CN110101731A - 具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物及其制备方法与应用，该提取物是由菊茎叶乙醇提取物经大孔吸附树脂和聚酰胺树脂精制而成。本发明提供的菊茎叶活性提取物，通过大量试验筛选制备得到，实验结果表明该菊茎叶活性提取物对急性虹膜睫状体炎，自发性高血压性急、慢性眼部疾病具有很好的防治作用，且具有良好的平肝明目活性，能够显著改善肝火上炎和肝阳上亢证候。本发明提供的制备方法，整个制备工艺设计合理，所得提取物总黄酮和总酚酸活性成分含量高。

Description

具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种天然药食同源植物传统非药用部位的综合开发利用，特别是涉及具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物及其制备方法与应用。
背景技术
随着经济快速发展和生活节奏加快，社会竞争激烈，人们工作压力增大，目赤肿痛、头痛眩晕、眼目昏花等证候普遍存在并日趋顽固化。西医应用眼药水对症治疗可以部分缓解症状，但其中的抗生素、类固醇激素有较大的副作用。此外，许多全身疾病伴随眼部症状和体征，如慢性肝炎、糖尿病、高血压等均可能有眼部损害，对此，现代医学尚无安全有效的治疗手段。
菊花为平肝明目的要药，其为菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，具有散风清热、平肝明目的功效，用于治疗风热感冒，头痛眩晕，目赤肿痛，眼目昏花，疮痈肿毒等症。《神农本草经》将其列为上品，现代研究亦证实其低毒安全性，适用于长期饮用。菊花能够促进巨噬细胞的吞噬作用，抑制脂多糖LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO，发挥免疫调节作用；同时抑制LPS以及干扰素IFN-γ诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的炎症反应。菊花中的绿原酸能够分别激活大鼠上皮内淋巴细胞以及肠道固有层淋巴细胞，外周血以及派伊尔结中的单核细胞和淋巴细胞，调节IFN-γ和TNF-α的分泌，发挥免疫调节作用。菊花中的槲皮素能够显著抑制四癸酰基佛波酯引起的小鼠耳肿胀；菊花中的芹菜素局部用药也具有抗炎作用，可以减轻过敏性接触性皮炎。肝脏是炎症反应的主要靶器官，菊花通过免疫调节作用以及抗炎作用来消除眼睛局部炎症反应而明目。此外，菊花含有类胡萝卜素，研究表明菊花提取物通过影响类维生素A代谢相关的细胞色素P450酶(CYP)活性，增加维生素A的吸收，改善夜视力下降。菊花总黄酮可显著抑制Fas及FasL的表达。总之，菊花可以通过多种途径，清肝经风热而明目。
但是，如何对菊花的传统非药用部位进行系统研究，尤其是将其应用于防止眼部疾病的药物开发，目前并无相关研究。因此，对菊茎叶进行分离纯化，制备其防治眼部疾病的活性成分，具有重要的临床意义。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种菊茎叶活性提取物，其能够对肝火上炎证候，急性虹膜睫状体炎，自发性高血压性急、慢性眼部疾病具有良好的改善作用；本发明的另一目的是提供上述菊茎叶提取物的制备方法和应用。
技术方案：为了实现以上目的，本发明所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，它由下述制备方法得到：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质、干燥、粉碎，投入提取罐中，加入8～20倍量的体积浓度50％～95％乙醇，加热回流提取1～3次，过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏，加入重量5～10倍体积量的乙醇，搅拌溶解，上大孔吸附树脂柱，先分别用水或体积浓度10％的乙醇洗脱，再用体积浓度为40％～95％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位粗提物，上聚酰胺柱，先分别用水和体积浓度10％乙醇洗脱，再用体积浓度为30％～85％乙醇洗脱，并收集体积浓度为30％～85％乙醇洗脱液，浓缩，经减压干燥得到菊茎叶活性提取物。
作为优选方案，所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，步骤(1)中提取条件为：依次取菊花茎、叶15倍量、10倍量和8倍量体积浓度为95％的乙醇，加热到80℃回流提取3小时，每次1.5小时，过滤，合并三次滤液。
作为优选方案，所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂型号为AB-8、HPD-100、ADS-17、S-8、HPD-300、D101、HP20或HPD-400。特别优选AB-8树脂。
作为优选方案，所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，步骤(2)和步骤(3)的干燥方法为减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，它由下述制备方法得到：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，60℃烘干后适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入15倍量的体积浓度为95％的乙醇浸泡过夜，加热到80℃回流提取2小时；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的体积浓度95％的乙醇，加热到80℃提取，每次1.5小时。过滤、合并三次提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏，加入5倍量乙醇溶解后，取上清液上AB-8型大孔吸附树脂柱，先用去离子水洗除去水溶性成分及未被充分吸附的成分，再用体积浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位粗提物上聚酰胺柱，先用体积浓度10％的乙醇洗脱除去大极性成分，再用体积浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。
作为优选方案，以上所述的菊茎叶提取物，其特征在于，步骤(2)中所述步骤为：先用去离子水洗脱除去水溶性成分及未被充分吸附的成分，再用浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。70％的乙醇洗脱基本可将大部分黄酮类成分及有机酸类成分洗脱下来，从而与其他脂肪酸类、甾体类、内酯类等小极性成分进行分离。
作为优选方案，以上所述的菊茎叶提取物，其特征在于，步骤(3)中所述的聚酰胺树脂的粒径为80-100目，提取步骤为：先用10％的乙醇洗脱除去大极性成分，再用浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。
本发明对菊茎叶提取物中各原料所含成分进行分析：以芦丁为对照品，采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)，应用紫外-可见分光光度在510nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊茎叶活性部位中总黄酮的含量为54.14％；以没食子酸为对照品，采用福林-酚法(Folin-Ciocalteu method)，在760nm处测定吸光度，测得所制备的菊茎叶活性部位中总酚酸的含量为26.53％。由此可知，制备得到的菊茎叶活性部位中总黄酮类和总酚酸类成分含量之和大于等于80.67％，有效成分含量高。
本发明所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在制备防治肝火上炎或肝阳上亢证候的眼部疾病中的应用。
本发明所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在制备防治急性虹膜睫状体炎疾病中的应用。
本发明所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在制备防治自发性高血压性急、慢性眼部疾病中的应用。
本发明所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物与药学上或化妆品可接受的载体制备成药品、保健品或化妆品。
一种药物制剂，其由权利要求1至6任一项所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物与药学上或化妆品可接受的载体制成颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、滴眼液、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、眼膜或眼贴等。
有益效果：本发明提供的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在菊茎叶原有应用基础上进行新的用途开发，和现有技术相比具有以下优点：
(1)本发明主要以药用菊花生产过程中产生的废弃物菊茎叶为原料，制备其活性提取物，开发其新用途，实现变废为宝，延伸了菊产业链，可实现菊资源的可利用价值和资源的综合利用，具有很好的经济效应、社会效益和环境效益。
(2)实验结果表明，本发明提供的菊茎叶提取物可以治疗急性虹膜睫状体炎、自发性高血压性急、慢性眼部疾病，能够显著改善上述疾病的各种症状及临床指标。在治疗急性虹膜睫状体炎的应用中，本发明提供的菊茎叶提取物能够减少脂多糖所致兔的眼部充血和水肿，减少模型组兔的眼部分泌物，缓解LPS造成的兔急性虹膜睫状体炎症状。同时，能够显著降低血清炎症因子TNF-α含量，并能够降低血清VA；显著增加各组兔血清E含量，不同程度增加血清NE、RBP、PGF2α含量，改善机体的应激状态，降低机体炎症水平。对自发性高血压大鼠，菊茎叶提取物可以显著增加体重和胸腺指数，显著降低收缩压、心率、饮水量、肾上腺指数，从而缓解高血压状态下的急慢性眼部疾病，但无利尿作用。
(3)本发明通过比较优选出最佳的制备工艺，可操作性强，自动化程度高，分离得到的菊茎叶活性成分含量高，活性更显著，活性成分转移率高，能很好地保留原料中的有效成分，杂质少，无毒副作用；制备工艺中能量消耗少，生产成本低，对环境无污染。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
本发明所述的药材和乙醇用量均指得是重量体积比。乙醇均指的是体积浓度。
实施例1
1、一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，晒干后适当粉碎，投入提取罐中，加入药材重量20倍体积量的95％乙醇，加热回流提取3次，每次1小时，过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)将适量经预处理的极性S-8型大孔吸附树脂装柱，取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏加入8倍量乙醇溶解后，取上清液上样，先用去离子水洗，并将洗脱液进行动态吸附，至无样品流分；依次用10％乙醇、40％乙醇、70％乙醇、100％乙醇进行梯度洗脱。收集40％乙醇和70％乙醇洗脱液，减压浓缩并干燥，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位粗提物上聚酰胺柱，先分别用水和10％乙醇洗脱，再用浓度为75％乙醇洗脱并收集75％乙醇洗脱液，浓缩，经减压干燥得到菊茎叶活性部位提取物。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)，应用紫外-可见分光光度在510nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊茎叶活性部位中总黄酮的含量为51.59％；以没食子酸为对照品，采用福林-酚法(Folin-Ciocalteu method)，在760nm处测定吸光度，测得所制备的菊茎叶活性部位中总酚酸的含量为25.37％。
实施例2
1、一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，阴干后适当粉碎，投入提取罐中，加入20倍量的75％乙醇，加热回流提取3次，过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)将适量经预处理的非极性D101型大孔吸附树脂装柱，取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏加入5倍量乙醇溶解后取上清液上样，先用去离子水洗，并将洗脱液进行动态吸附，至无样品流分；依次用10％乙醇，50％乙醇，95％乙醇进行梯度洗脱。收集50％乙醇洗脱液，减压浓缩并干燥，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位粗提物上聚酰胺柱，先用水洗脱，再用体积浓度为70％乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，经减压干燥得到菊茎叶活性部位提取物。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)，应用紫外-可见分光光度在510nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊茎叶活性部位中总黄酮的含量为48.14％；以没食子酸为对照品，采用福林-酚法(Folin-Ciocalteu method)，在760nm处测定吸光度，测得所制备的菊茎叶活性部位中总酚酸的含量为26.15％。
实施例3
1、一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，60℃烘干后适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入15倍量的浓度为95％的乙醇浸泡过夜，加热到80℃回流提取2小时；取提取后药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的95％的乙醇，加热到80℃提取，每次1.5小时。过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)将适量经预处理的弱极性AB-8型大孔吸附树脂装柱，取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏加入5倍量乙醇溶解后，取上清液上样，先用去离子水洗除去水溶性成分及未被充分吸附的成分，再用浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位上聚酰胺柱，先用10％的乙醇洗脱除去大极性成分，再用浓度为70％的乙醇洗脱，收集70％的乙醇洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)，应用紫外-可见分光光度在510nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊茎叶活性部位中总黄酮的含量为54.14％；以没食子酸为对照品，采用福林-酚法(Folin-Ciocalteu method)，在760nm处测定吸光度，测得所制备的菊茎叶活性部位中总酚酸的含量为26.53％。
实施例4
1、一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，60℃烘干后适当粉碎，投入提取罐中，加入15倍量的75％乙醇，加热回流提取3次，过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)将适量经预处理的中等极性HP400型大孔吸附树脂装柱，取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏加入10倍量乙醇溶解后取上清液上样，先用去离子水洗除去水溶性成分及未被充分吸附的成分，再用浓度为60％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位上聚酰胺柱，先用10％的乙醇洗脱除去大极性成分，再用浓度为60％的乙醇洗脱，收集60％的乙醇洗脱液，减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)，应用紫外-可见分光光度在510nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊茎叶活性部位中总黄酮的含量为50.96％；以没食子酸为对照品，采用福林-酚法(Folin-Ciocalteu method)，在760nm处测定吸光度，测得所制备的菊茎叶活性部位中总酚酸的含量为25.71％。
实施例5
1、一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物的制备方法，其包括以下步骤：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，60℃烘干后适当粉碎，投入提取罐中，加入15倍量的50％乙醇，加热回流提取3次，过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)将适量经预处理的弱极性ADS-17型大孔吸附树脂装柱，取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏加入5倍量乙醇溶解后取上清液上样，先用去离子水洗除去水溶性成分及未被充分吸附的成分，再用浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位上聚酰胺柱，先用10％的乙醇洗脱除去大极性成分，再用浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。
采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)，应用紫外-可见分光光度在510nm处测定吸光度，采用该方法可知所制备的菊茎叶活性部位中总黄酮的含量为46.27％；以没食子酸为对照品，采用福林-酚法(Folin-Ciocalteu method)，在760nm处测定吸光度，测得所制备的菊茎叶活性部位中总酚酸的含量为23.70％。
实施例6菊茎叶活性提取物对急性虹膜睫状体炎的药效学实验
一、实验材料与药物
1.药物和试剂
肾上腺素(epinephrine，adrenaline，E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、精氨酸加压素(Argininevasopressin，AVP)、维生素A(vitaminA，VA)、视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP)，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、前列腺素F2α(prostaglandin F2α，PGF2α)测试盒，均购于南京建成生物工程研究所。
盐酸丙美卡因滴眼液购自山东博士伦福瑞达制药有限公司，氯化钠注射液购自浙江康乐药业股份有限公司，脂多糖(liposaccharide，LPS，纯度≥99％)，购自百灵威生物科技有限公司，临用前以氯化钠注射液制成混悬液。羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂北京有限公司。
2.实验动物
普通级雄性新西兰兔，体重为1.8～2.0kg，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物合格证编号NO.201814596和NO.201819363。所有实验用兔饲养条件一致，笼养，自由摄食摄水。动物房室温为20～25℃，通风良好。
3.实验仪器
中药提取罐(北京科美制药机械有限公司)；RE-2002B旋转蒸发仪(20升，上海青浦沪西仪器厂)；TDL-5低速大容量离心机(上海安佳科学仪器厂)；LABCONCO FreeZone冷冻干燥机(美国LABCONCO公司)；热风循环烘箱(南京长江药机制造有限公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；高速离心喷雾干燥机(江苏健达)；BT125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；AnkeGL-16GII型离心机(上海安亭科学仪器厂)；酶联免疫仪(美国Bio-Tek公司)。
4.受试药物及处理方法
实施例1-5制备得到的菊茎叶活性提取物，临用前以0.5％的羧甲基纤维素钠制成浓度为0.1g原生药量/ml的混悬液。
二、实验方法
选取健康新西兰兔，随机分为7组，分别为正常对照组(NC)、脂多糖模型组(LPS)、菊茎叶活性提取物组(实施例1-5)。各给药组实施例1-5每日以10ml/只灌胃给药1次(即每兔1g原生药)，连续7天，同时正常对照组(NC)和脂多糖模型组(LPS)分别灌予相同体积的0.5％的羧甲基纤维素钠。末次给药1h后，除正常组外，其余各组兔两后掌肉垫皮下注射大肠杆菌脂多糖溶液0.5ml/只(使用前用生理盐水配制至400μg/ml)；对照组动物足底注射等量生理盐水。
造模前后，采用盐酸丙美卡因滴眼液进行眼球表面麻醉，用开睑器撑开上下眼皮，肉眼观察眼球形态学变化情况。另外，造模24h后各组动物迅速颈静脉采血2ml于EP管中，轻微震荡，摇匀。高速冷冻离心机于4℃以12,000rpm离心10min，获得血清，储存于-80℃以备分析。
三、实验结果
1.眼球形态学观察
根据急性虹膜睫状体炎病变评分标准，0分：眼明亮，虹膜纹理清晰，无水肿和分泌物；1分：睫状充血呈鲜红色，轻微水肿，角膜后沉着物较少；2分：睫状充血成深红色，虹膜纹理不清，明显水肿，分泌物较多；3分：睫状弥漫性充血呈紫色，水肿至眼睑近闭合，分泌物使整个眼脸粘着。
实验结果表明：LPS模型组兔急性虹膜睫状体炎炎症反应表现为明显的睫状充血、角膜后沉着物增多、房水变混浊、虹膜表面纹理不清、角膜水肿、玻璃体混浊等；实施例1-5中菊茎叶活性提取物组均能不同程度减轻模型组兔的眼部充血和水肿，减少模型组兔的眼部分泌物，从而缓解LPS造成的兔急性虹膜睫状体炎症状，尤其以实施例3的改善效果最为突出(表1)。显示出了非常好的治疗急性虹膜睫状体炎的功效。
表1菊茎叶提取物对脂多糖(LPS)致兔眼急性虹膜睫状体炎的形态学评分(n＝7,x±s)
组别 造模前分级 造模后分级
NC 0.45±0.07 0.49±0.06
LPS 0.37±0.04 2.69±0.31<sup>##</sup>
实施例1 0.23±0.03 1.16±0.22<sup>**</sup>
实施例2 0.47±0.01 1.60±0.19<sup>*</sup>
实施例3 0.45±0.01 1.12±0.20<sup>**</sup>
实施例4 0.27±0.06 1.87±0.21<sup>*</sup>
实施例5 0.44±0.07 1.98±0.24<sup>*</sup>
注：与正常对照组NC比较:#p<0.05，##p<0.01；与模型组LPS相比，*p<0.05，**p<0.01
2.血清生化检测
按照各测试盒操作方法测定兔血清中NE、E、AVP、TNF-α、PGE2、PGF2α、RBP、VA水平。结果表明：在足底注射脂多糖后，LPS组兔血清VA和TNF-α显著增加；NE、E、AVP、PGE2显著下降，PGF2α、RBP轻微下降。各菊茎叶活性提取物组菌能显著降低血清炎症因子TNF-α含量，并能够降低血清VA；同时显著增加各组兔血清E、PGF2α、RBP含量，不同程度增加血清NE含量，但对AVP和PGE2无明显影响(表2)。特别是实施例3对E、TNF-α、PGF2α、RBP、VA的回调作用最显著，综合评价实施例3对肝火上炎证候兔的平肝明目活性最佳。
表2菊茎叶提取物对脂多糖(LPS)肝火上炎证候模型兔血清各生化指标的影响(n＝7,x±s)
注：与正常对照组NC比较:#p<0.05，##p<0.01；与模型组LPS相比，*p<0.05，**p<0.01
实施例7
菊茎叶活性提取物对高血压大鼠的药效学实验
一、实验材料与药物
1.药物和试剂
氯化钠注射液购自浙江康乐药业股份有限公司，羧甲基纤维素钠购自国药集团化学试剂北京有限公司。
2.实验动物
清洁级雄性wistar大鼠及自发性高血压SHR大鼠，体重为180～200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证编号分别为NO.11400700302737及NO.11400700308038。所有实验大鼠饲养条件一致，笼养，自由摄食摄水。动物房室温为20～25℃，通风良好。
3.实验仪器
小动物心电监护仪(上海玉研科学仪器有限公司)，水分测定仪(梅特勒-托利多METTLER TOLEDO)。
4.受试药物及处理方法
所制备的如前所述实施例1-5的菊茎叶活性提取物临用前以0.5％的羧甲基纤维素钠制成浓度为0.1g原生药量/ml。
二、实验方法
选取健康14～18周龄的wistar大鼠作为空白对照组NC；同时取同周龄的健康SHR大鼠随机分为6组，分别为自发性高血压模型组(SHR)、菊茎叶活性提取物组(实施例1-5)。各给药组实施例1-5每日以2ml/只灌胃给药1次(即每只大鼠0.2g原生药)，连续4周，同时空白对照组NC和模型组SHR分别灌予相同体积的0.5％的羧甲基纤维素钠。
灌胃4周后测定各组大鼠体重增加量(weight gain,WG)、饮水量(waterconsumption，WC)、尿量(urine volume，UV)、尿液颜色(urine color，UC)、粪便含水量(moisture of feces，MF)、舒张压(systolic blood pressure，SBP)、收缩压(diastolicblood pressure，DBP)、心率(heart rate，HR)、体温(body temperature，BT)。末次给药后处死后各组动物，取各脏器称重，并计算心(heart index，HI)、肝(liver index，LI)、脾(spleen index，SI)、肾(kindeny index，KI)、胸腺(thymus index，TI)、肾上腺(adrenalgland index，AI)各脏器指数测定，同时进行组织病理学观察。
三、实验结果
1.各组大鼠日常数据监测
结果表明：相比正常对照组NC，自发性高血压模型组大鼠在4周时间内体重几乎不增加，各菊茎叶活性提取物给药组均能显著增加体重；高血压大鼠饮水量WC显著增加而尿量显著减少，各给药组动物饮水量相比模型组均显著下降，但尿液UV并未增加甚至下降，表明菊茎叶活性提取物给药组并无利尿作用；各组大鼠尿液颜色UC及粪便含水量MF并无显著变化。相比空白组，模型组大鼠收缩压SBP和舒张压DBP显著增加，各菊茎叶活性提取物给药组均能不同程度地降低收缩压SBP，但对舒张压DBP影响不大。各高血压组大学心率HR显著高于空白组，给菊茎叶活性提取物后心率显著下降；同时高血压模型组大鼠体温BT轻微下降，各给药组体温无明显变化。在实施例1-5所述的菊茎叶活性提取物中，尤其实施例3对WG、WC、UV、HR的调节效果最为显著。
表3各组大鼠血清日常生理数据(n＝6,x±s)
注：与正常对照组NC比较:#p<0.05，##p<0.01；与模型组LPS相比，*p<0.05，**p<0.01
2.各组大鼠脏器指数
脏器指数计算结果表明：相比正常对照组NC，自发性高血压模型组大鼠心脏、肝脏、肾上腺肿大，HI、LI和AI增加明显；肾脏轻微增加，KI轻微增大；胸腺严重萎缩，表现为TI显著下降；脾脏轻微缩小，SI轻微下降。各给药组均能不同程度降低模型组大鼠的心脏、肝脏指数HI、LI，增加模型组动物的胸腺指数TI，显著降低自发性高血压大鼠的肾上腺指数AI。在实施例1-5所述的菊茎叶提取物中，尤其实施例3对HI、LI、TI、AI的调节效果最为显著，综合考虑实施例3对自发性高血压大鼠调节效果最佳。
表4各组大鼠脏器指数(n＝6,x±s)
注：与正常对照组NC比较:#p<0.05，##p<0.01；与模型组LPS相比，*p<0.05，**p<0.01
以上实验结果表明，本发明提供的菊茎叶活性提取物可以防治多种原因导致急、慢性眼部疾病，尤其对急性虹膜睫状体炎和自发性高血压所致急、慢性眼部疾病具有很好的防治作用：能够减少内毒素LPS蓄积所致眼部充血和水肿，减少眼部分泌物，缓解LPS造成的急性虹膜睫状体炎症状；显著降低血清炎症因子TNF-α含量，并能够降低血清维生素A；显著增加血清肾上腺素含量，不同程度增加血清去甲肾上腺素、视黄醇结合蛋白、前列腺素PGF2α含量，改善机体的应激状态，降低机体炎症水平，从而改善肝火上炎证候的各项因子水平。对自发性高血压，菊茎叶提取物可以显著增加体重和胸腺指数，显著降低收缩压、心率、饮水量、肾上腺指数，从而缓解高血压状态下的头晕目眩。
本发明通过不同制备工艺的菊茎叶活性提取物的活性不同，通过本发明比较可知，实施例3制备得到的菊茎叶活性提取物活性最强，取得了非常好的预料不到的技术效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，其特征在于，它由下述制备方法得到：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质、干燥、粉碎，投入提取罐中，加入8～20倍量的体积浓度50％～95％乙醇，加热回流提取1～3次，过滤、合并提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏，加入重量5～10倍体积量的乙醇，搅拌溶解，上大孔吸附树脂柱，先分别用水或体积浓度10％的乙醇洗脱，再用体积浓度为40％～95％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位粗提物，上聚酰胺柱，先分别用水和体积浓度10％乙醇洗脱，再用体积浓度为30％～85％乙醇洗脱，并收集体积浓度为30％～85％乙醇洗脱液，浓缩，经减压干燥得到菊茎叶活性提取物。
2.根据权利要求1所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，其特征在于，步骤(1)中提取条件为：依次取菊花茎、叶15倍量、10倍量和8倍量体积浓度为95％的乙醇，加热到80℃回流提取3小时，每次1.5小时，过滤，合并三次滤液。
3.根据权利要求1所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂型号为AB-8、HPD-100、ADS-17、S-8、HPD-300、D101、HP20或HPD-400。
4.根据权利要求1所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，其特征在于，步骤(3)中所述的聚酰胺树脂的粒径为80-100目。
5.根据权利要求1所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，其特征在于：步骤(2)和步骤(3)的干燥方法为减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。
6.一种具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物，其特征在于，它由下述制备方法得到：
(1)取药用菊花茎、叶，去除杂质，60℃烘干后适当粉碎，投入提取罐中，第一次加入15倍量的体积浓度为95％的乙醇浸泡过夜，加热到80℃回流提取2小时；取药渣第二次和第三次依次加入10倍量和8倍量的体积浓度95％的乙醇，加热到80℃提取，每次1.5小时。过滤、合并三次提取液，减压回收乙醇至无醇味后，得菊茎叶醇提浸膏，备用；
(2)取步骤(1)得到的菊茎叶醇提浸膏，加入5倍量乙醇溶解后，取上清液上AB-8型大孔吸附树脂柱，先用去离子水洗除去水溶性成分及未被充分吸附的成分，再用体积浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物；
(3)取步骤(2)得到的菊茎叶活性部位粗提物上聚酰胺柱，先用体积浓度10％的乙醇洗脱除去大极性成分，再用体积浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩，得到菊茎叶活性部位粗提物。
7.权利要求1至6任一项所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在制备防治肝火上炎或肝阳上亢证候的眼部疾病中的应用。
8.权利要求1至6任一项所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在制备防治急性虹膜睫状体炎疾病中的应用。
9.权利要求1至6任一项所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物在制备防治自发性高血压性急、慢性眼部疾病中的应用。
10.权利要求1至6任一项所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物与药学上或化妆品可接受的载体制备成药品、保健品或化妆品。
11.一种药物制剂，其由权利要求1至6任一项所述的具有防治眼部疾病的菊茎叶活性提取物与药学上或化妆品可接受的载体制成颗粒剂、片剂、丸剂、散剂、滴眼液、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、眼膜或眼贴。
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