KR20120121232A - 소태나무 추출물의 제조방법 및 추출물의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 종래의 소태나무 추출물과 구별되는 새로운 효능?효과를 가지는 소태나무 추출물, 또는 종래 보다 더 효과가 우수한 소태나무 추출물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 분쇄된 소태나무 목피를 분산시킨 용액에 키위 및 파인애플을 마쇄한 용액을 첨가하여 일정기간 동안 반응시켜 제조되는 소태나무 추출물이 혈관신생억제효과 및 인터루킨-4(IL-4), 인터페론-감마(IFN-gamma; IFN-γ), NF-kB 의 생성을 저해효과를 가지며, 상기 사이토카인 생성 저해효과는 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거치지 않고 추출된 소태나무 추출물보다 저해효과가 월등히 우수하다는 것을 밝힌 것을 기초로 한다.
Description
본 발명은 소태나무 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 신규한 소태나무 추출물의 의약, 식품 및 미용 용도에 관한 것이다.
천연물 소재의 성분이 유효성분으로 포함되는 의약, 식품 또는 화장품에는 일반적으로 추출물 형태로 된 천연물이 사용된다. 추출물은 통상적으로 생약재 등의 천연물을 그대로 또는 적절하게 절단 또는 파쇄한 후, 물을 사용하여 유효성분을 침출?추출하는 열수추출법, 에탄올, 메탄올 등의 용매를 사용하는 용매추출법, 초임계이산화탄소 추출법, 증기추출법, 압착추출법, 감마선 조사 추출법, 초음파추출법 등을 단독으로 또는 병행 사용하여 제조되어 왔다(등록특허 제670612호).
최근에는 생약재를 미생물과 함께 반응시키는 단계가 포함되는 발효추출방법이 추출물 제조를 위하여 사용되기도 한다. 삼백초 추출물을 흑설탕, 효모와 함께 발효시키는 방법(등록특허 제821239호), 홍삼을 곰팡이와 함께 발효시키는 방법(등록특허 제884044호) 등이 그 예이다. 이와 같은 발효단계에서는 미생물에 포함되어 있는 효소들이 생약재에 작용하여, 본래 생약재에 포함되어 있지 않았던 새로운 성분이 생성될 수 있으며 또는 생약재에 포함된 유효성분이 더욱 효과적으로 추출될 수 있다. 따라서, 발효추출방법을 사용하면, 종래 방법을 사용하여 제조되는 생약재 추출물과 다른 효능?효과를 갖는 추출물을 제조하는 것이 가능하다.
이와 같이, 천연물 소재에 종래에 사용되어 오던 추출방법 외에 추가의 방법을 접목할 경우 종래의 추출방법에 의하여 제조되는 추출물과 다른 효능효과를 가지는 추출물의 제조가 가능하므로, 각 천연물 소재에 적합한 새로운 추출물 제조방법의 개발은 새로운 용도의 개발로까지 이어질 수 있다.
소태나무(Picrasma quassioides)는 소태나무과에 속하는 활엽교목으로, 콰시노이드(quasinoids), 콰신(quassin), 피크라스민(picrasmin), 피크라신(picrasin), 이오논(ionone), 알칼로이드(alkalroids) 등 다양한 생리활성 물질을 포함한다(중약대사전). 소태나무는 한방에서 건위제, 구충제, 소화제, 염증 치료에 사용되어 왔는데, 통상적으로 소태나무를 물로 달여 제조한 추출물을 복용하거나 외용으로 사용하여 왔다. 소태나무 추출물의 용도의 다각화를 위하여 새로운 추출물의 제조방법의 개발이 필요하다.
한편, 혈관신생(맥관형성)은 조직 또는 기관내로의 새로운 혈관의 생성을 의미하는데, 이는 정상적인 생리학적 조건하에서도 일어나지만, 비조절된(비정상적인) 혈관신생으로 인해 병리학적 손상을 일으키기도 한다. 비조절된(비정상적인) 맥관형성으로 인해 생성된 다양한 병리학적 상태는 ‘맥관형성의존질병’ 또는 ‘맥관형성관련질병’를 유발한다. 이러한 질병들로는 종양, 건선, 당뇨병성 망막증, 눈의 신맥관 질병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성염증, 혈관종 등을 포함하며, 이와 관련한 것은 등록특허 제506043호에 상세히 기재되어 있으며 본 특허발명에 상기 특허에 기재된 내용을 포함한다.
인터페론 감마는 Th1세포, NK 세포 등에 의해 생성되며, 면역반응에 관여하는 사이토카인의 일종이다. 인터페론 감마는 바이러스감염에 대한 방어기전에 참여하기도 하지만, 또 한편으로는 염증반응에서도 중요한 역할을 한다. 따라서, 인터페론감마의 저해제는 염증성 질환, 예를 들어 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)의 치료제로 사용이 가능하다(미국 공개특허공보 US2003/0012790). 또한 인터페론 감마의 저해제는 상처치료, 섬유과다증식증 치료에 사용될 수 있다(미국 공개특허공보 US 2008/0031879).
인터루킨-4(IL-4)는 Th2 세포, 비만세포 등에서 생성되며 IgE 생성을 촉진하고 면역반응 및 염증반응에 관여하는 사이토카인의 일종이다(International Immunology 2004, 16(8), p1155-1160). IL-4의 저해제는 염증질환, 아토피성 피부 염 등의 치료 효과가 있다.
아토피성 피부염은 대부분 IgE와 연관된 면역기전에 의해 발병되는데, T 세포 이상에 의한 면역반응이 관여한다는 보고가 많으며, 헬퍼 T세포 (Th cell)의 역할이 중요하다고 알려져 있다. 아토피성 피부염 병변에서 T 세포가 많이 발견되는데 이 중에서 Th2 세포에 의해 분비되는 사이토카인이 아토피 발병에 중요한 역할을 한다. Th2 세포 분비 사이토카인 뿐만 아니라 Th1 세포 분비 사이토카인인 인터페론감마도 아토피성피부염에 중요한 역할을 한다(Journal of Clinical Investigation 1999, 103(8), p1103-1111). 아토피성 피부염의 진전에 따라 면역반응이 달라지며, 급성 아토피성 피부염에는 Th2 세포가 관여하고, 만성 아토피성 피부염에는 Th1이 관여한다고 보고되었다. 즉, 초기에는 Th2에서 분비하는 IL-4와 IL-3가 중요하게 작용하는데, 가려움증이 생기면서 긁기 시작하면 Th1 세포가 증가한다(Journal of Clinical Investigation 2004, 113, pp651-657). Leung 등에 따르면, 집먼지진드기 알러겐에 의한 아토피성 피부염은 두 단계로 진전되는데, 초기 단계는 Th2세포에 의하여 IL-4가 주로 생성되며, 24-48시간 뒤에는 Th1 세포에 의하여 인터페론 감마가 생성된다(Lancet 2003, 361, p151-160). 따라서 효과적으로 아토피성 피부염을 예방, 치료 또는 개선하기 위해서는 Th1세포와 Th2 세포 모두에 영향을 미쳐 IL-4 및 인터페론감마의 생성을 억제할 수 있는 물질 또는 조성물이 효율적이다(등록특허 제954216호).
NF-kB는 염증을 일으키는 유전자 발현 기구를 작동시켜 면역반응이나 염증반응에 관여하는 tumor necrosis factor(TNF), interleukin-1(IL-1), IL-6, IL-8, GM-CSF, inducible nitric oxide synthase(iNOS), intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1), E-selectin, MHC class I, II 분자 등의 발현을 증가시키는 전사인자로 알려져 있다. 따라서 NF-kB의 억제제는 만성 및 급성 염증 질환, 아토피성 피부염 치료효과를 나타낼 수 있다(등록특허 제954216호). 또한, NF-κB의 저해제는 종양세포 증식 저해, 아폽토시스 유도효과가 있는 것으로 알려져 있다(미국 공개특허 공보 US 2006/0193784).
본 발명에서는 종래의 소태나무 추출물과 구별되는 새로운 효능?효과를 가지는 소태나무 추출물, 또는 종래 보다 더 효과가 우수한 소태나무 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 소태나무 추출물의 제조방법에 의하여 제조된 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
나아가 본 발명은 상기 신규한 소태나무 추출물의 제조방법에 의하여 제조된 추출물을 포함하는 조성물을 사용하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 소태나무 목피를 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거친 후, 통상의 추출방법을 사용하여 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 소태나무 목피를 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거친 후, 통상의 추출방법을 사용하여 제조되는 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명이 제공하는 방법에 의해 제조되는, 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거친 후 추출되는 소태나무 추출물은 신생혈관억제효과, 인터루킨-4(IL-4), 인터페론-감마(IFN-gamma; IFN-γ) 및 NF-kB 의 생성을 저해효과를 가지며, 상기 저해효과는 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거치지 않고 추출된 소태나무 추출물의 저해효과보다 월등히 우수하다.
따라서, 본 발명에 의하여 제공되는 방법에 의하여 제조되는 소태나무 추출물은 비정상적인 맥관형성을 억제하는데 효과적인 조성물, ‘맥관형성 의존 질병’또는 ‘맥관형성 관련 질병’ 예를 들어 종양, 건선, 당뇨병성 망막증, 눈의 신맥관 질병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성염증, 혈관종 등의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명이 제공하는 방법에 의해 제조되는 소태나무 추출물은 IL-4, 인터페론감마, NF-Kb의 저해를 위하여, 또는 염증성 질환, 아토피성 피부염, 염증성 질환, 염증성 장질환, 상처, 섬유과다증식증 등의 예방, 치료, 개선을 위하여 사용될 수 있다.
도1은 CAM (Chorioallantoic Membrane) 어세이 결과이다. 키위 및 파인애플 용액과 소태나무 분말 분산액의 반응시간을 0시간, 1주일로 한 후, 추출된 추출물의 혈관신생억제효과를 비교하였다.
도2는 소태나무 추출물에 의한 인터페론 감마 저해율을 나타낸 것이다.
도3은 소태나무 추출물에 의한 IL-4의 저해율을 나타낸다.
도4는 소태나무 추출물의 NF-kB 억제효과를 나타낸다.
도2는 소태나무 추출물에 의한 인터페론 감마 저해율을 나타낸 것이다.
도3은 소태나무 추출물에 의한 IL-4의 저해율을 나타낸다.
도4는 소태나무 추출물의 NF-kB 억제효과를 나타낸다.
본 발명은 종래의 소태나무 추출물과 구별되는 새로운 효능?효과를 가지는 소태나무 추출물, 또는 종래 보다 더 효과가 우수한 소태나무 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 분쇄된 소태나무 목피를 분산시킨 용액에 키위 및 파인애플을 마쇄한 용액을 첨가하여 일정기간 동안 반응시켜 제조되는 소태나무 추출물이 혈관신생억제효과 및 인터루킨-4, 인터페론-감마, NF-kB 의 생성을 저해효과를 가지며, 인터루킨-4, 인터페론-감마, NF-kB 의 생성 저해효과는 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거치지 않고 추출된 소태나무 추출물 보다 저해효과가 월등히 우수하다는 것을 밝힌 것을 기초로 한다. 키위 및 파인애플에는 단백질 분해효소 등이 다량 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 소태나무 추출물 제조 방법은 키위 및 파인애플을 마쇄한 액(A 용액)을 만드는 단계; 소태나무 목피를 분쇄하여 물에 분산시킨 액(B 용액)을 만드는 단계; 및 상기 A 용액과 B 용액을 혼합하여 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 키위 및 파인애플을 마쇄한 액을 만들 때는 물을 추가할 수 있다. 상기 A 용액을 제조할 때 사용되는 키위와 파인애플의 비율은 필요에 따라 조절이 가능하다. 예를 들어 키위: 파인애플을 중량비로 1: 0.1~10, 바람직하게는 1:0.1~1, 더욱 바람직하게는 1:0.1~0.5로 사용한다. A용액을 제조할 때 추가되는 물의 양은 적절하게 조절될 수 있으며, 예를 들어 키위 및 파인애플의 중량의 합에 대하여 0 ~ 100배를 추가할 수 있다. B용액을 제조할 때 사용하는 소태나무 목피와 물의 중량비는 필요에 따라 적절히 조절이 가능하며, 예를 들어 소태나무 목피에 대하여 1~100 배의 물을 사용할 수 있다.
상기 A 용액과 B 용액을 혼합하여 반응시키는 온도는 키위 및 파인애플에 존재하는 효소의 활성이 유지되는 범위이면 어느 온도라도 좋다. 반응시간도 적절히 조절이 가능하다. 예를 들어 1일 내지 1달, 바람직하게는 7일 동안 반응시킬 수 있다. 상기 A 용액과 B 용액을 혼합하여 반응시킨 후에는 고형물을 제거하는 단계가 더 포함될 수 있다. 반응이 완료된 용액은 농축하거나 건조하여 분말로 만들 수 있다. 고형물의 제거방법, 농축 또는 건조공정은 당업계에서 널리 사용되는 방법이면 어떤 방법이든지 사용 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 소태나무 추출물의 제조방법에 의하여 제조된 추출물 또는 상기 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명이 제공하는 방법에 의해 제조되는, 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거친 후 추출되는 소태나무 추출물은 신생혈관억제효과를 갖는다. 따라서, 본 발명에 의하여 제공되는 방법에 의하여 제조되는 소태나무 추출물은 비정상적인 맥관형성을 억제하는데 효과적인 조성물의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 제공되는 방법에 의하여 제조되는 소태나무 추출물은 ‘맥관형성 의존 질병’또는 ‘맥관형성 관련’ 질병 예를 들어 종양, 건선, 당뇨병성 망막증, 눈의 신맥관 질병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성염증, 혈관종 등의 예방, 치료, 개선를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에 의하여 제공되는 상기 소태나무 추출물은 인터루킨-4, 인터페론-감마 및 NF-kB 의 생성을 저해하며, 상기 저해효과는 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거치지 않고 추출된 소태나무 추출물의 저해효과보다 월등히 우수하다. 따라서, 본 발명이 제공하는 방법에 의해 제조되는, 키위 및 파인애플 마쇄액과 함께 일정기간 동안 반응시키는 단계를 거친 후 추출되는 소태나무 추출물은 IL-4, 인터페론감마, NF-Kb의 저해를 위하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 의하여 제공되는 소태나무 추출물은 염증성 질환, 아토피성 피부염, 염증성 질환, 염증성 장질환, 상처, 섬유과다증식증, 건선, 류마치스 관절염, 습진 등의 예방, 치료, 개선을 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 소태나무 추출물을 포함하는 조성물은 의약조성물, 화장료 조성물, 식품조성물로 이용이 가능하다. 따라서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 의약품, 의약부외품, 식품, 화장품을 발명의 범주에 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 소태나무 추출물 이외에 약제학적, 식품학적 또는 화장품학적으로 허용되는 성분을 추가로 함유할 수 있다. 예를 들어 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 안정화제, 기제, 윤활제, 보존제, 습윤제, 유화제, 현탁화제, 점도조절제, 방부제, 계면활성제, 산화방지제, 보습제, 향료, 색소 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한 종래의 아토피피부 치료제에 많이 사용되어온 세라마이드 등 보습제 또는 지질성분이나 하이드로코티손 등의 스테로이드, 레티닐팔미테이트 등의 비타민 A 유도체, 토코페폴, 기타 식물추출물 등을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구로 또는 국소에 적용할 수 있으며, 정제, 산제, 캅셀제, 과립제, 환제, 액제, 현탁화제, 연고제, 크림제, 로숀타입, 화장수타입, 팩타입 등 뿐만 아니라, 비누, 세안폼과 같은 세안료 등 여러 가지 형태로 제조할 수 있다. 또한 리포좀 형태로 만드는 것도 가능하다.
본 발명에 따른 조성물의 투여량은 이를 적용받는 사람의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 소화상태 등에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 통상적인 1회 투여량은 체중 1kg당 0.1mg 내지 100mg 으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물을 피부에 바르는 외용제의 형태로 제조하는 경우, 피부 외용제 중의 소태나무 추출물의 배합량은 전체의 0.05%~50.0 중량%, 바람직하게는 0.1~10.0 중량%로 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 의약부외품에 다양하게 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 기능성 식품에 다양하게 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품으로 복용할 수 있는 어떠한 제형으로도 적용하여 사용할 수 있으며, 그 예로 분말, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 연질캅셀제, 또는 액제 등을 포함한다. 이러한 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 육류, 차 등의 음료수, 스낵류, 과자류, 라면류, 기타면류, 캔디, 초콜릿, 아이스크림류, 껌, 비타민 복합체, 건강기능식품류 등이 있다.
본 발명은 상기 신규한 소태나무 추출물의 제조방법에 의하여 제조된 추출물을 포함하는 조성물을 사용하는 방법도 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 등을 통하여 보다 구체적으로 설명하나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 소태나무 추출물의 제조
키위 100g과 물 1000g, 그리고 파인애플 20g을 준비하여 같이 마쇄하여 용액을 만들었다 (이를 A 용액이라고 칭한다). 소태나무 목피 파쇄가루 100g에 물 2000g을 넣고 잘 분산시켰다(이를 B 용액이라고 칭한다.).
A 용액과 B용액을 동량으로 혼합하였다. 혼합하여 제조된 샘플들 중 일부는 바로 추출공정을 실시하였다. 즉 70oC에서 3시간 동안 열수추출을 하였다.원심분리후 필터링해서(0.2um) 실험을 위한 시료로 사용하였다. 이 추출물을 ‘시료 1’이라 한다. A용액과 B용액을 동량 혼합한 샘플들 중 일부는 냉장고(4oC)에서 1주일간 두어 반응시키고, 70oC에서 3시간 동안 열수추출을 하여 추출공정을 실시하였다. 원심분리후 필터링해서(0.2um) 실험을 위한 시료로 사용하였다. 이 추출물을 ‘시료 2’이라 한다.
실시예
2 :
CAM
(
chorioallantoic
membrane
)
assay
소태나무 추출물의 신생혈관의 생성 억제능을 관찰하기 위하여, 산란한 지 1일 내의 유정란을 구입하여, 3일 후에 계란 흰자를 5mL을 제거하여 계란 윗부분을 열 수 있도록 만들었다. 닭의 배아 주변을 둘러싸고 있는 장뇨막(CAM chorioallantoic membrane) 위에, 소태나무 추출물(시료 A또는 시료 B)을 0.01 mL 점적하고 건조시킨 coverslip을 덮었다. 3일 후 혈관신생 정도를 현미경으로 관찰하였다.
약물을 점적하지 않은 coverslip을 CAM 위에 올려 3일 후 관찰하면 정상적인 혈관 형태를 관찰할 수 있었다. 키위 및 파인애플 용액과 소태나무 분말 분산액의 반응시간을 0시간, 1주일로 한 후, 추출된 추출물의 혈관신생억제효과를 비교하였다. 키위 및 파인애플용액과 반응시키지 않은 소태나무 추출물인 ‘시료 1’을 점적한 경우 여전히 정상적인 혈관형성과 유사한 혈관형성이 관찰되었으나, 상기 반응공정을 실시하였던 소태나무 추출물인 ‘시료 2’를 점적한 경우 혈관형성이 억제되었다(도 1).
실시예
3: 사이토카인 분석을 위한 세포배양액의 제조
마우스 비장세포(mouse spleen cell)는 다음과 같이 제조하였다. 마우스를 경추탈골 시킨 후 알코올로 소독하여 복부를 절개한 후 비장을 무균적으로 채취하여 항생제가 첨가된 RPMI-complete media에 넣고 냉장보존하였다. 1개의 비장(spleen)당 약 2ml의 동물세포 배지(RPMI media)를 넣고 비장을 완전히 분쇄한 후, 0.84% 암모니움 클로라이드 용액을 10초간 처리하여 적혈구 세포를 제거하고, 배지로 적혈구 용혈 반응정지후 원심분리후 가라앉은 세포를 채취하였다. 얻은 세포분획을 하루동안 배양 후 실험에 사용하였다.
피토헤마글루티닌(Phytohemagglutinin; PHA) Stock Solution 은 살균된 인산완충용액 PBS 1 ml 당 PHA 0.5mg을 넣고 용해하여 제조하였다. PMA Stock Solution 은 DMSO 1 mL당 PMA 100 ug를 넣고 용해하여 제조하였다.
목단피 추출물은 목단피 100g을 물 2000g에 넣고 70oC에서 3시간 동안 열수추출을 하고, 원심 분리 후 여과하여 제조하였으며, 이를 stock solution으로 사용하였다. 소태나무 추출물의 stock solution은 실시예1의 방법으로 제조한 시료원액을 사용하였다.
2.5 ml 의 Jurkat cell culture, 마우스 비장세포, EL-4 세포주 (1 x 106 cells/ml, 1 x 107 cells/ml, 5 x 106 cells/ml) 와 2.5 ml 의 배지(RPMI 1640 + 10% fetal calf serum containing 10 ml/L penicillin-streptomycin) 을 25T flask에 넣고 배양하였다. 상기 세포배양액 150 ul를 96웰에 분주한 후, PHA stock solution을 15 ul 씩 첨가하고 동시에 소태나무 추출물 stock solution을 15 ul 씩 첨가하였다. 18 시간 배양 후 상등액을 원심분리한 후에 ELISA법을 이용하여 당일날 사이토카인을 분석하였다.
시료에 의한 사이토카인의 억제율 계산 방법은 다음과 같다.
억제율 = {1-(시료처리군의 사이토카인 생성량 / 양성대조군의 사이토카인 생성량)} x 100
실시예
4: 인터페론-감마
어세이
소태나무 추출물의 인터페론-감마 활성 저해효과를 측정하기 위하여 ELISA 방법을 사용하였다. 바이오소스(BIOSOURCE)사의 IFN-γ immunoassay kit를 사용하였다. 96-웰플레이트의 각 웰을 IFN-γ의 포획항체로 코팅하였다. 이후 세척하고, 적절히 희석한 세포배양상등액 100 ul 및 50ul의Incubation Buffer를 첨가하고, 50 ul의 biotinylated detection antibody (Biotin Conjugate) solution을 넣고 2시간 상온에 방치하였다. 완전히 용액을 제거하고 4번 세척한 후, 100 ul의 Streptavidin-HRP Working Solution 을 넣고 30분간 상온에 방치하고 완전히 용액을 제거하고 세척하였다. 100 ul의 Stabilized Chromogen을 넣고 30분 상온방치 후, 100 의 Stop Solution을 넣고 450 nm 에서 데이터 값을 읽었다.
도 2는 생약재 추출물의 IFN-gamma 저해율을 나타낸다. 0.56 및 0.14 는 각각 세포배양액에 시료원액이 0.56%(V/V), 0.14%(V/V) 들어갔음을 의미한다. 음성대조군은 유도원을 처리하지 않은 군이고, 양성대조군은 유도원을 처리한 경우이다.
키위 및 파인애플 용액과 소태나무 분말 분산액의 반응시간이 0시간인 경우의 추출물(시료 1)을 0.56%(V/V) 및 0.14%(V/V)로 처리하였을 때, 각각 67.76%, 63.19%의 저해율을 보인 반면, 반응시간을 1주일로 한 경우(시료 2)에는 위와 같은 농도로 처리하였을 때 각각 90.14%, 85.12%의 저해율을 보여 키위 및 파인애플 용액과의 반응으로 인해 인터페론 감마의 저해효과가 증가된 것을 확인하였다. 이는 항염증제로 상용되고 있는 목단피(보탄피 추출액)의 경우 0.56%(V/V) 및 0.14%(V/V) 처리할 때 보인 각각 84.36%, 75.74%의 저해율 보다도 높은 값이었다.
실시예
5: 인터루킨-4
어세이
실시예 3에 의하여 제조된 세포배양물에서 인터루킨-4(IL-4) 활성을 측정하기 위하여 ELISA 방법을 사용하였다. BIOSOURCE사의 immunoassay kit을 사용하였으며, WHO reference preparation 86/504 (NIBSC, Hertfordshire, UK, EN6 3QG)를 준수하였다.
도 3은 생약재 추출물의 인터루킨-4 저해율을 나타낸다. 0.56 및 0.14 는 각각 세포배양액에 시료원액이 0.56%(V/V), 0.14%(V/V) 들어갔음을 의미한다. 음성대조군은 유도원을 처리하지 않은 군이고, 양성대조군은 유도원을 처리한 경우이다.
키위 및 파인애플 용액과 소태나무 분말 분산액의 반응시간이 0시간인 경우의 추출물(시료 1)을 0.56%(V/V) 및 0.14%(V/V)로 처리하였을 때, 각각 33.176%, 25.98%의 저해율을 보인 반면, 반응시간을 1주일로 한 경우(시료 2)에는 위와 동일한 농도에서 각각 60.59%, 42.19%의 저해율을 보여 키위 및 파인애플 용액과의 반응으로 인해 인터루킨-4의 저해효과가 증가된 것을 확인하였다. 이는 목단피(보탄피 추출액)의 경우 0.56%(V/V) 및 0.14%(V/V) 처리할 때 보인 각각 32.05%, 21.66%의 저해율 보다도 높은 값이었다.
실시예
6:
NF
-
kB
어세이
NF-kB 분석을 위하여 등록특허공보 제 506043호에 기재된 Luciferase (루시퍼레이즈)를 사용하는 방법을 실시하였다. Panomics사의 NIH3T3 (Rev A 060820 Stable Cell Line: NIH3T3/NFkB-luc 1); Stable Cell Line: NIH3T3/NFkB-luc 을 사용하였다. 100-mm culture dish나 T-75 flask에 15mL의 미리 데워진 Growth 배지를 넣고, 세포주를 미리 준비된 배양접시에 넣어 세포주를 잘 분산시킨다. 배양접시를 습기가 공급되는 37oC (5% CO2) 배양기에 넣고, 2~3일마다 배지를 교환한다. 90% confluency에 도달하면 동결 보존할 Stock를 만들고 계속 배양한다. 세포는 계대배양법에 따라 배양하여 세포주를 보존한다.
NF-kB 측정은 다음과 같이 하였다. 세포를 Initial Growth Media에 5 x 10 5 / well 수준으로 12-well plate에 분주하고, 세포주가 바닥에 부착하도록 습기가 공급되는 5% CO2(37o C)에 넣고 24시간동안 배양한다. Serum이 함유되지 않은 새로운 배지로 교환한다. 약 8시간 동안 5% CO2(37 o C) 인큐베이터에 배양한 후, 배지를 제거하고 100 ul lysis buffer를 각각의 well에 넣어 Luciferase activity를 측정한다. 측정법은 Promega 사의 매뉴얼을 참고하여 실험한다. (Promega P/N E1500)
96-Well 을 이용한 NF-kB 정량은 log-growth phase 상태에 있는 세포주를 트립신으로 처리한 후 5 x 104 cells / 100 ul 수준으로 맞춘후 96-well plate에 넣으며, 이때 적절히 희석된 시료 15 ul도 같이 넣는다. 37 oC로 맞춰진 5% CO2 배양기에 밤새 배양하고, NF-kB를 유도하는 약재(TNF-alpha)를 15 ul volume 수준으로 처리하고, 배지를 제거한 후 50 ul lysis buffer (Promega P/N E1500)를 각각의 well에 넣고 처리한다. Lysis buffer넣은 상태로 2 분동안 상온에서 처리하고, Lysis Buffer가 충분히 녹여냈는지 확인한다. 0 oC 에 급속히 얼린 후 상온에서 녹여내고 2~3회 용액을 섞어준다. 20 ul 의 각각의 용해물(lysate)을 새로운 96-well에 옮기고, 20 ul의 luciferase substrate를 각각의 well에 넣고 2~3회 섞어 준 후, Luminometer를 이용하여 측정하였다.
도4는 생약추출물의 NF-kB 생성량에 대한 효과를 나타낸다. Y축의 fold는 유도원을 처리하지 않은 음성대조군의 NF-kB 생성량을 1 fold으로 한다. NF-kB의 정량 결과, 유도원에 의한 유도율은 19.44 배이었으며, 키위 및 파인애플 용액과 소태나무 분말 분산액의 반응시간이 0시간인 경우의 추출물(시료 1)을 0.56%(V/V) 및 0.28%(V/V) 처리하였을 때, 각각 4.09배, 7.74배이었으며, 반응시간을 1주일로 한 경우(시료 2)에는 위와 동일한 농도에서 각각 1.41배, 3.24배로 되어, 키위 및 파인애플 용액과의 반응으로 인해 NF-kB 생성량이 억제되는 것을 확인하였다. 이는 목단피(보탄피 추출액)의 경우 0.56%(V/V) 및 0.28%(V/V) 처리할 각각 5.49배, 7.12배의 생성량을 보인 것과 비교하여 생성 억제효과가 더 큰 것이다.
본 발명에 의하여 제조된 소태나무 추출물을 사용하여 다음 제품을 제조하였으며, 이는 실시가능한 형태의 일예이며, 이로서 발명이 제한되는 것은 아니다.
제조예
: 크림
1) 본 발명의 소태나무 추출물 (시료 2) 1.0 중량% / 2) 스테아린산 2.0 중량% / 3) 스테아릴알코올 3.0 중량% / 4) 1,3 부틸렌글리콜 5.0 중량% / 5) 모노스테아린산글리콜 4.0 중량% / 6) 수산화칼륨 0.1 중량% / 7) 정제수 77.9 중량% / 8) 레시틴 5.0 중량% / 9) 콜레스테롤 1.0 중량%
유성성분과 수성성분을 75oC로 각각 가열한 다음 크림제조용 혼합기에서 균질화용 믹서를 이용하여 유화시킨 후, 탈기, 여과, 냉각하여 크림을 제조하였다.
제조예
: 화장수
1) 본 발명의 소태나무 추출물 (시료 2) 0.1 중량% / 2) 1,3-부틸렌글리콜 8.0 중량% / 3) 글리세린 2.0 중량% / 4) 크산탄검 0.02 중량% / 5) 구연산 0.01 중량% / 6) 구연산나트륨 0.1 중량% / 7) 에탄올 5.0 중량% / 8) 파라옥시안식향산메틸 0.1 중량% / 9) 폴리옥시에틸렌경화피마자유(40E.O.) 0.1 중량% / 10) 향료 0.1 중량% / 11) 정제수 84.47 중량%
성분 1-6 및 11, 성분 7-10를 각각 균일하게 용해하여 양자를 혼합하고 여과하여 제조하였다.
제조예
: 연고
1) 본 발명의 소태나무 추출물 (시료 2) 1.0 중량% / 2) 폴리옥시에틸렌세틸에테르 (30 E.O.) 2.0 중량% / 3) 모노스테아린산글리세린 10.0 중량% / 4) 유동파라핀 5.0 중량% / 5) 세탄올 6.0 중량% / 6) 프로필렌글리콜 10.0 중량% / 7) 파라옥시안식향산메틸 0.1 중량% / 8) 정제수 64.9 중량%
성분 2-5를 가열용해하여 혼합하고, 70oC를 유지하여 유상으로 만든다. 성분1 및 6-7를 가열용해하여 혼합하고, 75oC를 유지하여 수상으로 만든다. 유상과 수상을 합하여 유화시키고 30oC까지 냉각하여 제품화한다.
제조예
: 목욕용제
1) 본 발명의 소태나무 추출물 (시료 2) 5.0 중량% / 2) 탄산수소나트륨 50.0 중량% / 3) 황색 202호 0.05 중량% / 4) 향료 0.25 중량% / 5) 무수황산나트륨 44.7 중량%
1-5 성분을 균일하게 혼합한다.
제조예
: 음료
1) 본 발명의 소태나무 추출물 (시료 2) 1.0 중량% / 2) 구연산 5.0 중량% / 3) 향료 0.1 중량%
성분1-3에 물을 혼합하여 전체 100 중량%으로 한다.
제조예
: 정제
1) 본 발명의 소태나무 추출물(시료 2) 2.5 중량% / 2) 정제백당 20.0 중량% / 3) 카르복시메틸셀룰로즈 27.5 중량% / 4) 미세결정셀룰로즈 35.0 중량% / 5) 폴리비닐피롤리돈 5.0 중량% / 6) 탈크 10.0 중량%
성분 1-4를 혼합한 후, 성분5의 수용액을 결합제로서 첨가하여 통상의 방법으로 과립화한다. 여기에 활택제로서 성분6를 배합한 후, 정제로 타정한다.
Claims (7)
- 키위 및 파인애플을 마쇄한 액(A 용액)을 만드는 단계;
소태나무 목피를 분쇄하여 물에 분산시킨 액(B 용액)을 만드는 단계; 및
상기 A 용액과 B 용액을 혼합하여 반응시키는 단계를 포함하는 소태나무 추출물의 제조 방법. - 제1항에 있어서, A용액과 B용액을 반응시킨 후, 열수 추출을 하는 단계를 더 포함하는 소태나무 추출물의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항의 방법으로 제조된 소태나무 추출물.
- 제3항의 소태나무 추출물을 포함하는 비정상적인 맥관형성을 억제하는데 효과적인 의약 조성물.
- 제3항의 소태나무 추출물을 포함하는, 종양, 건선, 당뇨병성 망막증, 눈의 신맥관 질병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성염증, 혈관종, 아토피성 피부염, 염증성 질환, 염증성 장질환, 상처, 섬유과다증식증 및 습진으로 구성된 군으로부터 선택된 질병의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물.
- 제3항의 소태나무 추출물을 포함하는, 종양, 건선, 당뇨병성 망막증, 눈의 신맥관 질병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성염증, 혈관종, 아토피성 피부염, 염증성 질환, 염증성 장질환, 상처, 섬유과다증식증 및 습진 으로 구성된 군으로부터 선택된 질병의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
- 제3항의 소태나무 추출물을 포함하는, 피부염증 또는 아토피성 피부염의 완화 또는 개선을 위한 화장료 조성물.
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