CN111568937A - 片仔癀及其制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应用 - Google Patents

片仔癀及其制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药研究领域，具体涉及片仔癀及其制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应用。本发明通过动物实验和免疫组织学实验，研究发现片仔癀对难愈性创面愈合具有显著促进作用，进一步研究表明，片仔癀对难愈性创面愈合的促进作用主要与其减少成纤维细胞异常衰老、抗氧化、促进氧化损伤的成纤维细胞增殖、促细胞黏附、降低成纤维细胞凋亡、促胶原蛋白分泌等作用有关。

Description

片仔癀及其制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药研究领域，具体涉及片仔癀及其制剂在制备促进难愈 性创面愈合的药物中的应用。
背景技术
难愈性创面也叫慢性伤口或慢性创面，一般认为难愈性创面是指无法通过 正常有序而及时的修复过程达到解剖和功能伤完整状态的创面。关于创面愈合 的时间并无绝对的期限，通常当创面每周不能缩小10-15％或者超过1个月不能 缩小50％时就被认为是慢性伤口，参加文献为：姜玉峰,付小兵.体表慢性难愈 合创面的研究进展[J].感染、炎症、修复,2011,12(01):59-61。常见难愈性创面有 大面积皮肤缺损创面、大面积皮肤撕脱伤、慢性溃疡创面、免疫性慢性创面、 癌性慢性创面、放射性慢性创面等。大面积皮肤缺损创面、大面积皮肤撕脱伤 是现代创伤外科中常见的复杂损伤，因创口面积大，且常伴有重要神经血管损 伤、软组织缺损等，创面无法自行愈合或愈合缓慢。参见文献如下：刘建敏, 马龙洋,常建华.自制皮肤牵张器与负压技术联合应用对大面积皮肤缺损的疗效 观察[J].中国美容整形外科杂志,2020,31(04):233-238；邱广伟,孙志刚,崔永珍,朱 敬民.肢体大面积皮肤撕脱伤的临床治疗[J].中华损伤与修复杂志(电子 版),2014,9(05):524-527。
正常的皮肤组织创面愈合，要经历炎症反应、细胞增殖、组织成熟和重建 三个阶段，是多种细胞、生长因子细胞外基质之间相互作用的动态过程。各种 内外原因导致胶原蛋白合成减少，限制了成纤维细胞、表皮细胞等组织修复细 胞的增殖和迁移，使得创面延绵不愈。参见文献为：刘强,邵家松.慢性难愈性创 面的形成机制及治疗进展[J].中国临床新医学,2013,6(09):917-920。
难愈性创面的病程长、治疗难度较大，不仅给患者及其家属带来躯体和精 神上的痛苦，还造成了巨大的经济压力。目前传统的治疗方案采用创面清洁换 药、以抗生素局部或全身应用为主，仅能起到控制感染的作用，效果单一，并 且可能产生抗药性。生长因子可参与皮肤皮肤创面修复，但不能在创面长时间 保持活性，临床应用受限。片仔癀(PZH)是国家一级中药保护品种，具有清 热解毒、凉血化瘀、消肿止痛之功效，主要用于热毒血瘀所致急慢性病毒性肝 炎、痈疽疔疮、无名肿毒、跌打损伤及各种炎症，临床前安全性评价(急性毒 性试验和长期毒性试验)显示出良好的安全性。片仔癀及其制剂在制备促进难 愈性创面愈合方面的药物中的应用未见报道。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种片仔癀及其制剂的新应用，即仔癀及其 制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供了片仔癀及其制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应 用。
进一步地，所述难愈性创面为大面积皮肤缺损创面、大面积皮肤撕脱伤、 慢性溃疡创面、免疫性慢性创面、癌性慢性创面或放射性慢性创面。
进一步地，片仔癀及其制剂在制备加速创伤愈合和/或改善愈合质量的药物 中的应用。
进一步地，片仔癀及其制剂在减少成纤维细胞异常衰老的药物中的应用。
本发明还提供了片仔癀及其制剂在制备促进成纤维细胞增殖、抑制成纤维 细胞凋亡、增强成纤维细胞黏附能力、促进成纤维细胞迁移能力或者促进胶原 蛋白合成的药物中的应用。
进一步地，所述药物为内服药物或者外用药物；和/或，
所述药物包括药学上有效量的片仔癀和药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种促进难愈性创面愈合的药物，所述药物以片仔癀为活 性成分。
进一步地，所述药物为内服药物或者外用药物。
进一步地，所述药物为片仔癀按照常规工艺，加入药学上可接受的辅料制 成临床上可接受的制剂。
进一步地，所述制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、油膏、乳霜、凝胶、敷剂、 洗剂、泡沫剂、局部用溶液、糊剂或酊剂。
进一步地，所述药学上可接受的辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬 剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化 淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预 胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤 维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑 石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、 羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤 维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味 剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山 梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：PEG6000、 PEG4000、虫蜡等。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明通过动物实验和免疫组织学实验，研究发现片仔癀对难愈性创面 愈合具有显著促进作用，进一步研究发现片仔癀是通过减少成纤维细胞的异常 衰老以促使伤口愈合。
2.本发明通过ABTS法、FRAP法、超氧阴离子实验以及DPPH自由基清 除实验，从分子层次上进行的抗氧化实验发现，片仔癀能够以较强的抗氧化活 性促进难愈性创面愈合。
3.本发明通过细胞凋亡实验，证实了片仔癀能够明显抑制HFF-1成纤维细 胞的的凋亡，本发明通过细胞增殖实验、细胞粘附实验和细胞划痕实验直接证 实了片仔癀能够显著促进HFF-1成纤维细胞的增殖和迁移，通过测定羟脯氨酸 和胶原蛋白的含量也发现片仔癀能够显著促进羟脯氨酸的分泌和胶原蛋白合 成，从而侧面证实了片仔癀能够显著促进HFF-1成纤维细胞的增殖，因而，研 究发现了片仔癀对于难愈性创面的修复具有显著的促进作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将 对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见 地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来 讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实验例1中片仔癀促进难愈性创面小鼠伤口愈合的实验结果图；
图2是实验例1中给药不同时间的难愈性创面小鼠伤口愈合情况统计图；
图3是实验例2中给药不同时间难愈性创面小鼠的脾指数结果；
图4是实验例2中给药不同时间的模型小鼠伤口组织切片的HE染色图；
图5是实验例2中给药5天的模型小鼠伤口组织切片的中性粒细胞的浸润 情况；
图6是实验例2中给药不同时间模型小鼠伤口组织切片的Masson三色染 色图，成纤维细胞凋亡情况以及α-SMA的免疫化学染色图；其中，图6(a) 为Masson三色染色图；图6(b)为成纤维细胞凋亡结果；图6(c)为α-SMA 的免疫化学染色图。
图7是实验例3-5中总抗氧化实验标准曲线；其中图7(a)为实验例3中 利用ABTS法建立的标准曲线；图7(b)为实验例4中利用FRAP法建立的标 准曲线；图7(c)为实验例5超氧阴离子含量的标准曲线；
图8是总抗氧化能力测试实验结果图，其中图8(a)表示用ABTS法在波 长734nm处测得空白组与不同浓度梯度片仔癀所测得的吸光度值；图8(b)表 示用FRAP法在波长593nm处测得的空白组与不同浓度梯度片仔癀吸光度值；
图8(c)表示测超氧阴离子含量时在波长530nm处测得的空白组和不同浓度片 仔癀吸光度；图8(d)表示不同浓度梯度片仔癀自由基清除率；
图9是实验例7中DHE染色的共聚焦显微镜图像和DHE染色定量分析结 果；其中图9(a)为DHE染色共聚焦显微镜图像；图9(b)为DHE染色定量 分析结果；
图10是实验例8中片仔癀抑制AGEs诱导的HFF-1细胞凋亡情况；其中， 图10(a)为细胞凋亡水平，图10(b)为凋亡阳性细胞百分比；
图11是实验例9中Capase-3酶活性分析测试结果；
图12是实验例9中凋亡相关通道蛋白的表达情况；
图13是实验例10测定的细胞增殖实验结果；
图14是实验例11测定的细胞粘附实验结果；
图15是实验例12测定的细胞划痕实验结果；
图16是实验例13测定的羟脯胺酸含量；
图17是实验例14测定的胶原蛋白-I(Col-I)的转录水平结果；
其中在图2-3，图8-11，13-17中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示 P<0.001。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实 施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或 是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近 似的产品，均落在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条 件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所 用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1动物药效学实验
1、药物与试剂
柠檬酸钠缓冲液的配制：将2.10g柠檬酸加入双蒸水100ml配成柠檬酸母 液，称为A液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸水100ml配成柠檬酸钠母液，称 为B液；将A、B液按1：1.32比例混合，pH计测定pH值，用柠檬酸调定溶 液pH为4.0，用柠檬酸调定溶液pH为4.0，即得柠檬酸钠缓冲液。
链脲佐菌素(STZ)溶液的配制：将链脲佐菌素溶于上述柠檬酸钠缓冲液 中，新鲜配制成10mg/mL浓度的STZ溶液，并用0.22μm滤菌器过滤除菌。 注意避光配制，现用现配。
片仔癀凝胶剂的配制：将1重量份的片仔癀与10重量份的泊洛沙姆混合， 加入89重量份的PBS缓冲液中混合，制得片仔癀质量分数为1％的片仔癀凝胶 剂。
云南白药凝胶剂的配制：将1重量份的云南白药与10重量份的泊洛沙姆混 合，加入89重量份的PBS中混合，制得云南白药质量分数为1％的云南白药凝 胶剂。
片仔癀口服液的配制，取片仔癀加入适量质量百分数为0.9％的NaCl水溶 液，分散，制得片仔癀质量分数为1％的片仔癀口服液。
2、难愈性创面小鼠模型的构建与给药方案
(1)将小鼠(C57BL/6，上海灵畅生物科技有限公司)随机分为模型组和 对照组，每组40只，模型组小鼠，按照70mg/kg剂量的STZ溶液进行腹腔注 射，对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液，均连续注射4天，每天一次。自 第一天腹腔注射之日起一周后，测定模型组小鼠的空腹血糖，选择血糖高于13.5 mmol/L为小鼠纳入后续实验。
(2)将小鼠模型背部剪开半径为0.9公分的创伤，得到难愈性创面小鼠模 型。将难愈性创面模型小鼠随机分为四组，即阳性药物组(PC)、阴性对照组 (NC)、口服给药组(S-PZH)、局部给药组(T-PZH)，每组10只小鼠，其 中阳性药物组和局部给药组均为在创伤处局部给药，阳性药物组给药云南白药 凝胶剂，局部给药组给药片仔癀凝胶剂，口服给药组为口服给药片仔癀口服液， 阳性药物组、口服给药组、局部给药组的给药量均为1ml，口服给药为每天给 药一次，局部给药为隔一天换药一次，阴性对照组不给药，分别在第1天、第 3天、第7天和第14天处记录创伤愈合情况。14天后处死全部小鼠，取伤口组 织，浸入福尔马林溶液中，固定伤口。
3.实验结果
从图1和图2可以看出，在难愈性创面小鼠模型中，S-PZH组伤口愈合的 速度与NC组相比略微提高，T-PZH组伤口愈合的速度与NC组相比有显著的 提高，到10天左右愈合程度明显超过NC组，14天伤口基本愈合，说明口服 给药和局部给药均能够有效加快难愈性创面小鼠模型的创伤修复进程，说明片 仔癀对难愈性创面的愈合具有显著促进作用。
实验例2免疫组织学实验
1、药物与试剂
柠檬酸钠缓冲液配制：将2.10g柠檬酸加入双蒸水100ml配成柠檬酸母液， 称为A液；将2.94g柠檬酸三钠加入双蒸水100ml配成柠檬酸钠母液，称为B 液；将A、B液按1：1.32比例混合，pH计测定pH值，用柠檬酸调定溶液pH 为4.0，即得柠檬酸钠缓冲液。
链脲佐菌素(STZ)溶液的配制：将链脲佐菌素溶于上述柠檬酸钠缓冲液 中，新鲜配制成10mg/mL浓度的STZ溶液，并用0.22μm滤菌器过滤除菌。注 意避光配制，现用现配。
片仔癀凝胶剂的配制：将1重量份的片仔癀与10重量份的泊洛沙姆混合， 加入89重量份的PBS缓冲液中混合，制得片仔癀质量分数为1％的片仔癀凝胶 剂。
云南白药凝胶剂的配制：将1重量份的云南白药与10重量份的泊洛沙姆混 合，加入89重量份的PBS中混合，制得云南白药质量分数为1％的云南白药凝 胶剂。
片仔癀口服液的配制，取片仔癀加入适量质量百分数为0.9％的NaCl水溶 液，分散，制得片仔癀质量分数为1％的片仔癀口服液。
2.难愈性创面小鼠模型的构建与给药方案及实验结果
(1)将小鼠(C57BL/6，上海灵畅生物科技有限公司)随机分为模型组和 对照组，每组40只，模型组小鼠按照70mg/kg剂量的STZ溶液进行腹腔注射， 对照组给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液，均连续注射4天，每天一次。自第一 天腹腔注射之日起一周后，测定模型组小鼠的空腹血糖，选择血糖高于 13.5mmol/L为纳入后续实验。
(2)将小鼠模型背部剪开半径为0.9公分的创伤，得到难愈性创面小鼠模 型。难愈性创面小鼠模型随机分为四组，即阳性药物组(PC)、阴性对照组(NC)、 口服给药组(S-PZH)和局部给药组(T-PZH)，每组10只小鼠，其中阳性药 物组和局部给药组均为在创伤处局部给药，阳性药物组给药云南白药凝胶剂， 局部给药组给药片仔癀凝胶剂，口服给药组为口服给药片仔癀口服液，阳性药 物组、口服给药组、局部给药组的给药量均为1ml，口服给药为每天给药一次， 局部给药为隔天换药一次，阴性对照组不给药，然后分别在第5天、第8天、 第14天处死部分小鼠，每次处死3只，然后取伤口组织，浸入福尔马林溶液中， 固定伤口。
(3)小鼠脾脏指数测定：处死小鼠后取脾脏，通过计算脾脏重量与小鼠体 重的比例得到脾脏指数，结果如图3所示。
从图3可以看出，与PC组相比，S-PZH组和T-PZH组在伤口恢复的 炎症期的脾指数有效降低，呈现适度的炎症反应，这有利于伤口的愈合， 说明口服给药和局部给药均能有效加快难愈性创面小鼠模型创伤修复进 程，说明片仔癀对难愈性创面的愈合具有显著促进作用。
(4)苏木素-伊红(Hematoxylin-eosinstaining,HE)染色
将伤口组织放入生理盐水中快速漂洗表面血迹后，于10％福尔马林中4℃ 固定过夜，进行梯度脱水、抽气，制成石蜡块。用切片机将包好的石蜡块切成 约5μm厚的薄片。在挂好胶的载玻片上滴一滴蒸馏水，将切好的蜡片轻轻放在 水上，待蜡片完全伸展开后，稍稍倾斜载玻片，使水流过而使蜡片粘在载玻片 上，于43℃烤片机上烤2h，待蜡片完全干透粘牢后，得伤口组织石蜡切片，4℃ 保存备用。
将伤口组织石蜡切片进行HE染色，步骤如下：1)蒸馏水中短暂洗涤组织 石蜡切片；2)苏木精染色溶液中核染色5min；3)自来水冲洗5min；4)0.1％ 盐酸-乙醇分解20s；5)自来水冲洗1min；6)于PBS中至发蓝；7)自来水冲 洗5min；8)体积百分数为95％乙醇水溶液洗涤10s；9)在曙红染色溶液中反 复染色2min；0)体积百分数为95％乙醇水溶液脱水5min；11)100％乙醇脱 水2次，每次10min；12)二甲苯洗2次，每次5min；13)显微镜下观察细胞，结果如图4所示。
从图4可以看出，所有给药组在创伤形成第5天均有炎症产生，肉芽组织 形成，上皮再生化的过程。而NC组在第5天内伤口未发生明显变化。另外， PC组凋亡炎性细胞大量积累，而PZH组炎症反应适度。第8天，T-PZH组炎 症反应较S-PZH组明显。第14天，所有药物组均完成创面闭合。而且，T-PZH 组胶原纤维排列整齐，毛囊完整，表明创面愈合质量较好。此外，与PC组相 比，S-PZH组和T-PZH组覆盖伤口部位的未吸收的细胞碎片和不溶性药物层明显减少，从而减少了疤痕形成的机会并有助于组织修复。
(5)中性粒细胞浸润情况
按照步骤(4)的方法制作伤口组织的石蜡切片，对石蜡切片采用MPO免 疫组化试剂盒(购自美国Abcam公司)，按照试剂盒说明书中的方法表征各组 给药5天伤口组织中性粒细胞的浸润情况。从图5可以看出，T-PZH组基质 界面附近的中性粒细胞密度升高，从而较早地启动了炎症反应及伤口愈合 的程序。
(6)Masson的三色染色和TUNEL测定以及α-SMA的免疫组织化学染 色
按照步骤(4)的方法制作伤口组织的石蜡切片，对石蜡切片进行Masson 的三色染色，步骤如下：1)将切片常规脱蜡至水；2)取适量的Weigert铁苏 木素A液和Weigert铁苏木素B液等量混合，即为Weigert铁苏木素染色液， 用Weigert铁苏木素染色液染色，流水稍洗；3)酸性乙醇分化液分化数秒，流 水冲洗数分钟；4)蓝化液返蓝数秒，流水冲洗数分钟；5)丽春红品红染色液染 色数分钟，流水稍冲洗；6)用乙酸工作液洗切片；7)磷钼酸溶液处理后，倾去 玻片上磷钼酸溶液(不用水洗)；8)苯胺蓝染色液复染，倾去玻片上染色液(不用水洗)；9)用乙酸工作液处理切片，至切片无蓝色脱出(必要时镜下控制)；10)95％ 乙醇迅速脱水，无水乙醇脱水数次后，二甲苯透明，中性树胶封固。
按照步骤(4)的方法制作伤口组织的石蜡切片，对各组给药5天的伤口组 织石蜡切片采用细胞凋亡试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)按照试剂 盒说明书中的方法进行TUNEL测定，步骤如下：1)将石蜡包埋的组织切片按 常规方法脱蜡至水；2)PBS漂洗3×5min；3)加入蛋白酶K工作液，37℃反应 15～30min；PBS漂洗3×5min；4)室温固定15min～30min；PBS漂洗3×5min； 5)浸入封闭液中，室温封闭10min，PBS漂洗3×5min；6)进行标记反应。
按照步骤(4)的方法制作伤口组织的石蜡切片，对各组给药8天的伤口组 织采用α-SMA的免疫组织化学试剂盒(购自美国Abcam公司)，按照试剂 盒说明书中的方法对石蜡切片进行α-SMA的免疫组织化学染色，观察各组 给药8天伤口组织肌成纤维细胞的生成情况。
从图6-a中可以看出，T-PZH组在第5天有助于形成明显的胶原蛋白。 从图6-b中可以看出，T-PZH组未表现出明显的细胞凋亡和受损状态，而 PC组中胶原基质上的细胞倾向于加剧凋亡，这与PZH使成纤维细胞正常 化的结果相一致，说明T-PZH组可以通过防止体内成纤维细胞异常衰老来 模拟伤口修复。从6-c中可以看出，损伤后8d，ECM区T-PZH组的α-SMA 阳性细胞数升高，证实了溃疡成纤维细胞分化为成肌纤维细胞的能力，证 实了PZH可以通过减少成纤维细胞的异常衰老来增强伤口愈合。
实验例3 ABTS法测定片仔癀的总抗氧化能力
1、实验方法
采用总抗氧化能力测试试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)，按 照试剂盒说明书中所示的方法进行测试，根据待测样品数量配制适量的 ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)工作液，首先用100 μL ABTS溶液和100μL氧化剂溶液配制ABTS工作母液。ABTS工作母 液配制后，室温避光存放15h后方可使用。使用时，将ABTS工作母液用 PBS稀释50倍。采用PBS溶液将10mM Trolox(水溶性维生素E)标准 溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM的工作液。向96孔板的 每个检测孔中加入200μL ABTS工作液，空白对照组中加入10μL蒸馏水， 标准曲线孔中加入第2步配制的一系列梯度的Trolox溶液，样品孔中加入 不同浓度的片仔癀溶液(0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、 1mg/mL，双蒸水配制)，设置三组平行试验，轻轻混匀。室温孵育5分 钟后测定波长734nm处的吸光度。根据标准曲线计算出不同浓度片仔癀 的总抗氧化能力。
2、实验结果
表1 ABTS法测定片仔癀的总抗氧化能力结果表
Figure BDA0002509429820000121
Figure BDA0002509429820000131
从表1和图7-8的结果显示，通过ABTS法测定片仔癀总抗氧化能力，较 空白对照组而言，不同浓度的片仔癀的总抗氧化能力都表现出一定程度的升高， 且浓度越高总抗氧化能力越强。
实验例4 FRAP法测定片仔癀的总抗氧化能力
1、实验方法
采用FRAP抗氧化能力测试试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)， 按照试剂盒说明书中所示的方法进行测试，根据待测片仔癀的数目配制适量 的FRAP工作液，将FRAP工作液37℃孵育，并保证在2小时使用结束。取片 仔癀加入适量双蒸水配制一系列浓度梯度的片仔癀溶液，片仔癀浓度分别为 0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL。称取27.8mg本 试剂盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1ml，此时浓度即为100mM。取适 量100mM FeSO4溶液稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。该实验中， 溶剂为蒸馏水。在96孔板每个孔中中加入180μL FRAP工作液，空白对照孔中 加入5μL蒸馏水，测定标准曲线的孔中加入5μL第三步配制的各种浓度的FeSO4溶液，样品孔中加入第二步配制的一系列浓度梯度的片仔癀溶液，每个浓度设 置三组平行，在37℃环境系孵育3-5分钟，用酶标仪在593nm波长处测定吸 光度。
2、实验结果
表2 FRAP法测定片仔癀的总抗氧化能力结果表
Figure BDA0002509429820000132
Figure BDA0002509429820000141
从表2和和图7-8的结果显示，通过FRAP法测片仔癀总抗氧化能力，较 空白对照组而言，不同浓度的片仔癀的总抗氧化能力都表现出一定程度的升高， 且浓度越高总抗氧化能力越强。
实验例5超氧阴离子含量
1、实验方法
采用超氧阴离子测试试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)，按照 试剂盒说明书中所示的方法进行测试取适量亚硝酸钠标准液，首先加水稀释 至0.625μmol/mL，然后加水分别稀释至0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、 0.009765、0.0049、0.00244、0.0012、0.0006μmol/mL的标准溶液，测定吸光度， 用0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.009765、0.00244、0.0006μmol/mL 标准溶液做标准曲线。以水为溶剂，配制一系列浓度梯度的片仔癀溶液，0.01 mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL。空白组加入0.5mL 蒸馏水、0.4mL试剂一(盐酸枪胺)，测定管中加入0.2mL样本、0.3mL提 取液以及0.4mL试剂一，标准管中加入0.2mL标准溶液、0.3mL提取液以及 0.4mL试剂一。然后把三份溶液混匀，置于37℃水浴锅中水浴20分钟。水浴 结束后，向三组溶液中分别都加入0.3mL试剂二(萘胺)和0.3mL试剂三(乙 谜)。将三组管完全混匀，置于37℃水浴锅中水浴20分钟。水浴结束后，三 组管中分别都加入0.5mL试剂四(氯仿)，将各组管混匀，配平后放置于离心机中离心(8000rpm)，25℃，离心五分钟，小心吸去上层水相200微升，加 入到96孔板中，然后在530nm波长处测吸光度值。
2、实验结果
表3超阴离子含量
Figure BDA0002509429820000142
Figure BDA0002509429820000151
从表3和和图7-8的结果显示，与空白对照组比较，不同浓度的片仔癀所 测得的超氧阴离子含量无明显变化，说明片仔癀不含超氧阴离子。
实验例6 DPPH自由基清除实验
1、实验方法
精密称取DPPH试剂3.5mg，用无水乙醇溶解，定至10mL，再取2mL至 100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol/L DPPH贮备液，置于4℃冰箱中 冷藏备用。以水为溶剂，配制一系列浓度梯度的片仔癀溶液，片仔癀溶液的浓 度分别为0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL。在96 孔板中分别加入100μL DPPH溶液和100μL片仔癀溶液，每个浓度设置三个平 行，空白组仅加入100μL DPPH溶液和100μL无水乙醇，混匀，在室温下避光保存30min后用酶标仪测定吸光度值，设置517nm波长，记录溶液吸光度值。
2、实验结果
结果见图8(c)所示，随着片仔癀浓度的升高，片仔癀DPPH自由基清除 率越高，且浓度为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL的片仔癀DPPH自由基 清除能力无明显区别，说明片仔癀具有显著的DPPH自由基清除能力，总抗氧 化能力较强。
实验例7片仔癀抑制成纤维细胞ROS的生成
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置
DMEM培养基：89％DMEM培养基(购自赛默飞世尔科技有限公司)+10％ 胎牛血清(购自赛默飞世尔科技有限公司)+1％双抗(即青链霉素混合液，购 自生工生物工程(上海)有限公司)
PBS溶液：取1L超纯水与8gNaCl、0.2gKCl、0.27g KH2PO4、3.58 gNaH2PO4·12H2O溶解，混匀，高温灭菌备用；
胰酶溶液：取2L PBS溶液加入400mg EDTA和5g胰酶，混匀，过膜灭菌 备用；
MTT：称取5mg噻唑蓝溶于10mL的PBS溶液中，过膜灭菌备用；
PZH药物溶液：取片仔癀用DMEM培养基配制得到含片仔癀0.05mg/mL、 0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL的PZH药物溶液。
(2)HFF-1细胞系培养：取HFF-1细胞加入DMEM培养基，置于95％空 气、5％二氧化碳培养箱中，37℃静置培养，每3天换次液。当成纤维细胞长 到T75培养瓶70％以上时，弃去培养基，加入PBS清洗三遍，弃去PBS，加入 2mL胰酶溶液消化至细胞间隙变大且细胞形态变圆时用10mL DMEM培养基 终止消化，形成细胞悬液，将细胞悬液于离心机中1000rpm离心3min，弃去 上层培养液，加入新鲜培养基，重悬细胞，按1:3的比例接种在新的培养瓶中 于37℃5％CO2恒温培养箱中培养。于上述步骤消化离心后用胎牛血清制成细 胞悬液，进行细胞计数，按照2×104个细胞/mL加入冻存液，分装于2mL冻存 管中，封口，标记好日期和持有者。4℃冰箱中保存10min，-20℃保存2h，-80℃ 保存2h，然后可以置于-196℃长期保存。将冻存管放入37℃水浴迅速解冻， 打开冻存管，取出细胞悬液置于离心管中，加入DMEM培养基，1000rpm离心 3min，弃上清，用培养液重悬，接种于培养瓶中，置于37℃培养箱培养，复苏 期培养基12h更换一次，以后按传代培养更换培养液，得到HFF-1细胞系。
(3)给药处理：取上述HFF-1细胞系采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条 件的3倍)孵育HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液， PZH药物溶液的浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL。温育24小时后， 收获细胞并采用ROS荧光探针-二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)进行染色， 通过激光共聚焦显微镜观察，结果如图9所示。
2、实验结果
从图9中可以看出，PZH药物添加组能够显著降低DHE的红色荧光强度。 流式细胞术也证明PZH能够以剂量依赖的方式非常显著地抑制(P<0.0001) ROS的产生，说明PZH具有抗氧化特性，可调节成纤维细胞ROS的生成。
实验例8细胞凋亡实验
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：取上述HFF-1细胞系采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条 件的3倍)孵育HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液， PZH药物溶液的浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL和0.05mg/mL，温育24小时 后，收获细胞并对细胞进行Annexin VFITC/PI进行双重标记。将老化的HFF-1 细胞与13.5mg/L葡萄糖共同孵育48h后行AnnexinV-FITC/PI染色。
2、实验结果
从图10可以看出，PZH给药后，凋亡细胞(Annexin V-FITC+/PI+和Annexin V-FITC+/PI+)和坏死细胞(Annexin V-FITC-/PI+)的百分比明显下降(图10a, b)，与NC组相比，高浓度药物组(0.5mg/mL)凋亡细胞的百分比降幅最大， 约为30％。
实验例9片仔癀通过下游的Caspase-3激活介导对ROS刺激的抑制凋亡作用
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：取上述HFF-1细胞系采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条 件的3倍)孵育HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液， PZH药物溶液的浓度分别为1mg/mL、0.1mg/mL和0.5mg/mL。温育24小时后， 收获细胞并采用Caspase酶活性测定试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司) 按照试剂盒说明书的方法测定Caspase-3的含量。
取上述HFF-1细胞系采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条件的3倍)孵育 HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液，PZH药物溶液的浓 度分别为0.05mg/mL、0.1mg/mL和0.5mg/mL。温育24小时后，收获细胞并采 用蛋白提取试剂盒试剂盒(购自sigma)按照按照试剂盒说明书的方法提取细 胞蛋白，用BCA法进行蛋白定量。每孔上样10μg总蛋白，在12％SDS-PAGE 中进行电泳分离，然后转到PVDF膜上。用含5％脱脂奶粉的封闭液封闭2h后， 加入用封闭液稀释的一抗，室温孵育1h，然后4℃冰箱过夜。TBST洗膜后， 加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育1h。再用TBST洗膜，在暗室中用Super ECL 进行化学发光，X线胶片曝光显影。扫描胶片，并就目标蛋白进行分析。
2、实验结果
如图11和12所示，虽然连续传代也导致空白细胞轻度衰老凋亡，但药物 组凋亡前蛋白Bax的表达较对照组下调。而抗凋亡蛋白Bcl-2水平显著上调， Bax与Bcl-2比值明显下降。这些结果表明，PZH通过下游的Caspase-3激活介 导对ROS刺激的抑制凋亡作用。
实验例10细胞增殖实验
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：收集细胞并将HFF-1成纤维细胞按照6×104个/mL的密度 接种于96孔板中(每孔约100μL)，培养12h。吸去上清，加入新的DMEM 培养基，将HFF-1细胞随机平行分为两组，即片仔癀给药组(浓度为0.05mg/mL 的片仔癀溶液)和空白对照组(DMEM培养基)，按上述分组进行加药，每组 设置5个复孔，37℃培养72h，37℃培养72h后，吸去上清，加入100mL MTT (0.5mg/mL，用PBS配置)，避光培养3h。用酶标仪在波长570nm处测量吸 光度。
2、实验结果
结果见图13所示，空白对照组的吸光度为1.1695，片仔癀给药组吸光度为1.2386，与空白对照组相比，片仔癀给药组吸光度的增长率约为23.9％，说明 加入了片仔癀给药组(0.05mg/mL)的HFF-1成纤维细胞的细胞活力远远大于 空白对照组，表明片仔癀能促进损伤HFF-1成纤维细胞的增殖。
实验例11细胞粘附实验
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：收集细胞，采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条件的3倍) 孵育HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液，PZH药物溶 液的浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL和0.05mg/mL，温育24小时。将HFF-1 成纤维细胞6×104个/mL的密度接种于96孔板中(每孔约100μL)，培养至 12h。吸去上清，加入新的DMEM培养基，将BSA用PBS溶解至2mg/mL， 过膜灭菌后，每孔加入200mL BSA溶液，室温过夜后，用PBS清洗一遍。每 孔加入100μL浓度为2mg/mL的溶于DMEM的BSA溶液，37℃下封闭90min。 每孔中加入100μL细胞密度约为3.5×104个/mL的细胞悬液，按上述分组处理 细胞，设置5个复孔，于5％CO2培养箱37℃培养45min。培养结束后，将96 孔板倾斜轻轻的颠，以除去未粘附的细胞，然后吸去上清，并用PBS洗涤一遍。 向每个孔中加入100mL MTT溶液，避光培养3h。用酶标仪在波长570nm处测量吸光度。
2、实验结果
结果见图14所示，HFF-1成纤维细胞粘附能力强表示HFF-1成纤维细胞 的增殖能力强。随着加入片仔癀浓度的升高，所测得的吸光度越大，说明细胞 粘附能力越强。与空白对照组相比，片仔癀浓度为0.05mg/mL时HFF-1成纤 维细胞的粘附能力提高了46.34％，片仔癀浓度为0.1mg/mL时HFF-1成纤维细 胞的粘附能力提高了57.89％，片仔癀浓度为0.5mg/mL时HFF-1成纤维细胞的 粘附能力提高了65.49％，实验结果表明，片仔癀能提高高糖刺激的HFF-1成纤 维细胞的粘附能力，从而证明了片仔癀能够促进高糖刺激的HFF-1成纤维细胞 的增殖。
实验例12细胞划痕实验
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：收集细胞，取六孔板，每孔中加入1.5mL的细胞密度为 15万个/mL的细胞悬液，置于37℃培养箱中培养12h左右。培养结束后，吸 去上清，将HFF-1细胞随机平行分为两组，即片仔癀给药组和空白对照组，其 中片仔癀加药组加入0.05mg/mL片仔癀溶液，空白对照组加入等体积的DMEM 培养基，37℃过夜培养。培养12h后，用枪头比着直尺划痕，枪头要垂直，不 能倾斜。PBS洗细胞3次，洗去划掉的细胞。培养结束后，吸去上清，按上述分组状况加药，放入37℃培养箱中培养，可按时间点0h、24h、48h、72h拍 照。使用Image J软件打开图片，统计划痕的宽度。
2、实验结果
结果见图15所示，从阴性对照组与片仔癀给药组不同的时间点较前一时间 点划痕距离的差值中可明显看出，片仔癀具有显著促进HFF-1成纤维增殖的作 用，计算迁移增长率可以得出，24h时片仔癀给药组较阴性对照组迁移增长率 增加了42.86％，48h时片仔癀给药组较阴性对照组迁移增长率增长了33.3％， 72h时片仔癀给药组较阴性对照组迁移增长率增长了5％。因此可得出结论， 片仔癀具有显著促进HFF-1细胞迁移的作用，且48h内作用比较显著。
实验例13羟脯胺酸含量测定实验
1、实验方法
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：收集细胞，采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条件的3倍) 孵育HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液，PZH药物溶 液的浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL，温育24小时。取细胞培养 液上清，参照羟脯氨酸检测试剂盒分析待测样本的光密度值。根据公式[羟脯氨 酸含量(μg/mL)＝(测定光密度值-空白光密度值)/(标准光密度值-空白光密度值)× 标准品浓度]计算羟脯氨酸含量浓度。
2、实验结果
结果见图16所示，与空白对照组相比，阴性对照组HFF-1成纤维细胞分 泌的羟脯胺酸含量少，而羟脯胺酸是胶原组织的主要成分之一，与细胞增殖能 力相关，说明高糖能够抑制HFF-1成纤维细胞的增殖，而随着片仔癀浓度的升 高，细胞分泌的羟脯胺酸含量也在逐渐升高，说明片仔癀能促进HFF-1成纤维 细胞的增殖。且计算羟脯胺酸的增长率，加入片仔癀浓度为0.1mg/mL时较阴 性对照组增长了11.12％，0.5mg/mL时增长了20.00％，1mg/mL时增长了 53.79％，可明显看出，片仔癀能够促进高糖刺激的HFF-1成纤维细胞分泌的羟脯胺酸含量，且片仔癀浓度越高促进作用越明显，从而可得出结论，片仔癀能 够促进高糖刺激的HFF-1成纤维细胞的增殖，从而促进羟脯胺酸的分泌，增加 胶原蛋白的含量。
实验例14胶原蛋白含量测定实验
1、实验试剂与方法
(1)溶液配置：同实施例7；
(2)HFF-1细胞系培养：同实施例7；
(3)给药处理：收集细胞，采用13.5mg/L葡萄糖(正常培养条件的3倍) 孵育HFF-1细胞系，并分组同时给予不同浓度的PZH药物溶液，PZH药物溶 液的浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL，温育24小时。取一块6孔 板，在其五个孔中加入处理好的成纤维细胞，每孔大概加入2毫升细胞溶液(约 30万细胞)，按上述分组处理细胞，37℃培养箱培养48h。培养结束后，在空 白管中加入250μL双蒸水与50μL消化液，标准管中加入250mL 5mg/mL标准应用液与50μL消化液，将六孔板孔中上吸去，胰酶消化，PBS洗涤，待测 组中加入250mL待测细胞液与50mL消化液。将各组混匀后，置于37℃水浴 3h，采用羟脯氨酸定量试剂盒(购自南京建成生物科技有限公司)测定胶原蛋 白含量。水浴结束后向各管中分别都加入500μL试剂一(羟脯氨酸标准液)， 混匀后室温下放置10min。然后向各管中加入500μL试剂二(乙酸-柠檬酸缓冲 液)，混匀后室温下静置5min，最后向各管加入1mL试剂三(氯胺T试剂)， 混匀，60℃下水浴15min。水浴结束后，流水冷却后，3500转/min离心10min， 取上清，在波长550nm处测每管吸光度值。
2、实验结果
结果见图17所示，在各浓度下，PZH均能够显著(P<0.01)提高胶原蛋白 -I(Col-I)的转录水平，说PZH具有显著促进胶原蛋白合成的能力。
综上所述，本发明通过动物、细胞和分子三个层面进行了片仔癀治疗糖尿 病合并创伤的系统性研究，有力证实了片仔癀对于糖尿病合并创伤的修复具有 显著的促进作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的 限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其 它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由 此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.片仔癀及其制剂在制备促进难愈性创面愈合的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述难愈性创面为大面积皮肤缺损创面、大面积皮肤撕脱伤、慢性溃疡创面、免疫性慢性创面、癌性慢性创面或放射性慢性创面。
3.片仔癀及其制剂在制备加速创面愈合和/或改善创面愈合质量的药物中的应用。
4.片仔癀及其制剂在制备减少成纤维细胞异常衰老的药物中的应用。
5.片仔癀及其制剂在制备具有抗氧化作用的药物中的应用。
6.片仔癀及其制剂在制备促进成纤维细胞增殖、抑制成纤维细胞凋亡、增强成纤维细胞黏附能力、促进成纤维细胞迁移能力或者促进胶原蛋白合成的药物中的应用。
7.根据权利要求1-6中任一所述的应用，其特征在于，所述药物为内服药物或者外用药物；和/或，
所述药物包括药学上有效量的片仔癀和药学上可接受的载体。
8.一种促进难愈性创面愈合的药物，其特征在于，所述药物为以片仔癀为活性成分。
9.根据权利要求8所述的促进难愈性创面愈合的药物，其特征在于，所述药物为以片仔癀为活性成分按照常规工艺，加入药学上可接受的辅料制成临床上可接受的制剂；和/或，所述药物为内服药物或者外用药物。
10.根据权利要求9所述的促进难愈性创面愈合的药物，其特征在于，所述制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、油膏、乳霜、凝胶、敷剂、洗剂、泡沫剂、局部用溶液、糊剂或酊剂。
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