TW202108164A - 用於提升植物中效性成分含量的發酵方法 - Google Patents

用於提升植物中效性成分含量的發酵方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用於提升植物中效性成分含量的發酵方法。

Description

用於提升植物中效性成分含量的發酵方法
本發明是有關於一種用於提升植物中效性成分含量的發酵方法。
脂肪為人體內的必要成分，但過度的脂肪成分對人體會造成損害。國家經濟愈來愈起飛的國家，肥胖問題只增不減，因此以亞洲區來看，中國會是下一波肥胖問題增加幅度大幅上升的國家。
另外，台灣目前已成為為「亞洲第一胖」的國家，18歲以上國民中，男性體重過重之比例為51.1%，女性體重過重之比例為35.8%，且比例還在上升中，甚至體重過重的年齡層也是逐年下降，中小學生體重過重的比例已上升至25%以上，是全球排名第八高的區域。因此肥胖是目前亟需解決的問題。
除此之外，醣化反應(glycation)與皮膚與體內老化相關，更與危害國人健康甚巨的糖尿病有關。醣化反應的本質就是梅納反應(Maillard reaction)或稱為羰胺褐變反應(carbonyl-amine browning)，這是糖的醛(酮)基與含胺基物質(例如蛋白質、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸或上述之衍生物)的胺基之間的一種非酵素性醣化(nonenzymatic glycosylation；glycation)反應。長期處於高血糖症狀下，會引起葡萄糖自動氧化與蛋白質糖化作用，形成高度醣化終產物(advanced glycation end products,AGEs)。而AGEs更可引起多種老化疾病，例如皮膚皺紋、白內障、粥狀動脈硬化、腎臟衰竭等。
皮膚組織是由表皮、真皮及皮下組織所構成，其中真皮含有大量膠原蛋白及玻尿酸，而與皮膚之保水性及彈力息息相關。人類皮膚會隨著年紀、生理因素或環境因素，而有氧化、老化、膚質粗糙或產生皺紋等現象，如 正常年輕人的皮膚都具一定的彈性和張力，當表情肌鬆弛後，皮膚會很快復原，使皺紋消失；但進入中年後，皮膚開始明顯老化，皮膚變薄、變硬、乾燥、張力降低；真皮膠原蛋白減少、彈力纖維變性、斷裂，使皮膚的張力和彈性降低，因此，當表情肌鬆弛後，皮膚不能很快復原，久之則使皺紋成形；且隨年齡的增大，皮膚和皮下組織更加鬆弛，加上面部支持組織的萎縮或缺失，以及肌肉的鬆軟，皮膚會在重力的作用下發生滑墜，形成更深的皺紋。而肌膚粗糙係由於乾燥、紫外線、清潔劑或化學物質等刺激性物質等外在重要因素，或激素平衡之紊亂等內在重要因素而產生之肌膚困擾，並伴隨角質層屏障功能之下降、角質層水分量之下降、表皮代謝回轉之亢進、鱗屑之產生而角質粗糙化等現象。因此皮膚上的細胞若失去彈性及保濕功能，會引起皮膚褶皺、乾燥及失去光澤等現象。
一直以來，發酵食品之製造均仰賴微生物，微生物被接入原料中，在其生長過程會產生所需酵素，將有機物分解變為人類生活上有益物質的過程稱之發酵；所以實際催化此代謝活動進行者乃微生物所產生的酵素。而發酵得到的產品範圍極廣，從極高單價的醫藥級產品，例如降血脂藥物或抗生素，到工業用的酵素，像是澱粉分解、纖維分解、蛋白質分解酵素等；還有食品用的有益微生物，例如乳酸菌、紅麴菌、納豆菌、食藥用菇菌等，以及味精類的調味品，農業用的生物殺蟲劑，像蘇力菌，或者枯草桿菌、放射線菌、木黴菌等拮抗菌類的微生物；甚至，從動物飼料藥劑或直接添加在飼料中的微生物等，到廢棄物回收、各類污染處理及清理用的微生物，以及其他的特殊酵素。特別地，近年來也有研發人員開始對植物(例如蔬果)進行發酵處理，所得到的植物發酵物可用來增進人體健康。因此，人們對於發酵食品的需求已日益增加。
然而，傳統用來製備發酵產品的發酵製程往往需要耗費大量時間來讓微生物生長，且需要工業級的發酵設備，例如發酵槽，成本極高。因此，若能研發出新穎用於發酵植物的方法，且該方法可用於提升啤酒酵母菌的生長速度及植物中效性成分含量，如此對本領域的技術帶來重大突破且可造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於發酵植物的方法，包含以下步驟：(a)以水萃取一植物，而得到一植物萃取物；以及(b)將該植物萃取物與一啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、一胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)及一醋酸菌(Acetobacter aceti)依序進行一發酵過程，而得到一植物發酵物，其中該發酵過程包括對該植物萃取物、該啤酒酵母菌、該胚芽乳酸菌及該醋酸菌照射一波長介於620~750nm的紅色光源。
在本發明的一實施例中，該植物為紅毛丹(Nephelium lappaceum)。
在本發明的一實施例中，在該萃取之前，根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。
在本發明的一實施例中，該啤酒酵母菌之發酵時間為1至2.5天，該胚芽乳酸菌之發酵時間為1至3天，及該醋酸菌之發酵時間為3至10天。
在本發明的一實施例中，該啤酒酵母菌的濃度介於0.01~0.5%(v/v)，該胚芽乳酸菌的濃度介於0.01~0.25%(v/v)，及該醋酸菌的濃度介於3~10%(v/v)。
在本發明的一實施例中，該植物與水的重量比為1：5~10。
在本發明的一實施例中，在步驟(a)中，該萃取的溫度介於50至100℃，及該萃取的時間介於0.5至1.5小時。
本發明之另一目的為提供一種如前所述的方法用於提升啤酒酵母菌的生長速度及植物中效性成分含量的用途。
在本發明的一實施例中，該植物是紅毛丹(Nephelium lappaceum)，及該效性成分是多酚(polyphenol)。
本發明之另一目的為提供一種植物發酵物，係藉由一如前所述的方法而製得。
本發明之另一目的為提供一種如前所述的植物發酵物用於製備一護膚及減脂之組成物的用途。
在本發明的一實施例中，該護膚包括提升肌膚的抗氧化能力、提升肌膚的抗醣化活性及促進彈力蛋白增生。
在本發明的一實施例中，該減脂包括促進脂肪分解及增加瘦體素分泌。
在本發明的一實施例中，該組成物是呈一醫藥品、一保養品或一食品產品的形式。
本發明之另一目的為提供一種用於提升微生物的生長速度之方法，包含以下步驟：(a)以水萃取一植物，而得到一植物萃取物；以及(b)將該植物萃取物與一微生物進行一發酵過程，而得到一植物發酵物，其中該微生物是一啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或一醋酸菌(Acetobacter aceti)，該發酵過程包括對該植物萃取物及該微生物照射一波長介於620~750nm的紅色光源。
在本發明的一實施例中，該植物為紅毛丹(Nephelium lappaceum)。
在本發明的一實施例中，在該萃取之前，根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。
在本發明的一實施例中，該微生物之發酵時間為1至3天。
在本發明的一實施例中，該啤酒酵母菌的濃度介於0.01~0.5%(v/v)，及該醋酸菌的濃度介於5%(v/v)。
在本發明的一實施例中，該啤酒酵母菌的生長速度被提升至少47%，及該醋酸菌的生長速度被提升至少22%。
綜上所述，本發明用於發酵植物的方法及由該方法所製得的植物發酵物之功效在於：可提升微生物(例如啤酒酵母菌及醋酸菌)的生長速度及植物中效性成分含量，並藉由提升肌膚的抗氧化能力、提升肌膚的抗醣化活性及促進彈力蛋白增生以達到護膚美肌的功效。另一方面，該植物發酵物可藉由促進脂肪分解及增加瘦體素分泌達到減脂的功效。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1是微生物生長速度檢測的數據圖。
圖2是植物中效性成分含量分析的數據圖，其中***表示與對照組比較，p<0.001。
圖3是本發明方法所製得的植物發酵物在提升肌膚的抗氧化能力上之效用的數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。
圖4是本發明方法所製得的植物發酵物在提升肌膚的抗醣化活性上的功效之數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。
圖5是本發明方法所製得的植物發酵物在促進彈力蛋白增生上的功效之數據圖。
圖6A及圖6B是本發明方法所製得的植物發酵物在促進彈力蛋白增生上的功效之細胞染色圖，其中藍色代表細胞核，綠色代表彈力蛋白。
圖7是本發明方法所製得的植物發酵物在促進脂肪分解上的功效之數據圖，其中*表示與對照組比較，p<0.05。
圖8是本發明方法所製得的植物發酵物在增加瘦體素分泌上之效用的數據圖。
圖9是本發明用於提升微生物的生長速度之方法在提升啤酒酵母菌的生長速度上的功效之數據圖。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，個此之間的差異以學生t檢驗(student's t-test)分析。
依據本發明，紅毛丹(Nephelium lappaceum)是無患子科(Sapindaceae)韶子屬(Nephelium)的大型熱帶果樹，馬來文稱之「rambutan」，意為「毛茸茸之物」。成熟的紅毛丹果並非都是紅色的，也有黃色的果子。有的紅毛丹的核的大小近似於芝麻。紅毛丹的味道類似於荔枝，果肉(假種皮)白色，肉質透明多汁，酸甜可口，內藏種子1粒，扁卵形。
如本文中所使用的，用語「啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」、「胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)」以及「醋酸菌(Acetobacter aceti)」分別意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌菌株。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之 物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。
依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。
依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P(carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑 (emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。
依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固 醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。
依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。
實施例1. 微生物生長速度檢測
首先，將來自泰國南部羅勇市的紅毛丹(Nephelium lappaceum)果汁以1：5~10的重量比例與水混合，並根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。接著，在50℃~100℃下萃取0.5~1.5小時，得到一植物萃取物。
接著，在植物萃取物的培養基殖入啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BCRC 20271開始發酵後，每24小時取出1mL之菌液，經序列稀釋後，將菌液塗於酵母腖葡萄糖(Yeast peptone dextrose,YPD)盤上，其中發酵全程照射波長介於620~750nm(較佳為635nm)的紅色LED光源，得到照射紅色LED光源的植物發酵物。之後，將照射紅色LED光源的植物發酵物使用作為實驗組，比較組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以波長介於400~450nm的藍光取代紅色LED光源；至於對照組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。接著，將塗有菌液之YPD盤放置於攝氏30℃之培養箱培養48小時，然後計算菌落以評估啤酒酵母菌生長速度。實驗結果顯示於圖1。
圖1是微生物生長速度檢測的數據圖。由圖1可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的啤酒酵母菌生長速度有顯著的提升。特別地，於發酵製程中，全程照射波長620~750nm之紅色LED光源可提升啤酒酵母菌生長速度47%(與對照組比較)，反之照射自然光與藍光則無提升生長速度之效果。本實施例的結果顯示，在發酵植物過程中照射紅色LED光源可有效提升啤酒酵母菌的生長速度。
實施例2. 植物中效性成分含量分析
首先，製備標準溶液，將10g的沒食子酸(gallic acid)溶於水中並添加10mL的體積至量瓶中。接著，分別配製0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL及100μL/mL的標準溶液，接而取100μL的各個標準溶液至具有10mL體積的離心管。之後，添加500μL的佛蕭酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)、混合並直立放置3分鐘，接而添加400μL的7.5%碳酸鈉(sodiμM carbonate)、混合並直立放置30分鐘。接著，將200μL的各個反應溶液轉移至96-孔盤中，於750nm下測量吸光值。
另外，將實施例1所述之照射紅色LED光源的植物發酵物使用作為實驗組，對照組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。將實驗組及對照組分別以水予以稀釋五倍並取100mL的體積至微量離心管中。之後，添加500μL的佛蕭酚試劑、混合並直立放置3分鐘，接而添加400μL的7.5%碳酸鈉、混合並直立放置30分鐘。接著，將200μL的各組反應溶液轉移至96-孔盤中，於750nm下測量吸光值。總多酚含量的結果顯示於圖2。
圖2是植物中效性成分含量分析的數據圖。由圖2可見，與對照組相較之下，實驗組的總多酚含量有顯著的提升(提升60%)。本實施例的結果顯示，在發酵植物過程中照射紅色LED光源可有效提升植物(即紅毛丹)中效性成分(即總多酚)含量。
實施例3. 本發明用於發酵植物的方法之製程
基於實施例1及實施例2的結果，本發明決定利用紅色LED光源進行植物發酵物的製備。首先，將來自泰國南部羅勇市的紅毛丹(Nephelium lappaceum)果汁以1：5~10的重量比例與水混合，並根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。接著，在50℃~100℃下萃取0.5~1.5小時，得到一植物萃取物。將該植物萃取物冷卻至室溫供後續三段式發酵使用。三段式發酵係為把植物萃取物依序接種0.01~0.5%(v/v)啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BCRC 20271發酵1~2.5天；接種0.01~0.25%(v/v)胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)TCI028(於民國106年12月13日寄存於食品工業發展研究所的生物資 源保存及研究中心，寄存編號BCRC910805)發酵1~3天；接種3~10%(v/v)醋酸菌(Acetobacter aceti)BCRC 11688(以上菌株皆是購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC))發酵3~10天，並於發酵全程照射波長介於620~750nm(較佳為635nm)的紅色LED光源。之後，於45℃~70℃下減壓濃縮，接而以200~400網目(mesh)的網篩過濾。接著，添加40~70%異麥芽寡糖後滅菌，得到植物發酵物。
實施例4. 本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物在提升肌膚的抗氧化能力上之效用評估
據報導，35歲過後，人體抗氧化能力大幅下降，自由基大量堆積，肌膚快速老化。因此，本實施例探討依據實施例3方法所製得的植物發酵物可否提升肌膚的抗氧化能力。使用降低鐵氧化之能力(Ferric reducing antioxidant power,FRAP)的比色法，以測定待測物的抗氧化能力；其中，係利用具有還原活性的待測物能夠將鐵離子(Fe3+)還原成亞鐵離子(Fe2+)，而溶液顏色回由紅褐色轉變為綠色，而該綠色化合物的深淺與還原能力呈正比，因此可用於定量待測物的還原活性。
首先，利用已知具有還原活性的抗壞血酸製作標準曲線。精密秤取10mL的L-抗壞血酸(L-Ascorbic acid,Vit C，維他命C，購自Sigma，美國，編號A5960-25g)，置於10mL的容量瓶中，再加入ddH2O定量至10mL，配製為1mg/mL之L-抗壞血酸。接著，取1mL配好的L-抗壞血酸置於10mL的容量瓶中，再加入ddH2O定量至10mL，配製為1μg/mL之L-抗壞血酸，並將該100μg/mL的L-抗壞血酸進行系列稀釋成0、10、20、40、60、80、及100μL/mL之L-抗壞血酸(如表1所示)，並分別取250μL之各濃度的標準溶液至試管中，再各加入250μL之磷酸鹽緩衝溶液(以無水磷酸二氫鈉(NaH2PO4，購自J.T.Baker，編號3828-01)及磷酸氫二鈉(Na2HPO4，購自Sigma，編號04270)以1：1比例混合所配製而成)以震盪儀(Vortex)混合均勻後，加入250μL之1%的赤血鹽(Potassium ferricyanide,K3Fe(CN)，購自Sigma，編號244023)以震盪儀混合均勻後，於50℃水浴槽中加熱20分鐘，再加入250μL之10%的三氯醋酸(Trichloroacetic acid,TCA,CCl3COOH，購自J.T Baker，編號0414-01)以震盪儀混合均勻後，以300g離心10 分鐘，並注意取出時不要搖晃，接著取出300μL的各管反應溶液之上清液，再加入300μL之ddH2O及120μL之1%的氯化鐵(FeCl3，購自Alfa Aesar，編號A16231)以震盪儀混合均勻後反應10分鐘，並測量其於700nm之吸光值，以繪製標準溶液之迴歸曲線公式。
Figure 108146489-A0101-12-0012-1
接著，將實施例3所製得的植物發酵物使用作為實驗組，比較組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實施例3所述之用於發酵植物的方法，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。此外，將實施例3的植物萃取物使用作為對照組。各組樣品稀釋20倍後進行後續實驗。之後，分別取250μL之各組樣品於10mL之玻璃試管中，再分別加入250μL之磷酸鹽緩衝溶液以震盪儀混合均勻後，加入250μL之1%的赤血鹽以震盪儀混合均勻後，於50℃水浴槽中加熱20分鐘，再加入250μL之10%的三氯醋酸以震盪儀混合均勻後，以300g離心10分鐘，並注意取出時不要搖晃，接著取出300μL的各管反應溶液之上清液，再加入300μL之ddH2O及120μL之1%的氯化鐵以震盪儀混合均勻後反應10分鐘，並測量其於700nm之吸光值，再以上述之標準溶液的迴歸曲線公式，以內差法算出濃度後，再回乘稀釋倍數以取得各組樣品的還原能力。本實施例的結果顯示於圖3。
圖3是本發明方法所製得的植物發酵物在提升肌膚的抗氧化能力上之效用的數據圖。由圖3可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的還原能力有顯著的提升。特別地，與對照組比較，實驗組的還原能力提升57%。本實施例的結果顯示，本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物可有效提升肌膚的抗氧化能力。
實施例5. 本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物在提升肌膚的抗醣化活性上之效用評估
本實施例係為了測試本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物的抗醣化活性，因此以抑制D-果糖(D-fructose)使膠原蛋白(Collagen)產生醣化的效率，進行醣化活性之定量。醣分子與蛋白交聯形成高度醣化終產物(Advanced glycation end-products,AGEs)，引發細胞內氧化壓力，造成肌膚老化受損。首先，將實施例3所製得的植物發酵物使用作為實驗組，比較組1之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實施例3所述之用於發酵植物的方法，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源，比較組2的製備方法與實施例3所述之用於發酵植物的方法不同之處在於：以水萃取得到植物萃取物之後沒有進行三段式發酵及紅色LED光源照射。至於對照組的方法則沒有照光及沒有添加植物發酵物或萃取物。將各組樣品稀釋10倍後進行後續實驗。之後，加入0.2mL之含有0.06%之NaN3的60mg/mL之膠原蛋白溶液(以200mM之磷酸鈉緩衝液配製，pH 7.4)，並與0.2mL的1.5M D-果糖(以200mM之磷酸鈉緩衝液配製，pH 7.4)溶液均勻混合，取出0.1mL混合溶液作為原點產物，並將剩餘的混合溶液於50℃下反應24小時後，取出0.1mL作為終點產物，再分別測量原點產物與終點產物於激發波長360nm、放射波長460nm的螢光數值，其中已知胺基胍(Aminoguanidine,AG)具有抑制醣化作用的功效。最後，以下列公式計算清除高度醣化終產物(AGEs)能力之效率，以代表其抗醣化作用的活性，其中高度醣化終產物生成量越少表示抗醣化活性越高。
Figure 108146489-A0101-12-0013-2
本實施例的結果顯示於圖4。圖4是本發明方法所製得的植物發酵物在提升肌膚的抗醣化活性上的功效之數據圖。由圖4可見，與對照組、比較組1及比較組2相較之下，實驗組的醣化比例百分比有顯著的降低。其中，與對照組比較，實驗組的醣化比例百分比減少約55%。本實施例的結果顯示，本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物能有效提升其清除高度醣化終產物之能力，並具有優異的提升肌膚之抗醣化活性。
實施例6. 本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物在促進彈力蛋白(elastin)增生上的效用評估
在肌膚中，彈力蛋白跟膠原蛋白相互配合，能幫助支持肌膚的架構，提升肌膚的彈性，加強肌膚的緊實，減少皺紋的產生。因此，本實施例探討依據實施例3方法所製得的植物發酵物可否促進彈力蛋白增生。首先，將實施例3所製得的植物發酵物(濃度為0.0625%)使用作為實驗組，比較組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實施例3所述之用於發酵植物的方法，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。至於對照組的方法則沒有照光及沒有添加植物發酵物或萃取物。
接著，進行彈力蛋白(elastin)含量分析，流程如下：使用FastinTM彈力蛋白分析套組(Elastin Assay kit)在6孔盤中用2mL培養基接種1×105細胞/孔，所使用的細胞株為人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk(ATCC®編號為CRL-1881)，培養基為最低必需培養基(Minimum essential medium,MEM)(添加有10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(Penicillin/streptomycin)及1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)(Gibco))，並在37℃下培育24小時。之後，用2mL培養基處理各組樣品，然後作用48小時。接著，移除培養基並以1X PBS清洗一次，然後以胰蛋白酶(trypsin)處理細胞3分鐘。用培養基停止胰蛋白酶活性，然後轉移至1.5mL管中。接著，用胰蛋白酶收集細胞，然後轉移到1.5mL微量離心管中，以300 xg離心5分鐘，然後以PBS(Gibco)清洗。之後，以300 xg離心5分鐘，然後將細胞沉澱物保留在約300μL的PBS中。接著，向300μL細胞懸浮液中加入100μL的1.0M草酸(oxalic acid)，並在加熱塊(heating block)中於100℃作用1小時。向每個試管中加入等體積的彈力蛋白沉澱試劑(Elastin Precipitating Reagent)，蓋上試管並短暫渦旋混合，靜置15分鐘以完成沉澱。之後，以10,000 xg離心10分鐘，排放試管的液體內容物，然後透過將倒置的試管輕拍到紙巾上，以除去試管中剩餘的大部分流體。接著，添加1mL染料試劑，透過顛倒試管來混合內容物，然後將試管放在機械振盪器上，作用90分鐘。之後，排空未結合的染料管，彈力蛋白-染料複合物可以觀察到為在試管的底部和內部下壁中的紅棕色沉積物。向每個試管中加入250μL染料解離試劑(Dye Dissociation Reagent)，蓋上試管，藉由渦旋混合器將染料釋放到溶液中，確保所有結合的染料都已進入溶液。之後，將每個試管的內容物轉移到96孔盤中，然後將盤放入ELISA讀取儀(BioTek)中，在513nm處測量吸光值。
接著，進行彈力蛋白免疫螢光染色，流程如下：在室玻片上每孔接種5×103人類皮膚纖維母細胞CCD-966sk(BCRC編號為60153)，培養基為最低必需培養基(Minimum essential medium,MEM)(Eagle)(配於厄爾平衡鹽溶液(Earle's Balanced Salt Solution,Earle's BSS)，GIBCO公司，編號41500-034，美國)(添加有0.1mM非必需胺基酸、1.5g/L碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、1mM丙酮酸鈉(sodium pyruvate)(佔比90%)、及10%胎牛血清(FBS)(Gibco))，並培育隔夜。之後，在室溫下用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定細胞10分鐘，接而以1X PBS清洗3次，然後添加0.2% Triton X-100(配於1X PBS(Gibco))以穿透細胞，並於室溫下作用10分鐘。接著，加入1% BSA(配於1X PBS中)，在37℃下封阻1小時，然後以1X PBS清洗3次。之後，加入一次抗體(彈力蛋白抗體(Merck；MAB2503)，用1% BSA稀釋，在37℃作用1小時)，並以1X PBS清洗3次。接著，加入二次抗體(抗-小鼠-alexa 488抗體(Thermo)，用1% BSA稀釋，在37℃作用1小時)，並以1X PBS清洗3次。之後，加入Hoechst 33342(Thermo)並於室溫下作用3~5分鐘，然後以1X PBS清洗3次。接著，使用固定膠(mounting gel)固定載玻片，並在螢光顯微鏡下觀察。本實施例的結果顯示於圖5及圖6A與圖6B。
圖5是本發明方法所製得的植物發酵物在促進彈力蛋白增生上的功效之數據圖。圖6A及圖6B是本發明方法所製得的植物發酵物在促進彈力蛋白增生上的功效之細胞染色圖。由圖5可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的彈力蛋白含量有顯著的提升。其中，與對照組比較，實驗組的彈力蛋白含量提升13%。由圖6A和圖6B可見，本發明方法所製得的植物發酵物在促進彈力蛋白增生上的功效之細胞染色圖，其中藍色代表細胞核，綠色代表彈力蛋白。圖6A為圖5的對照組，圖6B為圖5的實驗組，在螢光顯微鏡下觀察結果顯示，植物發酵物作用下彈力蛋白較多，數據化後如圖5彈力蛋白含量提升13%。本實施例的結果顯示，本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物能有效促進彈力蛋白增生。
實施例7. 本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物在促進脂肪分解上的效用評估
本實施例以小鼠骨髓基質細胞進行本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物於促進脂肪分解之功效測試。該小鼠骨髓基質細胞OP9係購 自美國典型培養物保藏中心(美國ATCC®)，編號CRL-2749TM。該細胞於分化前係培養於前脂肪細胞擴增培養液(Pre-adipocyte Expansion Medium)，其中包含90%之最低必需培養基Alpha培養基(minimum essential medium alpha medium，購自Gibco，美國，12100-046)、20%之胎牛血清(Fetal Bovine Serum，購自Gibco，美國)，且加入1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco，美國)；並使用分化培養液(Differentiation Medium)使小鼠骨髓基質細胞進行分化，其中包含90%最低必需培養基Alpha培養基、20%之胎牛血清，且加入1%之青黴素/鏈黴素。
為證實本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物具有促進脂肪分解的功效，首先將小鼠骨髓基質細胞分化成脂肪細胞(adipocyte)，做法為將8×104小鼠骨髓基質細胞OP9與500μL的前脂肪細胞擴增培養液(Pre-adipocyte Expansion medium)接種於24孔培養盤中，並於37℃下培養7天，每3天更換新鮮的分化培養基。接著，使用顯微鏡(ZEISS)觀察脂滴(lipid droplet)的形成，確保細胞已完全分化。
之後，將OP9細胞分成3組，其中包括1個對照組、1個比較組及1個實驗組。將依據實施例3所述方法所得到的植物發酵物添加至實驗組的細胞中，濃度為0.0625%。比較組細胞添加的物質之製備方法大致上是相同於實施例3所述之用於發酵植物的方法，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。至於對照組的細胞則不做任何處理。接著，將各組細胞培養7~10天，每3天更換培養基。之後，參照Cayman的以甘油細胞為基礎的分析套組(Glycerol cell-based assay kit)之使用者操作指南，對各組細胞進行甘油分析(glycerol assay)。
甘油為脂肪分解的終產物，利用偵測甘油的生成量，檢驗脂肪分解的分解速度。從各孔培養盤中收集細胞培養物上清液，然後取25μL的細胞培養物上清液及標準物(standard)至新的96孔培養盤中。之後，於每孔添加100μL的改製游離甘油分析試劑(reconstituted Free Glycerol Assay Reagent)，然後於室溫下反應15分鐘。接著，以ELISA讀取儀(BioTek)讀取各組之OD540nm吸光值。
本實施例的結果顯示於圖7。圖7是本發明方法所製得的植物發酵物在促進脂肪分解上的功效之數據圖。由圖7可見，與對照組及比較組相較之 下，實驗組的油滴含量有顯著的降低。本實施例的結果顯示，本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物具有促進脂肪分解的功效。
實施例8. 本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物在增加瘦體素分泌上的效用評估
瘦體素為人體調節體重的重要因子，可抑制食慾及脂肪增生，並增加基礎代謝率，將體脂肪控制於適當範圍中。許多長期肥胖者皆有瘦體素分泌不足的問題，難以減重且容易復胖。因此，本實施例探討依據實施例3方法所製得的植物發酵物可否增加瘦體素分泌。首先，在96孔盤中用200μL前脂肪細胞擴增培養液(Pre-adipocyte Expansion Medium)接種1×104小鼠脂肪細胞(Mus musculus,mouse adipocyte cell)3T3-L1(ATCC®編號為CL-173TM)，其中包含90%之杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，購自Gibco)、10%之牛血清(Bovine Serum，購自Gibco)，且加入1%之青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin，購自Gibco)，然後於37℃下培養48小時。48小時後，去除培養基並添加分化培養液4天(每兩天更換新鮮的分化培養基)，其中包含90%杜貝可氏改良的依格氏培養基、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin)、1.0μM/mL地塞米松(Dexamethasone,DEXA)(Sigma)、0.5mM/mL甲基異丁基黃嘌呤(Methylisobutylxanthine,IBMX)(Sigma)及1.0μg/mL胰島素(insulin)(Sigma)。4天後，將分化培養液換成脂肪細胞維持培養基(Adipocyte Maintenance Medium)(每兩天更換一次新鮮的維持培養基)，其中包含90%杜貝可氏改良的依格氏培養基、10% FBS、1%青黴素/鏈黴素(Penicillin-streptomycin)、及1.0μg/mL胰島素。在開始分化誘導後的7~10天後，細胞已完全分化，然後利用顯微鏡觀察脂滴(lipid droplet)的形成。之後，加入各組樣品(濃度為0.0625%)，再作用12天，每48小時更換一次培養基。接著，收集培養基，並使用小鼠LEP(瘦體素)ELISA套組(Mouse LEP(Leptin)ELISA Kit)(Elabscience)確定瘦體素含量。本實施例的結果顯示於圖8。
圖8是本發明方法所製得的植物發酵物在增加瘦體素分泌上之效用的數據圖。由圖8可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的瘦體素含量有顯著的提升。特別地，與對照組比較，實驗組的瘦體素含量提升30%。本實施 例的結果顯示，本發明用於發酵植物的方法所製得的植物發酵物可有效增加瘦體素分泌。
實施例9. 本發明用於提升微生物的生長速度之方法的製程
首先，將來自泰國南部羅勇市的紅毛丹(Nephelium lappaceum)果汁以1：5~10的重量比例與水混合，並根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。接著，在50℃~100℃下萃取0.5~1.5小時，得到一植物萃取物。
接著，在植物萃取物的培養基殖入0.01~0.5%(v/v)啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)BCRC 20271開始發酵1~3天後，每24小時取出1mL之菌液，經序列稀釋後，將菌液塗於酵母腖葡萄糖(Yeast peptone dextrose,YPD)盤上，其中發酵全程照射波長介於620~750nm(較佳為635nm)的紅色LED光源，得到照射紅色LED光源的植物發酵物。之後，將照射紅色LED光源的植物發酵物使用作為實驗組，比較組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以波長介於400~450nm的藍光取代紅色LED光源；至於對照組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。接著，將塗有菌液之YPD盤放置於攝氏30℃之培養箱培養48小時，然後計算菌落以評估啤酒酵母菌生長速度。實驗結果顯示於圖9。
圖9是本發明用於提升微生物的生長速度之方法在提升啤酒酵母菌的生長速度上的功效之數據圖。由圖9可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的啤酒酵母菌生長速度有顯著的提升。特別地，於發酵製程中，全程照射波長620~750nm之紅色LED光源(即實驗組)可提升啤酒酵母菌生長速度47%(與對照組比較)，反之照射自然光與藍光則無提升生長速度之效果。本實施例的結果顯示，本發明用於提升微生物的生長速度之方法可有效提升啤酒酵母菌的生長速度。
接著，在植物萃取物的培養基(AAB培養基，添加有0.5%酵母萃取物、0.3%蛋白腖(peptone)及2.5%甘露醇(mannitol))殖入5%(v/v)醋酸菌(Acetobacter aceti)BCRC 11688開始發酵1~3天後，每24小時取出1mL之菌液，經序列稀釋後，將菌液塗於酵母腖葡萄糖(Yeast peptone dextrose,YPD)盤上，其中發酵全程照射波長介於620~750nm(較佳為635nm)的紅色LED光源，得到照 射紅色LED光源的植物發酵物。之後，將照射紅色LED光源的植物發酵物使用作為實驗組，比較組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以波長介於400~450nm的藍光取代紅色LED光源；至於對照組之植物發酵物的製備方法大致上是相同於實驗組，不同之處在於：以自然光取代紅色LED光源。接著，將塗有菌液之YPD盤放置於攝氏30℃之培養箱培養48小時，然後計算菌落以評估醋酸菌生長速度。實驗結果顯示於表2。
Figure 108146489-A0101-12-0019-3
由表2可見，與對照組及比較組相較之下，實驗組的醋酸菌生長速度有顯著的提升。特別地，於發酵製程中，全程照射波長620~750nm之紅色LED光源(即實驗組)可提升醋酸菌生長速度22%(與對照組比較)，反之照射自然光與藍光則無提升生長速度之效果。本實施例的結果顯示，本發明用於提升微生物的生長速度之方法可有效提升醋酸菌的生長速度。
綜上所述，本發明用於發酵植物的方法及由該方法所製得的植物發酵物可提升微生物(例如啤酒酵母菌及醋酸菌)的生長速度及植物中效性成分含量，並藉由提升肌膚的抗氧化能力、提升肌膚的抗醣化活性及促進彈力蛋白增生以達到護膚美肌的功效。另一方面，該植物發酵物可藉由促進脂肪分解及增加瘦體素分泌達到減脂的功效。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
【生物材料寄存】
食品工業發展研究所(台灣)；民國106年12月13日；編號BCRC910805。

Claims (20)

  1. 一種用於發酵植物的方法，包含以下步驟：
    (a)以水萃取一植物，而得到一植物萃取物；以及
    (b)將該植物萃取物與一啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、一胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)及一醋酸菌(Acetobacter aceti)依序進行一發酵過程，而得到一植物發酵物，
    其中該發酵過程包括對該植物萃取物、該啤酒酵母菌、該胚芽乳酸菌及該醋酸菌照射一波長介於620~750nm的紅色光源。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該植物為紅毛丹(Nephelium lappaceum)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在該萃取之前，根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該啤酒酵母菌之發酵時間為1至2.5天，該胚芽乳酸菌之發酵時間為1至3天，及該醋酸菌之發酵時間為3至10天。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該啤酒酵母菌的濃度介於0.01~0.5%(v/v)，該胚芽乳酸菌的濃度介於0.01~0.25%(v/v)，及該醋酸菌的濃度介於3~10%(v/v)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該植物與水的重量比為1：5~10。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在步驟(a)中，該萃取的溫度介於50至100℃，及該萃取的時間介於0.5至1.5小時。
  8. 一種如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的方法用於提升啤酒酵母菌的生長速度及植物中效性成分含量的用途。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的用途，其中該植物是紅毛丹(Nephelium lappaceum)，及該效性成分是多酚(polyphenol)。
  10. 一種植物發酵物，係藉由一如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的方法而製得。
  11. 一種如申請專利範圍第10項所述的植物發酵物用於製備一護膚及減脂之組成物的用途。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該護膚包括提升肌膚的抗氧化能力、提升肌膚的抗醣化活性及促進彈力蛋白增生。
  13. 如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該減脂包括促進脂肪分解及增加瘦體素分泌。
  14. 如申請專利範圍第11項所述的用途，其中該組成物是呈一醫藥品、一保養品或一食品產品的形式。
  15. 一種用於提升微生物的生長速度之方法，包含以下步驟：
    (a)以水萃取一植物，而得到一植物萃取物；以及
    (b)將該植物萃取物與一微生物進行一發酵過程，而得到一植物發酵物，
    其中該微生物是一啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或一醋酸菌(Acetobacter aceti)，該發酵過程包括對該植物萃取物及該微生物照射一波長介於620~750nm的紅色光源。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該植物為紅毛丹(Nephelium lappaceum)。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中在該萃取之前，根據總重量加入一具有一濃度為10%(w/w)的葡萄糖。
  18. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該微生物之發酵時間為1至3天。
  19. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該啤酒酵母菌的濃度介於0.01~0.5%(v/v)，及該醋酸菌的濃度介於5%(v/v)。
  20. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該啤酒酵母菌的生長速度被提升至少47%，及該醋酸菌的生長速度被提升至少22%。
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