TWI719781B - 草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途，其中該草本植物為秋葵；本發明之發酵製程能提升該草本植物發酵物中總多糖的含量，並有效提高該草本植物發酵物的澱粉酶抑制率及葡萄糖苷酶抑制率，而可有效地抑制澱粉及葡萄糖苷的分解與吸收，本發明之該草本植物發酵物亦能有效減低個體飯後血糖值，且能夠有效地降低個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及平均軀幹體脂率，而能夠有效地應用於調控血糖與血脂及預防肥胖的用途：其中，該草本植物發酵物係將由一草本植物以酵母菌及乳酸菌同時進行發酵而獲得。

Description

草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途

本發明係關於一種草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途，尤其是一種秋葵發酵物的製備方法及其用於製備預防肥胖之組合物的用途，特別是一種將秋葵萃取物以本發明之發酵製程所製備出的秋葵發酵物，及其用於預防肥胖的用途。

近年來全球肥胖的發病率已經逐漸的增加，世界衛生組織(World Health Organization,WHO)更以「傳染病」形容快速蔓延的肥胖，並稱其為「全球肥胖症」(Globesity)，根據2014年世界衛生組織的估計，全球約有39%的人口超重(約19億人)，更有13%的人口肥胖(約6億人)。而隨著飲食習慣改變及生活品質改善，台灣的肥胖盛行率亦逐年上升，依據衛生福利部國民健康署所公布之國民營養健康狀況變遷調查，其中成人過重或肥胖盛行率高達百分之四十三左右，而男性與女性比率分別為百分之四十九及百分之四十，換句話說台灣人中平均每兩個男性就有一個過重或肥胖，平均女性則兩至三個就有一個過重或肥胖，且其中就有20萬人以上已達病態型肥胖的標準，而須以手術進行治療。

肥胖的個體會使多種健康問題的風險增加，並可能導致多種併發症的發生，包括高血壓、高血脂、心血管疾病、睡眠呼吸中止、狹心症、退化性關節炎、尿酸過高骨關節炎、第二型糖尿病、及癌症等疾病。其中，由於體內脂肪細胞過多，會分泌阻礙胰島素作用的有害物質，使得胰島素功能受阻， 便無法有效控制上升的血糖，因而導致高血糖的症狀，若身體長期處於高血糖的情況，將使胰臟疲於分泌更多的胰島素來降低血糖，一旦胰臟超過負荷便會發展成第二型糖尿病。另外，血脂係指血液中的脂肪，主要包括膽固醇及三酸甘油酯，當血液中流通之膽固醇或三酸甘油酯之濃度高於正常值時，稱為高血脂症；而膽固醇或三酸甘油酯值過高，或高密度脂蛋白濃度過低時，又稱為血脂異常。高血脂症除會導致心臟疾病之外，也與腦中風、高血壓、糖尿病、腎病等慢性疾病息息相關。

因此，肥胖會降低生活質量並可能導致過早的死亡，因此病態性肥胖病患的平均壽命比起正常體重者少了許多。雖然，基因可能參與肥胖的發展，但肥胖流行病主要歸因於高熱量飲食和久坐的生活方式。因此，生活方式的改變可以預防肥胖及其並發症。

雖然低卡路里飲食和定期運動能夠用於減輕體重和治療肥胖，但這些方法難以實施且其功效受到限制，主要是因為維持體內能量儲存的適應性生理機制導致。另外，有部分藥物已被批准用於長期肥胖症治療(例如奧利司他、芬特明、或托吡酯)，然而該些藥物常造成嚴重的副作用，因而限制了治療功效及患者依從性；再者，減肥手術能夠大幅的造成體重減輕，但這種干預式的手術並不適合所有超重的人；基於以上該些原因，研究安全且有效的方式減少體重及脂肪積累確實有其需求性。

綜上所述，因應現代人因生活及飲食習慣改變所面臨的肥胖及因肥胖造成之整體健康問題，且基於現代人生活水平提高且對於保健概念提高，研發一種能有效地控制個體血糖及血脂，以減緩肥胖所導致的併發症，及從根本減少導致肥胖之過度攝入之養分的分解與吸收，以減少脂肪的形成且減少肥胖機會之有效成分組成的組合物，著實有其必要性。

緣此，本發明之一目的在提供一種草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途，其中該草本植物發酵物為一秋葵(Abelmoschus esculentus)發酵物，且該秋葵發酵物係調控一個體之血糖及/或血脂。

本發明之又一目的在提供一種草本植物發酵物，其中該草本植物發酵物為一秋葵發酵物，其係將一秋葵經由一溶劑萃取所得之秋葵萃取物，再將該秋葵萃取物經由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)同時進行發酵而獲得。

本發明之另一目的在提供一種草本植物發酵物之製備方法，其中該草本植物發酵物為一秋葵發酵物，係包含：將一秋葵經由一溶劑萃取所得之秋葵萃取物，再將該秋葵萃取物經由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸菌(Lactobacillus plantarum)同時進行發酵而獲得。

在本發明之一實施例中，該秋葵發酵物係抑制該個體之澱粉及/或葡萄糖的吸收；且該秋葵發酵物係抑制該個體之澱粉酶的活性及/或抑制一葡萄糖苷酶的活性。

在本發明之又一實施例中，該秋葵發酵物係提升其中總多糖含量。

在本發明之又一實施例中，該秋葵發酵物的濃度為至少5%(v/v)。

在本發明之又一實施例中，該秋葵發酵物係降低該個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及/或平均軀幹體脂率。

在本發明之另一實施例中，該秋葵發酵物係將一秋葵經由一溶劑萃取所得之秋葵萃取物，再將該秋葵萃取物經由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)同時進行發酵而獲得；該秋葵萃取物係以水為溶劑萃取該秋葵所獲得；該秋葵與水的重量比係為1-3：5-29；該酵母菌之添加量為0.01-0.5%(v/v)及該乳酸菌之添加量0.01-0.25%(v/v)；且該發酵的時間為1-7天。

本發明將秋葵水萃取物以酵母菌及乳酸菌同時進行發酵所得之秋葵發酵物，能藉由該微生物發酵製程顯著提高本發明秋葵發酵物中總多糖的含量，能使本發明之秋葵發酵物能更加有效的應用於調節血糖及血脂之用途；且本發明之發酵方法可有效提高本發明秋葵發酵物的澱粉酶以及葡萄糖苷酶的抑制率，使得本發明之秋葵發酵物可有效地抑制澱粉以及葡萄糖苷的分解，並可從源頭阻斷澱粉以及葡萄糖的分解，以達到抑制澱粉以及葡萄糖吸收的功效，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效；本發明之秋葵發酵物亦能有效減低個體飯後血糖值，能夠有效調控血糖，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效；且本發明之秋葵發酵物還可有效地降低個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及平均軀幹體脂率，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。因此，本發明之秋葵發酵物可用於製備調控血糖與血脂及/或預防肥胖之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、一保養品、或一食品，可藉由口服、塗抹等方式給予一個體。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1係為本發明之一實施例的秋葵發酵物提升總多糖之功效的長條圖。

圖2係為本發明之一實施例的秋葵發酵物提升澱粉酶抑制率之功效的長條圖。

圖3係為本發明之一實施例的秋葵發酵物提升葡萄糖苷酶抑制率之功效的長條圖。

圖4 係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體飯後血糖值之功效的折線圖。

圖5係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體的體重之功效的長條圖。** p<0.01。

圖6係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體的BMI值之功效的長條圖。** p<0.01。

圖7係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體的腰圍之功效的長條圖。

圖8係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體的內臟脂肪之功效的長條圖。* p<0.05。

圖9係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體的平均全身體脂率之功效的長條圖。*** p<0.001。

圖10係為本發明之一實施例的秋葵發酵物降低一個體的平均軀幹體脂率之功效的長條圖。** p<0.01。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。

秋葵(Abelmoschus esculentus)為錦葵科(Malvaceae)秋葵屬(Abelmoschus)之一年或多年生草本植物，又稱為黃蜀葵、角豆、毛茄、阿苹田、倭克拉、歐克拉、越南芝麻、羊角豆等別名。原產於非洲東北部阿比西尼、埃及及加勒比海一帶或熱帶亞洲，並於1901年引進台灣，產地分布在彰化、雲林、嘉義等縣境內，每年四到九月是盛產期。秋葵植株為直立性，高約一公尺，全株被有絨毛，莖部為木質化，花為完全花且呈現淡黃色，花謝後三至四天左右 便可採收嫩果，秋葵的果實為蒴果，長約十公分，細長似羊角或辣椒，果皮薄且呈現革質，先端尖細，果色從淡綠至深綠色，亦有紫紅色者。秋葵果實含有特殊黏滑物質，更具有特殊香氣或風味。秋葵果實可供食用，已知具有改善消化不良及消水腫之功效。

如本文中所使用的，用語「秋葵發酵物」意為秋葵與溶劑以1-3：5-29的重量比混合後經一特定時間與溫度萃取而得之秋葵萃取物，再以酵母菌及乳酸菌同時進行一發酵而獲得，其中該酵母菌之添加量為0.01-0.5%(v/v)；該乳酸菌之添加量為0.01-0.25%(v/v)。

本文所述之「有效濃度」係表示能有效提高澱粉酶的抑制率、提供葡萄糖苷酶的抑制率、減低個體飯後血糖值、並有效降低個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及平均軀幹體脂率所需本發明之秋葵發酵物的濃度。有效濃度依所作用的對象而可能不同，但可藉由例如劑量遞增試驗(dose escalation)以實驗決定其有效濃度。

依據本發明，有關萃取的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，有關微生物發酵反應的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液 (buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石 油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum，)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普^®974P(carbopol^®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油 (sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

如本文中所使用的，用語「酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」以及「乳酸菌(Lactobacillus plantarum)」分別意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的啤酒酵母菌以及胚芽乳酸菌(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的啤酒酵母菌以及胚芽乳酸菌菌株。

本發明提供一種草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途，本發明之秋葵發酵物是將秋葵與溶劑以1-3：5-29(w/w)比例經一特定時間與溫度萃取而得之秋葵萃取物，再以酵母菌及乳酸菌同時進行發酵而獲得。本發明之發酵步驟能有效提升秋葵中的總多糖含量，而本發明之秋葵發酵物可有效提高澱粉酶的抑制率、提供葡萄糖苷酶的抑制率、減低個體飯後血糖值、並有效降低個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及平均軀幹體脂率而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

同時，本發明用於預防肥胖之組合物，亦可包含一有效量之秋葵發酵物及一醫藥上可接受之載體，該組合物係一醫藥品、一保養品、或一食品。

以下將詳細說明本發明秋葵發酵物之詳細製備方法、本發明發酵方法提升該秋葵發酵物中總多糖之功效的測試、本發明發酵方法提升該秋葵發酵物於澱粉酶抑制率之功效的測試、本發明發酵方法提升該秋葵發酵物於葡萄糖苷酶抑制率之功效的測試、本發明之秋葵發酵物減低個體飯後血糖值之功效的測試、及本發明之秋葵發酵物降低個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及平均軀幹體脂率之功效的測試，以證實本發明之秋葵發酵物具有調控血糖與血脂之功效，而能夠有效地應用於預防肥胖之用途。

實施例1 本發明之秋葵發酵物的製備方法

在本發明一實施例中，將台灣產的秋葵與水、醇、或醇水混合物之萃取溶劑以1-3：5-29(w/w)之比例均勻混合，萃取溶劑較佳為水，並於50-100℃下同時滅菌萃取0.5-3小時後，即獲得一秋葵萃取物，在本發明一較佳實施例中，萃取溶劑為水而得到一秋葵水萃取物，再將該秋葵萃取物冷卻至室溫供後續發酵使用。接著，於該秋葵萃取物中同時植入0.01-0.5%(w/w)之酵母菌(Saccharomyces cerevisiae，購買於生物資源保存與研究中心，台灣，編號為BCRC20271)、及0.01-0.25%(w/w)之乳酸菌(Lactobacillus plantarum，購買於生物資源保存與研究中心，台灣，編號為BCRC910760)，於25-35℃下進行發酵 1-7天，實際時間視發酵狀態而異。最後在不移除此該二種菌之情況下，使用設定的糖度範圍2-4°、pH<4、酒精>5%等規格，如檢驗符合該規格，則判定發酵完成並得到粗發酵液。接著，將該粗發酵液於45-70℃進行減壓濃縮，並以200-400mesh的網篩進行過濾，再添加40-70%異麥芽寡糖調整規格後，於95-105℃下加熱70-90分鐘進行滅菌，即得到本發明之秋葵發酵物。

實施例2 本發明之秋葵發酵物提升總多糖含量之效果

本發明之一實施例為進行本發明之發酵方法提升秋葵發酵物中總多糖含量之功效的測試實驗，使用苯酚-硫酸法(Phenol-sulfuric acid assay)來定量樣品中總多糖的濃度，其中當糖類遇到強酸時，結構式上的羥基會與酚結合，並產生橘黃色液體，因此可用比色法(特別是樣品於490nm之吸光值)檢測其中之總多糖的濃度。首先，精密秤取10mg之D-葡萄糖(D-Glucose，購自J.T.Baker，美國，編號為1916-01)置於10mL之容量瓶中，再加入ddH₂O至總體積達10mL，並完成D-葡萄糖之標準品(D-Glucose stock,1mg/mL)，接著將上述標準品以表一之配方進行系列稀釋，以dd H₂O稀釋為0μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、及200μg/mL之D-Glucose。另外，取1.25g之Phenol(購自Merck，德國，編號1.00206.0250)於容量瓶中，再加入ddH₂O至總體積達25mL，以完成5% Phenol的作用溶液。

接著繪製標準溶液之迴歸曲線，取各濃度之標準溶液100μL於玻璃試管中，分別加入500μL之5% Phenol溶液，並緩慢地加入2.5mL硫酸溶液(95.5%之H₂SO4，購自Showa，日本，編號1970-5250)於各試管中，以Vortex混 合均勻後靜置20分鐘，接著取200μL各組混合液於96孔培養盤中，測量於490nm之吸光值，以繪製標準溶液之迴歸曲線公式。接著，分別取100μL之秋葵水萃取物(參見實施例1)、及本發明之秋葵發酵物於玻璃試管中，分別加入500μL之5% Phenol溶液，並緩慢地加入2.5mL硫酸溶液於各試管中，以Vortex混合均勻後靜置20分鐘，接著取200μL各組混合液於96孔培養盤中，測量於490nm之吸光值，並以上述之標準溶液的迴歸曲線公式，以內差法算出濃度後再回乘稀釋倍數以取得原秋葵水萃取物及本發明之秋葵發酵物中總多糖之濃度。

本發明之秋葵發酵物中總多糖含量上升之結果如圖1所示。秋葵水萃取物的總多糖含量為3135ppm，而本發明之秋葵發酵物的總多糖含量則為3738ppm，為未經發酵之秋葵水萃取物的1.2倍。此結果顯示本發明之發酵步驟能有效提升秋葵中的總多糖含量，且能使本發明之秋葵發酵物能更加有效的應用於調節血糖及血脂之用途。

實施例3 本發明之秋葵發酵物抑制澱粉酶之功效

本發明之一實施例為進行本發明之發酵方法提升秋葵發酵物抑制澱粉酶(Amylase)之功效的測試實驗，因此利用澱粉酶會將澱粉水解產生還原糖(例如葡萄糖、麥芽糖等)的特性，其中該些還原糖具有醛基(-CHO)或酮基(-C=O)之官能基，因此具有還原性，而在鹼性溶液下可將3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitr osalicylic acid,DNS)還原成3-氨基-5-硝基水楊酸(3-amino-5-nitrosa licylic acid)，而3-氨基-5-硝基水楊酸可吸收540nm波長的光，且吸光值與3-氨基-5-硝基水楊酸的濃度成正比，因此可用此原理以測定待測物中澱粉酶的相對活性或相對含量。

首先，先配置以下溶液：0.02M的磷酸鈉緩衝液(Sodium phosphate buffer，pH為6.9，且含有6mM的氯化鈉(NaCl)，以下簡稱Pi緩衝 溶液)，為溶於500mL水(H₂O)的0.7356g的磷酸氫鈉(Sodium hydrogen phosphate,Na₂HPO₄，購自J.T.Baker，美國，編號3828-01)、0.5492g的磷酸二氫鈉(Sodium dihydrogen phosphate,NaH₂PO₄，購自Sigma，美國，編號04270)、及1.7532g的氯化鈉所配製而成；2N的氫氧化鈉(Sodium hydroxide,NaOH，購自Macron，美國，編號7708-10)溶液，為溶於100mL水中的8g的氫氧化鈉所配製而成；將1g的3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，購自Sigma，美國，編號D0550)加入50mL去離子水中，並緩慢地加入30g的酒石酸鉀鈉(Sodium potassium tartrate tetrahydrate，購自Sigma，美國，編號32312)，再緩慢地加入20mL的2N氫氧化鈉，最後以去離子水定量至100mL，即為二硝基水楊酸顯色試劑(Dinitrosalicylic acid color reagent)，此試劑為本反應的終止劑，其保存期限為兩周；秤取1g的澱粉(Starch，購自Sigma，美國，編號S9765)溶於100mL的Pi緩衝溶液中，並緩慢加熱使之完全溶解後，降至室溫再以H₂O定量至100mL，即為1%的澱粉溶液，儲存於4℃，使用前則至少要置於室溫下4-5分鐘回溫；秤取0.0096g的α-澱粉酶(α-amylase，購自sigma，美國，編號A3176，保存於4℃)，並以25mL的Pi緩衝溶液進行溶解，即為5units/mL的α-澱粉酶溶液，儲存於4℃可存放2-3天。

以下列實驗組作為第10分鐘的最終組別：首先，取出新的微量試管分別加入200μL之經相同倍率稀釋的秋葵水萃取物(參見實施例1)、及本發明之秋葵發酵物，其中每組進行三重複。接著，分別於每一個試管中加入200μL之溶於Pi緩衝溶液之5units/mL的α-澱粉酶溶液，再以震盪儀(Vortex)將溶液混合均勻，並於25℃下作用10分鐘後，分別於每個試管中加入200μL之1%澱粉溶液，再以震盪儀將溶液混合均勻，並於25℃下作用10分鐘後，於每個試管中加入400μL之反應終止劑，即二硝基水楊酸顯色試劑，再以震盪儀將 溶液混合均勻，並於沸水中作用5分鐘後將其冷卻至室溫後，再以適當的水稀釋至可測定吸光值的範圍，例如150μL之反應後的溶液加上850μL之H₂O。最後，分別取200μL各個稀釋後的反應溶液至96孔培養盤中，測量其於540nm之吸光值。其中，以加入200μL之Pi緩衝溶液的組別做為控制組。

以下列實驗組作為第0分鐘的起始組別：首先，取出新的微量試管分別加入200μL之經相同稀釋倍率的秋葵水萃取物(參見實施例1)、及本發明之秋葵發酵物，並分別於每一個試管中加入200μL之溶於Pi緩衝溶液之5units/mL的α-澱粉酶溶液，再以震盪儀將溶液混合均勻，並於25℃下作用10分鐘後，為了避免α-澱粉酶繼續反應，需先於每個試管中加入400μL之反應終止劑，並以震盪儀將溶液混合均勻後，於沸水中作用5分鐘後將其冷卻至室溫後，再分別於每個試管中加入200μL之1%澱粉溶液，再以震盪儀將溶液混合均勻，並於25℃下作用10分鐘；其中，因為時間為關鍵因素，所以加入的間隔亦須控制妥當。最後，再以適當的水稀釋至可測定吸光值的範圍，並分別取200μL各個稀釋後的反應溶液至96孔培養盤中，測量其於540nm之吸光值。其中，以加入200μL之H₂O的組別做為控制組。

接著，以下列公式分別計算秋葵水萃取物、及本發明之秋葵發酵物之澱粉酶抑制率，作為抑制澱粉酶之功效的標準：

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物抑制澱粉酶之功效的測試結果如圖2所示。秋葵水萃取物的澱粉酶抑制率僅有29.9%，而本發明之秋葵發酵物的澱粉酶抑制率則高達52.8%，相較於未經發酵的秋葵水萃取物能夠提高22.9%的澱粉酶抑制率。此結果顯示本發明之發酵方法可有效提高本發明秋葵 發酵物的澱粉酶抑制率，使得本發明之秋葵發酵物可有效地抑制澱粉的分解，並可從源頭阻斷澱粉的分解，以達到抑制澱粉吸收的功效，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

實施例4 本發明之秋葵發酵物抑制葡萄糖苷酶之功效

本發明之一實施例為進行本發明之發酵方法提升秋葵發酵物抑制葡萄糖苷酶(Glucosidase)之功效的測試實驗，因此利用葡萄糖苷酶會將人造基質-對硝基苯基α-d-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-Glucopyranoside,pNPG)進行水解，並產生產生葡萄醣醛酸(Glucuronic acid)及黃色的對硝基苯酚(p-nitrophenol)的特性，而對硝基苯酚可吸收405nm波長的光，且吸光值與對硝基苯酚的濃度成正比，因此可用此原理以測定待測物中葡萄糖苷酶的相對活性或相對含量。

首先，先配置以下溶液：0.1M的磷酸鈉緩衝液(pH為7.0)，以下簡稱Pi緩衝溶液，將4.7283g的磷酸氫鈉及2.0028g的磷酸二氫鈉以400mL的RO水溶解後，再以定量瓶將溶液定量至500mL；2.5mM的pNPG溶液，為0.0377g的pNPG(購自Sigma，美國，編號N1377)以RO水定量至100mL，並冷藏3-4日進行保存，使用前須注意，若溶劑變為淡黃色，則表示溶劑已氧化，則需再重新配置；取2.1198g的碳酸鈉(Sodium carbonate,Na2CO₃，購自Sigma，美國，編號31432)以RO水定量至100mL，即為0.2M的碳酸鈉溶液，此溶液為本實驗的終止劑；以0.1M的Pi緩衝溶液配置0.2units/mL的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，購自Sigma，美國，編號G5003-100UN，購入時為26units/mg solid，且共有3.85mg個solid)溶液；其中，本實施例中的α-葡萄糖苷酶溶液以下列方法所配置：將2.0mL的Pi緩衝溶液加入容量瓶中，並加入0.1mL所購入之50U/mL的酵素原液(儲存於-20℃備用)，並以RO水定量至25mL，即為0.2units/mL的α-葡萄糖苷酶。

以下列實驗組作為第15分鐘的最終組別：首先，分別將160μL 之經相同倍率稀釋的秋葵水萃取物(參見實施例1)、及本發明之秋葵發酵物置入96孔培養盤中，其中每組進行三重複。接著，分別於每一個孔洞中加入20μL之溶於0.1M之Pi緩衝溶液的0.2units/mL之α-葡萄糖苷酶溶液，再將溶液混合均勻，並於25℃下作用10分鐘後，再分別於每一個孔洞加入20μL之2.5mM的pNPG溶液，再將溶液混合均勻，並於37℃下作用10分鐘後，於每一個孔洞中加入80μL之反應終止劑，再將溶液混合均勻後，測量每一個孔洞中溶液於405nm之吸光值。其中，以加入160μL之Pi緩衝溶液的組別做為控制組。

以下列實驗組作為第0分鐘的起始組別：首先，分別將160μL之經相同倍率稀釋的秋葵水萃取物(參見實施例1)、及本發明之秋葵發酵物置入96孔培養盤中，其中每組進行三重複。接著，分別於每一個孔洞中加入20μL之溶於0.1M之Pi緩衝溶液，再將溶液混合均勻，並於25℃下作用10分鐘後，再分別於每一個孔洞加入20μL之2.5mM的pNPG溶液，再將溶液混合均勻，並於37℃下作用10分鐘後，於每一個孔洞中加入80μL之反應終止劑，再將溶液混合均勻後，測量每一個孔洞中溶液於405nm之吸光值。其中，以加入160μL之Pi緩衝溶液的組別做為控制組。

接著，以下列公式分別計算秋葵水萃取物、及本發明之秋葵發酵物之葡萄糖苷酶抑制率，最為抑制葡萄糖苷酶之功效的標準：

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物抑制葡萄糖苷酶之功效的測試結果如圖3所示。秋葵水萃取物的葡萄糖苷酶抑制率僅有95.5%，而本發明之秋葵發酵物的葡萄糖苷酶抑制率則高達109.6%，相較於未經發酵的秋葵水萃取物能夠提高14.1%的葡萄糖苷酶抑制率。此結果顯示本發明之發酵方法可有效提高本發明秋葵發酵物的葡萄糖苷酶抑制率，使得本發明之秋葵發酵物可有效 地抑制葡萄糖苷的分解，並可從源頭阻斷葡萄糖的分解，以達到抑制葡萄糖吸收的功效，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

實施例5 本發明之秋葵發效物降低個體飯後血糖值之功效

本發明之一實施例為進行本發明之秋葵發酵物於降低個體飯後血糖值之功效的測試實驗，以交叉試驗的方式進行測試。首先，募集7位成人為受試者，並分成兩天進行試驗，試驗前受試者需要空腹八個小時，並於試驗起始時間點測量血糖值，作為餐前血糖值，接著於測試的第一天，讓每位受試者食用三片白吐司後，每經過三十分鐘測量一次餐後血糖值，測量至兩小時結束，並以此結果作為對照組；並於第一次測試的二天後，每位受試者同樣需要保持試驗前空腹八個小時，並於試驗起始時間點測量血糖值，作為餐前血糖值，接著再飲用一瓶含有5-10%本發明之秋葵發酵物的飲品，並於飲用後靜待十五分鐘，再於十分鐘內食用完三片白吐司，之後每經過三十分鐘測量一次餐後血糖值，測量至兩小時結束。最後將兩天的測試結果做比較，以觀察本發明之秋葵發酵物於降低個體飯後血糖值之功效。

本發明之秋葵發酵物於降低個體飯後血糖值之功效的測試結果如圖4所示。未飲用本發明之秋葵發酵物時，受試者的餐前血糖值為93mg/dL，而食用完白吐司之飯後第三十分鐘的血糖值為145mg/dL、第六十分鐘的血糖值為126.7mg/dL、第九十分鐘的血糖值為111.8mg/dL、而第一百二十分鐘的血糖值為112.0mg/dL；在飲用本發明之秋葵發酵物時，受試者的餐前血糖值同樣為93mg/dL，然而食用完白吐司之飯後第三十分鐘的血糖值為137.1mg/dL、第六十分鐘的血糖值為114.9mg/dL、第九十分鐘的血糖值為109.6mg/dL、而第一百二十分鐘的血糖值為107.7mg/dL，分別較未飲用本發明之秋葵發酵物之控制組低10.4%、14.4%、3.9%、及6.1%。此結果顯示本發明之秋葵發酵物能有效減低個體飯後血糖值，能夠有效調控血糖，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

實施例6 本發明之秋葵發效物預防肥胖之功效

本發明之一實施例為進行本發明之秋葵發酵物於促進預防肥胖之功效的測試實驗。首先，募集男性或女性受試者共十位，其中該些受試者之BMI值≧24、體脂肪則為男性>25%、女性>30%、空腹血糖值偏高但非為糖尿病患者、且皆未服用控制血糖藥物之個體；使該十位受試者於每日飯前飲用一瓶含有5-10%本發明之秋葵發酵物的飲品，並分別於服用前、及服後兩週後，對受試者進行體重指標之測定，其中包含測量體重、身高體重指數(Body Mass Index，以下簡稱為BMI值)、腰圍、內臟脂肪、全身體脂率、及軀幹體脂率。

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物降低個體體重之功效的測試結果如圖5所示。飲用本發明之秋葵發酵物前，受試者的平均體重為70.7公斤；而在飲用本發明之秋葵發酵物兩週後，受試者的平均體重顯著降低為70公斤，相較於飲用前共降低0.7公斤。此結果顯示本發明之秋葵發酵物可有效地降低個體的體重，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物降低個體BMI值之功效的測試結果如圖6所示。飲用本發明之秋葵發酵物前，受試者的平均BMI值為25.5；而在飲用本發明之秋葵發酵物兩週後，受試者的平均BMI值顯著降低為25.2，相較於飲用前共降低0.3。此結果顯示本發明之秋葵發酵物可有效地降低個體的BMI值，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物降低個體腰圍之功效的測試結果如圖7所示。飲用本發明之秋葵發酵物前，受試者的平均腰圍為84.2公分；而在飲用本發明之秋葵發酵物兩週後，受試者的平均腰圍有效降低為83.9公分，相較於飲用前共降低0.3公分。此結果顯示本發明之秋葵發酵物可有效地降低個體的腰圍，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物降低個體內臟脂肪之功效的測試結果如圖8所示。飲用本發明之秋葵發酵物前，受試者的平均內臟脂肪為 7.4單位；而在飲用本發明之秋葵發酵物兩週後，受試者的平均腰圍顯著降低為7.1單位，相較於飲用前共降低0.3單位。此結果顯示本發明之秋葵發酵物可有效地降低個體的內臟脂肪，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物降低個體平均全身體脂率之功效的測試結果如圖9所示。飲用本發明之秋葵發酵物前，受試者的平均全身體脂率為35.4%；而在飲用本發明之秋葵發酵物兩週後，受試者的平均全身體脂率顯著降低為34.4%，相較於飲用前共降低1%。此結果顯示本發明之秋葵發酵物可有效地降低個體的平均全身體脂率，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

本發明之發酵方法提升秋葵發酵物降低個體平均軀幹體脂率之功效的測試結果如圖10所示。飲用本發明之秋葵發酵物前，受試者的平均軀幹體脂率為36.2%；而在飲用本發明之秋葵發酵物兩週後，受試者的平均軀幹體脂率顯著降低為35.3%，相較於飲用前共降低0.9%。此結果顯示本發明之秋葵發酵物可有效地降低個體的平均軀幹體脂率，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效。

綜上所述，本發明將秋葵水萃取物以酵母菌及乳酸菌同時進行發酵所得之秋葵發酵物，能藉由該微生物發酵製程顯著提高本發明秋葵發酵物中總多糖的含量，能使本發明之秋葵發酵物能更加有效的應用於調節血糖及血脂之用途；且本發明之發酵方法可有效提高本發明秋葵發酵物的澱粉酶以及葡萄糖苷酶的抑制率，使得本發明之秋葵發酵物可有效地抑制澱粉以及葡萄糖苷的分解，並可從源頭阻斷澱粉以及葡萄糖的分解，以達到抑制澱粉以及葡萄糖吸收的功效，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效；本發明之秋葵發酵物亦能有效減低個體飯後血糖值，能夠有效調控血糖，而能夠有效地應用於預防肥胖的功效；且本發明之秋葵發酵物還可有效地降低個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及平均軀幹體脂率，而能夠有效地應用於預防肥胖 的功效。因此，本發明之秋葵發酵物可用於製備調控血糖與血脂及/或預防肥胖之組合物的用途，且該組合物是一醫藥品、一保養品、或一食品，可藉由口服、塗抹等方式給予一個體。

Claims (7)

1. 一種草本植物發酵物用於製備預防肥胖之組合物的用途，其中該草本植物發酵物為一秋葵(Abelmoschus esculentus)發酵物，該秋葵發酵物係將一秋葵以一水為溶劑，於50-100℃下萃取0.5-3小時後萃取所得之秋葵萃取物，再將該秋葵萃取物經由一酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及一乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)同時進行發酵後並經由滅菌而獲得，且該秋葵發酵物係調控一個體之血糖及/或血脂。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該秋葵發酵物係抑制該個體之澱粉及/或葡萄糖的吸收。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該秋葵發酵物係抑制該個體之澱粉酶的活性及/或抑制一葡萄糖苷酶的活性。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該秋葵發酵物係提升其中總多糖含量。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該秋葵發酵物的濃度為至少5%(v/v)。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該秋葵發酵物係降低該個體的體重、BMI值、腰圍、內臟脂肪、平均全身體脂率、及/或平均軀幹體脂率。
7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該秋葵與水的重量比係為1-3：5-29；該酵母菌之添加量為0.01-0.5%(v/v)及該乳酸菌之添加量0.01-0.25%(v/v)；且該發酵的時間為1-7天。

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