CN110101747A - 桑叶有效部位组合物在制备防治ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用 - Google Patents

桑叶有效部位组合物在制备防治ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用 Download PDF

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CN110101747A CN201910509248.3A CN201910509248A CN110101747A CN 110101747 A CN110101747 A CN 110101747A CN 201910509248 A CN201910509248 A CN 201910509248A CN 110101747 A CN110101747 A CN 110101747A
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张立雯
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Abstract

本发明公开了一种桑叶有效部位组合物在制备治疗和预防Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用。结果显示：桑叶黄酮、桑叶多糖和/或桑叶生物碱组成的桑叶有效部位组合物可显著改善糖尿病引起的肝肾损伤，降低自发型糖尿病db/db小鼠的空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、尿微量白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量及胰岛素抵抗指数；改善肝肾组织的病理变化；增加肝脏组织中InsRβ与PI3K蛋白的水平，降低IRS‑1和NF‑κB蛋白的表达，同时降低肾脏中TGF‑β1、CTGF、Smad2、Smad3和Smad4蛋白水平，显示出对糖尿病肝肾损伤具有很好的防治作用。

Description

桑叶有效部位组合物在制备防治Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物 或保健品中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，桑叶有效部位组合物在制备防治Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用。
背景技术
桑叶为桑科(Moraceae)桑属植物桑(Morus alba L.)的干燥叶，其性寒、味甘苦，具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效，是临床常用中药之一。现代研究表明，桑叶黄酮具有降血糖、降血压、抗病毒、抗肿瘤和抗菌等多种生物活性；桑叶多糖亦具有抑制血脂升高的作用；桑叶生物碱具有显著的抑制α-糖苷酶活性。
糖尿病是一种由于体内胰岛素分泌不足或生物效应降低所致的以糖代谢紊乱为主要特征的全身性代谢疾病。Ⅱ型糖尿病，又名非胰岛素依赖型糖尿病(non-insulin-dependentdiabetes mellitus，NIDDM)，主要表现为组织对胰岛素不敏感(胰岛素抵抗)和β细胞机能障碍从而导致高血糖。慢性高血糖状态常致各种脏器病变，包括肾脏、肝脏、眼、神经及心血管等的病变。
糖尿病肝损伤是继发于糖尿病的肝功能损害为特点的一种常见慢性并发症，可表现为肝脏组织和功能的病变，肝脏作为糖脂代谢重要的靶器官，在糖尿病状态下产生的肝脏病以非酒精性脂肪肝最为常见，包括脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化等。糖尿病肾病是糖尿病患者临床常见的微血管并发症，糖尿病肾病的具体发病机制极为复杂，涉及多种因素：糖代谢紊乱、肾脏血流动力学改变、氧化应激及遗传因素等均与糖尿病肾病的发病机制有关。
发明内容
发明目的：本发明目的是通过深入研究桑叶各类型活性成分，以桑叶黄酮、桑叶多糖和/或桑叶生物碱为活性成分，开发出防治Ⅱ型糖尿病合并肝肾损伤的组合药物或保健品。
本发明以自发型糖尿病db/db小鼠为实验动物模型，应用桑叶黄酮、桑叶多糖和/或桑叶生物碱及其组合物进行干预治疗，通过对其各项生化指标，肝脏、肾脏病理切片分析以及利用Western blot法分析肝肾组织中信号通路，表明本发明提供的桑叶黄酮、桑叶多糖和/或桑叶生物碱及其组合物对糖尿病合并肝肾损伤具有明显的改善作用。
技术方案：本发明采用以下技术方案：
桑叶有效部位组合物在制备治疗和预防Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用。
桑叶黄酮、桑叶多糖和/或桑叶生物碱在制备治疗和预防Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用。
作为优选方案，以上所述的应用，所述的Ⅱ型糖尿病肝损伤包括肝细胞变性或坏死、脂肪变性、肝细胞纤维化。
作为优选方案，以上所述的应用，所述糖尿病肾损伤包括肾小管间质纤维化、肾小球高滤过和肾脏肥大期或肾小球硬化早期。
作为优选方案，以上所述的应用，所述药物剂型为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或者经皮给药剂型。
作为更加优选方案，以上所述的应用，所述药物或保健品为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、贴剂或者凝胶剂。
本发明所述的桑叶黄酮的制备方法为：取桑叶，以重量体积比1：40加入体积浓度为70％乙醇，回流提取2次，每次45min，合并两次滤液，减压浓缩至无醇味；上AB-8型号的大孔树脂，用体积浓度70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得；
桑叶多糖的制备方法为：取桑叶，以重量体积比1：12加水回流提取2次，每次1h，减压浓缩，加入体积浓度95％的乙醇至乙醇最终浓度为80％，放置沉淀24h，取沉淀部分蒸干，利用Sevage法去除提取物中的蛋白质；然后使用AB-8大孔树脂进行纯化，用0.l mg·mL-1浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得；
桑叶生物碱的制备方法为：取桑叶，以重量体积比1：12加水回流提取2次，每次1h，减压浓缩，加入体积浓度95％的乙醇至乙醇最终浓度为80％，放置沉淀24h；取上清液采用001x7型阳离子交换树脂纯化，以0.5mol·L-1的氨水进行洗脱，收集pH7-9.4，pH 9.4-10.5段的洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得。
所述的桑叶黄酮中含的有效成分为：重量百分比3.43％的绿原酸、重量百分比3.85％的新绿原酸、重量百分比4.38％的隐绿原酸、重量百分比3.56％的芦丁、重量百分比1.58％的异槲皮苷、重量百分比1.02％的紫云英苷；桑叶多糖的总多糖含量为18.86％；桑叶生物碱生物碱提取物中含有的有效成分为：重量百分27.7％的1-脱氧野尻霉素(DNJ)、重量百分3.78％的fagomine。
作为特别优选方案，以上所述的应用，所述的桑叶黄酮、桑叶多糖和桑叶生物碱的重量比为4.5～9:5～10:0.5～1；特别优选桑叶黄酮、桑叶多糖和桑叶生物碱的重量比为9:10:1(相当于有效成分比5:6:1)。
本发明提供的桑叶有效部位组合物在制备调节胰岛素受体传导通路与NF-κB蛋白表达的药物或保健品中的应用。
本发明提供的桑叶有效部位组合物在制备降低TGF-βl/Smad信号通路与CTGF蛋白表达的药物或保健品中的应用。
本发明提供的桑叶有效部位组合物在制备增加InsRβ与PI3K蛋白，降低IRS-1、NF-κB、TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达量的药物或保健品中的应用。
有益效果：
本发明提过大量实验深入筛选桑叶有效部位的活性成分，实验结果表明，本发明提供的桑叶有效部位组合物对糖尿病合并肝肾损伤具有明显的改善作用。本发明提供的桑叶有效部位组合物可以调节胰岛素受体传导通路的紊乱和炎症反应，降低TGF-βl/Smad信号通路与相关蛋白的表达，改善肾间质纤维化程度，从而达到改善肝肾损伤的作用。
肝脏HE染色显示，与空白组相比，模型组肝细胞广泛水泡变性至气球样变，细胞肿胀，胞浆疏松淡染或呈空泡化；组织局部可见坏死灶，坏死肝细胞胞核固缩深染，或碎裂溶解；少量还伴有脂肪变性，胞浆内可见圆形脂肪空泡。masson染色的空白组仅有少量蓝染物质，模型组可见大量蓝色胶原纤维，主要沉积在血管、汇管区及狄氏间隙。各给药组可以不同程度减轻糖尿病小鼠肝脏病理改变(见图3a)。肾脏HE染色显示，模型组肾小管上皮细胞水肿变性，细胞肿胀，胞浆疏松淡染，并可见少量管型，少量肾小管上皮细胞坏死，胞核固缩深染；肾小囊上皮部分增厚，肾小囊腔狭窄。各给药组肾小囊上皮部分增厚减轻，水肿变性细胞减少，未见有管型。PAS染色显示相比于空白组，模型组的肾小球系膜细胞和系膜基质有少量增生，基底膜增厚，各给药组病理变化有所改善(见图4a)。此外，分析PAS染色中基底膜阳性表达的累积光密度值(IOD)以及肾小球血管丛的像素面积(AREA)，并计算平均光密度值IOD/AREA，各给药组与模型组相比，均有显著性差异(图4c)。模型组肝、肾脏器指数低于对照组。这些变化在给药后减轻，肝脏的调节尤为明显(图3b、图4b)。
每周空腹血糖值及各相关指标的结果显示，与模型组相比，桑叶有效部位及组合物各组治疗组的FBG值和尿液中mALB含量明显下降，标志肝损伤的血清酶(ALT和AST)水平显著降低，血脂水平(TG、T-CHO)也得到不同程度的调节，均趋向于正常组方向(图1、图2)。Wersternblot结果显示，db/db小鼠在桑叶有效部位组合物干预后，肝脏中胰岛素受体蛋白InsRβ与PI3K蛋白的水平增加，IRS-1和NF-κB蛋白的表达降低(P<0.05)；肾脏Wersternblot结果显示，桑叶有效部位组合物可以降低肾脏中TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3和Smad4蛋白水平(P<0.01)。
附图说明
图1为治疗前和治疗后1、2、3、4、6周的空腹血糖水平测定结果；图中##P<0.01，#P<0.05：模型组vs空白组；**p<0.01，*p<0.05：给药组vs模型组。
图2为各组TG、T-CHO、mALB、ALT、AST含量和HOMA-IR的测定结果；图中##P<0.01，#P<0.05：模型组vs空白组；**p<0.01，*p<0.05：给药组vs模型组。
图3中a为桑叶有效部位对db/db小鼠肝脏组织病理变化的影响结果图(400，HE和masson染色)；b.为肝脏指数。其中A.对照组；B.模型组；C.二甲双胍(Metformin)；D.桑叶黄酮(MF)；E.桑叶多糖(MP)；F.桑叶生物碱(MA)；G.桑叶黄酮+桑叶多糖(MP)+桑叶生物碱配比组(PB，下同)。##P<0.01：模型组vs空白组；**p<0.01，*p<0.05：给药组vs模型组。
图4中a为桑叶有效部位对db/db小鼠肾脏组织病理学变化的影响结果图(400,HE和PAS染色)；b为肾脏指数；c.平均光密度值(IOD/AREA)。A.对照组；B.模型组；C.二甲双胍(Metformin)；D.桑叶黄酮(MF)；E.桑叶多糖(MP)；F.桑叶生物碱(MA)；G.配比组(PB)。##P<0.01：模型组vs空白组；**p<0.01，*p<0.05：给药组vs模型组。
图5为桑叶有效部位对db/db小鼠肝脏蛋白表达水平的影响结果图；##P<0.01，#P<0.05：模型组vs空白组；**p<0.01，*p<0.05：给药组vs模型组。
图6为桑叶有效部位对db/db小鼠肾脏蛋白表达水平的影响结果图；##P<0.01，#P<0.05：模型组vs空白组；**p<0.01，*p<0.05：给药组vs模型组。
具体实施方式
1材料与试剂
1.1实验动物
SPF级6-8周龄雄性db/db小鼠(35-40g)40只，db/m小鼠(15-20g)10只，购自南京大学生物医药研究院，许可证号SCXK(苏)2015-0001，常规饲料喂养，自由饮食，温度和湿度分别保持在23±2℃与60±2％、光照周期为12h。
1.2药品及试剂
盐酸二甲双胍片购自中美上海施贵宝制药有限公司(批号：AA03572)；甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白(mALB)、胰岛素(INS)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)、谷草转氨酶(AST/GOT)试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、5*SDS蛋白上样缓冲液、ECL超敏发光试剂盒、电泳液、转膜液、封闭液、彩色预染蛋白marker、抗体均为上海威奥生物科技有限公司生产。乙腈、甲酸均为色谱纯(德国Merck公司)；甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司)，水为Millipore超纯水。
1.3仪器
小型垂直电泳槽(Bio-Rad)，小型Trans-Blot转印槽(Bio-Rad)，基础电源(Bio-Rad)，组织匀浆器(北京鼎昊源)，超声波细胞破碎仪(宁波新芝)，台式高速冷冻离心机(Thermo)，脱色摇床(海门其林贝尔)，全波长酶标仪(Thermo)，Anke LXJ-IIB型及TDL-240B型离心机购自于上海安亭科学仪器厂(中国，上海)。WatersACQUITYUPLC系统(包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器；Waters公司，USA)；Xevo质谱检测器(Waters公司)；massLynxTM质谱工作站软件(Waters公司)；Anke LXJ-IIB型及TDL-240B型离心机购自于上海安亭科学仪器厂(中国，上海)；Millipore Direct-Q3Advantage超纯水系统(Millipore)。
2.实验方法
2.1药物制备
桑叶黄酮的制备方法为：
取桑叶，以重量体积比1：40加入体积浓度为70％乙醇，回流提取2次，每次45min，合并两次滤液，减压浓缩至无醇味；上AB-8型号的大孔树脂，用体积浓度70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得；
桑叶多糖的制备方法为：
取桑叶，以重量体积比1：12加水回流提取2次，每次1h，减压浓缩，加入体积浓度95％的乙醇至乙醇最终浓度为80％，放置沉淀24h，取沉淀部分蒸干，利用Sevage法去除提取物中的蛋白质；然后使用AB-8大孔树脂进行纯化，用0.l mg·mL-1浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得；
桑叶生物碱的制备方法为：
取桑叶，以重量体积比1：12加水回流提取2次，每次1h，减压浓缩，加入体积浓度95％的乙醇至乙醇最终浓度为80％，放置沉淀24h；取上清液采用001x7型阳离子交换树脂纯化，以0.5mol·L-1的氨水进行洗脱，收集pH7-9.4，pH 9.4-10.5段的洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得。
去上述制备得到的桑叶黄酮、桑叶多糖和桑叶生物碱以0.5％羧甲基纤维素钠配制成浓度分别为黄酮6mg·mL-1、多糖4mg·mL-1和生物碱2mg·mL-1的单个混悬液以及黄酮、多糖和生物碱三者含量分别为1.98、2.2和0.22mg·mL-1的混合混悬液，将二甲双胍片研磨成粉后溶于0.5％羧甲基纤维素钠中，配制成浓度为2.5mg·mL-1的混悬液。
2.2模型评价及分组给药
适应性喂养18天，期间禁食不禁水，12h后尾静脉取血测定空腹血糖，待血糖稳定且大于16.7mmol·L-1为造模成功。db/m小鼠为空白组(C)，将达到模型标准的db/db小鼠分为6组，每组8只，分别为糖尿病模型组(M)，二甲双胍对照组(Metformin，250mg/kg·d-1)，桑叶黄酮组(MF，600mg/kg·d-1)，桑叶多糖组(MP，400mg/kg·d-1)，桑叶生物碱组(MA，200mg/kg·d-1)，三者配比组(PB，黄酮198mg/kg·d-1+多糖220mg/kg·d-1+生物碱22mg/kg·d-1)，进行灌胃给药，连续给药6周。各给药组小鼠鼠按照10mL·(kg·d)-1剂量连续灌胃给药6周，给药期间，正常组与模型组小鼠灌胃相同剂量的生理盐水。
2.3样本采集及生化指标测定
给药6周后，将小鼠禁食不禁水置于代谢笼中，收集12h尿液；接着尾静脉取血测定各组小鼠空腹血糖值(FBG)；最后摘左眼球取血离心(3000r/min，10min)收集血清；并迅速摘取小鼠肝脏及肾脏，肝脏与肾脏称重，计算脏器指数：肾脏指数＝(左肾质量+右肾质量)/(小鼠体质量*100)，肝脏指数＝肝脏质量/(小鼠体质量*100)；肾脏左侧放入液氮，右侧放入福尔马林，肝脏切去部分放入福尔马林，其余放入液氮，用于Westernblot检测及HE染色、PAS染色、masson染色等。相应的试剂盒分别测定血清中TG、T-CHO、BUN、INS、ALT、AST及尿液中尿中mALB的含量。
2.3.1病理切片结果与分析
如图3a所示，光镜下HE染色的空白组肝细胞排列紧密，肝板结构清晰，中央静脉及汇管区未见异常，模型组肝细胞广泛水泡变性至气球样变，细胞肿胀，胞浆疏松淡染或呈空泡化；组织局部可见坏死灶，坏死肝细胞胞核固缩深染，或碎裂溶解；少量还伴有脂肪变性，胞浆内可见圆形脂肪空泡。masson染色的空白组仅有少量蓝染物质，模型组可见大量蓝色胶原纤维，主要沉积在血管、汇管区及狄氏间隙。各给药组可以不同程度减轻糖尿病小鼠肝脏病理改变，细胞水泡变性现象明显减少，坏死细胞减少，细胞排列较为紧密有序，蓝色胶原纤维不同程度减少。
图4a为光镜下肾脏组织的染色图，正常组肾脏组织皮髓质分界清晰，肾小球及肾小管形态基本正常，模型组肾小管上皮细胞水肿变性，细胞肿胀，胞浆疏松淡染，并可见少量管型，少量肾小管上皮细胞坏死，胞核固缩深染；肾小囊上皮部分增厚，肾小囊腔狭窄。各给药组肾小囊上皮部分增厚减轻，水肿变性细胞减少，未见有管型。PAS染色显示相比于空白组，模型组的肾小球系膜细胞和系膜基质有少量增生，基底膜增厚，各给药组病理变化有明显改善。此外，分析PAS染色中基底膜阳性表达的累积光密度值(IOD)以及肾小球血管丛的像素面积(AREA)，并计算平均光密度值IOD/AREA，各给药组与模型组相比，均有显著性差异(图4c)。模型组肝、肾脏器指数低于对照组。这些变化在给药后得到有效调节。
2.3.2生化指标结果与分析
每周空腹血糖值及各相关指标的结果如图所示(图1、图2)，与正常组相比，模型组小鼠FBG、TG、T-CHO、mALB、ALT、AST含量及胰岛素抵抗指数HOMA-IR显著增加。给药干预后，桑叶多糖组和桑叶生物碱组的FBG值和尿液中mALB含量明显下降。而桑叶黄酮和桑叶生物碱对降低ALT和AST水平有显著作用。与模型组相比，桑叶各治疗组的血脂水平(TG、T-CHO)降低，均趋向于正常组方向，并且整体看来配比后效果更佳。
2.3.3Westernblot结果与分析
与空白组相比，db/db小鼠肝脏中胰岛素受体蛋白InsRβ与PI3K蛋白的水平显著降低，IRS-1和NF-κB蛋白的表达增加(P<0.05)(图5)，经过各提取物调节后，各组均有不同程度的回调，但各给药组对IRS-1蛋白无明显调节作用。肾脏Wersternblot结果显示，肾脏中TGF-β1、CTGF、Smad2、Smad3和Smad4蛋白水平显著升高(P<0.01)(图6)。桑叶各有效部位及其组合物干预后上述蛋白表达回调效果明显。
本发明使用db/db小鼠为6-8周龄，适应性喂养18天后，已出现明显的高血糖现象，且产生了明显的肝肾损伤。给以桑叶有效部位治疗6周后，表现出显著的调节db/db小鼠模型血糖、血脂，改善肝脏和肾脏功能和结构紊乱的作用，具体表现为下调血糖和血脂生化指标，减少尿微量白蛋白、转氨酶水平以及胰岛素抵抗，改善肝脏中脂肪细胞病变和肝细胞坏死，保护肾小球和肾小管。
肝脏Westernblot结果显示胰岛素受体传导通路被激活，胰岛素受体传导通路缺陷是发生胰岛素抵抗的主要分子机制，而胰岛素信号传导障碍是Ⅱ型糖尿病产生胰岛素抵抗的病因之一，桑叶有效部位及其组合物可通过促进外周组织葡萄糖代谢、提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗，从而发挥降低糖尿病小鼠血糖和保护肝脏的作用。肾脏Westernblot结果显示TGF-β/SmaDS信号通路被激活。研究表明，TGF-β/Smads信号通路的异常可影响成纤维细胞的分化、迁移和纤维化相关因子的表达，增加CTGF，进而导致细胞肥大、系膜基质扩张，CTGF通过调节CDK(周期蛋白依赖性激酶，cyclin-dependentkinases)活性作为TGF-β诱导的成纤维细胞增殖的介质，桑叶有效部位及其组合物可通过抑制CTGF及相关基因的表达来抑制肾脏损伤。综上所述，db/db小鼠体内存在炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗、血管内皮功能紊乱等，桑叶各有效组分干预后可与模型组明显区分，且向正常组靠拢，较阳性药二甲双胍的效果明显，其中桑叶黄酮和生物碱表现出较好的改善效果，特别是桑叶黄酮、桑叶多糖和生物碱按重量比9：10:1配伍后，显示出在更低剂量下发挥多效应多靶点的协同增效的作用，取得了预料不到的技术效果。
以上实验结果表明，本发明提供的桑叶有效部位组合物具有很好的治疗糖尿病肝肾损伤的功效。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，并非是对本发明的实施方式的限定。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下还可以做出其它不同形式的变化和改进。而这些基于本发明的实质精神所引伸出的的变化也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.桑叶有效部位组合物在制备治疗和预防Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用。
2.桑叶黄酮、桑叶多糖和/或桑叶生物碱在制备治疗和预防Ⅱ型糖尿病肝肾损伤的药物或保健品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，所述的Ⅱ型糖尿病肝损伤包括肝细胞变性或坏死、脂肪变性、肝细胞纤维化。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述糖尿病肾损伤包括肾小管间质纤维化、肾小球高滤过和肾脏肥大期、肾小球硬化早期。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或者经皮给药剂型。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物或保健品为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、贴剂或者凝胶剂。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的桑叶黄酮的制备方法为：取桑叶，以重量体积比1：40加入体积浓度为70％乙醇，回流提取2次，每次45min，合并两次滤液，减压浓缩至无醇味；上AB-8型号的大孔树脂，用体积浓度70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得；
桑叶多糖的制备方法为：取桑叶，以重量体积比1：12加水回流提取2次，每次1h，减压浓缩，加入体积浓度95％的乙醇至乙醇最终浓度为80％，放置沉淀24h，取沉淀部分蒸干，利用Sevage法去除提取物中的蛋白质；然后使用AB-8大孔树脂进行纯化，用0.1mg·mL-1浓度的NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得；
桑叶生物碱的制备方法为：取桑叶，以重量体积比1：12加水回流提取2次，每次1h，减压浓缩，加入体积浓度95％的乙醇至乙醇最终浓度为80％，放置沉淀24h；取上清液采用001x7型阳离子交换树脂纯化，以0.5mol·L-1的氨水进行洗脱，收集pH7-9.4，pH9.4-10.5段的洗脱液，减压浓缩、冷冻干燥，既得。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的桑叶黄酮中含的有效成分为：重量百分比3.43％的绿原酸、重量百分比3.85％的新绿原酸、重量百分比4.38％的隐绿原酸、重量百分比3.56％的芦丁、重量百分比1.58％的异槲皮苷、重量百分比1.02％的紫云英苷；桑叶多糖的总多糖含量为18.86％；桑叶生物碱生物碱提取物中含有的有效成分为：重量百分27.7％的1-脱氧野尻霉素(DNJ)、重量百分3.78％的fagomine。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的桑叶黄酮、桑叶多糖和桑叶生物碱的重量比为4.5～9:5～10:0.5～1。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的桑叶黄酮、桑叶多糖和桑叶生物碱的重量比为9:10:1。
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