CN116370487A - 王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，公开了王不留行黄酮苷对急性肾损伤的防治作用，涉及医药工业领域中的药物新用途。所述急性肾损伤是顺铂和缺血再灌注诱导的急性肾损伤，属于医药工业领域。涉及王不留行黄酮苷的医药新用途，具体涉及王不留行黄酮苷有效降低急性肾损伤所引起的炎症反应及氧化应激相关的反应，进而发挥肾脏保护作用。

Description

王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途
技术领域
本发明涉及医药工业领域中的药物新用途，具体涉及一种王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途。
背景技术
急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是临床常见危重疾病之一，发病率逐年升高，预后差。部分AKI病人会可出现持续慢性炎症、肾脏组织修复异常和进展性纤维化，其是引起继发性慢性肾脏病、终末期肾病的重要原因。迄今为止，AKI以对症支持治疗为主，尚缺少直接有效的药物治疗措施。因此，寻找可以减轻组织损伤、促进修复、防止慢性纤维化发生的肾脏保护药物具有重要意义。
王不留行黄酮苷(ProtocatechuicAldehyde，PA)是从石竹科植物王不留行[Vaccariasegetalis(neck)Garcker的干燥种子中提取分离的一种黄酮苷类化合物，是王不留行的主要活性成分，文献报道，王不留行黄酮苷具有促进伤口愈合以及伤口部位的内皮细胞和成纤维细胞增殖的作用。
专利号202210536408.5公开了“一种王不留行黄酮苷在制备治疗脓毒症的药物中的应用”，其中公开了王不留行黄酮苷对脓毒症的治疗效果，并且进一步说明了王不留行黄酮苷对改善脓毒症小鼠肺和肾组织的炎症作用。但是在实际的临床应用上，脓毒症及脓毒症导致的器官损伤和顺铂及缺血导致的AKI在病理机制上有很大的差异。脓毒症是一种由感染引起的全身炎症反应综合征，活化的免疫细胞产生的大量炎症因子和炎症趋化因子在脓毒症疾病进程中起着关键作用。在专利号(202210536408.5)中，王不留行黄酮苷主要通过抑制巨噬细胞活化发挥治疗脓毒症的作用。顺铂及缺血导致的AKI首先出现是肾小管上皮细胞功能失调，细胞内产生大量ROS并出现损伤及死亡，进而导致无菌性的肾脏炎症并加剧AKI的病理表现。王不留行黄酮苷对于这些原因造成的急性肾损伤治疗，药理学作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供中药单体王不留行黄酮苷新的药物用途，具体涉及王不留行黄酮苷在防治急性肾损伤时的用途。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，所述急性肾损伤包括顺铂和缺血再灌注诱导的急性肾损伤；所述王不留行黄酮苷的分子式为C32H38O19，且其化学结构式如下：
Figure BDA0004137767530000021
优选的，所述治疗急性肾损伤药物为能够有效降低急性肾损伤所引起的炎症反应及氧化应激相关反应的药物。
优选的，所述治疗急性肾损伤药物为能够减轻肾小管坏死、扩张和糖原沉积，以及保护和改善肾组织形态损伤的药物。
优选的，所述王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物的方式为以王不留行黄酮苷为活性化合物，添加药物制剂上能够接受的辅料，制备成药物制剂。
优选的，所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、悬浮剂或乳剂。
本发明提供一种王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，与现有技术相比优点在于：
本发明首次证实王不留行黄酮苷可有效减轻顺铂和缺血再灌注导致的急性肾损伤，改善肌酐和尿素氮的水平，减轻顺铂引起的肾小管坏死、扩张和糖原沉积，抑制顺铂诱发的氧化应激相关蛋白NOX4的升高，并对肾脏缺血再灌注引起的肾组织形态损伤具有保护和改善作用。
附图说明：
图1中：1A为本发明实施例中王不留行黄酮苷对顺铂诱导HK-2细胞活性的实验结果图；1B、1C为本发明实施例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中肾脏损伤分子(KIM-1)蛋白的Western Blot及半定量分析结果图；
图2中：2A为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中TNF-α的mRNA水平图；2B为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中IL-1β的mRNA水平图；2C为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中MCP-1的mRNA水平图；2D为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中IL-6的mRNA水平图；2E、2F、2G为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中p-P65、P65、NLRP3蛋白水平图；
图3中：3A、3B为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导HK-2细胞中NOX4蛋白水平图；
图4中：4A、4B为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型的血肌酐和尿素氮水平图；4C、4D为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型的肾脏损伤分子(KIM-1)蛋白的Western Blot及半定量分析结果图；4E为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤的糖原染色(PAS染色)的组织病理图；
图5中：5A为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型TNF-α的mRNA水平图；5B为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型IL-1β的mRNA水平图；5C为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型MCP-1的mRNA水平图；5D为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型IL-6的mRNA水平图；5E、5F、5G为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型p-P65、P65和NLRP3蛋白水平图；
图6中：6A、6B为本发明实例中王不留行黄酮苷影响顺铂诱导小鼠急性肾损伤模型NOX4的蛋白水平及半定量分析结果图；
图7中：7A、7B为本发明实例中王不留行黄酮苷影响缺血再灌注诱导小鼠急性肾损伤模型的血肌酐和尿素氮水平图；图7C、7D为本发明实例中王不留行黄酮苷影响缺血再灌注诱导小鼠急性肾伤模型的肾脏损伤分子(KIM-1)蛋白的WesternBlot及半定量分析结果图；7E为本发明实例中王不留行黄酮苷影响缺血再灌注诱导小鼠急性肾伤模型的肾脏损伤分子(KIM-1)的mRNA水平图；7F为本发明实例中王不留行黄酮苷影响缺血再灌注诱导小鼠急性肾伤模型的PAS染色的组织病理图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
其中主要实验材料如下：
细胞：人肾小管上皮细胞(HK-2)；
培养基：含5％FBS的DMEM/F12(1∶1)培养基；
培养环境：37℃含5％CO2培养箱；
动物：6-8周龄雄性C57BL/6小鼠，由安徽医科大学动物中心提供；
王不留行黄酮苷：购于成都普利斯生物科技有限公司；
肌酐、尿素氮试剂盒：购于南京建成生物工程研究所；
顺铂、MTT：购于美国sigma公司。
实施例1：
王不留行黄酮苷在体外对顺铂诱发肾小管上皮细胞损伤的保护作用；
MTT法：将HK-2细胞接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔。培养24h，换用0.5％血清培养基饥饿12小时后，加入王不留行黄酮苷培养12小时，再加入顺铂培养24h，分别为正常组(NC)、单纯用药组(Va 60μM)、模型组(Cisplatin 20μM)、王不留行黄酮苷低剂量(Cisplatin 20μM+Va 15μM)、中剂量(Cisplatin 20μM+Va30μM)、高剂量组(Cisplatin20μM+Va 60μM)。培养结束后每孔加入5g·L-1的MTT溶液20μL，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150μL的DMSO，振荡，混匀。用酶标仪在492nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率(Cell viability)对剂量作图。结果计算：细胞存活率＝(试验组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。
Western Blot：将对数生长期的HK-2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×105个细胞/mL。培养24h，换用0.5％血清培养基饥饿12小时后，加入王不留行黄酮苷培养12小时，再加入顺铂培养24h，分别分为正常组(NC)、单纯用药组(Va)、模型组(Cisplatin 20μM)、王不留行黄酮苷低剂量(Cisplatin 20μM+Va 15μM)、中剂量(Cisplatin20μM+Va 30μM)、高剂量组(Cisplatin 20μM+Va 60μM)，每组重复3次实验。PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过WesternBlot法检测肾脏损伤分子KIM-1的蛋白表达并进行半定量分析。
MTT结果如图1A显示，顺铂刺激的HK-2细胞经过低、中、高浓度的王不留行黄酮苷处理后，该细胞的相对存活率值从顺铂刺激组的40％分别升高到68％、77％和86％，存活率增加约2.2倍。说明王不留行黄酮苷对顺铂刺激的肾小管上皮细胞具有较好的保护作用，且效应呈剂量依赖性。
Western Blot及半定量分析结果如图1B、1C显示，顺铂刺激的HK-2细胞经过王不留行黄酮苷处理后，肾脏损伤分子KIM-1的蛋白表达水平明显受到抑制，呈剂量依赖性，证明王不留行黄酮苷对顺铂引起肾小管上皮细胞损伤的保护作用。
结合MTT和Western Blot实验结果，后续细胞实验选王不留行黄酮苷高剂量(60μM)为治疗浓度进行后续实验。
实施例2：
王不留行黄酮苷在体外对顺铂诱导炎症因子的抑制作用；
将HK-2细胞接种于12孔板中，分别分为正常组(NC)、单纯用药组(Va)、模型组(Cisplatin 20μM)、王不留行黄酮苷治疗组(Cisplatin20μM+Va 60μM)，每组重复3次实验。接种密度约为0.5×105个细胞/孔，孵育24小时，用0.5％血清培养基饥饿12小时后加入王不留行黄酮苷作用12小时，再加入顺铂培养24h。PBS洗三遍，收集细胞，提RNA，逆转录，扩增，Real time PCR结果如图2A，顺铂明显诱导肾小管上皮细胞中TNF-αmRNA水平的升高，而王不留行黄酮苷处理组TNF-αmRNA表达明显被抑制，图2B结果显示肾小管上皮细胞受到顺铂刺激后经王不留行黄酮苷处理，其IL-1βmRNA表达明显下降，图2C结果显示王不留行黄酮苷处理顺铂刺激后的肾小管上皮细胞后MCP-1mRNA的表达明显下降，图2D结果显示王不留行黄酮苷处理顺铂刺激后的肾小管上皮细胞后IL-6mRNA的表达明显下降。
Western Blot同实施案例1，Western Blot法检测p-P65、P65、NLRP3，β-actin蛋白表达并进行半定量分析。
图2E、2F显示王不留行黄酮苷能明显降低p-P65和NLRP3的蛋白水平。且图2提示王不留行黄酮苷可显著抑制顺铂诱发的炎症反应。
实施例3：
王不留行黄酮苷对体外顺铂诱导氧化应激的抑制作用；
Western Blot：同实施案例1，通过Western Blot法检测NOX4、β-actin蛋白表达并进行半定量分析。
结果如图3A、3B，顺铂明显诱导肾小管上皮细胞NOX4蛋白水平的升高，而Va处理组NOX4蛋白减少。
实施例4：
王不留行黄酮苷对急性肾损伤模型中血肌酐(Creatinine)和血尿素氮(BUN)的影响。
将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性饲养1周，分别分为正常组(NC)、单纯用药组(Va25mg/kg)、模型组(Cisplatin 20mg/kg)、王不留行黄酮苷低剂量(Cisplatin 20mg/kg+Va6.25mg/kg)、中剂量(Cisplatin20mg/kg+Va 12.5mg/kg)、高剂量(Cisplatin 20mg/kg+Va25mg/kg)组，每组4只。王不留行黄酮苷(6.25、12.5和25mg/kg)共腹腔注射4次，1次/天，每次给药间隔24h，第一次王不留行黄酮苷给药12h后腹腔注射顺铂(20mg/kg)或生理盐水。顺铂给药72小时后，1％戊巴比妥钠(0.08ml/10g)麻醉小鼠采集血液和肾组织。并根据血肌酐和尿素氮试剂盒说明书检测动物模型血清中肌酐和尿素氮的含量。
肌酐测试如下表1所示：
表1
Figure BDA0004137767530000071
肌酐含量(μmol/L)＝[(测定A2-K*测定A1)-(空白A2-K*空白A1)]/[(标准A2-K*标准A1)-(空白A2-K*空白)]*标准品浓度(442μmol/L)。
注：稀释因子K＝(加样量+酶溶液A体积)/(加样量+酶溶液A体积+酶溶液B体积)＝186/246。
尿素氮测试如下表2：
表2
Figure BDA0004137767530000081
尿素氮含量(mmol/L)＝(测定OD值-空白测定值)/(标准OD值-空白OD值)*标准浓度(10mmol/L)*样本测试前稀释倍数。
提取组织蛋白，WesternBlot法检测KIM-1、β-actin蛋白表达并进行半定量分析。
糖原(PAS)染色
染色前处理：
(1)组织固定：将收获的新鲜小鼠肾组织浸没于4％多聚甲醛或丙酮中，避光，常温固定组织，持续24-48h。
(2)脱水：固定完毕后包埋盒置于组织脱水循环机中，检查乙醇容量与浓度梯度(70％→80％→90％→95％→100％Ⅰ→100％Ⅱ)设定每罐容器脱水1h，将组织中的水分脱去；
(3)透明：脱水完毕，组织随循环机进入二甲苯容器进行透明处理；
(4)浸蜡包埋：从循环机中取出包埋盒置于液体石蜡浸润2h，组织置于不锈钢磨具灌入液体石蜡组合于包埋盒一面，冷却成形；
(5)切片与贴片：成型的蜡块在冷冻台或-20℃冰箱预冷1-3h，开启切片机，将蜡块固定于插槽，设置切片厚度为4μm。薄片置于捞片、烤片一体机的温水槽(50-60℃)，充分展开，载玻片捞片，于烤片槽烤干。
(6)脱蜡染色：准备染色前，载玻片于65℃烘箱2h以融化石蜡，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min脱去石蜡，高到低浓度乙醇(100％，95％，85％，75％)涮洗，最后蒸馏水冲洗10min。
糖原染色
1)脱完蜡的切片用疏水笔画圈，圈住组织区域；
2)滴加1％高碘酸溶液10min；
3)PBS冲洗，每次5min，一共3次；
4)滴加Schiff氏液15min；
5)PBS冲洗，每次5min，一共3次；
6)滴加苏木素染核5min；
7)流水缓慢冲洗10min；
8)从低到高梯度浓度(75％，85％，95％，100％)乙醇脱水；
9)晾干后，用中性树脂封片；
10)显微镜镜检，图像采集分析。
实验结果如图4A显示，顺铂诱导模型组中血肌酐含量明显升高，肾功能恶化，而不同剂量的王不留行黄酮苷有效降低模型组血肌酐水平，呈剂量依赖性，图4B结果同样显示不同剂量的王不留行黄酮苷有效降低模型组尿素氮水平，呈剂量依赖性，进一步证实王不留行黄酮苷对急性肾损伤时肾功能具有保护作用。图4C、4D显示王不留行黄酮苷能够剂量依赖性抑制顺铂导致的KIM-1蛋白水平升高。图4E显示，给予王不留行黄酮苷可以减轻顺铂引起的肾小管坏死、扩张和糖原沉积。图4结果表明王不留行黄酮苷能够剂量依赖性的保护顺铂导致急性肾损伤的功能。后续实验将选取疗效更好的高剂量浓度(25mg/kg)实施实验。
实施例5：
王不留行黄酮苷对急性肾损伤模型中炎症的抑制作用；
将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性饲养1周，分别分为正常组(NC)、单纯用药组(Va25mg/kg)、模型组(Cisplatin 20mg/kg)、王不留行黄酮苷治疗组(Cisplatin 20mg/kg+Va25mg/kg)，每组4只。王不留行黄酮苷(6.25、12.5和25mg/kg)共腹腔注射4次，1次/天，每次给药间隔24h，第一次王不留行黄酮苷给药12h后腹腔注射顺铂(20mg/kg)或生理盐水。顺铂给药72小时后采集肾组织，提取组织RNA，逆转录，扩增。提取组织蛋白、WesternBlot法检测NLRP3、p-P65、P65蛋白表达并进行半定量分析。
Real-time PCR结果如图5A，TNF-αmRNA水平的升高，而王不留行黄酮苷处理组TNF-αmRNA表达明显被抑制，图5B结果显示肾小管上皮细胞受到顺铂刺激后经王不留行黄酮苷处理，其IL-1βmRNA表达明显下降，图5C结果显示王不留行黄酮苷处理顺铂刺激后的肾小管上皮细胞后MCP-1mRNA的表达明显下降，图5D显示结果显示王不留行黄酮苷处理顺铂刺激后的肾小管上皮细胞后IL-6mRNA的表达明显下降，图5E：显示王不留行黄酮苷能明显降低p-P65和NLRP3的蛋白水平，王不留行黄酮苷可显著抑制顺铂诱发的炎症反应。
实施例6：
王不留行黄酮苷对急性肾损伤模型中氧化应激相关蛋白的抑制作用；
同实施案例5，提取组织蛋白，通过Western Blot法检测NOX4蛋白表达并进行半定量分析。
实验结果如图6A、6B，王不留行黄酮苷能明显降低NOX4的蛋白水平。提示王不留行黄酮苷可显著抑制顺铂诱发的氧化应激相关蛋白NOX4的升高。
实施例7：
王不留行黄酮苷对缺血再灌注急性肾损伤的血肌酐和尿素氮的影响：
将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性饲养1周，分别分为假手术组(Sham)、单纯用药组(Va 25mg/kg)、缺血再灌注组(I/R)组、治疗组(I/R+Va 25mg/kg)，每组6只。
随后，小鼠采用1％戊巴比妥钠(0.08ml/10g)腹腔注射麻醉。缺血再灌注组：小鼠背部两侧各做0.8～1.0cm的切口，暴露双侧肾脏钝性剥离肾蒂，然后用无损伤微型动脉夹迅速阻断双侧肾蒂，1min内可见肾脏由鲜红色变为紫黑色表示夹闭成功，持续夹闭50min。
然后松开微动脉夹恢复血流灌注，观察肾脏颜色迅速变为鲜红色，分层缝合小鼠背部。术后小鼠置于24～29℃的环境，密切观察小鼠的生命体征，同时补充水与饲料。假手术组：同法打开腹腔仅钝性剥离肾蒂，其余与I/R组做相同处理。
模型建立成功标志：松开动脉夹观察肾脏从紫黑色转红色，说明经过肾脏缺血-再灌注病理生理过程；如果松开动脉夹后5min，肾脏未转变为正常的红色，则认为再灌注不成功；术中如损伤大血管或者周围组织时认为造模不成功；缝合腹部切口继续观察2h，如动物体温正常且能正常活动说明造模成功，否则也认为造模不成功剔除。再灌注24h后处死动物，取血清及肾脏组织进行后续的检测。
SCr和BUN的检测：处死小鼠前采集血液，3000rpm/min离心15分钟。收集分离出的上层血清，按照肌酐、尿素氮说明书操作，如实施例4中血肌酐和尿素氮检测计算方法。
提取组织蛋白，WesternBlot法检测KIM-1、β-actin蛋白表达并进行半定量分析。
PAS染色同实施案例4中的PAS染色
实验结果如图7A，缺血再灌注诱导模型组中血肌酐含量明显升高，肾功能恶化，而王不留行黄酮苷有效降低模型组血肌酐水平，图7B结果同样显示王不留行黄酮苷有效降低模型组尿素氮水平，进一步证实王不留行黄酮苷对急性肾损伤时肾功能具有保护作用。
图7C、7D显示王不留行黄酮苷能够抑制缺血再灌注导致的KIM-1蛋白水平升高。图7E显示，王不留行黄酮苷能够抑制缺血再灌注导致的KIM-1mRNA水平升高。
图7F显示，缺血再灌注给予生理盐水的小鼠组织形态出现明显的损伤，表现为肾脏近曲小管管腔扩张、刷状缘缺失、小管细胞凋亡。给予王不留行黄酮苷后，肾组织形态损伤显著得到改善，表明王不留行黄酮苷对肾脏缺血再灌注引起的肾组织形态损伤具有保护和改善作用。图7结果表明王不留行黄酮苷能够保护缺血再灌注导致的急性肾损伤的功能。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (5)

1.王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，其特征在于，所述急性肾损伤包括顺铂和缺血再灌注导致的急性肾损伤；所述王不留行黄酮苷的分子式为C32H38O19，且其化学结构式如下：
Figure FDA0004137767520000011
2.根据权利要求1所述的王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，其特征在于：所述治疗急性肾损伤药物为能够有效降低急性肾损伤所引起的炎症反应及氧化应激相关反应的药物。
3.根据权利要求1所述的王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，其特征在于：所述治疗急性肾损伤药物为能够减轻肾小管坏死、扩张和糖原沉积，以及保护和改善肾组织形态损伤的药物。
4.根据权利要求1所述的王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，其特征在于：所述王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物的方式为以王不留行黄酮苷为活性化合物，添加药物制剂上能够接受的辅料，制备成药物制剂。
5.根据权利要求4所述的王不留行黄酮苷在制备治疗急性肾损伤药物中的用途，其特征在于：所述药物制剂的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、悬浮剂或乳剂。
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