CN114010683A - 桑提取物在制备治疗胰腺相关疾病的药物中的应用 - Google Patents

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刘志华
朱向阳
王婷婷
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Abstract

本发明公开了桑提取物的应用。本发明所公开的应用是桑提取物或其主要活性成分在制备预防和/或治疗胰腺相关疾病产品中的应用。本发明通过实验证实，桑提取物具有如下功效：促进β细胞和原代胰岛的胰岛素分泌；增加MIN6细胞的[Ca2+]i；扭转糖脂毒性对MIN6细胞生长的抑制作用；逆转胰岛中β细胞去分化；降低自发性2型糖尿病动物血糖并促进胰岛素分泌；改善自发性2型糖尿病动物的胰岛结构；改善胰腺腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大。

Description

桑提取物在制备治疗胰腺相关疾病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及桑提取物在制备治疗胰腺相关疾病的药物中的应用。
背景技术
胰腺是人体重要的消化器官及内分泌器官，通过其外分泌腺和内分泌腺两个部分实现功能，外分泌腺由腺泡和腺管组成，腺泡分泌胰液，腺管是胰液排出的通道。胰液中含有碳酸氢钠、胰蛋白酶原、脂肪酶、淀粉酶等。胰液通过胰腺管排入十二指肠，有消化蛋白质、脂肪和糖的作用。内分泌腺由大小不同的细胞团——胰岛所组成，胰岛主要由4种细胞组成：A细胞、B细胞、D细胞、PP细胞。其中，胰岛β细胞是机体内唯一可合成并分泌胰岛素的细胞，在血糖感知和稳态调节中扮演重要角色，胰岛β细胞破坏或受损，引起胰岛素缺乏，最终导致高糖血症。胰岛β细胞在高脂、高糖、炎症等因素存在的情况下会出现功能异常。胰岛β细胞功能异常不仅包括胰岛素分泌缺陷，还包括β细胞质量减少。已有研究证实，终末分化的胰岛β细胞仍具可塑性，它的去分化可能在胰岛β细胞身份丢失中起重要作用，研究人员在糖尿病模型小鼠中发现了胰岛素和胰高血糖素共表达的中间态细胞，为胰岛β细胞去转分化提供了直接证据(韦晓等，2020)。因此，β细胞质量减少不应完全归因于凋亡，还包括已有的β细胞增殖衰减，以及β细胞去分化等(Marselli et al.,2014；Amo-Shiinoki et al.,2021；Sun and Han,2020；Ying et al.,2020)。近期研究显示β细胞损伤主要是由于其去分化增加(Cinti et al.,2016；Ishida et al.,2017；Sun et 63al.,2019)。
GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂是目前临床上明确的可有效促进胰岛素分泌，改善胰岛β细胞功能的药物(Josh Reed&Venkateswarlu Kanmarlapudi,2020；Juris JMeier,2012；Be Ahren&James E.Foley,2016；Shanshan Wu&Siyan Zhan,2019)，研究表明GLP-1受体激动剂可促进胰岛β细胞增殖和再生，抑制其凋亡(Josh Reed&VenkateswarluKanmarlapudi,2020；Juris J Meier,2012)，但其具有增加胰腺炎的风险(Vanita RAroda,2018)；DPP-4抑制剂可提高β细胞的葡萄糖敏感性。没有研究显示GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂可有效预防或扭转β细胞去分化。
桑系列药材，如桑提取物，包含多种多羟基生物碱及其苷类，具有较强的糖苷酶抑制剂活性，研究发现其不仅可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，还可改善糖脂代谢紊乱、调节肠道菌群、减轻体重、减轻肠道炎症(Liu et 74 al.,2019；Quan Liu,2021；Yuling Liu,2015)。但其对胰岛β细胞的作用和机制还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供桑提取物或其主要活性成分在制备治疗胰腺相关疾病的药物中的应用，可选地，所述胰腺相关疾病包括胰腺分泌功能异常；可选地，本发明提供桑提取物或其主要活性成分在制备治疗胰腺分泌功能异常的产品中的应用。
进一步地，所述胰腺分泌功能异常包括胰腺内分泌异常和/或胰腺外分泌异常，所述胰腺内分泌异常可包括胰岛β细胞功能异常，所述胰腺外分泌异常可包括胰腺外分泌腺异常。
本发明提供了桑提取物或其主要活性成分的应用，为下述至少一种：
桑提取物或其主要活性成分在制备预防和/或治疗胰腺相关疾病产品中的应用；
或，桑提取物或其主要活性成分在预防和/或治疗胰腺相关疾病中的应用。
所述胰腺相关疾病选自下述至少一种：
(a1)胰岛β细胞功能异常引起的糖尿病，所述糖尿病可为I型糖尿病或II型糖尿病；
(a2)胰腺炎。
所述胰岛β细胞功能异常包括胰岛β细胞生长的抑制、胰岛β细胞去分化、胰岛β细胞分泌胰岛素减少。
本发明中预防胰腺炎体现在可明显降低急性胰腺炎的发病风险。
本发明中预防胰岛β细胞功能异常引起的糖尿病体现在可明显降低糖尿病的发病风险。
所述糖尿病具体可为2型糖尿病。
本发明还保护桑提取物或其主要活性成分的应用，为如下(b1)-(b18)中的至少一种：
(b1)制备保护胰岛β细胞的产品；
(b2)制备用于促进胰岛β细胞株胰岛素分泌的产品；具体为通过促进细胞内Ca2+浓度的增加从而促进胰岛素分泌，促进I相胰岛素分泌；
(b3)制备用于促进自发性2型糖尿病患者胰岛分泌胰岛素的产品；具体为通过促进细胞内Ca2+浓度的增加从而促进β细胞株胰岛素分泌,促进I相胰岛素分泌；
(b4)制备扭转糖脂毒性对胰岛β细胞生长的抑制作用的产品；
(b5)制备逆转自发性2型糖尿病患者胰岛中β细胞去分化的产品；
(b6)制备降低自发性2型糖尿病患者血糖并促进胰岛素分泌的产品；具体为促进细胞内Ca2+浓度的增加，促进I相胰岛素分泌；
(b7)制备用于促进胰岛损伤后结构恢复的产品；具体为β细胞分布趋于胰岛中央，α细胞趋于胰岛边缘，且β细胞占比增加，α细胞占比减少；
(b8)制备用于促进自发性2型糖尿病患者胰岛结构恢复的产品；
(b9)制备用于改善胰腺腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大的产品；
(b10)保护胰岛β细胞；
(b11)促进胰岛β细胞株胰岛素分泌；
(b12)促进自发性2型糖尿病患者胰岛分泌胰岛素；
(b13)扭转糖脂毒性对胰岛β细胞生长的抑制；
(b14)逆转自发性2型糖尿病患者胰岛中β细胞去分化；
(b15)降低自发性2型糖尿病患者血糖并促进胰岛素分泌；
(b16)促进胰岛损伤后结构恢复；
(b17)促进自发性2型糖尿病患者胰岛结构恢复；
(b18)改善胰腺腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大。
本发明所述的胰岛β细胞可为人或哺乳动物(如小鼠)的胰岛β细胞。进一步的，所述胰岛细胞可为小鼠胰岛β细胞株MIN6。
所述产品为药物或药物制剂
本发明所述的桑提取物可参照CN 111568948 A中记载的方法进行制备，具体包括下述步骤：制备粗提液；任选地，经阳离子树脂和/或阴离子树脂分离；任选地，对树脂流出液进行醇沉处理；以及任选地，浓缩干燥处理。
或，所述桑提取物也可以市售的桑枝总生物碱片(国药准字Z20200002)的形式提供。
优选地，所述桑提取物的制备方法包括以下步骤：
1)制备桑科植物粗提液；
2)将所述粗提液经阳离子树脂和/或任选的阴离子树脂分离，得到所述桑提取物。
所述方法还可进一步包括下述步骤：
3)对步骤2)的树脂流出液进行醇沉处理，收集上清液；
4)对所述上清液进行浓缩干燥处理。
或，所述还可进一步包括下述步骤：将步骤2)的树脂流出液进行浓缩干燥处理。
所述桑科植物选自广东桑、鲁桑、白桑、细齿桑、山桑或杂交桑，所述杂交桑优选为粤桑11号、桂桑优62号或桑特优2号。可以使用所述植物的叶、根、枝、皮、芽、茎、果实等各部位。
在本发明的一种实施方式中，所述桑提取物包含生物碱、多糖、黄酮和氨基酸。优选地，所述生物碱包含1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin或DNJ)、N-甲基-1-脱氧野尻霉素(N-methly-1-deoxynojirimycin)、荞麦碱(fagomine或FAG)、3-表荞麦碱(3-epi-fagomine)、1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-核糖醇(1,4-dideoxy-1，4-imino-D-arabinitol或DAB)、打碗花精B2(calysteginB2)、打碗花精C1(calysteginC1)、2-氧-(α-D-半乳吡喃糖基)-1-脱氧野尻霉素(2-O-(α-D-galactopyranosyl)-1-deoxynojirimycin)、6-氧-(β-D-吡喃葡萄糖)-1-脱氧野尻霉素(6-O-(β-D-glucopyranosyl)-1-deoxynojirimycin)、1，4-双脱氧-1，4-亚胺-(2-氧-β-D-吡喃葡萄糖)-D-阿拉伯糖醇(1,4-dideoxy-1,4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-D-arabinitol)中的至少一种。
其中，1-deoxynojirimycin的重量百分比不低于总生物碱的30％。优选地，1-deoxynojirimycin的重量百分比不低于总生物碱的40％。更优选地，1-deoxynojirimycin的重量百分比不低于总生物碱的50％。
优选的，所述生物碱包含DNJ(1-脱氧野尻霉素，1-deoxynojirimycin)、FAG(荞麦碱，Fagomine)和DAB(1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇，1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol)；
优选的，所述主要活性成分选自下述至少一种：DNJ(1-脱氧野尻霉素，1-deoxynojirimycin)、FAG(荞麦碱，Fagomine)和DAB(1,4-二脱氧-1,4-亚氨基-D-阿拉伯糖醇，1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol)
优选地，基于所述桑提取物，各组分重量含量为：
Figure BDA0003416700290000041
更优选地，基于所述桑提取物，各组分重量含量为：
Figure BDA0003416700290000042
进一步优选地，基于所述桑提取物，各组分重量含量为：
Figure BDA0003416700290000043
在一种实施方式中，所述桑提取物的制备包括以下步骤：制备粗提液；任选地，经阳离子树脂和/或阴离子树脂分离；任选地，对树脂流出液进行醇沉处理；以及任选地，浓缩干燥处理。优选地，所述桑提取物的制备包括以下步骤：步骤1)：制备粗提液；步骤2)：经阳离子树脂和/或任选的阴离子树脂分离；任选的步骤3)：对步骤2)的树脂流出液进行醇沉处理；任选的步骤4)浓缩干燥处理。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液浓缩上阴离子交换树脂，收集不吸附的部分，加入乙醇，沉淀去除杂质，离心，清液减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液浓缩上阴离子交换树脂，收集不吸附的部分，减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍(优选为4-15倍)，重复提取1-3次(提取时间优选为每次0.5-3h)，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液浓缩上阴离子交换树脂，收集不吸附的部分，加入乙醇，沉淀去除杂质，离心，清液减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
优选地，在阳离子树脂装柱后，按照酸性溶液洗、碱性溶液洗、酸性溶液洗的顺序进行活化。优选地，碱性溶液洗至洗出液pH为8.0-9.5，优选为8.5-9.5；优选地，所述碱性溶液选自氨水溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或碳酸钠溶液；优选地，所述碱性溶液的浓度为0.5-4mol/L。优选地，酸性溶液洗至洗出液pH为3.0-7.0，优选为4.5-6.5。优选地，所述酸性溶液选自盐酸溶液、磷酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。任选地，所述阳离子树脂经最后一次酸性溶液洗后还可以使用3-5倍柱体积的去离子水冲洗。优选地，所述阳离子树脂为732型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、734型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和D001型大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂。
优选地，所述阳离子树脂的用量与植物原材料投料重量比为1:2-20。上样植物粗提液至阳离子树脂后，用洗脱剂对上样后的阳离子树脂进行洗脱，优选地，所述洗脱剂的浓度为0.5-2.5mol/L。优选地，洗脱剂流速为5-10BV/h。
优选地，所述阴离子树脂为717型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，D201型大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子交换树脂。优选地，所述阴离子树脂的用量与植物原材料投料重量比为1:1-32。当液体流出阴离子树脂时开始收集。优选地，当收集液的体积达到植物原材料投料重量的0.1-5倍时，停止收集。
优选地，醇沉处理所用的乙醇与植物原材料投料重量比为1:20-300。醇沉处理中，搅拌速度为40-500rpm。
本发明所述的“动物”所指的动物种类不受特别限制，可以为任何具有肠道器官的动物，优选哺乳动物，更优选大鼠、小鼠和人，最优选人。
本发明具备如下优点：
1、在MIN6细胞和KKAy小鼠胰岛，无论是低浓度葡萄糖(2.8mM)还是高浓度葡萄糖(16.8mM)，SZ-A均可促进胰岛素分泌。但在C57BL/6J小鼠胰岛，SZ-A可促进高浓度葡萄糖下胰岛素分泌。除此之外，三个有效成分DNJ、FAG和DAB的促胰岛素分泌作用各有不同。在MIN6细胞，除DNJ外，DAB和FAG均具有促胰岛素分泌作用。但在C57BL/6J小鼠胰岛，DAB可促胰岛素分泌；在KKAy小鼠胰岛，FAG可促胰岛素分泌。
2、SZ-A和其有效成分FAG、DAB均可有效促进细胞内Ca2+浓度的增加。
3、高浓度葡萄糖和棕榈酸可使MIN6细胞增殖能力显著降低，SZ-A则可使其恢复。三个有效成分中，DNJ也可扭转糖脂毒性作用下的MIN6增殖能力促进细胞生长，而FAG和DAB则无此作用。
4、SZ-A可使KKAy小鼠胰岛中Aldh1a3的表达量显著降低，同时使胰岛中β细胞相关基因Ins1和Ins2显著增加，而α细胞相关基因Gcg和MafB显著减少。且给予SZ-A的KKAy小鼠，其胰腺胰岛中ALDH1A3+细胞明显减少。
5、在IPGTT，SZ-A不仅可有效降低KKAy小鼠糖负荷前(0min)和后30min的血糖，同时使30min的血胰岛素相对于0min增加82.81％，而Con组小鼠30min的血胰岛素相对0min反而下降。高葡萄糖钳夹实验结果显示，与Con组相比，SZ-A可使KKAy小鼠的I相胰岛素分泌量增加86.17％。
6、SZ-A可使KKAy小鼠胰腺胰岛细胞空泡变性和坏死明显减少，受损胰岛的形态明显恢复。β细胞分布更趋于胰岛中央，α细胞趋于胰岛边缘，且β细胞占比显著增加而α细胞则显著减少。
7、SZ-A可明显改善胰腺组织的腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大，明显降低急性胰腺炎及糖尿病的发病风险，对其具有预防作用。
附图说明
图1为SZ-A对小鼠β细胞株MIN6和小鼠原代胰岛胰岛素分泌的影响。分别在MIN6细胞和小鼠原代胰岛进行葡萄糖刺激胰岛素分泌实验；(A)和(D)MIN6细胞；(B)和(E)正常C57BL/6J小鼠原代胰岛；(C)和(F)自发性2型糖尿病KKAy小鼠原代胰岛；Mean±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.Vehicle组。
图2为SZ-A对小鼠β细胞株MIN6胞内Ca2+浓度的影响。(A)25、50、100μg/ml的SZ-A作用时，MIN6细胞内Ca2+浓度变化。(B)100μg/ml的SZ-A、10μg/ml的FAG和10μg/ml的DAB作用时，MIN6细胞内Ca2+浓度变化。Mean±SEM，***P<0.001vs.Vehicle组。
图3为SZ-A对糖脂毒性作用下MIN6细胞增殖能力的改善作用。MIN6细胞在含有33mM葡萄糖和0.25mM棕榈酸的培养基培养24h，同时加入(A)25、50、100μg/ml的SZ-A，或(B)100μg/ml的SZ-A、40μg/ml的DNJ、10μg/ml的FAG、10μg/ml的DAB。Mean±SEM，*P<0.05，***P<0.001vs.Vehicle组。
图4为SZ-A对自发性2型糖尿病KKAy小鼠胰岛中β细胞去分化的影响。(A)和(B)小鼠胰岛细胞中ALDH1A3蛋白的表达水平。(C)Aldh1a3基因的表达水平。(D)β细胞和α细胞相关基因的表达水平。(E)和(F)KKAy小鼠胰腺的免疫组化结果。Mean±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.Vehicle组/Con组。
图5为SZ-A对自发性2型糖尿病KKAy小鼠血糖和胰岛素的影响。腹腔注射葡萄糖耐量试验，注射葡萄糖(2.0g/kg)前(0min)和注射后15min、30min的(A)血糖和(B)血胰岛素。高葡萄糖钳夹实验过程中小鼠的(C)血胰岛素水平和(D)前15min内血胰岛素曲线下面积(AUC)。Mean±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.Con组。
图6为SZ-A对自发2型糖尿病KKAy小鼠中胰岛形态的影响。(A)小鼠胰腺的HE染色结果。(B-D)小鼠胰腺的免疫组化结果。胰岛素标记β细胞，胰高血糖素标记α细胞。Mean±SEM，*P<0.05，***P<0.001vs.Con组。
图7为实施例7中HFD模型小鼠用SZ-A处理后，胰腺组织病理图片。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进一步详细说明。通过这些示例性说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
在这里专业的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明涉及的组分含量根据已公开的方法进行检测(参考公开号为CN111077247A和CN110393738A的专利中记载的方法)。
桑提取物的制备
制备例1
取新鲜桑枝(细齿桑粤桑11号)1000kg，粉碎后，加4000L水，用加热回流法提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液热浓缩至固形物质量百分含量达到4％，保温50℃作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂150kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到870L结束。
收集液进行离心除杂再进行反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.25，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨500rpm下加入无水乙醇25L。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。
所述桑枝提取物浸膏中，生物碱的含量为52％，多糖的含量为22％，黄酮的含量为0.8％，氨基酸的含量为20％。在生物碱中，1-DNJ的含量为60％，FAG为17％，DAB为15％。
制备例2
取新鲜桑枝(桑特优2号)10kg，粉碎后，加150L水，分2次加入，每次用煎煮法提取3h，合并提取液，过滤除去不溶物。提取液热浓缩至固形物质量百分含量达到8％，将其转移至醇沉罐，搅拌桨300rpm下加入2367.9g无水乙醇(3L)。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液作为阳离子树脂柱的上样液。使用002SC型强酸性苯乙烯系阳离子树脂5kg装柱，按照实施例1的方法对阳离子树脂进行活化。上样经浓缩醇沉处理的提取液，然后使用100L 5mol/L氯化钾洗脱，洗脱速度为5BV/h，用20％硅钨酸检测流出液，当有白色沉淀生成时开始收集，当收集液达到25L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用711型强碱性苯乙烯系阴离子树脂10kg装柱，按照实施例3的方法对阴离子树脂进行活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到15L结束。将收集液重新上样至阳离子树脂，按照上述方法依次用阳离子树脂和阴离子树脂再分离两次。
将经过三次柱分离后得到的收集液进行离心除杂再进行反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.25，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨1000rpm下加入无水乙醇125g。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。另外取新鲜桑白皮和桑叶(桑特优2号)进行提取，提取方法和参数与上述方法相同。
得到的桑枝提取物浸膏中，生物碱的含量为98％，多糖的含量为0.2％，黄酮的含量为0.05％，氨基酸的含量为0。在生物碱中，1-DNJ的含量为99％，FAG为0.5％，DAB为0.4％。
得到的桑白皮提取物中，生物碱的含量为95％，多糖的含量为2％，黄酮的含量为0.1％，氨基酸的含量为1％。在生物碱中，1-DNJ的含量为96％，FAG为1.5％，DAB为1.4％。
得到的桑叶提取物中，生物碱的含量为90％，多糖的含量为4％，黄酮的含量为0.1％，氨基酸的含量为3％。在生物碱中，1-DNJ的含量为91％，FAG为3.1％，DAB为2.8％。
制备例3
取新鲜桑枝(广东桑)1000kg，粉碎后，加11500L水，加热回流提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液先经离心除杂，再用反离子渗透膜浓缩至固形物质量百分含量达到1％，作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D001型大孔强酸性苯乙烯系阳离子树脂300kg装柱，按照制备例1的方法对阳离子树脂进行活化。上样经浓缩处理的粗提液，使用5000L 0.04mol/L硝酸铵洗脱，洗脱速度为5BV/h，用20％硅钨酸检测流出液，当有白色沉淀生成时开始收集，当收集液达到1000L时，停止收集。
将经过阳离子柱分离后得到的收集液进行纳滤膜浓缩，减压浓缩得提取物浸膏。
得到的桑枝提取物中，生物碱的含量为15％，多糖的含量为20％，黄酮的含量为7％，氨基酸的含量为45％。在生物碱中，1-DNJ的含量为55％，FAG为23％，DAB为10％。
制备例4
取干桑枝(粤桑11号)333kg，粉碎后，加4000L水，加热回流法分两次提取，每次回流1h，合并提取液，过滤，将提取液浓缩至1kg生药量/L。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂150kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂125kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集集pH大于8的流出液至流出液达到870L结束。
将经过阴离子柱分离后得到的收集液进行微滤膜过滤除杂再用反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.1，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨400rpm下加入无水乙醇15kg。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。样品含量：生物碱的含量为80％，多糖的含量为5％，黄酮的含量为0.1％，氨基酸的含量为4％。在生物碱中，1-DNJ的含量为75％，FAG为12％，DAB为10％。
制备例5
取干桑枝(粤桑11号)400kg，粉碎后，加4000L水，加热回流法分两次提取，每次回流1h，合并提取液，过滤，将提取液浓缩至1kg生药量/L。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的提取浓缩液上样至阴离子树脂，收集流出液。
将经过阴离子柱分离后得到的收集液进行微滤膜过滤除杂再用反离子渗透膜浓缩，进一步减压浓缩干燥得桑枝提取物浸膏。样品含量：生物碱的含量为3％，多糖的含量为70％，黄酮的含量为10％，氨基酸的含量为10％。在生物碱中，1-DNJ的含量为68％，FAG为17％，DAB为8％。
制备例6
取新鲜桑枝(细齿桑粤桑11号)1500kg，粉碎后，加6000L水，用加热回流法提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液热浓缩至固形物质量百分含量达到4％，保温50℃作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂100kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到870L结束。将流出液减压浓缩得桑枝提取物浸膏，其中，生物碱的含量为30％，多糖的含量为35％，黄酮的含量为2％，氨基酸的含量为25％。在生物碱中，1-DNJ的含量为62％，FAG为20％，DAB为13％。
制备例7
取新鲜桑枝(细齿桑粤桑11号)1000kg，粉碎后，加4000L水，用加热回流法提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液热浓缩至固形物质量百分含量达到4％，保温50℃作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂100kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到870L结束。将流出液减压浓缩得桑枝提取物浸膏，其中，生物碱的含量为40％，多糖的含量为25％，黄酮的含量为0.5％，氨基酸的含量为25％。在生物碱中，1-DNJ的含量为57％，FAG为24％，DAB为16％。
制备例8
取干桑枝(粤桑11号)333kg，粉碎后，加4000L水，加热回流法分两次提取，每次回流1h，合并提取液，过滤，将提取液浓缩至1kg生药量/L。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂150kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集pH大于8的流出液至流出液达到870L结束。
将经过阴离子柱分离后得到的收集液进行微滤膜过滤除杂再用反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.1，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨400rpm下加入无水乙醇15kg。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。样品含量：生物碱的含量为63％，多糖的含量为23％，黄酮的含量为1％，氨基酸的含量为5％。在生物碱中，1-DNJ的含量为61.9％，FAG为16.6％，DAB为11.1％。
桑提取物的药效学试验
实施例1、SZ-A促进小鼠胰岛β细胞株MIN6和小鼠原代胰岛的胰岛素分泌
小鼠胰岛β细胞株MIN6在DMEM培养基(含15％胎牛血清)培养，在96孔板中分别用含有0.1％双蒸水(Vehicle)、100μg/ml制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)、40μg/ml 1-脱氧野尻霉素(DNJ)、10μg/ml 1 4-双脱氧-1 4-亚氨基-d-阿拉伯糖醇(DAB)和10μg/ml荞麦碱(FAG)的Kreb缓冲液(2.8mM葡萄糖)培养1h，随后用新的含有Vehicle(0.1％)、制备例8制备的SZ-A(100μg/ml)、DNJ(40μg/ml)、FAG(10μg/ml)、DAB(10μg/ml)的Kreb缓冲液(2.8mM、16.8mM葡萄糖)继续培养1h，收取上清用于胰岛素检测。用25μg/ml或50μg/ml制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)替换100μg/ml制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)进行实验。小鼠原代胰岛通过胶原酶V灌流技术从正常C57BL/6J小鼠和自发性2型糖尿病KKAy小鼠分离提取，并在RPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)培养。挑取10个大小合适的胰岛转移至含有0.1％双蒸水、100μg/ml制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)、40μg/ml 1-脱氧野尻霉素(DNJ)、10μg/ml 1 4-双脱氧-1 4-亚氨基-d-阿拉伯糖醇(DAB)和10μg/ml荞麦碱(FAG)的Kreb缓冲液(2.8mM葡萄糖)培养1h，再转移至新的含有Vehicle(0.1％)、SZ-A(100μg/ml)、DNJ(40μg/ml)、FAG(10μg/ml)、DAB(10μg/ml)的Kreb缓冲液(2.8mM、16.8mM葡萄糖)培养1h，收取上清用于胰岛素检测。用25μg/ml或50μg/ml制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)替换100μg/ml制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)进行实验。
分别收取细胞和胰岛用于蛋白定量。
结果如图1所示，在MIN6细胞(图1A)和KKAy小鼠胰岛(图1C)，无论是低浓度葡萄糖(2.8mM)还是高浓度葡萄糖(16.8mM)，SZ-A均可促进胰岛素分泌。但在C57BL/6J小鼠胰岛(图1B)，SZ-A可促进高浓度葡萄糖下胰岛素分泌。除此之外，三个有效成分DNJ、FAG和DAB的促胰岛素分泌作用各有不同。在MIN6细胞(图1D)，除DNJ外，DAB和FAG均具有促胰岛素分泌作用。但在C57BL/6J小鼠胰岛(图1E)，DAB可促胰岛素分泌；在KKAy小鼠胰岛(图1F)，FAG可促胰岛素分泌。
实施例2、SZ-A增加MIN6细胞的[Ca2+]i
MIN6细胞在96孔板中分别用含有Vehicle、制备例8制备的桑枝总生物碱提取物(SZ-A)、FAG和DAB的培养基培养1h。随后加入Ca2+荧光指示剂Fluo4-AM在37℃培养30min，通过多功能酶标仪检测细胞中Ca2+浓度变化。检测过程中，细胞首先在含有2.8mM葡萄糖的Kreb缓冲液中连续检测5min，随后在葡萄糖浓度为16.8mM且含有Vehicle、SZ-A、FAG和DAB的Kreb缓冲液连续检测20min，记录分析细胞中Ca2+信号变化。
结果如图2所示，当葡萄糖浓度为16.8mM时，SZ-A(图2A)和其有效成分FAG、DAB(图2B)均可有效促进细胞内Ca2+浓度的增加。
实施例3、SZ-A扭转糖脂毒性对MIN6细胞生长的抑制作用
MIN6细胞在含有33mM葡萄糖和0.25mM棕榈酸的培养基培养24h，同时分别加入不同浓度的SZ-A或其有效成分DNJ、FAG、DAB。通过BeyoClickTM EdU-488细胞增殖检测试剂盒检测细胞的增殖能力。
结果如图3所示，高浓度葡萄糖和棕榈酸可使MIN6细胞增殖能力显著降低，SZ-A则可使其恢复(图3A)。三个有效成分中，DNJ也可扭转糖脂毒性作用下的MIN6增殖能力促进细胞生长，而FAG和DAB则无此作用(图3B)。
实施例4、SZ-A逆转自发性2型糖尿病KKAy小鼠胰岛中β细胞去分化
通过胶原酶灌流技术分离的自发性2型糖尿病KKAy小鼠的胰岛，在含有Vehicle、SZ-A的培养基中培养24h。随后收集胰岛，一部分用RIPA裂解液处理后通过Western-blot技术检测胰岛中ALDH1A3的表达水平；另一部分通过TRIzol提取RNA并反转录为cDNA，通过qPCR检测胰岛中Aldh1a3，及β细胞和α细胞相关基因Ins1、Ins2、Pdx1、NeuroD、Nkx6.1、Pc1、Pc2、MafA、Gcg、MafB、Pax6等表达。
自发性2型糖尿病KKAy小鼠依据空腹血糖、血甘油三酯和总胆固醇、体重以及葡萄糖耐量的30min血糖上升百分数，随机分为Con组和SZ-A组。正常C57BL/6J小鼠作为Nor组。SZ-A组灌胃给予SZ-A(200mg/kg)，Con组和Nor组灌胃给予辅型剂，连续给药11周，处死小鼠，提取胰腺，用4％福尔马林固定后做石蜡包埋切片。通过胰岛素抗体标记胰岛β细胞，β细胞去分化标记物ALDH1A3抗体标记去分化的β细胞。
结果如图4所示，SZ-A可使KKAy小鼠胰岛中Aldh1a3的表达量显著降低(图4A-C)，同时使胰岛中β细胞相关基因Ins1和Ins2显著增加，而α细胞相关基因Gcg和MafB显著减少(图4D)。且给予SZ-A的KKAy小鼠，其胰腺胰岛中ALDH1A3+细胞明显减少(图4E-F)。
实施例5、SZ-A降低自发性2型糖尿病KKAy小鼠血糖并促进胰岛素分泌
上述小鼠于给药第8周进行腹腔注射葡萄糖耐量试验(IPGTT)。小鼠禁食4h后腹腔注射葡萄糖(2.0g/kg)，分别于注射前(0min)和注射后15min、30min取尾尖血检测血糖和胰岛素。于给药第11周进行高葡萄糖钳夹实验。禁食过夜的小鼠麻醉后，首先通过颈静脉在1min内灌注葡萄糖(100mg/kg)，并收集0min、2min、5min、10min和15min的尾尖血检测I相胰岛素分泌；随后，缓慢输注5％的葡萄糖直到血糖稳定在14.0±0.5mM(约2.0-2.5h)，于60min、100min和120min收集尾尖血检测II相胰岛素分泌。
结果如图5所示，在IPGTT，SZ-A不仅可有效降低KKAy小鼠糖负荷前(0min)和后30min的血糖(图5A)，同时使30min的血胰岛素相对于0min增加82.81％(图5B)，而Con组小鼠30min的血胰岛素相对0min反而下降。高葡萄糖钳夹实验结果显示，与Con组相比，SZ-A可使KKAy小鼠的I相胰岛素分泌量增加86.17％(图5C-D)。
实施例6、SZ-A改善自发性2型糖尿病KKAy小鼠的胰岛结构
前述KKAy小鼠的胰腺经石蜡包埋切片后，一部分进行HE染色并通过显微镜观察分析胰岛形态，一部分通过胰岛素抗体标记胰岛β细胞，胰高血糖素抗体标记胰岛α细胞，并分别观察计算胰岛中β细胞和α细胞分布及其各自占比。
结果如图6所示，SZ-A可使KKAy小鼠胰腺胰岛细胞空泡变性和坏死明显减少(图6A)，受损胰岛的形态明显恢复。β细胞分布更趋于胰岛中央，α细胞趋于胰岛边缘，且β细胞占比显著增加而α细胞则显著减少(图6B-D)。
实施例7、SZ-A可明显降低高脂喂养小鼠急性胰腺炎及糖尿病的发病风险
随机将45只6周龄健康的雄性C57小鼠分为正常组(Chow)、模型组(HFD)、SZ-A组，每组各15只。其中正常组小鼠给予基础饲料喂养，模型组、SZ-A组给予高脂饮食(ResearchDiet,D12492,60kcal％Fat)建立小鼠模型。饲养14周后，每天对各组小鼠给予相应的药物，连续给药6周，SZ-A组按总生物碱200mg/kg/d腹腔注射，模型组给药同时继续高脂喂养，正常组和模型组注射相应剂量的溶剂(生理盐水)，药物治疗期间，观察小鼠一般情况。
取胰腺组织，进行H&E染色：取各组新鲜胰腺组织放入4％多聚甲醛中固定，48小时以后，置于不同浓度的酒精中，梯度脱水，随后置于二甲苯中透明。将已透明的组织置于石蜡中进行包埋。包埋好的蜡块固定于切片机上，进行切片。
病理结果见图7。从病理图片可以看出，Blank组胰腺组织未见明显异常；高脂喂养的model组，胰腺外分泌腺腺泡功能亢进，分泌大量的酶原颗粒(粉染明显增多)，同时内分泌腺胰岛代偿性增大明显，且在胰岛周围出现明显炎症细胞(浆细胞及淋巴细胞)聚集；给予SZ-A后，胰腺组织的腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大现象得到明显改善。
从病理结果可以看出，SZ-A可明显降低急性胰腺炎及糖尿病的发病风险，对其具有预防作用。
以上结合了优选的实施方式对本发明进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本发明进行多种替换和改进，这些均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.桑提取物或其主要活性成分在制备预防和/或治疗胰腺相关疾病产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述胰腺相关疾病选自下述至少一种：
(a1)胰岛β细胞功能异常引起的糖尿病；
(a2)胰腺炎。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述胰岛β细胞功能异常包括胰岛β细胞生长的抑制、胰岛β细胞去分化、胰岛β细胞分泌胰岛素减少。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：预防胰腺炎体现在可明显降低急性胰腺炎的发病风险；
预防胰岛β细胞功能异常引起的糖尿病体现在可明显降低糖尿病的发病风险。
5.桑提取物或其主要活性成分的应用，为如下(b1)-(b18)中的至少一种：
(b1)制备用于保护胰岛β细胞的产品；
(b2)制备用于促进胰岛β细胞株胰岛素分泌的产品；具体为通过促进细胞内Ca2+浓度的增加从而促进胰岛素分泌，促进I相胰岛素分泌；
(b3)制备用于促进自发性2型糖尿病患者胰岛分泌胰岛素的产品；具体为通过促进细胞内Ca2+浓度的增加从而促进β细胞株胰岛素分泌,促进I相胰岛素分泌；
(b4)制备扭转糖脂毒性对胰岛β细胞生长的抑制作用的产品；
(b5)制备逆转自发性2型糖尿病患者胰岛中β细胞去分化的产品；
(b6)制备降低自发性2型糖尿病患者血糖并促进胰岛素分泌的产品；具体为促进细胞内Ca2+浓度的增加，促进I相胰岛素分泌；
(b7)制备用于促进胰岛损伤后结构恢复的产品；具体为β细胞分布趋于胰岛中央，α细胞趋于胰岛边缘，且β细胞占比增加，α细胞占比减少；
(b8)制备用于促进自发性2型糖尿病患者胰岛结构恢复的产品；
(b9)制备用于改善胰腺腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大的产品；
(b10)保护胰岛β细胞；
(b11)促进胰岛β细胞株胰岛素分泌；
(b12)促进自发性2型糖尿病患者胰岛分泌胰岛素；
(b13)扭转糖脂毒性对胰岛β细胞生长的抑制；
(b14)逆转自发性2型糖尿病患者胰岛中β细胞去分化；
(b15)降低自发性2型糖尿病患者血糖并促进胰岛素分泌；
(b16)促进胰岛损伤后结构恢复；
(b17)促进自发性2型糖尿病患者胰岛结构恢复；
(b18)改善胰腺腺泡功能亢进及胰岛代偿性增大。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：
所述桑提取物的制备方法包括以下步骤：
1)制备桑科植物粗提液；
2)将所述粗提液经阳离子树脂和/或任选的阴离子树脂分离，得到所述桑提取物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述方法还包括下述步骤：
3)对步骤2)的树脂流出液进行醇沉处理，收集上清液；
4)对所述上清液进行浓缩干燥处理。
或，所述还包括下述步骤：将步骤2)的树脂流出液进行浓缩干燥处理。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于：所述桑提取物的主要活性成分选自下述至少一种：1-脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、荞麦碱、3-表荞麦碱、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-核糖醇、打碗花精B2、打碗花精C1、2-氧-(α-D-半乳吡喃糖基)-1-脱氧野尻霉素、6-氧-(β-D-吡喃葡萄糖)-1-脱氧野尻霉素、1，4-双脱氧-1，4-亚胺-(2-氧-β-D-吡喃葡萄糖)-D-阿拉伯糖醇中的至少一种；
优选的，所述桑提取物的主要活性成分选自下述至少一种：1-脱氧野尻霉素、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-核糖醇和荞麦碱。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的应用，其特征在于：所述胰岛β细胞为人或哺乳动物的胰岛β细胞。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于：所述桑提取物或其主要活性成分作用于人或哺乳动物。
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