照组)。

图5示出的是实施例2中敞箱实验的结果，其中图5A显示的是各组小鼠水平得分情况，图5B显示的是各组小鼠垂直得分情况。

图6示出的是实施例2中悬尾实验的结果，图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Veh(溶剂对照组)。

图7示出的是实施例2中小鼠强迫游泳实验的结果，图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Veh(溶剂对照组)。

图8示出的是实施例2中柿叶提取物对急性应激小鼠血清皮质酮水平的影响的测定结果，图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Veh2(溶剂对照组)；^##P＜0.01vs.Veh1(正常对照组)。

图9示出的是实施例2中柿叶提取物对急性应激小鼠大脑单胺类神经递质水平的影响的测定结果。其中，图9A示出的是5-羟色胺(5-HT)的测定结果，图9B示出的是多巴胺(DA)的测定结果，图9C示出的是去甲肾上腺素(NE)的测定结果。图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Veh(溶剂对照组)；^###P＜0.01vs.Normal(正常对照组)。

图10示出的是实施例3中糖水偏爱实验的结果。图中，1为正常对照组，2为模型组，3为柿叶提取物，4为柿叶黄酮组合物，5为槲皮素，6为山柰酚，7为金丝桃苷，8为芦丁；^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05,^$$P<0.01vs.柿叶提取物。

图11示出的是实施例3中敞箱实验的结果；其中图11A示出的是小鼠水平运动得分，图11B示出的是小鼠垂直运动得分。图中，1为正常对照组，2为模型组，3为柿叶提取物，4为柿叶黄酮组合物，5为槲皮素，6为山柰酚，7为金丝桃苷，8为芦丁；^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05,^$$P<0.01vs.柿叶提取物。

图12示出的是实施例3中悬尾实验的结果。图中，1为正常对照组，2为模型组，3为柿叶提取物，4为柿叶黄酮组合物，5为槲皮素，6为山柰酚，7为金丝桃苷，8为芦丁；^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05,^$$P<0.01vs.柿叶提取物。

图13示出的是实施例3中小鼠强迫游泳实验的结果，图中，1为正常对照组，2为模型组，3为柿叶提取物，4为柿叶黄酮组合物，5为槲皮素，6为山柰酚，7为金丝桃苷，8为芦丁；^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05,^$$P<0.01vs.柿叶提取物。

图14示出的是实施例3中CUMS小鼠血清皮质酮和促肾上腺皮质激素水平的测定结果；其中，图左侧示出的血清皮质酮水平测定结果，图右侧示出的是血清促肾上腺皮质激素水平测定结果。图中，^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组；^###P＜0.01vs.正常对照组；^$P<0.05,^$$P<0.01vs.柿叶提取物。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中，部分试剂和仪器购买情况如下：

柿叶提取物(NXQ)：广州白云山和记黄埔中药有限公司，批号H16P006，制备方法为：

取干燥柿叶，加水煎煮2次，第1次2小时，第2次1小时，合并滤液，滤过，浓缩汁相对密度1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达85％；静置过夜，滤取上清液，备用；沉淀物用65％乙醇洗涤2次，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，与备用上清液合并，回收乙醇，加入适量水，混匀，滤过，滤液用醋酸乙酯提取4次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯并浓缩成稠膏，低温干燥，即得。

氟西汀、皮质酮、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)：Sigma公司；

DMEM高糖培养基、澳洲胎牛血清、马血清：Gibco公司；

PC12细胞：大鼠来源，中科院细胞库；

LDH检测试剂盒：南京建成生物科技有限公司；

炎症因子ELISA检测试剂盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；

细胞培养箱：Thermo公司；

酶标仪：Bio-rad公司；

敞箱：上海欣软信息科技有限公司；

圆形游泳缸：上海移数信息科技有限公司；

悬尾仪：上海欣软信息科技有限公司。

实施例1柿叶提取物体外对皮质酮所致神经细胞损伤的保护作用

1.1实验药物配制

柿叶提取物溶于100％DMSO中，配制成400mg/mL的储存液，使用时将其稀释成400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL，并保证DMSO的浓度低于0.1％适合进行细胞实验。

1.2数据分析及统计

所有数据均采用均数±标准差(x±SD)表示，用SPSS软件分析数据，方差分析(One-Way ANOVA)。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用Bonferronic法；若方差不齐将采用Welch法进行分析，多重比较采用Dunnett’s T3法。P＜0.05为存在显著性差异，具有统计学意义。

1.3不同浓度柿叶提取物对PC12细胞存活率的影响

8个不同浓度柿叶醋酸乙酯提取物(3.125～400μg/mL)与正常培养的PC12细胞共同孵育24h后，采用MTT法进行PC12细胞存活率检测。MTT的结果显示(见图1及表1)，与正常组对比，各浓度柿叶提取物处理组的细胞存活率无明显区别。经单因素方差(One-wayANOVA)分析，差异不具统计学意义(P>0.05)。因此，所选择的柿叶提取物浓度范围适用于后续抗抑郁细胞水平的筛选。

表1柿叶提取物(NXQ)对正常培养的PC12细胞存活率的影响

1.4神经细胞皮质酮损伤模型的建立

细胞培养至对数生长期，用含5％胎牛血清、10％马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU/L，链霉素100mg/L，pH 7.4)重悬细胞，调细胞密度为1×10⁵个/mL.细胞接种于96孔板中，各孔加入100μL细胞液，置于37℃、CO₂培养箱中贴壁孵育24h，待细胞长满孔底后即开始实验。细胞血清剥夺1h后，加入不同浓度的皮质酮(0,25,50,100,200,400μM)，作用24h后，用MTT法和LDH检测法观察皮质酮出现致损伤浓度，选择皮质酮的最佳造模浓度。

结果见图2和表2。0～800μM的皮质酮对PC12细胞的损伤呈剂量依赖性。经One-wayANOVA分析，200μM皮质酮处理PC12细胞24h后显著性降低细胞活力(P<0.01)，细胞存活率下降30％(图2A)。LDH检测结果也与此相似，给予不同浓度皮质酮处理后，各组的LDH外漏存在显著性差异(P<0.01,图2B)。当皮质酮的浓度在200μM作用24h后，细胞LDH外漏与正常对照组比较显著性增加。根据以上结果，200μM的皮质酮损伤PC12细胞24h可作为后续实验皮质酮诱导细胞浓度。

表2皮质酮(Cort)对PC12细胞存活率和LDH的影响

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.正常对照组.

1.5不同浓度柿叶提取物对皮质酮损伤PC12细胞的保护作用

细胞种板96孔板后12h后，不同浓度柿叶提取物(3.125～400μg/mL)预处理细胞1h。除对照孔外，其余各孔加入200μM皮质酮共同孵育24h。收集细胞上清液用于检测乳酸脱氢酶(LDH)活性变化，MTT法检测96孔板内细胞存活率，酶标仪570nm检测各孔吸光度值。以对照组平均吸光度为100％，以各处理组吸收度值与对照组的比值计算存活力和LDH的变化情况。

结果见图3和表3。经One-way ANOVA分析显示，200μM的皮质酮对PC12细胞进行损伤24h后，PC12细胞的细胞活力明显下降而细胞上清液LDH的分泌则明显增加。从6.25～100μg/mL，柿叶提取物呈浓度依赖性的增加细胞存活率和降低上清液LDH分泌，其中25、50、100μg/mL对皮质酮诱导的细胞损伤具有显著抵抗作用(P<0.01)。该结果提示，25μM的柿叶醋酸乙酯提取物在细胞水平即具有明显的抗抑郁活性。

表3柿叶提取物对皮质酮造成的细胞存活率及乳酸脱氢酶变化的影响

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.模型对照组，^##P<0.01vs.正常对照组

1.6柿叶提取物对皮质酮诱导PC12细胞炎症反应的影响

由于200μM皮质酮处理24h引起细胞存活率下降，因此，为了评价柿叶提取物在抗抑郁症过程是否发挥了抗炎效应，选择不同浓度柿叶提取物与皮质酮共培养处理PC12细胞4h，ELISA法检测上清液中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度，以观察柿叶提取物对炎症因子分泌的影响。

ELISA的结果显示(见图4及表4)，与空白对照组(Control)比较，200μM皮质酮极显著地增加PC12细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平(P<0.001)。与空白对照组比较，柿叶提取物最大浓度单独处理(无皮质酮)并不产生炎症效应(P>0.05)。柿叶提取物处理1h后，各剂量均不同程度地抑制由皮质酮引起的PC12细胞炎症因子的释放。其中，柿叶提取物在剂量为25μg/ml时即对TNF-α、IL-1β和IL-6的抑制产生显著效果，均具有统计学意义(P<0.01)。

表4柿叶提取物对皮质酮引起的炎症因子分泌的影响

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.Cort组，^##P<0.01vs.正常对照组.

1.7结论

本实施例成功建立了皮质酮损伤PC12细胞抑郁模型。通过研究发现柿叶提取物在3.125～400μM浓度范围对正常培养细胞无毒害作用，但是在PC12细胞抑郁模型中，柿叶提取物在50μM即可产生较好的神经细胞保护作用，其作用机理可能与其抑制皮质酮引起的炎症反应有关。本实施例的结果提示，柿叶提取物在细胞层面上具有明显的抗抑郁活性。

实施例2柿叶提取物对急性应激诱导小鼠抑郁样行为的作用

2.1实验动物

C57小鼠，雌性，60只，体重18～22g；实验动物许可证号：SCXK(京)2014-0004。

2.2实验药物与仪器

柿叶提取物(NXQ)、氟西汀(FLX)、羧甲基纤维素钠、敞箱、圆形游泳缸、悬尾仪。

2.3实验分组与给药方法

实验用小鼠适应饲养环境1周后，将50只小鼠随机分为五组，分别为溶剂对照组(Veh)、阳性药氟西汀(FLX,10mg/kg)给药组、柿叶提取物(NXQ)低剂量(20mg/kg)给药组、柿叶提取物(NXQ)中剂量(40mg/kg)给药组、柿叶提取物(NXQ)高剂量(80mg/kg)给药组；每天灌胃给药一次，连续给药7天，溶剂对照组同时给以同体积的0.5％羧甲基纤维素钠水溶液。末次给药后1h，开始行为学检测。另外10只小鼠用于生化指标检测作为正常对照组。

药物配制：柿叶提取物或氟西汀均以0.5％羧甲基纤维素钠充分溶解，按给药剂量现配现用，以0.1ml/10g体重给药体积进行灌胃。

2.4实验方法

2.4.1敞箱实验

敞箱实验主要用于测试小鼠自发活动能力以排除药物中枢兴奋作用干扰实验结果。实验在一个底部为25cm×25cm，高为20cm的黑色木箱中进行，底面为25个正方格。第6天给药后1h，小鼠放入中央方格，适应5min，拿出。每换一只小鼠，用75％酒精擦洗一遍以去除前一只小鼠残留气味的影响。实验第7天给药后1h，摄像记录5min内小鼠穿越格子数(四爪均进入方格内方可计数，为水平运动得分)、后肢直立次数(两前爪腾空或攀附箱壁，为垂直运动得分)。

2.4.2悬尾实验

用胶布将小鼠尾(距尾尖1cm处)粘住后固定于悬尾支架上，使小鼠成倒悬体位，两侧以隔板挡开小鼠视线，使之不互相干扰。摄像记录5min内小鼠的累计不动时间。小鼠“不动”的判定标准为停止挣扎，身体呈垂直倒悬状态，静止不动。

2.4.3强迫游泳实验

在悬尾实验的第二天，将小鼠逐一放入高20cm、直径12cm、水深10cm的圆形游泳缸中进行强迫游泳6min，摄像记录后4min小鼠的累计不动时间。小鼠“不动”的判定标准为在水中停止挣扎，呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部漂浮水面。

2.4.4ELISA检测血清皮质酮

小鼠行为学实验结束后摘除眼球取血，抗凝管中静置10min后，8500r/min离心15min，分离血清，-80℃冰箱保存备用。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠血清中皮质酮水平。同时，另取一组未经任何应激处理的小鼠(10只)作为正常对照组，按照实验组相同的方法，摘除眼球取血，分离血清，测定血清中皮质酮水平。

2.4.5HPLC检测脑组织中单胺类神经递质

2.4.5.1色谱条件

色谱柱:Dikma Diamonsil C18(5μm,4.6mm×250mm)；

流动相:A-B(90:10，体积比),A为磷酸二氢钠水溶液(含25.0mmol/L NaH₂PO₄,1.7mmol/L OSA，0.7mmol/L三乙胺，0.025mmol/L EDTA-2Na，pH＝3.0)，B为乙腈；

流速：1.0mL/min；

柱温:32℃；

检测电势:E1＝-150V,E2＝220V；

进样量10μL

2.4.5.2样品处理

取冻存的脑组织,称重后置于玻璃勻浆器，按10mL/kg的比例加入预冷的含有0.01％EDTA-2Na的0.1mol/L高氯酸溶液，于冰浴下快速匀浆2min。将研磨好的匀浆液移入棕色离心管，于4℃条件下14000g离心20min后取上清，上清液用0.22μm滤器过滤后上机检测脑组织中单胺类神经递质5-HT、NE、DA水平。

2.5数据分析及统计

用SPSS软件分析数据，方差分析(One-Way ANOVA)。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用Bonferronic法；若方差不齐将采用Welch法进行分析，多重比较采用Dunnett’s T3法。P＜0.05为存在显著性差异，具有统计学意义。

2.6实验结果

2.6.1柿叶提取物连续给药对小鼠自主活动的影响

敞箱实验结果见图5和表5。各组小鼠间的水平运动得分(P>0.05)和垂直运动得分(P>0.05)差异均不具有统计学意义，说明柿叶提取物连续给药均不对小鼠的自主活动产生影响。

表5敞箱实验实验结果

2.6.2柿叶提取物对悬尾急性应激小鼠行为学的影响

结果见图6和表6。柿叶提取物各剂量较模型对照组，均不同程度缩短小鼠悬尾不动时间且作用呈剂量依赖关系；剂量20、40和80mg/kg均效果显著，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。柿叶提取物中剂量(40mg/kg)的效果与氟西汀(10mg/kg)相当，柿叶提取物高剂量(80mg/kg)缩短小鼠悬尾不动时间效果好于氟西汀。

表6小鼠悬尾实验结果

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.溶剂对照组.

2.6.3柿叶提取物对强迫游泳急性应激小鼠行为学的影响

小鼠强迫游泳试验结果见图7与表7。柿叶提取物各剂量较模型对照组，均不同程度缩短小鼠强迫游泳不动时间且作用呈剂量依赖关系，其中剂量40mg/kg和80mg/kg效果显著，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。柿叶提取物高剂量(80mg/kg)缩短小鼠强迫游泳不动时间的效果略好于氟西汀(10mg/kg)。本实验结果与悬尾试验结果相似。

表7小鼠强迫游泳实验结果

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.溶剂对照组.

2.6.4柿叶提取物对急性应激小鼠血清皮质酮的影响

该部分实验，新增正常无应激小鼠血清进行对比，结果见图8和表8。与对照组比较，模型组应激小鼠血清皮质酮水平显著升高(P<0.001)；与模型组比较，柿叶提取物40、80mg/kg组血清皮质酮水平均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.001)。而且，柿叶提取物高剂量(80mg/kg)降低急性应激小鼠血清皮质酮水平的作用显著强于氟西汀(10mg/kg)。

表8柿叶提取物对急性应激小鼠血清皮质酮水平的影响

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.溶剂对照组，^##P<0.01vs.正常对照组.

2.6.5柿叶提取物对急性应激小鼠脑组织单胺类神经递质的影响

该部分实验，新增正常对照无应激小鼠脑组织进行对比，结果见图9和表9。与正常对照组比较，模型组应激小鼠5-HT、DA、NE水平显著降低(P<0.01)；与模型组应激比较，柿叶提取物20、40、80mg/kg组5-HT水平明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，柿叶提取物20、40、80mg/kg组DA、NE水平显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。此外，柿叶提取物高剂量(80mg/kg)升高急性应激小鼠脑组织中5-HT、DA、NE水平的作用强于氟西汀(10mg/kg)。

表9柿叶提取物对小鼠大脑单胺类神经递质水平的影响

^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001vs.溶剂对照组，^###P<0.001vs.正常对照组。

2.7实验结论

本实施例在实施例1的细胞水平的基础上，进一步采用整体动物实验进行柿叶提取物抗抑郁药效学的评价。小鼠强迫游泳实验(FST)和小鼠悬尾实验(TST)是最为常用的急性行为绝望模型。小鼠在FST和TST中表现的不动状态反映了其在不可逃避的行为绝望中的一种持续性挫败，或者是处理应激刺激时产生的被动承受状态。目前认为这种行为绝望类似于构成临床抑郁症的成分，这种应激状态下动物不动状态持续时间的缩短反应了药物的抗抑郁特性。多数抗抑郁药在小鼠FST和TST中能减少其不动时间，且其药效学显示与临床药效相关。

本实施例的结果显示，柿叶提取物连续给药在不影响小鼠自主活动的情况下，可显著性减少小鼠在强迫游泳和悬尾试验中的不动时间；其中柿叶提取物中剂量减少小鼠悬尾不动时间的作用与氟西汀相当，高剂量减少小鼠强迫游泳不动时间和悬尾不动时间的作用好于氟西汀。该结果证实柿叶提取物单独用药即可产生明显的抗抑郁效应。

急性应激是机体内各种内外环境因素及社会、心里因素刺激时所出现的全身性非特异性适应反应，可以引起大脑功能减退及神经元损害同时在急性应激情况下，机体激活下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)，促使血清中促肾上腺皮质激素和皮质酮(Corticosterone,CORT)的浓度升高，是对抗外来突发事件的一条重要反馈和自我保护途径。在生化指标检测上，柿叶提取物可显著减少急性应激小鼠血清皮质酮的水平，从而可能起到保护神经元的作用。此外，脑组织单胺类神经递质5-HT、DA和NE与抑郁症单胺类假说密切相关，本实施例通过HPLC检测发现，柿叶提取物能及时显著性逆转急性应激小鼠脑组织三类神经递质的下调。这也是柿叶提取物发挥抗抑郁作用的重要机制之一。

实施例3柿叶提取物抗抑郁作用的物质基础的研究

在实施例1和2的实验中，本发明已证实柿叶提取物对典型的抑郁障碍具备显著性的作用，但柿叶提取物中含有黄酮类、有机酸、三萜类及香豆素类等多种组分，而黄酮类成分的含量占30％(主要为槲皮素、山柰酚苷元及其单、双糖苷类如芦丁、金丝桃苷等)，已有报道也提示槲皮素、金丝桃苷具备一定的抗抑郁活性。但是本发明所述的柿叶提取物经HPLC检测显示，槲皮素、金丝桃苷、山柰酚和芦丁的含量均分别不超过1.5％。此外尚不清楚柿叶提取物中的有机酸、三萜类、香豆素等组分是否存在协同增效的可能。为了初步探索柿叶提取物抗抑郁作用的物质基础，本实施例进一步将柿叶提取物与单一的黄酮类化合物(槲皮素、山柰酚、芦丁、金丝桃苷)及它们的组合物进行抗抑郁药效对比，所选的典型抑郁障碍模型为国际认可的慢性不可预知温和应激模型。

3.1实验动物

C57小鼠，雄性，80只，体重18～22g，实验动物许可证号：SCXK(粤)2011-0015；实验前小鼠适应饲养环境一周，所有小鼠饲养在温度21±2℃的普通级实验动物房，并遵循昼夜节律。小鼠可自由摄食饮水。

3.2实验药物与仪器

柿叶提取物、槲皮素、山柰酚、芦丁、金丝桃苷、羧甲基纤维素钠、小鼠开场敞箱、电子分析天平(德国Sartrious公司)、冷冻型台式大容量高速离心机5810(德国EPPENDORF公司)、Victor3多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司)、超声组织破碎仪(美国Sonic公司)、DYY-Ⅲ型电泳仪(北京六一仪器厂)、垂直板电泳槽(美国Bio-Rad公司)、WD-9405型水平摇床(北京六一仪器厂)、荧光/化学发光成像系统(美国Sonic公司)、Mill-Q超纯水系统(美国Millipore公司)、悬尾仪，鼠尾夹，计数器，温度计，体重秤等。ECl发光液(Invitrogen公司，美国)；脱脂奶粉(广州斯佳生物科技有限公司)；PVDF膜(Milipore公司，美国)；X线感光胶片(Kodak公司，日本)；皮质酮(CORT)酶联免疫分析试剂盒(美国Enzo公司)；ACTH酶联免疫分析试剂盒(美国phoenix pharmaceuticals公司)。

3.3实验造模与分组给药

实验前适应环境一周，所有小鼠可自由获得食物和水，并遵循昼夜节律，在温度恒定的清洁级环境中饲养，每日人工抚摸，以适应人工操作。适应环境一周后根据小鼠的体重及糖水偏爱实验结果将小鼠分为两组：正常对照组10只、慢性温和不可预测应激(CUMS)组70只，分组后开始进行应激。应激造模方式有：夹尾1min、昼夜颠倒24h、鼠笼倾斜24h、4℃冰水游泳5min、束缚1h、湿笼24h、强迫游泳15min、饮水剥夺24h、食物剥夺24h、电击足底、频闪应激、独笼应激，合笼应激等。在实验开始、应激后第3周进行糖水偏爱实验用以判定造模是否成功，若抑郁症模型未成功，将顺延CUMS应激的时间。造模成功后将模型组分为CUMS模型组(溶剂Veh+CUMS)、柿叶提取物组(NXQ40mg/kg+CUMS)、槲皮素组(4.0mg/kg+CUMS)、金丝桃苷组(4.0mg/kg+CUMS)、山柰酚组(3.0mg/kg+CUMS)、芦丁组(1.5mg/kg+CUMS)、柿叶黄酮组合物组[(槲皮素4.0mg/kg+金丝桃苷4.0mg/kg+山柰酚3.0mg/kg+芦丁1.5mg/kg)+CUMS]，每组10只小鼠。给药4周后进行行为学测试。其中槲皮素、金丝桃苷、山柰酚、芦丁的给药剂量均为其在柿叶提取物中含量比例的10倍以上，

3.4实验方法

3.4.1糖水偏爱实验

实验前，小鼠训练适应1％(w/v)糖水：每笼放置两瓶1％糖水溶液，24h后其中一瓶1％糖水换成纯水，放置24h。适应后，小鼠禁水禁食24h，进行糖水偏爱实验。实验中，每只小鼠自由饮用两瓶水，一瓶为25ml 1％糖水，另一瓶为25ml纯水，实验开始之前称量每瓶水的重量。2h后，测量剩余的重量，得出糖水和纯水的消耗量(g)。用糖水消耗量与总液体消耗量(糖水消耗量+纯水消耗量)之比表示糖水偏爱度，该实验贯穿于实验的整个过程。

3.4.2敞箱实验

实验方法同实施例2的“2.4.1敞箱实验”项。

3.4.3悬尾实验

实验方法同实施例2的“2.4.2悬尾实验”项。

3.4.4强迫游泳实验

实验方法同实施例2的“2.4.3强迫游泳实验”项。

3.4.5ELISA检测小鼠血清皮质酮和促肾上腺皮质激素的水平

实验方法同实施例2的“2.4.4”项，在检测皮质酮的同时，检测促肾上腺皮质激素(ACTH)水平。

3.5数据分析及统计

用SPSS软件分析数据，方差分析(One-Way ANOVA)。经方差齐性检验，若方差齐性则组间两两比较采用Bonferronic法；若方差不齐将采用Welch法进行分析，多重比较采用Dunnett’s T3法。P＜0.05为存在显著性差异，具有统计学意义。

3.6实验结果

3.6.1CUMS小鼠糖水偏爱实验

结果见图10。与正常对照组比较，模型组(Veh+CUMS)小鼠糖水偏嗜度显著降低(P<0.001)，说明小鼠抑郁造模成功；与模型组比较，柿叶提取物(40mg/kg)、柿叶黄酮组合物组和金丝桃苷组连续灌胃给药后显著升高小鼠糖水偏爱度(P<0.001,P<0.01，P<0.05)，而槲皮素、山柰酚和芦丁虽然能一定程度上提高CUMS小鼠的糖水偏爱度，但作用无统计学意义。与柿叶黄酮组合物组、金丝桃苷组比较，柿叶提取物组升高CUMS小鼠糖水偏爱度的作用具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。

该结果提示，柿叶提取物在其有效剂量范围内在蔗糖饮水实验上抗抑郁作用明显优于各黄酮和黄酮组合物。

6.2CUMS小鼠敞箱实验

结果见图11。与正常对照组比较，模型组小鼠在敞箱实验中水平活动次数和垂直活动次数均显著性减少(P<0.001)，提示抑郁症模型建立成功，自主活动减少。

与模型组比较，各给药组均能显著增加小鼠水平活动次数，与其它各给药组比较，柿叶提取物组增加水平作用更大，差异具有统计学意义(P<0.05)；各组作用强度排序为：柿叶提取物组(P<0.001)＞柿叶黄酮组合物组、槲皮素组、金丝桃苷组和芦丁组(P<0.01)＞山柰酚组(P＜0.05)(见图11A)。

与模型组比较，柿叶提取物、柿叶黄酮组合物组连续给药显著性增加小鼠垂直活动次数(P<0.001，P<0.05)；与柿叶黄酮组合物组相比，柿叶提取物增加垂直活动次数作用更大，差异具有统计学意义(P<0.05)。槲皮素、山柰酚、金丝桃苷和芦丁各组虽然小鼠垂直活动次数有所增加，但是与模型组比较，差异没有统计学意义(见图11B)。

该结果提示，柿叶提取物在其有效剂量范围内在敞箱实验上抗抑郁作用明显优于各黄酮和黄酮组合物。

6.3CUMS小鼠悬尾实验

结果见图12。与正常对照组比较，模型组小鼠在悬尾实验中不动时间显著性增加(P<0.001)，说明造模成功，CUMS小鼠出现抑郁样症状。

与模型组比较，连续给药，柿叶提取物极显著地(P＜0.001)、柿叶黄酮组合物和金丝桃苷显著地(P<0.05)减少小鼠悬尾不动时间。其它组与模型组比较差异没有统计学意义。与柿叶黄酮组合物组、金丝桃苷组相比，柿叶提取物减少CUMS小鼠不动时间作用更大，差异具有统计学意义(P<0.05)。

该结果提示，柿叶提取物在其有效剂量范围内在小鼠悬尾实验上抗抑郁作用明显优于各黄酮和黄酮组合物。

6.4CUMS小鼠强迫游泳实验

结果见图13。与正常对照组比较，模型组小鼠在强迫游泳实验中不动时间极显著性增加(P<0.001)，说明造模成功，CUMS小鼠出现抑郁样症状。

与模型组比较，连续给药，柿叶提取物极显著地(P＜0.001)、柿叶黄酮组合物(P<0.01)和金丝桃苷(P<0.05)显著地缩短小鼠不动时间。其它组与模型组比较差异没有统计学意义。与柿叶黄酮组合物组、金丝桃苷组相比，柿叶提取物减少CUMS小鼠不动时间作用更大，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。

该结果提示，柿叶提取物在其有效剂量范围内在小鼠强迫游泳实验上抗抑郁作用明显优于各黄酮和黄酮组合物。

6.5CUMS小鼠血清皮质酮和促肾上腺皮质激素的水平

结果见图14。与正常对照组相比，模型组小鼠血清皮质酮和促肾上腺素皮质激素水平均极显著升高(P<0.001)。

与模型组比较，柿叶提取物能极显著地减少血清皮质酮水平(P<0.001)。柿叶黄酮组合物和金丝桃苷能够显著降低血清中皮质酮水平(P<0.05)。与柿叶黄酮组合物组和金丝桃苷组比较，柿叶提取物降低CUMS小鼠血清皮质酮水平更为显著，差异具有统计学意义(见图14左侧图)。

与模型组比较，柿叶提取物能极显著地降低血清促肾上腺皮质激素水平(P<0.01)。其它各组降低促肾上腺皮质激素水平的作用相较模型组没有统计学差异。(见图14右侧图)。

该结果提示，柿叶提取物在其有效剂量范围内降低抑郁小鼠血清中皮质酮和促肾上腺皮质激素的作用优于各黄酮和黄酮组合物。

6.6结论

在本实施例中，设计了模拟在柿叶提取物中天然存在的部分黄酮组合物，将其与柿叶提取物及各个黄酮成分单体(该部分研究所采用的黄酮单体剂量是其在柿叶提取物中含量的10倍以上)进行了平行的药效比较。令人意料不到的，柿叶提取物的作用在各项实验中都显著强于对照的黄酮组合物和各单体黄酮。

总之，本发明提供了柿叶提取物新到的医药用途——用于预防和/或治疗典型抑郁障碍。动物试验证明了柿叶提取物具有确切的改善CUMS小鼠抑郁症状和逆转相关的异常生化指标的作用。柿叶提取物发挥抗抑郁的作用机理是通过抑制神经炎症、调节HPA轴功能和单胺类神经递质(5-HT、NE、DA)实现的，因此可以防治非躯体其它问题(如心、脑血管病变等)引起的典型抑郁障碍。

Claims (10)

1.柿叶提取物在制备用于预防和/或治疗抑郁症的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑郁症是指典型抑郁障碍，尤其是精神性、情感障碍所致的抑郁障碍。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述柿叶提取物作为所述药物的唯一活性成分。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物包括或不包括药学上可以接受的辅料。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物为口服制剂或非口服制剂。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂选自散剂、普通口服片剂、分散片、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、滴丸剂、微丸剂、颗粒剂、口腔崩解片和口腔速溶膜剂中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非口服制剂选自注射剂、冻干粉针和大容量输液剂中的一种或多种。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物为口服制剂；更优选为脑心清片或脑心清胶囊。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的应用，其特征在于，所述用于预防和/或治疗抑郁症的药物通过如下方法制备：所述将所述柿叶提取物，加入或不加入药学上可以接受的辅料，按照本领域常规的方法，制备得到临床上可以接受的口服制剂或非口服制剂。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的应用，其特征在于，所述柿叶提取物通过如下方法制备：

取干燥柿叶，加水煎煮2次，每次1～2小时，合并水煎液，滤过，浓缩至相对密度1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达80～90％；静置过夜，滤取上清液，备用；沉淀物用60～70％乙醇洗涤，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，与备用上清液合并，回收乙醇，加入适量水，混匀，滤过，滤液用醋酸乙酯提取2次以上，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯并浓缩成稠膏，低温干燥，即得；

优选的，上述柿叶提取物通过如下方法制备：

取干燥柿叶，加水煎煮2次，第1次2小时，第2次1小时，合并滤液，滤过，浓缩汁相对密度1.12～1.15(60℃)，加乙醇至含醇量达85％；静置过夜，滤取上清液，备用；沉淀物用65％乙醇洗涤2次，合并洗涤液，静置过夜，滤取上清液，与备用上清液合并，回收乙醇，加入适量水，混匀，滤过，滤液用醋酸乙酯提取4次，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯并浓缩成稠膏，低温干燥，即得。