TWI752330B - 芙蓉萃取物用於治療乳癌或提高乳癌預後之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露一種將芙蓉萃取物用於製備治療乳癌之組合物之用途，意即透過投予含有一有效量之芙蓉萃取物的組合物至一乳癌患者，係能夠有效地抑制乳癌惡化，或是當該組合物結合其他臨床療法時，能更增強治療效果。

Description

芙蓉萃取物用於治療乳癌或提高乳癌預後之用途

本發明係有關於一種植物萃取物之第二用途，特別係指一種芙蓉萃取物用於治療乳癌或提高乳癌預後之用途。

按，乳癌為臺灣罹癌人數前三大的癌症，並且估全世界女性癌症發生率第一高。乳癌惡化與癌細胞之遷移和侵襲相關，當原位癌轉移後，會使乳癌之治療難度增加。上皮間質轉化作用(epithelial mesenchymal transition，EMT)被證實與腫瘤的浸潤及遠處轉移關係密切，其中牽涉許多特定分子的表現，例如附著因子(adhesion factor)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase)。目前研究指出，一旦附著因子表現量下降，使得細胞間連結附著減弱，癌細胞便可脫離原處進行移動，而此類蛋白酶可以分解癌細胞周圍的結締組織以利擴散。

雖然目前臨床有多種治療乳癌之方法，例如手術切除、化學治療、放射治療、賀爾蒙療法及標靶治療，但是一旦原位癌移轉或惡化後，即使施以上述至少一種治療方法，仍無法達到高治癒率；並且，絕大多數患者被投予化療藥物後會產生嚴重副作用，而導致患者會抗拒接受治療。因此，獲得一種能夠有效治療乳癌且低副作用之組合物乃為目前臨床治療之要務。

本發明之主要目的在於提供一種芙蓉萃取物之第二用途，由於該芙蓉萃取物係具有該芙蓉萃取物能夠抑制NF-κB/MMPs訊息傳遞路徑，並且減少間質細胞型態標記蛋白之表現，而能夠抑制乳癌細胞遷移、上皮細胞間質轉化，並能夠抑制血管新生，因此，該芙蓉萃取物係能夠作為治療乳癌、減緩乳癌惡化或移轉、提高預後之組合物，而能應用於臨床治療上。

為能達成上述目的，本發明係揭露一種將芙蓉萃取物用於製備治療乳癌之組合物之用途，意即透過投予含有一有效量之芙蓉萃取物的組合物至一乳癌患者，係能夠有效地抑制乳癌惡化，或是當該組合物結合其他臨床療法時，能更增強治療效果。

於本發明之另一實施例中，該芙蓉萃取物係能夠用於製備成為一抑制乳癌移轉之組合物。

於本發明之次一實施例中，該芙蓉萃取物係能用於製備成為一提高乳癌預後之組合物。

更進一步來說，該組合物得為一藥品或一食品。當該組合物為一藥品時，該組合物係包含有一有效量之芙蓉萃取物及一藥學上可接受之載體及/或賦形劑；而當該組合物為一食品時，該組合物中包含一有效量之芙蓉萃取物，以食品工業上可接受之載體。

於本發明之實施例中，該芙蓉萃取物包含有多酚化合物及黃酮類化合物，其中，該多酚化合物之含量約為6~16%，該黃酮類化合物之含量約為17~28%。

於本發明之實施例中，該芙蓉萃取物係將芙蓉於高溫下進行萃取而得者，並所使用之萃取溶劑為水，其中，該芙蓉係得先經乾糙處理後再進行萃取。

於本發明之實施例中，該芙蓉萃取物係能夠有效地抑制腫瘤細胞遷移及腫瘤細胞生長，並且，不會影響個體之體重與營養吸收。

第一圖係為MCF-7細胞及M10細胞分別經不同濃度芙蓉萃取物處理後之細胞存活率。

第二圖係為MCF-7細胞及M10細胞分別經不同濃度芙蓉萃取物處理後，分別檢測其細胞生長週期之結果。

第三圖A係為MCF-7細胞經不同濃度芙蓉萃取物處理不同時間，分別進行傷口癒合試驗之結果。

第三圖B係統計分析第三圖A之結果。

第四圖A係為MCF-7細胞經不同濃度芙蓉萃取物處理不同時間，分別進行細胞侵襲測試之結果

第四圖A係統計分析經不同處理之MCF-7細胞的細胞遷移數量。

第五圖A係檢測經不同濃度芙蓉萃取物處理不同時間之MCF-7細胞內基質金屬蛋白酶活性表現之結果。

第五圖B係統計分析第五圖A之結果。

第六圖A係檢測經不同濃度芙蓉萃取物處理不同時間之MCF-7細胞內NF-κB/MMPs訊息路徑之結果。

第六圖B係統計分析第六圖A之結果。

第七圖A係檢測經不同濃度芙蓉萃取物處理不同時間之MCF-7細胞內上皮間質轉化作用之結果。

第七圖B係統計分析第七圖A之結果。

第八圖係為顯示經不同處理之各組裸鼠的體重變化。

第九圖係為各組裸鼠腫瘤組織圖。

第十圖係為統計分析各組裸鼠腫瘤組織體積之結果。

第十一圖係為檢測各組裸鼠腫瘤組織表面血紅素濃度之結果。

第十二圖A檢測各組裸鼠腫瘤組織中基質金屬蛋白酶活性之結果。

第十二圖B係統計分析第十二圖A之結果。

第十三圖A檢測各組裸鼠腫瘤組織中NF-Kb/MMPs訊息傳遞路徑與EMT相關蛋白表現之結果。

第十三圖B係統計分析第十三圖A之結果。

第十四圖係為統計分析斑馬魚經不同濃度芙蓉萃取物處理後之存活率。

本發明所揭「芙蓉(Crossostephium chinense)」，屬於菊科(compositae)蘄艾屬(Crossostephium)之常綠多年生亞灌木，分布在中南半島、日本、菲律賓、中國南方以及臺灣等地。

以下實例中所使用之細胞株包含有人類乳腺癌細胞株Michigan Cancer Foundation-7(下稱MCF-7細胞)，以及正常乳房表皮細胞株H184G5F5(下稱M10細胞)，兩株細胞皆來自台灣食品工業發展研究所。

以下實例中所使用之飢餓培養基(starvation medium)係指不含有10%胎牛血清之培養液。

實例一：製備芙蓉萃取物

秤取乾燥芙蓉300g，打碎至粉末狀。以2L二次水大滾後，小火萃取1小時過濾，重複此步驟三次，再將濾液進行冷凍乾燥，其粉末即為本發明所揭芙蓉萃取物。

更進一步地，以Folin-Ciocalteu分析法及Jia分析法檢測芙蓉萃取物中之總多酚及總黃酮含量，可知本發明所揭芙蓉萃取物中總多酚之含量約為11.2±4.8%，總黃酮之含量約為22.4±4.9%。

將上述芙蓉萃取物粉末以ddH2O：無水酒精=1：1充分溶解，並經過濾後，保存於-20℃環境下，供後續實例使用。

實例二：細胞培養

取MCF-7細胞及M10細胞，其中，MCF-7細胞使用MEM培養液，M10細胞使用MEM-α培養液；並各該培養液中分別添加10%胎牛血清、1%盤尼西林/鏈黴素、2mM麩醯胺酸、2.2g/L碳酸氢钠、0.1mM MEM非必須胺基酸溶液(100X)、1.0mM丙酮酸鈉；培養於一預定大小之燒瓶中；培養環境為5%二氧化碳、37℃。

實例三：細胞存活試驗

將MCF-7細胞或M10細胞培養於12孔盤中，每個孔中細胞數量為3X104顆，培養24小時待細胞貼附後，將培養液更換為飢餓培養基進行飢餓處理，24小時後將培養液換回含有10%胎牛血清之MEM培養液，並將各細胞分組，並分別加入不同劑量之芙蓉萃取物，劑量分別為0、10、50、100、250、500、1000μg/ml，培養24小時之後將培養液移除。收集培養後之細胞，並藉由添加 碘化物染劑進行避光反應，而後再使用細胞分析儀(Muse^TM)觀察不同劑量之芙蓉萃取物對於各細胞之毒性程度，結果如第一圖所示。

由第一圖之結果可知，劑量為10-1000μg/mL芙蓉萃取物對於M10細胞之存活率無明顯影像，但是卻會抑制MCF-7細胞生長，並且隨著芙蓉萃取物劑量增加，MCF-7細胞之存活率隨之降低，具體來說，當芙蓉萃取物為100μg/mL以下劑量時，MCF-7細胞存活之抑制程度約10%；而當芙蓉萃取物於高濃度：250μg/mL到1000μg/mL時，對於MCF-7細胞生長之抑制程度約達20%。

實例四：細胞生長週期試驗

將MCF-7細胞培養在6孔盤中，每個孔中細胞數量為5X104顆，培養24小時待細胞貼附後，更換培養液為飢餓培養基，24小時後將培養液換回含有10%胎牛血清之MEM培養液，並於各組MCF-7細胞中加入不同劑量之芙蓉萃取物，培養24小時後，移除培養液，收取細胞溶液，以1200rpm離心5分鐘，去除上清液，再以磷酸鹽緩衝液清洗後離心，移除磷酸鹽緩衝液後打散細胞，添加1mL 70%冰酒精固定細胞，而後去除冰酒精，再以磷酸鹽緩衝液清洗、離心，移除上清液後加入200μL碘化物染劑反應一定時間後，最後以細胞分析儀(Muse^TM)檢測各組細胞之細胞週期，結果如第二圖所示，其中，以經飢餓培養基培養48小時之組別作為細胞凋亡之陽性對照組。

由第二圖之結果可知，芙蓉萃取物對於MCF-7細胞生長具有亦製作用，並且於DNA合成期(S期)之抑制最為明顯。

實例五：傷口癒合試驗

將MCF-7細胞以含10%胎牛血清之MEM培養液培養24小時，待細胞貼壁，將培養液更換為飢餓培養基進行飢餓處理24小時，接著去除飢餓培養基，以100μL微量吸管尖在每個培養孔做出直線刮痕，培養液更換回具10%胎牛血清之MEM培養液，並分別添加不同濃度之芙蓉萃取物：0、10、50、100μ g/mL，於0小時、24和48小時之時間點以光學顯微鏡觀察細胞移動性的表現並拍照紀錄，結果如第三圖所示。

由第三圖A及第三圖B之結果可知，未添加芙蓉萃取物培養之MCF-7細胞於培養48小時後，傷口接近癒合；而經芙蓉萃取物處理之MCF-7細胞，其於24小時之時間點時已有傷口癒合緩慢之現象，並且隨著處理時間增加或處理濃度增加，都會使傷口癒合之現象被抑制。

由此顯示，本發明所揭芙蓉萃取物不僅具有抑制細胞生長之能力，亦具有抑制細胞移動之能力，以達到有效抑制癌症轉移或惡化之功效。

實例六：細胞侵襲測試

將細胞數約2X106顆之MCF-7細胞培養在孔盤中24小時，等待細胞貼附後，更換飢餓培養基飢餓處理24小時，接著將培養液更換回具10%胎牛血清之MEM培養液，並於每孔分別添加濃度為0、10、50、100μg/mL之芙蓉萃取物，培養24小時後，收取各細胞溶液，以1000rpm離心5分鐘，去除上清液，回溶於無血清培養基，進行細胞計數，調整細胞數至1X105/mL。使用市售Boyden chamber分析裝置分析經不同濃度芙蓉萃取物處理之MCF-7細胞的移形狀況，並進行拍照計數，其中，下層容室加入30μL具10%胎牛血清之MEM培養液，中間放上PCTE(polycarbonate track etched)膜，上層容室分別加入經不同濃度芙蓉萃取物處理之各組細胞培養液(細胞數為1X105/mL)50μL。測試結果如第四圖所示。

由第四圖A及第四圖B之結果可知，當MCF-7細胞經濃度為10μg/mL之芙蓉萃取物處理，MCF-7細胞穿透薄膜的抑制作用約10%；當MCF-7細胞經濃度為50μg/m之芙蓉萃取物處理，MCF-7細胞穿透薄膜的抑制作用約30%；當MCF-7細胞經濃度為100μg/mL之芙蓉萃取物處理，MCF-7細胞穿透薄膜的抑制作用約60%。

由上述結果顯示本發明所揭芙蓉萃取物確實具有抑制細胞遷移之能力，並且隨著投予劑量增加，抑制遷移之效果越佳，因此，本發明所揭芙蓉萃取物確實能夠有效地達到治療乳癌或延緩乳癌惡化之功效。

實例七：基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，下稱MMP)活性分析

將MCF-7細胞以含有10%胎牛血清之MEM培養液於培養盤中進行培養24小時，待其貼附，更換為飢餓培養基處理24小時，再將培養基更換回含有10%胎牛血清之MEM培養液，並分別以濃度為0、50、100μg/mL之芙蓉萃取物處理，且分別於24與48小時收取培養液置入-20℃保存，全部收取完畢後以3000rpm離心5分鐘，取其上清液，加入基質金屬蛋白酶染劑後進行電泳，並且以西方墨點法分析蛋白質表現，結果分別如第五圖及第六圖所示。

由第五圖A及第五圖B之結果可知，未經芙蓉萃取物處理之MCF-7細胞中可偵測到MMP-2與MMP-9之活性表現較高，處理48小時較處理24小時者提高約1.2倍；而經由芙蓉萃取物處理之MCF-7細胞內之MMP-2與MMP-9之活性表現下降；由第六圖A及第六圖B之結果顯示，芙蓉萃取物會抑制MCF-7細胞內MMP-2與MMP-9之活化表現，並且亦會抑制MMP-2與MMP-9共同上游轉錄因子NF-κB蛋白及其抑制分子IκBα磷酸化表現。

由第五圖及第六圖之結果可知，本發明所揭芙蓉萃取物能夠調控NF-κB去活化和IκBα去磷酸化，進而抑制MMP-2與MMP-9之活性和蛋白表現，因而能夠抑制癌症細胞移轉，達到治療乳癌、延緩乳癌惡化及提昇預後之功效。

實例八：分析芙蓉萃取物對於細胞內上皮細胞間質轉化作用之影響

參照實例七所述培養步驟，將經不同濃度芙蓉萃取物處理不同時間之MCF-7細胞分別以西方墨點法分析其內上皮間質轉化作用(epithelial mesenchymal transition，下稱EMT)，結果如第七圖所示。

由第七圖A及第七圖B之結果可知，MCF-7細胞經本發明所揭芙蓉萃取物處理48小時後，細胞內上皮標記分子E-cadherin的表現有顯著上升；而N-cadheirn、Vimentin等間皮標記分子及轉錄因子SLUG的蛋白表現量則有顯著抑制之情形；由此顯示本發明所揭芙蓉萃取物係能夠有效地抑制細胞之EMT作用，以達到避免乳癌惡化及移轉之功效。

實例九：動物試驗

自國家動物中心購入9隻6周大的BALB/c雌性裸鼠，飼養於中山醫學大學動物實驗中心IVC飼育室。環境條件控制如下：溫度22~24℃、溼度50~60%、換氣次數：12~15次/小時、燈光自動明滅控制系統(12小時週期)與24小時不斷電裝置。

該些裸鼠以上述條件飼養至約7周大時，取MCF-7細胞(2*106/100μL)植入於各裸鼠左右後腿兩側，注射後2周，隨機分為三組，並分別以下列條件處理之：第一組：單獨移植腫瘤對照組；第二組：投予1%芙蓉萃取物；第三組：投予藥物Tamoxifen，劑量為：4mg/kg。

試驗期間，每3天量測一次腫瘤大小，每周測量各組裸鼠體重，並拍照紀錄生長情形，觀察30天後犧牲各組裸鼠，取其腫瘤組織進行後續分析。

實例十：檢測各組裸鼠之腫瘤生長情形

紀錄實例九之各組裸鼠試驗期間體重及腫瘤尺寸變化之結果係如第八圖至第十圖所示。

由第八圖之結果可知，第三組裸鼠之體重自第14天開始較第一組裸鼠體重明顯下降，並持續至試驗結束；而第二組裸鼠之體重一直與第一組裸鼠相近；由此顯示本發明所揭芙蓉萃取物不會影響到受試個體之食慾及營養吸收，能夠維持其體重。

由第九圖及第十圖之結果可知，第二組及第三組裸鼠之腫瘤尺寸係分別小於第一組裸鼠，並且第二組裸鼠於試驗第24天時，腫瘤體積已經被明顯抑制，抑制效果持續至試驗結束；由此顯示本發明所揭芙蓉萃取物不僅能夠確實地持續抑制腫瘤生長，且能夠於較短之投予時間內發揮其對於腫瘤抑制之效果。

實例十：檢測各組裸鼠之腫瘤表面血紅素濃度

將各組裸鼠之腫瘤組織泡入磷酸鹽緩衝液中，利用鐵氰化鉀(Drabkins method)檢測各組裸鼠腫瘤細胞表面之血紅素濃度，結果如第十一圖所示。

由第十一圖之結果可知，第二組及第三組裸鼠腫瘤表面血紅素濃度係較第一組裸鼠明顯降低，推知本發明所揭芙蓉萃取物與藥物Tamoxifen皆具有抑制血管新生之能力，能夠達到抑制腫瘤生長而有效治療乳癌之功效。

實例十一：檢測各組裸鼠腫瘤組織中基質金屬蛋白酶活性

檢測各組裸鼠之之腫瘤組織中MMP-2及MMP-9之活性，結果如第十二圖所示。

由第十二圖A及第十二圖B之結果可知，就活化之MMP-2的表現來說，第二組較第一組下降約20%，第三組則較第一組下降約10%；由此結果顯示，本發明所揭芙蓉萃取物確實能夠抑制基質金屬蛋白酶之活化表現，進而能夠有效地達到治療或延緩乳癌惡化之功效。

實例十二：檢測各組裸鼠腫瘤組織蛋白之表現

藉由西方墨點法檢測各組腫瘤組織中NF-Kb/MMPs訊息傳遞路徑與EMT相關蛋白的表現，結果如第十三圖所示。

由第十三圖A及第十三圖B之結果可知，於第二組及第三組裸鼠腫瘤組織中，其活化之MMP-2(Active-MMP-2)及NF-Kb蛋白皆較第一組明顯下降，並且第二組與第三組之下降幅度相近；並間質細胞型態蛋白Vimentin於第二組與第三組裸鼠腫瘤組織表現中係分別較第一組下降；且僅有第二組裸鼠腫瘤組織中之E-cadherin表現量增加。

由上述結果顯示，本發明所揭芙蓉萃取物確實能夠於調控細胞遷移及EMT相關蛋白表現，意即投予本發明所揭芙蓉萃取物至一乳癌患者，係能夠有效地抑制癌症細胞移轉或是惡化，並且能夠有效提高預後，達到治療乳癌之功效。

實例十三：斑馬魚血管新生試驗

取受精後斑馬魚胚胎，於受精後24小時以水解酵素液(2mg/mL)在37℃進行人工破殼，並於受精後32小時在解剖顯微鏡下進行分類，挑選色素及胚胎發展程度一致的斑馬魚，將其分為六個組別，每組30隻，並移動到6孔盤中。受精後48小時，依組別添加不同濃度之芙蓉萃取物進行處理，濃度分別為0、100、200、500、1000、2000μg/mL；接著在受精後72小時，以4% PFA(Paraformaldehyde溶於PBS)進行固定，並進行染色，待斑馬魚之腸下靜脈(Sub-intestinal vessels，SIV)呈色明顯後，終止反應，並保存於4%多聚甲醛中，以相位差顯微鏡或解剖顯微鏡進行觀察，拍照與記錄各組斑馬魚之腸下靜脈生長數量，結果如第十四圖至第十六圖所示。

由第十四圖結果可知，芙蓉萃取物之濃度對於斑馬魚胚胎的存活率沒有影響，顯示本案所揭芙蓉萃取物係能有效地抑制腫瘤細胞生長，但是不會影響個體之存活率。。

Claims (8)

1. 一種芙蓉萃取物用於製備治療乳癌之組合物之用途，其中，該芙蓉萃取物係由一乾燥芙蓉(Crossostephium chinense)粉碎與水混合後加熱至沸騰，再取濾液並進行冷凍乾燥製備而得者，並該芙蓉萃取物係能夠抑制乳癌細胞遷移及抑制MMP-2與MMP-9之活性。
2. 一種芙蓉萃取物用於製備抑制乳癌移轉之組合物之用途，其中，該芙蓉萃取物係由一乾燥芙蓉(Crossostephium chinense)粉碎與水混合後加熱至沸騰，再取濾液並進行冷凍乾燥製備而得者，並該芙蓉萃取物係能夠抑制MMP-2與MMP-9之活性。
3. 一種芙蓉萃取物用於製備提高乳癌預後之組合物之用途，其中，該芙蓉萃取物係由一乾燥芙蓉(Crossostephium chinense)粉碎與水混合後加熱至沸騰，再取濾液並進行冷凍乾燥製備而得者，並該芙蓉萃取物係能夠抑制乳癌細胞遷移及抑制MMP-2與MMP-9之活性。。
4. 依據申請專利範圍第1、2或3項所述用途，其中，該組合物係為一藥品。
5. 依據申請專利範圍第1、2或3項所述用途，其中，該組合物係為一食品。
6. 依據申請專利範圍第1、2或3項所述用途，其中，該芙蓉萃取物中含有多酚化合物及黃酮類化合物。
7. 依據申請專利範圍第6項所述用途，其中，該多酚化合物之含量約為6~16%。
8. 依據申請專利範圍第6項所述用途，其中，該黃酮類化合物之含量約為17~28%。

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