CN104856996B - 吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐新的药用用途以及药用组合物 - Google Patents

吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐新的药用用途以及药用组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐在制备用于治疗和/或预防子宮内膜异位、以及由子宮内膜异位引起的疼痛和/或不孕的药物中的应用，以及PQQ或PQQ联合NAC、白藜芦醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、姜黄素、花青素、维生素E、维生素C或维生素d等的药物组合，该药物及药物组合可以治疗子宫内膜异位症以及与子宫内膜异位症相关的适应症。本发明能够在体外显著抑制子宫内膜异位细胞是增殖，可显著减小子宫内膜异位损伤的尺寸，基本无副作用，且特别是该治疗不妨碍且有助于妊娠。

Description

吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐新的药用用途以及药用组合物
技术领域
本发明涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐新的药用用途以及药用组合物，具体涉及吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐在制备用于治疗和/或预防子宮内膜异位、以及由子宮内膜异位引起的疼痛和/或不孕的药物中的应用。
背景技术
子宫内膜异位症(Endometriosis，EM，简称内异症)是指具有生长功能的子宫内膜出现于子宫体腔内壁以外部位引起的疾患(或一系列病变和症状)，包括腺肌症、卵巢巧克力囊肿、深部浸润型子宫内膜异位症等，是一种雌激素依赖性疾病。临床表现为痛经、不孕、慢性盆腔痛、性交痛、盆腔包块、急腹症，甚至恶变等，是生育期的女性常见疾病，发病率高达10％-15％。近年来，子宫内膜异位症的发病率继续呈显著的上升趋势，其中近一半的患者合并不孕。更为严重的是，EM虽为良性疾病，但异位子宫内膜具有浸润、扩散和远处转移等类似恶性行为，全身多处(如鼻腔、肺部、肾脏、输尿管、膀胱、肠道等)均可发病，因此也被称为“良性癌”，是一种严重影响患者身心健康的疑难疾病。
一般认为，经血逆流，内膜种植是子宫内膜异位症的主要病因。子宫内膜细胞在宫腔外逆流种植成功需要具备4个基本条件：(l)子宫内膜细胞必须通过输卵管进入腹腔；(2)经血逆流碎片中的细胞必须是活的；(3)子宫内膜细胞必须有能力移植到盆腔组织器官上；(4)内异症在盆腔的解剖学分布必须与脱落的子宫内膜细胞的种植原理相一致。因此，异位内膜的转移、种植、生长等类似肿瘤转移的生物学行为可能是内异症发病的关键。
目前EM治疗方法包括手术和药物冶疗两大类，普通手术治疗只是将内膜异位的病变切除，保留子宫和正常卵巢组织的保守性治疗方法，术后复发率很高；根治性手术虽然治疗效果好，但需切除子宫和双附件，会使妇女彻底丧失生育功能与卵巢的内分泌功能，不适用于生育期的患者。药物治疗的常用药物有四大类：孕激素类、睾酮衍生物、丹那唑与内美通、促性腺素释放激素激动剂。这些药物主要是通过干预下丘脑-垂体-卵巢轴，直接或间接干扰雌激素水平，形成假孕或假绝经，达到治疗的目的。但这些药物常常有肝功能损害、低雌激素状态所致更年期样改变等副作用，不能长期服用，治疗期间难以怀孕。由于药物治疗期间体内雌激素仍保持一定的水平或维持一定的生理功能，尤其是深部侵润的异位灶对外周血中的雌激素不依赖且自分泌雌激素，因此异位灶组织仍存在，一旦停药，异位灶容易死灰复燃。据统计，药物治疗的复发率约25％-67％。
有研究表明，EM细胞增殖水平的增加与氧自由基水平升高有关，氧化应激对于子宫内膜异位症(EM)的形成与发展有重要作用(Murphy等人，Semin ReprodEndocrinol.1998；16:263–73)。腹腔中活化的巨噬细胞能够形成高氧化应激区域，其中包括脂质过氧化物及其降解产物(Agarwal等人，Curr Opin Obstet Gynecol.2006；18:325–32)。这种高氧化应激状态会进一步导致炎症反应的产生，促进炎症、驱化与生长因子的分泌，释放到患者的腹腔积液中(Van Langendonckt等人，Fertile Steril.2002；77:861–70)，这些因子反过来又可以不断驱动异位的子宫内膜组织在腹腔中的种植与生长(Santanam等人,Ann N YAcad Sci.2002；955:183–98)。
有报道，异位子宫内膜基质细胞的超氧阴离子(O2-)产量显著高于原位子宫内膜基质细胞(等人,Am J Pathol.2009Jul；175(1):225-34)。在病变EM组织中，超氧阴离子浓度增加又能通过激活mTOR/AKT通路进而促进基质的细胞的增殖(Leconte等人,AmJPathol.2011Aug；179(2):880-9)。
上述研究表明，EM细胞增殖、侵袭能力与细胞氧自由基、炎症水平升高正相关。因此，抗氧化和抗炎有可能成为新的EM治疗途径(Transl Res.2013March；161(3):189–195)，关键在于寻找到合适的抗氧化剂。
N-乙酰半胱氨酸(NAC)是体内合成谷胱甘肽的前体，是重要的抗氧化剂。利用子宫内膜异位症小鼠模型的研究显示，每天每公斤体重1.3克NAC的能够显著抑制异位子宫内膜病灶的生长(C Ngo等人，Am J Pathol,Jul 2009；175(1):225-34)。在最近的一个临床队列研究中，NAC处理EM患者3个月后，能够明显减小腹腔囊泡的大小，效果优于激素治疗的方案(Porpora等人,Evid Based ComplementAlternat Med.2013；vol 2013:ID 240702)。中国专利申请CN 102665707 A披露了一种抗氧化治疗EM的药物N-乙酰半胱氨酸(NAC)。但是，NAC的治疗ME的临床应用有着明显的不足：NAC在体内稳定性不高，因此抗氧化能力有限，需要较大的剂量才能保证疗效；同时，NAC是一种酸性物质，在人体试验中每天服用剂量高达1.8克，这一剂量可能引起部分患者的消化道症状；而且，根据2010版中华人民共和国药典的记载，NAC作为一种公知的化痰药物，还存在多种其它不良反应，严重的包括中毒。
因此，有必要寻找更加稳定、安全，功能强大的抗氧化剂，或者药物联合小剂量的NAC，用于治疗子宫内膜异位症。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是上述现有手术和药物冶疗EM的方法所存在的缺陷，以及已知的抗氧化治疗EM的药物NAC所存的稳定性不高、抗氧化能力有限、需较大的剂量才能保证疗效以及有多种不良反应等问题。
为解决上述问题，申请人进行了大量的文献检索，发现多种抗氧化剂如表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)、白藜芦醇(Resveratrol)、欧米伽-3多不饱和脂肪酸(omega-3PUFAs)、维生素B，E，C等对EM动物模型都有一定的疗效(HumReprod,2013Jan；28(1):178-88.J Endometr.2013January 1；5(1):17–26)，但到目前为止，尚未有任何一种抗氧化剂获批成为治疗EM的药品。申请人推测原因：1，一些抗氧化剂存在和NAC相似的问题，如维生素c,；2，一些抗氧化剂属于脂溶性物质，人体难以吸收足够的治疗剂量，如欧米伽-3多不饱和脂肪酸、维生素E。最终，申请人将目光投向了可用如下结构式表达的吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)：
结构式(I)
1964年，首先在细菌中发现PQQ作为一种辅酶存在。随后的研究证实，PQQ是一种水溶性的物质，可作为电子的受体或供体参与氧化还原酶的酶促反应。PQQ广泛存在于动植物中，在人体组织广泛分布，其中在母乳中含量最高。PQQ具有广泛的生物学功能，主要功能包括：(1)刺激微生物、植物、动物生长；(2)动物发育和繁殖必需的营养因子；(3)清除过多的自由基，保护机体免受氧化损伤；(4)，降低血浆中炎症因子IL-6和C-反应蛋白(CRP)的表达(Journal of Nutritional Biochemistry 24(2013)2076-2084.)，说明PQQ能够抑制炎症；(5)提供神经营养和保护作用；(6)PQQ能够改善睡眠和认知。有学者提出将PQQ归类为第14种维生素，现已作为保健品在美国和日本上市。由于PQQ具有独特的邻苯醌结构，使其具有其它辅酶所没有的生理特性，在化学性质方面相对稳定，这种特性使其能参与20000次氧化还原循环，自由基清除活性显著高于维生素C(Altern Med Rev.2009Sep；14(3):268-77)。
申请人通过大量的研究和实验，惊奇的发现：吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐均对治疗和/或预防子宮内膜异位、以及由子宮内膜异位引起的疼痛和/或不孕有较好的疗效。
申请人通过进一步的研究和实验，还惊奇的发现：吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐与NAC等其他抗氧化剂联合使用，对治疗和/或预防子宮内膜异位、以及由子宮内膜异位引起的疼痛和/或不孕有更好的疗效。
前述其他抗氧化剂还包括白藜芦醇(Resveratrol)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、姜黄素、花青素、维生素E、维生素C等。
申请人通过研究和实验，进一步发现，吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐与NAC联合使用的情况下，可再加入缓释和/或胃保护的制剂，以减轻药物的胃肠道反应。
本发明为吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐提供了新的药用用途，并为人们提供了一种以吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐为有效成分的药物组合物。采用吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐为有效成分的药物与以N-乙酰半胱氨酸为有效成分的药物相比，具有如下优点和进步：
1)稳定，PQQ具有独特的邻苯醌结构，在化学性质方面相对稳定，这种特性使其能参与20000次氧化还原循环，自由基清除活性显著高于维生素C(Altern Med Rev.2009Sep；14(3):268-77)；
2)用量小，本药物方案中大鼠所用PQQ剂量为每天每公斤体重1毫克，远远小于NAC在动物实验中的用量每天每公斤体重44-1300毫克(TheAmericanJournalofPathology,Vol.175,No.1,July 2009.Fertil Steril_2010；94:2905–8.)；
3)安全，PQQ的大鼠半数致死剂量为1000-2000毫克/公斤体重，每天每公斤体重100毫克连续14天，未发现任何不良反应(Regul Toxicol Pharmacol.2014Oct；70(1):107-21)；
4)PQQ与小剂量NAC有明显协同作用，该药物组合治疗子宫内膜异位症有更好的前景。
将吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐用于制备治疗子宫内膜异位、以及由子宮内膜异位引起的疼痛和/或不孕的药物，目前未见报道。而且，其对子宫内膜异位症及由子宮内膜异位引起的疼痛的治疗效果较NAC更好。同时，PQQ有助于生育，可能在减轻子宫内膜异位症病痛的同时，增加怀孕机会，这是现有EM临床治疗药物所没有的。
附图说明
图1为经不同浓度的PQQ处理后的子宫内膜基质细胞的细胞生长曲线图。
图2为经不同浓度的PQQ处理后的子宫内膜基质细胞的细胞周期各期占比直方图。
图3为经不同浓度的PQQ处理后的子宫内膜基质细胞的细胞凋亡比例直方图。
图4为NAC单独或协同不同浓度PQQ抑制子宫内膜基质细胞的增殖的细胞生长曲线图，其中：
图4-1为经不同浓度的NAC处理后的子宫内膜基质细胞的细胞生长曲线图。
图4-2为经3μM PQQ联合10μM NAC处理后的子宫内膜基质细胞的细胞生长曲线图。
图4-3为经300nM PQQ联合10μM NAC处理后的子宫内膜基质细胞的细胞生长曲线图。
图4-4为经30nM PQQ联合10μM NAC处理后的子宫内膜基质细胞的细胞生长曲线图。
图5为经不同浓度的PQQ处理后的子宫内膜基质细胞中氧自由基相对含量直方图，其中图5-1，图5-2，图5-3分别表示超氧阴离子自由基(O2·－)、羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)在0，30nM，300nM和3μM PQQ处理下的相对含量，*P<0.05。
图6-1为经不同浓度的PQQ处理后的子宫内膜基质划痕细胞的照片。
图6-2为经不同浓度的PQQ处理后的子宫内膜基质划痕细胞的细胞划痕愈合实验的测量统计曲线图。
图7-1为经不同浓度的PQQ作用下侵袭子宫内膜基质细胞的结晶紫染色图片。
图7-2为为经不同浓度的PQQ作用下侵袭子宫内膜基质细胞的计数统计直方图。
具体实施方式
实验化合物来源及处理
PQQ,NAC,Resveratrol均购自于sigma公司，分别溶解于双蒸水，PQQ,Resveratrol母液浓度为1mM，NAC母液浓度为10mM。
实验1：PQQ体外抑制子宫内膜基质细胞增殖
异位子宫内膜组织中主要包括上皮细胞和基质细胞，这两种细胞的增殖和侵袭能力决定了异位子宫内膜所引起的病症的严重程度。本实验选用异位子宫内膜组织中的基质细胞，在体外研究PQQ对子宫内膜组织基质细胞的增殖抑制作用。
材料与方法
人异位子宫内膜基质细胞分离
手术分离的人卵巢巧克力囊肿子宫内膜组织，超净台内用含抗生素的PBS漂洗2～3遍，无菌手术剪 将组织剪至1mm3大小碎块。浓度为1mg/mlⅠ型胶原酶，37℃消化组织60～90min，继续加入DNaseⅠ(终浓度15U/ml,0.02％DNaseⅠ)消化30min。60目不锈钢细胞过滤网滤去未消化的细胞组织，进一步400目或200目的筛网过滤，收集滤液经1000rpm，5min离心后，用含DMEM/F12(1：1v/v)+10％胎牛血清的培养液洗涤一遍，再用培养液重悬后以合适密度铺至6孔板或T25培养瓶中，24小时后换液去除未贴壁的血液细胞、内皮细胞、巨噬细胞等杂细胞。原代分离培养的人子宫内膜基质细胞细胞生长至90％汇合时，0.25％胰蛋白酶消化4～6min，按照1:2～3传代培养。通过免疫荧光方法检测基质细胞特异性表达的波形蛋白(vimentin)，细胞纯度超过95％的才能用于下一步的试验。
细胞增殖检测
传代培养人原代异位子宫内膜基质细胞，选取P3～P6代传代细胞作为实验对象。取对数生长期细胞消化接种于细胞培养板，接种密度为50％～60％(2×104个细胞)，细胞贴壁生长24小时后进行加药处理。实验分组加药处理后，分别按照设置时间点，每孔加入MTT(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20μL，在5％CO2、37℃培养箱中孵育4h；终止培养，小心吸去孔内培养上清，然后每孔加入150μL DMSO，并于脱色摇床震荡10min，使结晶充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上对各孔的吸光值进行检测。最后绘制细胞增殖曲线。
细胞周期与凋亡检测
传代培养人原代异位子宫内膜基质细胞，选取P3～P6代传代细胞作为实验对象。取对数生长期细胞消化接种于细胞培养板，接种密度为50％～60％(2×104个细胞)，细胞贴壁生长24小时后进行加药处理。实验分组加药处理后24h后，用0.25％胰酶消化细胞，加入预冷的碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测细胞周期。或加入5μLAnnexin V-FITC，室温(25℃)避光孵育20min后，加入10μL PI染液，流式细胞仪检测细胞凋亡。
结果：
PQQ抑制子宫内膜基质细胞的增殖
参见图1，采用MTT检测不同剂量PQQ处理子宫内膜基质细胞后，发现从48h开始，与对照组相比，300nM与3μM PQQ组能够明显抑制细胞增殖(p<0.01)，30nM处理组表现出一定的抑制作用，但差异不明显(p>0.05)，表明PQQ能够有效抑制子宫内膜基质细胞的增殖，并呈剂量依赖效应。
PQQ抑制子宫内膜基质细胞的周期
参见图2，用不同剂量PQQ处理子宫内膜基质细胞96h，MTT法检测细胞的增殖状况(n＝6)，**P<0.01，采用流式细胞技术检测发现300nM与3μM PQQ处理组能够将细胞阻滞在G0/G1期(P<0.01)，表示PQQ能够显著抑制子宫内膜基质细胞细胞的增殖。
PQQ不影响子宫内膜基质细胞的凋亡或坏死
参见图3，申请人采用流式细胞检测技术观察不同浓度PQQ对子宫内膜基质细胞凋亡的影响，发现三个PQQ处理组与对照组相比，无论剂量大小，都没有检测到子宫内膜基质细胞的凋亡或坏死的产生， 表明PQQ的作用主要表现为抑制细胞的周期，不会促进细胞的凋亡或死亡，因此并非毒性作用。
实验2：NAC协同PQQ抑制子宫内膜基质细胞增殖
材料与方法
细胞增殖检测
传代培养人原代异位子宫内膜基质细胞，选取P3～P6代传代细胞作为实验对象。取对数生长期细胞消化接种于细胞培养板，接种密度为50％～60％(2×104个细胞)，细胞贴壁生长24小时后进行加药处理。实验分组加药处理后，分别按照设置时间点，每孔加入MTT(5mg/ml用PBS配制，pH＝7.4)20μL，在5％CO2、37℃培养箱中孵育4h；终止培养，小心吸去孔内培养上清，切勿吸掉甲攒结晶；然后每孔加入150μL DMSO，并于脱色摇床震荡10min，使结晶充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上对各孔的吸光值进行检测。最后绘制细胞增殖曲线。
结果
NAC抑制子宫内膜基质细胞的增殖作用
根据Charlotte等人的报道(等人,Am J Pathol.2009Jul；175(1):225-34.)，10mM的NAC能够抑制子宫内膜细胞的增殖，在小鼠动物实验中剂量用到3g/kg，对应人每天150克，申请人认为这是一个不现实的剂量。因此，申请人检测了1/100与1/1000浓度剂量NAC的作用，发现100μM(P<0.01)仍够能够有效抑制细胞的增殖，而10μM处理组没有明显的作用(参见图4-1)。
NAC协同PQQ抑制子宫内膜基质细胞的增殖
考虑到NAC与PQQ相似，具有较强的还原性质，能够有效地清除氧自由基，申请人尝试试验二者联合使用是否能产生协同作用，具体做法是采用在细胞水平基本没有作用的10μM NAC，分别联合30nM、300nM与3μM PQQ，MTT检测细胞的增殖状况。结果发现：参加图4-2，3μM PQQ联合10μM NAC，能够显著抑制细胞增殖(P<0.01)，效果优于单独3μM PQQ(P<0.05)；参见图4-3，300nM PQQ联合10μM NAC，能够显著抑制细胞增殖(P<0.01)，效果优于单独300nM PQQ(P<0.05)；参见图4-4，30nM PQQ联合10μM NAC抑制细胞增殖作用不明显。
实验3：PQQ处理对子宫内膜基质细胞氧化应激状态的抑制
材料与方法
超氧阴离子(02·－)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所；羟自由基检测试剂盒：上海信裕生物科技有限公司；过氧化氢检测试剂盒：碧云天生物技术研究所。
超氧阴离子(02·－)含量测定
细胞以2×104个/孔接种于96孔板，培养24h贴壁后，加入30，300nM和3μM浓度的PQQ孵育18h。处理结束后，弃去培养液，加入终浓度为lmg/mL NBT的培养液，37℃继续培养1h。100％甲醇固定，晾干后，加入120μl 2mol/L KOH和140μl DMSO，570nm测定OD值。
过氧化氢(H202)含量测定
细胞以8×105个/孔接种于6孔板，培养24h贴壁后，加入30，300nM和3μM浓度的PQQ孵育18h。处理结束后，用试剂盒提供的裂解液裂解细胞，4℃，12000g离心5min，将50μl样品上清与100μl检测液混合，室温放置30min，560nm测定OD值。
羟自由基(·OH)含量测定
细胞以8×105个/孔接种于6孔板，培养24h贴壁后，加入30，300nM和3μM浓度的PQQ孵育18h。处理结束后，收集细胞，加样本50μL/孔，然后加入抗体工作液50μL/孔，振荡混匀，37℃反应30min。洗板4-5次。加入酶标记物100μL/孔，37℃反应20min。显色：每孔加入底物缓冲液50μL，再加底物液50μL，轻轻振荡混匀，37℃环境避光显色10min。测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450nm处(在20min内读完数据)，测定吸光度值。
结果
PQQ清除子宫内膜基质细胞中氧自由基衍生物质
氧自由基包括超氧阴离子自由基(O2·－)，羟自由基(·OH)，氢过氧自由基(HOO·)和脂过氧自由基(ROO·)等。它们与单线态氧(1O2)、过氧化氢(H2O2)和臭氧(O3)统称为活性氧(ROS)。图5-1，图5-2，图5-3分别表示超氧阴离子自由基(O2·－)，羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)在0，30nM，300nM和3μM PQQ处理下的相对含量，结果显示，三种ROS在300nM和3μM PQQ处理下，在基质细胞中的含量明显下降(P<0.05)，说明PQQ能够清除子宫内膜基质细胞中氧自由基衍生物物质，在子宫内膜基质细胞中的抗氧自由基作用。
实验4：PQQ抑制子宫内膜基质细胞的迁移侵袭
背景介绍
EM虽然是良性疾病，恶变率极低，但它的生物学行为却与恶性肿瘤极为相似，尤其是具有组织侵袭、远处种植的能力。异位内膜通过黏附作用入侵盆腹腔腹膜或其他脏器表面，必须降解被黏附细胞外基质(ECM)屏障是其种植生长的必要条件。
ECM的降解主要依靠蛋白水解酶的作用，而基质金属蛋白酶(MMP)是其中最重要的一组蛋白酶，它几乎能降解ECM的所有成分，是ECM和基底膜降解与重建的关键。基质金属蛋白酶的组织抑制因子(TIMP)是MMP天然的特异性抑制剂，MMP/TIMP平衡失调在内异症的发病过程中具有重要意义。Uzan等研究表明(Uzan等人,C1,VirchowsArch.2004Dec；445(6):603-9)，EM患者异位内膜MMP和TIMP活性发牛改变，表现在MMP-1、-2、-3、-7、-9和-1l表达增加，而TIMP-l、-2和-3表达降低，使MMP/TIMP平衡失调，促进ECM降解，增加异位内膜侵袭力(Jana等人，Indian J BiochemBiophys.2012Oct；49(5):342-8)。通过各种手段抑制MMP能够在一定程度上缓解EM的发展
材料与方法
划痕试验：
细胞铺板前，用刀片在24孔板背后，用直尺引导均匀划出横线，3条/孔直线横穿过孔；转染后第二天，细胞融合率已达90％，用枪头比照直尺，尽量垂直于背后的横线在细胞层上划痕，枪头要垂直，不能倾斜；划痕后用PBS洗细胞3次，去除脱落的细胞，然后加入含有2％的FBS的1640培养基；放入5％CO2、37℃培养箱中培养；在各时间点选取同一视野进行拍照。
Transwell试验：
在24孔板中，每孔加入500μL含有10％FBS的培养基；将0.3mg/mL的FN用不含血清的1640培养基稀释后处理transwell小室(BD公司)，将细胞5×104个细胞/小室接种于transwell上室中，最终保持上室内100μL培养基；在5％CO2、37℃培养箱中培养规定时间。取出小室，用0.1％结晶紫染色，拍照后用300μL33％冰醋酸溶解膜上的结晶紫，酶标仪测定OD573nm吸光值；
Matrigel试验
在冰上用预冷的枪头吸取100μl Matrigel加入冰预冷的300μl无血清培养基中,充分混均。取上述稀释的Matrigel 25μl加入transwell板上室，覆盖整个聚碳酯膜，37℃，30min,使Matrigel聚合成胶。其余处理同Transwell实验。
结果
PQQ处理抑制细胞的运动
参见图6-1和图6-2，划痕实验表明，72h时内膜细胞能够覆盖85％的划痕区域。用30nM PQQ处理细胞显示能够部分抑制细胞迁移，但没有统计学意义(P>0.05)。而300nM处理组在24h与对照组就有一定差异，48h与72h时抑制细胞运动的效果显著(P<0.05)。3μM组的抑制作用最为明显，72h时划痕覆盖率较对照组降低了42％。300nM与3μMPQQ能够明显抑制划痕愈合(P<0.05)。
PQQ处理抑制子宫内膜基质细胞的侵袭
参见图7-1和图7-2，经Transwell/Matrigel方法检测细胞侵袭实验，相比对照，48h时，PQQ在30nM浓度抑制细胞侵袭作用不明显，而300nM的作用明确，具有统计学意义，3μM PQQ处理细胞则可以让子宫内膜基质细胞的侵袭力下降35％。300nM与3μM PQQ处理子宫内膜基质细胞可以明显抑制细胞侵袭力(P<0.05)。
实验5：PQQ抑制大鼠子宫内膜异位灶
材料与方法
大鼠子宫内膜异位症模型制作
健康清洁级雌性SD大鼠，体重200-220g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，合格证号SCXK(沪)2007-0005。大鼠皮肤常规消毒后，下腹部正中切口长约2cm，进腹后在膀胱背侧找到子宫。
游离左侧子宫，近端离左子宫角1cm处结扎，远端离卵巢1cm处结扎。将切下的子宫组织放在盛有无菌生理盐水的培养皿中，纵行剖开子宫段，剪取4mm×4mm的子宫内膜组织1块。在腹壁切口右侧从腹肌与皮下筋膜层之间打隧道，以正好能置入子宫片为宜，将子宫内膜组织块平整地置人右侧隧道底部，使内膜面紧贴腹肌，常规关腹。术后连续3天注射青霉素40万u/只，正常喂养。术后次日开始肌内注射雌二醇0.1mg·kg·d，每隔4天1次，共3次，以促进异位内膜生长。术后每周触摸包块2次，观察包块有无及大小。第21天观察到明显包块，通过游标卡尺测量，根据长径乘以短径乘以短径除以2计算包块体积，体积大于60mm3即造模成功。
实验分组
将建模成功的大鼠54只随机分成6组，第22天开始给药处理(共给药4周)。方法如下
表1大鼠实验分组表
移植灶重量测定
给药4周后，大鼠麻醉，手术分离出移植灶，称重。
结果：
造模情况
共做63只SD大鼠模型，有54例大鼠在移植处可见明显小囊肿。有7例大鼠包块未达到要求体积，考虑可能与取内膜片断时内膜面积太小或内膜与浆肌层分离不够有关。有2例大鼠死于意外。
PQQ治疗子宫膜异位症的效果
治疗8周后各实验组的异位灶体积比较：发现PQQ组、PQQ+NAC、PQQ+Res异位病灶囊肿重量明显低于对照组，其差异有显著统计学意义(P﹤0.01)，而单纯NAC，Res异位灶体积与对照组无明显差异。PQQ与NAC、Resveratro联用，效果均好于单纯PQQ组(P﹤0.01)，说明PQQ与这些抗氧化剂存在协同作用。
表2大鼠子宫内膜异位症模型治疗后移灶重量的比较
注：*表示各组与对照组进行比较，P﹤0.01，#表示PQQ组与PQQ+NAC组，PQQ组与PQQ+Res组相比较，P<0.01。
以上实验表明：
PQQ能够明显抑制子宫内膜基质细胞的增殖、细胞周期；能够明显抑制子宫内膜基质细胞的侵袭能力；PQQ处理能够剂量依赖性地抑制子宫内膜基质细胞的氧化应激状态；PQQ联合NAC使用具有明显的抑制细胞增殖的协同作用：在体外显著抑制子宫内膜异位细胞是增殖，在体内所述建议的治疗方案可显著减小子宫内膜异位损伤的尺寸，且显著减少NAC的使用剂量。因此，PQQ或者PQQ联合NAC作为药物将开辟一条新的治疗内异症方法，基本无副作用，且特别是该治疗不妨碍妊娠。
本发明采用大鼠每天每公斤体重1毫克PQQ，能够有效抑制异位病灶的增殖。这一剂量对应人体，与作为保健品销售推荐的PQQ用量相当，是完全安全的。在以往应用NAC治疗子宫内膜异位症的动物实验研究中，NAC的有效用量在每天每公斤体重1.3克，该剂量无法对应到人体使用。申请人在实验中选用的NAC剂量只有以往动物实验所用剂量的1/100，单独使用没有明显的疗效。但将PQQ与该剂量的NAC联合使用时，表现出明显的协同效应，异位灶的大小只有单纯PQQ组59％，相当于对照组的34％，在大幅度降低NAC使用剂量的同时，提高了效率接近1倍。NAC与PQQ类似，能够有效地清除组织中氧自由基，二者稳定性相差很大，还可能作用于抗氧化的不同环节，因此表现出很好的协同作用，提示PQQ联合NAC在临床应用中的良好前景。
白藜芦醇(Resveratrol)是多酚类化合物，主要来源于葡萄(红葡萄酒)、虎杖、花生、桑椹等植物，是一种很强的抗氧化剂。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，是茶多酚生物活性的主要成份，EGCG具有非常强的抗氧化活性。Ricci等人(Hum Reprod,2013Jan；28(1):178-88)报道，EGCG与白藜芦醇都能够通过抗氧化作用有效抑制EM模型小鼠的病灶。
经申请人研究和实验，PQQ联合白藜芦醇、表没食子儿茶素没食子酸酯、维生素E、维生素C或维生素d均能够显著减小子宫内膜异位损伤的尺寸。
人用剂量与剂型
PQQ剂量：
在本发明中，动物实验PQQ采用1毫克/公斤/天。该剂量是动物实验中常用剂量，对应成人约60毫克每天，如果考虑到人鼠代谢率的差异，约为成人每天10-20毫克(成人以60公斤/人计，下同)。
NAC或白藜芦醇剂量：
在本发明中，动物NAC或白藜芦醇采用的剂量为10毫克/公斤/天。该剂量对应成人600毫克/天，如果考虑到人鼠代谢率的差异，约为成人每天100-200毫克，该剂量仅为背景技术部分提及的NAC治疗人体EM试验剂量的1/10-1/20。

Claims (3)

1.吡咯喹啉醌、其衍生物和/或盐在制备用于治疗和/或预防子宮内膜异位、以及由子宮内膜异位引起的疼痛和/或不孕的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的子宫内膜异位包括腺肌症、卵巢巧克力囊肿、深部浸润型子宫内膜异位症。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的吡咯喹啉醌、其衍生物或盐由以下结构式(I)表示：
结构式(I)中，R1、R2和R3相同或不同，分别单独表示低级烷基、低级烯基、低级炔基、芳烷基、烷芳基、苯基、氢原子、钠原子或钾原子。
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