TWI831348B - 甜菜根發酵物用於製備抑制血管鈣化組合物的用途 - Google Patents

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Abstract

一種甜菜根發酵物用於製備抑制血管鈣化組合物的用途，其中甜菜根發酵物係將甜菜根經水浸提後，再依序經由酵母菌、乳酸桿菌及醋酸菌進行發酵而製得。

Description

甜菜根發酵物用於製備抑制血管鈣化組合物的用途
本發明是關於甜菜根發酵物，特別是關於甜菜根發酵物用於製備促進血液循環或減重或抗老的組合物的用途。
甜菜是莧科(Amaranthaceae)甜菜屬(Beta)的一種草本植物，學名為Beta vulgaris，其葉是一種蔬菜，其根是熱帶甘蔗以外一種糖的來源。
常見所稱的甜菜根就是指甜菜的塊根，有圓錐形，也有紡錘形和楔形，依顏色分有紅色、紫色、白色、淺黃色等不同的品種。
在營養學相關研究上發現，肥胖的女性通常伴隨鐵質吸收律不佳的情況，從而導致體內缺氧。意即脂肪組織增加造成身體發炎反應，進而影響鐵調節蛋白運送鐵的能力，最終使細胞中攜帶氧氣的能力下降，當身體缺氧細胞粒線體活性亦隨之降低，促使身體代謝也變差而更容易產生肥胖，也稱為缺氧性肥胖。
為了進一步提升甜菜根的價值，並針對缺氧性肥胖的改善，發明人繼續研究開發甜菜根相關產品及其用途。
有鑑於此，本發明提供一種甜菜根發酵物的用途，其是用於製備促進血液循環或減重或抗老的組合物，且甜菜根發酵物是由甜菜根經水浸提後，再依序經由酵母菌、乳酸桿菌及醋酸菌進行發酵而製得。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升腸道鐵蛋白含量。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升血液內鐵含量。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以抑制血管鈣化。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以減少發炎反應。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以減少皮膚皺紋。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升抗氧化能力。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升總抗氧化能力(TAC)及提升抗氧化酵素含量。
在一實施例中，甜菜根發酵物的有效用量為7mL/天。
綜上所述，根據本發明任一實施例的甜菜根發酵物，其可用於製備促進血液循環以達到減重用途的組合物。根據本發明任一實施例的甜菜根發酵物，其可用於製備促進血液循環以達到抗老用途的組合物。根據本發明任一實施例的甜菜根發酵物，其可用於製備促進血液循環或減重或抗老，從而達到避免缺氧性肥胖用途的組合物。換言之，前述之組合物在有效用量為7mL/天下具有下列一種或多種功能：提升腸道鐵蛋白含量、提升血液內鐵含量、抑制血管鈣化、減少發炎反應、減少皮膚皺紋、提升抗氧化能力、提升總抗氧化能力(TAC)及提升抗氧化酵素含量等。
A:鈣化區域
圖1 是甜菜根發酵物與甜菜根汁總多酚比較結果圖。
圖2 是甜菜根發酵物與甜菜根汁促進鐵蛋白含量實驗結果圖。
圖3 是甜菜根發酵物與甜菜根汁避免血管鈣化實驗結果圖。
圖4 是甜菜根發酵物與甜菜根汁減少發炎反應實驗結果圖。
圖5 是甜菜根發酵物人體實驗減少皮膚皺紋實驗結果圖。
圖6 是甜菜根發酵物人體實驗提升血清鐵含量實驗結果圖。
圖7 是甜菜根發酵物人體實驗提升總和抗氧化能力實驗結果圖。
圖8 是甜菜根發酵物人體實驗提升抗氧化酵素GST-RBC實驗結果圖。
關於本文中所使用之濃度符號「%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。
關於本文中所使用之「甜菜根」是指甜菜的塊根，學名為Beta vulgaris。
在一些實施例中，甜菜根發酵物是由甜菜的塊根經由水浸提後，再依序經由酵母菌、乳酸桿菌及醋酸菌依序進行發酵而製得。
在一些實施例中，甜菜根採用產地為義大利基奧賈(Chioggia)的甜菜的塊根，其剖面可見白色和紅色相間的環狀紋路。
在一些實施例中，甜菜根可包含原始、經乾燥、冷凍或以其他物理方式加工以利於處理之塊根，可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之塊 根。
在一些實施例中，經由水浸提是指以將甜菜根與水依1：10的比例提取而得甜菜根汁。在一些實施例中，甜菜根汁是以甜菜根與水同時進行混合打碎後提取而得。在一實施例中，甜菜根汁是以甜菜根與水混加打碎後再加熱至80℃~100℃持續30~60分鐘提取而得。在一實施例中，甜菜根汁是以甜菜根與水混加打碎後再加熱至95℃持續60分鐘提取而得。
在一些實施例中，甜菜根汁降溫後依序加入酵母菌、乳酸桿菌及醋酸菌進行三階段發酵而製得甜菜根發酵物。在一些實施例中，甜菜根汁不另濾除其內部的固形物(即甜菜根)直接加入菌種進行發酵，以利用菌種進一步提取固形物中的活性成分。
在一實施例中，酵母菌可以是啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。舉例而言，採用寄存編號BCRC20271(國際寄存編號ATCC26602)菌株的啤酒酵母或其他市售啤酒酵母。
在一實施例中，乳酸菌可以是乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。舉例而言，採用寄存編號BCRC910882(國際寄存DSM33286)菌株的乾酪乳桿菌。
在一實施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌(Acetobacter aceti)。舉例而言，採用寄存編號BCRC11688(國際寄存ATCC15973)菌株的乙酸醋酸菌。
在一些實施例中，依序經由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌依序進行發酵(後續簡稱三階段發酵程序)是指在甜菜根汁內加入 0.05%~0.15%w/v的酵母菌並且於室溫下靜置發酵1天~2.5天形成初發酵液，而後加入0.025%~0.01%w/v的乳酸菌並且於室溫下靜置發酵1天~3天以形成次發酵液，最後再加入4%~6%w/v的醋酸菌並且於室溫下靜置發酵3天~10天小時後形成發酵原液。於此，室溫是指28℃到37℃範圍內的溫度。在一些實施例中，較佳地室溫是指30℃。
在一些實施例中，三階段發酵程序是指在甜菜根汁內加入0.1%的酵母菌並且於30℃下靜置發酵1天形成初發酵液，而後加入0.05%的乾酪乳桿菌並且於30℃下靜置發酵1天形成次發酵液，最後再加入5%的醋酸菌並且於30℃下靜置發酵5天後形成發酵原液。
於此，酵母菌、乾酪乳桿菌、醋酸菌之發酵順序無法前後對調或調整。透過先添加酵母菌可以使甜菜根汁發酵以產生酒精，酒精有利提取出甜菜根內不同的有效成份。再透過添加乾酪乳桿菌可以使得初發酵物內的葡萄糖被進一步消耗而降低糖度並且產生乳酸，以降低PH值，較低的PH值有利於進一步提取甜菜根內其他不同有效成分。最後，透過添加醋酸菌可以使得次發酵物內的酒精被消耗，並且再進一步再降低葡萄糖的含量。
在一些實施例中，初發酵液的pH值小於4，且其糖度約為8.5°Bx。在一些實施例中，次發酵液的pH值小於3.5，且其糖度約為6°Bx。在一些實施例中，發酵原液的pH值小於3.5，且其糖度約為3.5°Bx。
在一實施例中，發酵原液內可以添加寡糖以使其糖度達到26°Bx以形成甜菜根發酵物。於此，寡糖係指由3~10個單醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、異麥芽寡糖 等等。在一實施例中，所添加的寡糖可為含40%~70%異麥芽寡糖的寡糖溶液。
在一些實施例中，發酵原液可以以篩網過篩以製得濾液。舉例而言，以200mesh網目的篩網過篩。在一些實施例中，過篩後的濾液再進行減壓濃縮以製得濃縮液，減壓濃縮可以協助去除殘餘的酒精以確保濃縮液內酒精的殘留。於此，減壓濃縮於55~65℃下進行。
在一些實施例中，甜菜根發酵物是發酵原液。在一些實施例中，甜菜根發酵物是濾液。在一些實施例中，甜菜根發酵物是濃縮液。
在一些實施例中，本發明提供一種甜菜根發酵物的用途，其是用於製備促進血液循環、減重或抗老的組合物。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升腸道鐵蛋白含量。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升血液內鐵含量。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以抑制血管鈣化。意即，降低平滑肌細胞鈣離子沉積，可以維持血管彈性。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以減少發炎反應。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以抑制脂肪堆積。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升粒線體活性。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以減少皮膚皺紋。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升抗氧化能力。
在一實施例中，甜菜根發酵物用以提升總抗氧化能力(TAC)及提升抗氧化酵素含量。
在一實施例中，甜菜根發酵物的有效用量為7mL/天。
在一些實施例中，促進血液循環是經由提升腸道鐵蛋白含量、提升血液內鐵含量、抑制血管鈣化、減少發炎反應等上述至少一種功效，以達到促進血液循環的功效。
在一些實施例中，減重是經由減少發炎反應以達到減重的功效。
在一些實施例中，抗老是經由抑制血管鈣化、減少發炎反應、減少皮膚皺紋、提升抗氧化能力、提升總抗氧化能力(TAC)及提升抗氧化酵素含量上述至少一種功效，以達到抗老的功效。
在一實施例中，促進血液循環或減重或抗老的組合物為食品、飲品或營養補充劑，且甜菜根發酵物有效劑量為7mL/日。換言之，食用、飲品或營養補充劑包含特定含量的甜菜根發酵物。在一些實施例中，食品可為一般食品、保健食品、膳食補充品或食品添加物(food additive)。
上述保健食品(food for special health use,FoSHU)也可稱為功能(性)食品(functional food)，是指加工成使得供給營養之外而且有效地表現出生物體調節功能的高效果的食品。在此“功能(性)”是指對人體的結構和功能調節營養素或者對生理學作用等保健用途獲得有用的效果。本發明的食品可以通過本領域常用的方法製備，在上述製備時，可以通過添加本領域通常添加的原料和成分來製備。另外，上述食品的劑型只要被認為是食品的劑型就可以不受限制地製備。本發明的食品用組合物可以以多種形式的劑型製備，並且與一般藥品不同，以食品為原料，因而具有沒有因長期服用藥品而可能產生的副作用等的優點， 具有優異的可攜帶性使得本發明的食品可以作為用於增強免疫增強效果的輔助劑來攝入。
在一些實施例中，前述之食品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於口服的劑型。在一些實施例中，一般食品可為但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)或調味料。
上述組合物可以進一步包含生理學上可接受的載體，並且載體的種類沒有特別限制，並且可以使用本技術領域中常用的任何載體。
另外，上述組合物可以包含通常用於食品中而可提高氣味、味道、視覺等的附加成分。例如，可以包含0.1-5重量%的維生素A、C、D、E、B1、B2、B6、B12、菸鹼酸(niacin)、生物素(biotin)、葉酸(folate)、泛酸(panthotenic acid)等。另外，可以包含鋅(Zn)、鐵(Fe)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、鎂(Mg)、錳(Mn)、銅(Cu)、鉻(Cr)等的礦物質。另外，可以包含賴氨酸、色氨酸、半胱氨酸、纈氨酸等的氨基酸。
另外，上述組合物可以包含氧化防止劑(丁基羥基茴香醚(BHA)、丁基羥基甲苯(BHT)等)、著色劑(焦油色素等)、香料(香蘭素、內酯類等)、成色劑(亞硝酸鈉、亞硝酸鈉等)、防腐劑(山梨酸鉀、苯甲酸鈉、水楊酸、脫氫乙酸鈉等)、漂白劑(亞硫酸鈉)、調味料(MSG谷氨酸鈉等)、甜味料(甘素(dulcin)、甜蜜素(cyclamate)、糖精(saccharin)、鈉等)、膨脹劑(明礬、D-酒石酸氫鉀等)、強化劑、乳化劑、增稠劑(糊料)、皮膜劑、膠基礎劑、泡沫抑制劑、溶劑、改良劑等的食品添加物(food additives)。上述添加物可以根據食品的種類擇一或多進行添加以適當的量。
在一些實施例中，能藉由習知方法於原料製備時添加任一實施例的甜菜根發酵物(即作為食品添加物)，或是於食品的製作過程中添加任一實施例的甜菜根發酵物(即作為食品添加物)，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食用產品。
在一些實施例中，前述之組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有有效含量的甜菜根發酵物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於經腸道或口服的投藥劑型。這些投藥劑型包括，但不限於：錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這些投藥劑型包括，但不限於：注射品(injection)、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。在一些實施例中，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射 (intralesional injection)。
在一些實施例中，醫藥品可進一步包含有被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，醫藥上可接受的載劑可包含下列的試劑中一種或多種：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)。
例一：甜菜根發酵物的製備
原料：甜菜根(學名：Beta vulgaris)的塊根，係採用產地為義大利基奧賈(Chioggia)的常溫甜菜根粉。
接著，將甜菜根粉及水依1：10的比例混合攪打後加熱至95℃，並於加熱達到95℃後持續加熱60分鐘以得到甜菜根汁。並且，甜 菜根汁的溫度降溫至室溫後，即進行後續三階段發酵程序。
於甜菜根汁中加入0.1%w/v的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)並靜置培養24小時以形成初發酵液。於此，啤酒酵母是採用寄存編號BCRC20271的啤酒酵母。
接下來於初發酵液內添加0.05%w/v的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)並靜置培養24小時以形成次發酵液。於此，胚芽乳酸菌採用寄存編號BCRC910882的菌株。
接著，在次發酵液內加入5%w/v的醋酸菌靜置發酵5天以形成發酵原液。於此，醋酸菌是採用寄存編號BCRC11688的醋酸菌。發酵原液的白利糖度小於3(約為2°Bx)，且其酸鹼值(pH值)小於3.5(約為3.4±1)。
將發酵原液過濾得到濾液，將濾液於60℃下及150巴下進行減壓濃縮程序得到濃縮液，添加寡糖至發酵原液以使發酵原液的糖度達到26°Bx以形成甜菜根發酵物。
例二：總多酚含量測試
秤取10.0mg的沒食子酸(Gallic acid)置於10mL容量瓶中，然後以水(H2O)定量至10mL，以得到沒食子酸的儲備溶液(stock solution)。將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100μL沒食子酸的儲備溶液加900μL的水，以得到100μg/mL沒食子酸的初始溶液(即含1000ppm的沒食子酸)。然後，依據下表一配置0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、及100μg/mL之沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至玻璃試管中。加入500μL之福林 酚試劑(Folin-Ciocalteu's phenol reagent，購自Merck)至各玻璃試管內與標準溶液混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液至96孔板中，並測量其在750nm下之吸光值，以獲得標準曲線。
Figure 111132575-A0305-02-0013-1
分別取例一所製備的甜菜根汁作無對照組樣本，例一所製備的甜菜根發酵物作為實驗組樣本。
將各樣本以水稀釋10倍後取100mL到離心管中。接著，加入500μL之福林酚試劑至玻璃試管中與樣本混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。將裝有待測反應溶液的玻璃試管進行震盪以確保無氣泡後，取200μL之待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。
接著，利用標準曲線與內插法將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚含量。於此，可得到甜菜根汁的總多酚含量為137.92μg/mL及甜菜根發酵物的總多酚含量為360.83μg/mL，圖1所示。由此可知，甜菜根透過三階段發酵後，總多酚含量較原本甜菜根汁提高260%。即，相對於甜菜根汁，甜菜根發酵物能大幅提升其總多酚含量。
例三：腸道鐵蛋白含量測試
本測試採用腸道上皮細胞進行，以量測細胞內鐵蛋白含量 以測試細胞對鐵質的吸收力是否提升。
材料：細胞：採用人類結腸細胞C2BBel(ATCC® CRL-2102TM)。
C2BBel培養基：以90%DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium,Gibco)添加10%的胎牛血清(Gibco)、1%的抗生素-抗真菌劑(Gibco)和0.01mg/ml的轉鐵蛋白所製得。
無鐵培養基：最低必需培養基(Gibco)添加10mmol/LPIPES(先過濾NaOH配置為150mg/mL溶液，後過濾取1mL至50mL培養基)、4mg/L氫化可的松(取10uL 20mg/ml氫化可的松至50mL培養基)、5μg Se/L亞硒酸鈉(取1uL 250ug/ml亞硒酸鈉至50mL培養基)、34μg/L三碘甲狀腺原氨酸(取0.17uL 10mg/mL三碘甲狀腺原氨酸至50mL培養基)、5mg/L胰島素(取25uL 10mg/mL胰島素至50mL培養基)、20μg/L表皮生長因子(取10uL 100mg/mL EGF至50mL培養基)以及1X抗生素-抗真菌劑(Gibco)所製得。
人鐵蛋白FTL的ELISA試劑盒，採購自Abcam。
測試流程：首先進行細胞的初培育，在24孔板中各孔分別接種2×104的細胞及500μL的C2BBel培養基，並在37℃下培養14天，並且每3天更換一次培養基。
移除培養基，清洗細胞之後，以無鐵培養基進行培育2天。
將細胞分為空白組、對照組及實驗組，其中，空白組僅更 換新鮮的無鐵培養基同時加入測試樣品和0.1μmol/mL的抗壞血酸(ascorbic acid)，對照組更換新鮮的無鐵培養基同時加入0.25%例一所製得的甜菜根汁和0.1μmol/mL的抗壞血酸，實驗組更換新鮮的無鐵培養基同時加入0.25%例一所製得的甜菜根發酵物和0.1μmol/mL的抗壞血酸。
各組再加入10μmol/mL的FeSO4作為鐵源，並且培育24小時。接著，收獲各組的細胞後，加入200mL的RIPA緩衝液並儲存於-20℃下。最後，使用人鐵蛋白FTL的ELISA試劑盒量測各組細胞內的鐵蛋白含量。
所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖2所示，其中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上相對於對照組的差異越顯著。
測試結果參閱圖2。可知，以空白組的鐵蛋白含量為100%的基礎下，對照組鐵蛋白含量反降到54.09%，實驗組的鐵蛋白含量高達150.5%。換言之，與空白組相較，對照組的人類結腸細胞內鐵蛋白含量沒有提升反而下降，實驗組的人類結腸細胞內鐵蛋白含量顯著提升多達50.5%。
例四：平滑肌鈣沉積測試
本次測試使用β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，後續簡稱β-GP)模擬高磷血症的環境以誘導細胞產生鈣化現象，並觀察甜菜根汁或甜菜根發酵液是否能有效抑制鈣化的發生。基此，藉以瞭解是否 能達到避免血管鈣化。
材料及溶液配置：細胞：人類主動脈平滑肌細胞(Human aortic/smooth muscle cells，簡稱hVSMC細胞，採用寄存編號ATCC Cat.CS-100-012的細胞株)
10莫耳濃度(M)β-甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate stock solution)：將2.1604g的β甘油磷酸鹽(β-glycerophosphate，β-GP，採購自Sigma，型號Cat.G9422)溶於1mL的1xDPBS緩衝液，達最終濃度為10M。
細胞培養基：將Dulbecco改良培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，購自Gibco，11965-092)添加額外成分使其含有10vol% FBS(fetal bovine Serum，購自Gibco，10437-028)及1%青黴素-鏈黴素(購自Gibco，Cat.15140122)。
製備三種測試培養基：以上述的細胞培養基為基底，另添加10mM的β-甘油磷酸鹽的培養基為空白組培養基，另添加有0.25%例一所製備的甜菜根汁與10mM的β-甘油磷酸鹽作對照組培養基，另添加有0.25%例一所製備的甜菜根發酵物與10mM的β-甘油磷酸鹽作為實驗培養基。
10%的甲醛溶液：以滅菌後的雙蒸水將甲醛(formaldehyde，採購自景明，型號Cat.119690010)稀釋10倍。
2%茜素紅染劑：將0.2g的茜素紅(Alizarin red，採購自Sigma，型號Cat.G9422)溶於10mL的雙蒸水，並且震盪均勻後備用。
測試流程：首先，進行細胞的初培育，在六孔板中各孔分別接種2×105的HASMC細胞及2000μL細胞培養液，並在二氧化碳培養箱內培養24小時，並確認hASMC細胞貼附後再進行後續步驟。
將培養盤的各孔中的培養基更換成2mL的測試培養基(空白組培養基、對照組培養基或實驗培養基)，各測試培養基組分別進行三重複試驗。
接下來，在37℃下培養分化14天，其中每二天~三天更換一次測試培養基。於14天培養後，將各組的液體移除，然後以緩衝液沖洗一次。接下來，以10%的甲醛溶液固定hASMC細胞15分鐘。再次將各組的液體移除後，以雙蒸水沖洗一次。然後，加入茜素紅染劑進行染色5分鐘。再次將各組的液體移除後，以雙蒸水沖洗二次，並以顯微鏡觀察並拍照記錄如圖3所示。
測試結果：請參閱圖3，在空白組中有局部範圍(紅色)可視的鈣化區域A，對照組及實驗組中並未見明顯可視的鈣化區域，意即甜菜根汁及甜菜根發酵液對於動脈血管鈣化具有良好的抑制能力，即便在磷酸酶抑製劑所模擬的致病環境下，仍能有效維持血管細胞的健康狀態。也就是說，甜菜根發酵液能有效維持血管的彈性，進行維持較佳的血液循環狀態，提升身體的新陳代謝。
例五：抗發炎反應測試
脂多醣(lipopolysaccharide，簡稱LPS)是格蘭氏陰性菌 產生的一種內毒素，在之前的許多研究中都認為，此內毒素是造成病人產生發炎反應的原因。再由於細胞被LPS影響下會釋放一氧化氮(nitric oxide；NO)到組織中，本次測試藉量測NO的量來了解細胞的發炎狀態。
材料及溶液配置：細胞：小鼠巨噬細胞RAW 264.7(寄存編號ATCC TIB-71的細胞株)。
培養基：90% DMEM，添加有10% FBS(採購自Gibco)、1%青黴素/鏈黴素(Gibco)及4mM L-麩醯胺酸(L-glutamine)(採購自Gibco)。
PBS溶液，採購自Gibco。
脂多醣(LPS)採購自Sigma，產品編號SI-L2880-25MG。
革利士試劑套組(Griess reagent kit)(Life technologies；1445263)。
測試流程：首先，將小鼠巨噬細胞於96孔培養盤的每孔中加入200μL的培養基，並植入1×104個細胞。在37℃、5%二氧化碳的恆溫培養箱中培養24小時後，移除培養基。
之後，將小鼠巨噬細胞分成4組，其中包含空白組、對照組、實驗組01及實驗組02。其中，空白組僅加入培養基，不添加脂多醣或其他樣本，以代表正常代謝下細胞所產生的NO含量，並以其為基準100%。
接下來，在對照組、實驗組01及實驗組02的細胞中皆添加 200ng/mL的脂多醣(LPS)藉以誘發發炎反應，並將0.03125%依據上面例一所製得的甜菜根汁添加至實驗組01的細胞，而將0.03125%依據上面例一所製得的甜菜根發酵物添加至實驗組02的細胞。於此，對照組組、實驗組01及實驗組02是以不含FBS的培養基來配製。上述組別皆進行四重複。
各組細胞培養物在作用24小時後，從每孔中取出150μL的培養液並置入新的96孔培養盤，接而加入130μL的二次水。之後，使用革利士試劑套組來配製革利士試劑(試劑A及試劑B的比例為1：1)，取20μL的體積與96孔培養盤中的培養液進行避光反應30分鐘。接著，於548nm的波長下以微盤分析儀來讀取各孔的吸光值。於此，讀取的吸光值越大，表示NO的濃度越高。
所得結果利用Excel軟體進行student t-test以決定兩個樣本群體之間是否在統計上具有顯著差異，如圖4所示，其中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上相對於對照組的差異越顯著。其中「#」代表p值小於0.05，「##」代表p值小於0.01，以及「###」代表p值小於0.001。當「#」越多時，代表統計上相對於空白組的差異越顯著。
參照圖4可見，與空白組相較之下，對照組的發炎程度顯著提升，這表示LPS確實會誘發巨噬細胞的發炎反應。而與對照組相較之下，實驗組01的發炎程度確實有降低，但尚未達統計學上的顯著。而與對照組相較之下，實驗組02的發炎程度則顯著減少，達到幾乎不發炎的狀態(與空白組相同)。
基此，測試的結果顯示，本發明甜菜根發酵物具有顯著的抗發炎的功效。
例六：甜菜根發酵物的人體試驗
受試者：9位受試者(年齡介於25到55歲的成年人，經常久坐，主訴易產生疲勞感受)。
測試項目及儀器：
1、肌膚皺紋量(Wrinkles)：使用美國Canfield Scientific所販售之VISIA高階數位膚質檢測儀進行檢測，透過高解析度之相機鏡頭對同一受試者在飲用前與飲用後的面部肌膚進行拍攝，藉由標準白光照射、偵測皮膚陰影的變化，即可偵測紋理位置並得到一數值，可代表皮膚的平滑程度。
2、血液樣本委由立人醫事檢驗所進行相關檢測血液中血清鐵含量以及血液內抗氧化指標。其中，血液內抗氧化指標包括抗氧化能力(TAC)與抗氧化酵素二項指標。
測試方式：令9位受試者每日飲用7mL例一所製得的甜菜根發酵物，並連續飲用四周。於飲用前(又稱對照組)及飲用四周後(又稱為實驗組)，分別使用上述儀器設備測定各受試者的面部肌膚狀況，並且抽取各受試者飲用前及飲用後的血液樣本進行檢測。
於此，於飲用前、後進行儀器檢測時，受試者所在的測試區域的溫度與濕度為一致，以減少外界的溫濕度等因素會對皮膚所造成的影響。
需要特別說明的是，圖5中顯示係以相對倍率呈現，即將對照組的定量結果視為100%來將實驗組的定量結果換算成相對於實驗組的表現量。
測試結果：請參考圖5，經過四周的每日飲用甜菜根發酵物後，9位受試者中有6位受試者的面部肌膚皺紋明顯減少，意即受試者改善人數比例達66.7%。9位受試者的平均肌膚皺紋由100%下降為94.5%。意即，每日飲用7mL甜菜根發酵物可以有效減少皺紋達5.5%。
請參閱圖6，經過四周的每日飲用甜菜根發酵物後，9位受試者中有7位受試者的血清鐵含量提升，意即受試者改善人數比例達77.8%。同時，9位受試者的平均血清鐵含量從106μg/dL提升到129.6μg/dL。意即，每日飲用7mL甜菜根發酵物可以有效提升血液內血清鐵含量達22.2%。
請參閱圖7，經過四周的每日飲用甜菜根發酵物後，9位受試者中有8位受試者的體內總和抗氧化能力(Total antioxidant capacity)得到提升，意即受試者改善人數比例達88.9%。同時，9位受試者的平均總和抗氧化能力從0.6提升到0.64。意即，每日飲用7mL甜菜根發酵物可以有效提升血液內總和抗氧化能力達6.7%。
請參閱圖8，經過四周的每日飲用甜菜根發酵物後，9位受試者中有7位受試者的抗氧化酵素濃度提升，意即受試者改善人數比例達77.8%。同時，9位受試者的平均抗氧化酵素濃度從5.4U/g-Hb顯著提升到6.8U/g-Hb。意即，每日飲用7mL甜菜根發酵物可以有效提升血 液內氧化酵素濃度達25.9%。
綜上所述，根據本發明任一實施例的甜菜根發酵物，其可用於製備促進血液循環以達到減重用途的組合物。根據本發明任一實施例的甜菜根發酵物，其可用於製備促進血液循環以達到抗老用途的組合物。根據本發明任一實施例的甜菜根發酵物，其可用於製備促進血液循環或減重或抗老，從而達到避免缺氧性肥胖用途的組合物。換言之，前述之組合物在有效用量為7mL/天下具有下列一種或多種功能：提升腸道鐵蛋白含量、提升血液內鐵含量、抑制血管鈣化、減少發炎反應、抑制脂肪堆積、提升粒線體活性、減少皮膚皺紋、提升抗氧化能力、提升總抗氧化能力(TAC)及提升抗氧化酵素含量等。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (2)

  1. 一種甜菜根發酵物的用途，用於製備抑制血管鈣化的組合物，其中該甜菜根發酵物由打碎的一甜菜根(Beta vulgaris)與水以比例1：10混合後加熱到80℃~100℃持續30~60分鐘，然後加入0.05%~0.15%w/v的一啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)並且於室溫下靜置發酵1天~2.5天，而後加入0.025%~0.01%w/v的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)並且於室溫下靜置發酵1天~3天，最後再加入4%~6%w/v的醋酸菌(Acetobacter aceti)並且於室溫下靜置發酵3天~10天所製得。
  2. 如請求項1所述的用途，其中該甜菜根發酵物用以提升血液內鐵含量。
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