KR102619375B1 - 병풀 발효 추출물을 포함하는 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

병풀 발효 추출물을 포함하는 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 포함함으로써, 비만 및 당뇨에 의해 유발될 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있으므로 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.

Description

병풀 발효 추출물을 포함하는 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating of obesity comprising Centella asiatica fermentation extract}
본 발명은 프로바이오틱스로 발효시킨 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
비만은 심혈관계질환, 고혈압 및 Type II 당뇨병과 같은 다양한 치사성 대사 질환의 원인으로서, 지방세포는 장기형 에너지원으로 지질을 저장할 뿐만 아니라 지방세포 및 비지방세포의 대사와 염증에 관여하는 다양한 adipokine을 분비하여 만성 염증을 유발하고, 인슐린 저항성과 같은 관련 대사성 질환을 야기한다.
최근 들어, 전세계적으로 고열량의 식이와 함께 운동 부족으로 인한 비만으로 Type II 당뇨병으로 알려진 대사 증후군의 발병 증가가 일어나고 있으며, 2025년에는 대사성 증후군 환자가 현재의 2배 즉, 대략 3억 명에 육박할 것으로 예측되고 있다. 복부 비만과 같이 비정상적인 국소 지방 축적에 의한 비만은 고혈압, 고지혈증, 혈액 응고 장애, 혈관 염증, 비정상적인 인슐린 분비증가를 동반한 인슐린 저항성과 같은 동맥 죽종상 병증을 심각하게 유발할 수 있는 다양한 원인을 제공하고, 최종적으로 치사적인 심혈관계 질환에 대한 유병율 증가의 요인이 된다.
지방의 과다한 섭취는 다양한 조직에서 triglyceride(TG)의 축적을 유발하여, 지방분해의 증가를 수반함과 동시에 혈중 순환 지방산의 증가를 초래하고, 지방세포에서 인슐린 저항성을 유발하여, 결과적으로 근육, 췌장 및 간과 같은 비지방세포에서 지방 축적을 일으킨다. 지방세포에서 인슐린 저항성이 유발되면, 잉여의 지방산 결합 및 운반 단백질이 비지방세포의 지방산 흡수 증가를 초래하고, 특히 근육세포의 경우 인슐린 매개성 포도당 대사에 악영향을 미치며, 이와 동시에 췌장에서는 유리 지방산에 장기간 노출되어, 소위 지방독성(lipotoxicity) 기전에 의해 인슐린 분비 장애가 초래되는 악순환이 반복된다. 이 경우, 간에서도 고농도의 유리지방산이 축적되어 인슐린에 대한 저항성이 초래되고, 다량의 포도당을 간에서부터 유리시키기 시작한다. 간세포 내 TG의 축적은 비알코올성 간 지방병증(non-alcoholic fatty liver disease; NAFLD)을 유발하며, 포도당 대사를 주로 담당하는 간세포의 지방축적을 유발하여 지방간염(steatohepatitis)을 이차적으로 일으키고, 최종적으로 간세포의 괴사에 의한 섬유화를 유발한다. 따라서 간세포의 지방 합성과 분해의 균형은 대사 증후군 시 초래되는 인슐린 저항성과 NAFLD의 유발을 억제할 수 있는 중요한 치료 표적이 되어왔다.
현재 다양한 대사증후군 치료제들이 개발되어 있으며, 근래에 들어 적절한 혈당 조절과 함께 당뇨 및 관련 합병증의 주요 병인으로 지목되고 있는 산화 스트레스의 적절한 제어가 당뇨 치료에 가장 핵심적인 방법으로 부각됨에 따라, 부작용이 낮고 보다 효과적인 α-glucosidase 차단제 또는 항산화제들의 개발이 시도되고 있다.
비만의 치료에는 약물 요법 등이 있는데, 약물 요법은 비만치료제를 비만 환자에게 투여하는 치료법이다. 비만치료제의 종류에는 식욕억제제, 대사항진제, 흡수억제제, 열생성 촉진제 등이 있으나, 장시간 섭취시에는 무기력증, 성격변화 등의 문제가 발생한다.
따라서, 상기와 같은 문제점이 발생하지 않는 천연물질을 이용한 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제2132066호 대한민국 등록특허 제1915071호
본 발명의 목적은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 당뇨의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 비만 및 당뇨를 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 병풀 발효 추출물은 병풀 용매 추출물을 균주로 발효시킨 발효 추출물일 수 있다.
상기 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 병풀 용매 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것일 수 있다.
상기 병풀 용매 추출물은 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 700 W의 파워의 초음파기로 5 내지 60분 동안 처리된 것일 수 있다.
상기 초음파 처리 시 추출온도는 50 내지 90 ℃일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 비만 및 당뇨를 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물은 병풀(Centella asiatica) 발효 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물은 비만 및 당뇨에 의해 유발될 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있으므로, 식품 조성물, 나아가 건강기능식품 또는 약학 조성물로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 병풀 발효 추출물의 glucose transporter 4(GLUT4)의 발현을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 병풀 발효 추출물의 PPAR-α발현을 나타낸 도면이다.
본 발명은 프로바이오틱스로 발효시킨 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만 및 당뇨의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 비만 및 당뇨를 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유한다.
상기 병풀(Centella asiatica)은 다년생 포복성 초본으로서 미나리과(Umbelliferae)에 속해있으며, 주로 고온 다습한 곳에서 자생하는 식물로 아프리카, 인도, 스리랑카 등의 습지에서 서식한다. 국내에서는 제주도 및 남부지방의 섬에서 주로 서식하며, 병풀 안의 마데카소사이드(madecassoside) 성분은 오래전부터 피부 궤양 및 상처 등의 치료 시에 사용이 되어왔다.
상기 병풀 발효 추출물은 용매 추출물을 균주로 발효시킨 것이다.
상기 병풀 용매 추출물은 추출용매 하에서 초음파처리를 통해 추출되는 것으로서, 구체적으로 병풀과 추출용매가 1 : 5 내지 25, 바람직하게는 1 : 10 내지 20의 중량비로 혼합되어 20 내지 50 kHz, 바람직하게는 30 내지 40 kHz의 진동수 및 50 내지 700 W, 바람직하게는 150 내지 400 W 파워의 초음파기로 50 내지 90 ℃, 바람직하게는 60 내지 70 ℃하에서 5 내지 60분, 바람직하게는 15 내지 30분 동안 처리된 것이다.
병풀을 추출 시 초음파로 추출하는 것이 아니라 용매로 추출 또는 초고압으로 추출하는 경우에는 유효성분이 소량 추출될 뿐만 아니라 항비만 및 항당뇨 효과가 낮을 수 있다.
상기 병풀과 추출용매의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 추출물에 병풀의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있다.
또한, 초음파기의 진동수 및 파워가 상기 하한치 미만인 경우에는 병풀의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 유효성분 외에 다른 물질도 다량으로 추출되어 효과가 저하될 수 있다.
또한, 추출온도 및 추출시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 병풀의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 폴리페놀 및 알파글루코시데이즈의 열에 의한 변형으로 인해 기능성이 감소할 수 있다.
상기 추출물을 추출하는 추출용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올, 에틸렌글리콜, 에틸에테르 또는 이들의 혼합용매이다. 상기 저급알코올로는 20 내지 99 부피%의 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 프로판올 수용액을 들 수 있으며, 바람직하게는 우수한 항비만 효과를 50 내지 80 부피%의 에탄올 수용액을 들 수 있다.
본 발명의 병풀 발효 추출물은 상기 병풀 초음파 용매 추출물, 바람직하게는 병풀 초음파 에탄올 추출물에 균주를 접종시킨 후 25 내지 50 ℃에서 100 내지 300 rpm으로 10 내지 30일 동안 발효시킨 것이다.
상기 균주로는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 베타-글루코시데아제를 생산한다고 알려진 상기 균주 이외에 다른 균주를 사용하는 경우에는 항비만 및 항당뇨 효과가 없거나 낮을 수 있다.
상기 발효 시 온도, 혼합 속도 및 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 병풀의 유효성분이 적은 양으로 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 생리활성물질의 분해로 인해 원하는 효과가 전혀 발휘되지 못할 수 있다.
본 발명의 병풀 발효 추출물은 약학 조성물 외에 식품 조성물에도 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 '추출물'은 상기 용매를 이용하여 병풀에 포함된 성분을 추출한 추출물, 이들로부터 분획한 분획물, 이들 추출물 또는 분획물을 추가적으로 농축한 농축물, 이를 정제 또는 분리한 정제물도 포함하고, 상기 추출물, 분획물, 농축물 또는 정제물을 건조한 건조물 또는 그를 분쇄한 분말을 포함하는 의미로 사용된다.
상기 정제물의 제조를 위해 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시키거나, 또는 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 부가할 수 있다.
본 발명은 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 '식품 조성물'은 유효성분으로 병풀 발효 추출물 이외에, 식품 제조에 통상적으로 사용되는 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 기재된 식품으로 사용가능한 식품 원료, 식품첨가물 공전에 기재된 식품첨가물을 포함한다.
특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상기 탄수화물은 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 설탕, 유당 등; 올리고당 또는 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 물엿, 사이클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들어 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제는 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 식품 조성물을 제조하는 경우에 병풀 발효 추출물은 비만 및 당뇨 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 함량이면 특별히 한정할 필요는 없으나, 예를 들어 0.1 내지 99 중량%, 0.5 내지 95 중량%, 1 내지 90 중량%, 2 내지 80 중량%, 3 내지 70 중량%, 4 내지 60 중량%, 5 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
상기 식품 조성물에서 유효성분인 병풀 발효 추출물은 섭취자의 상태, 체중, 질병의 유무나 정도 및 기간에 따라 다르지만, 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예들 들어 1일 투여량을 기준으로 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 5 내지 2,000 mg, 더욱 바람직하게는 10 내지 1,000 mg, 더더욱 바람직하게는 20 내지 800 mg, 가장 바람직하게는 50 내지 500 mg일 수 있고, 투여 횟수는 특별히 한정할 필요는 없으나 1일 3회 내지 1주일에 1회의 범위 내에서 통상의 기술자가 조절할 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
상기 식품 조성물은 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 엑스제, 젤리 제형, 티백 제형 또는 음료 제형일 수 있다.
또한 일반 식품에 비만 및 당뇨의 예방 또는 개선의 기능성을 부여하기 위하여 상기 병풀 발효 추출물을 첨가할 수 있으며, 첨가가 가능한 식품은, 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어 식품위생법 제7조에 따른 식품의 기준 및 규격('식품공전')에 예시된 과자류, 빵 또는 떡류, 코코아가공품류 또는 초콜릿류, 식육 또는 알가공품, 어육가공품, 두부류 또는 묵류, 면류, 다류, 커피, 음료류, 특수용도식품, 장류, 조미식품, 드레싱류, 김치류, 젓갈류, 절임식품, 조림식품, 주류, 건포류, 기타 식품류 등에 첨가될 수 있다. 또한 축산물위생관리법 제4조에 따른 축산물의 가공기준 및 성분규격('축산물공전')에 예시된 유가공품, 식육가공품 및 포장육, 알가공품에 첨가될 수 있다.
한편, 상기 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 하는 식품 조성물은 단독으로 "비만 및 당뇨의 예방 또는 개선용 건강기능식품"으로 이용될 수 있다.
상기 '건강기능식품'은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 법적 기준에 따라 제조(가공을 포함)한 식품(건강기능식품에 관한 법률 제3조 제1호)을 말한다. 상기 '건강기능식품'은 국가마다 용어나 범위에 차이가 있을 수 있으나, 미국의 '식이 보충제(Dietary Supplement)', 유럽의 '식품 보충제(Food Supplemnet)', 일본의 '보건기능식품' 또는 '특정보건용식품(Food for Special Health Use, FoSHU)', 중국의 '보건식품' 등에 해당할 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 '식품첨가물공전'의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 따른다.
또한 상기 건강기능식품에는 상기 병풀 발효 추출물과 함께 "비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품"에 사용되는 '기능성 원료'로 고시된 원료 또는 개별인정된 원료로서, Lactobacillus gasseri BNR17, L-카르니틴타르트 레이트, 가르시니아캄보지아껍질추출물, 공액리놀렌산(유리지방산), 공액리놀렌산(트리글리세라이드), 그린마떼추출물, 그린커피빈추출물, 깻잎추출물, 녹차추출물, 대두배아추출물 등 복합물, 돌외잎주정추출분말, 락토페린(우유정제단백질), 레몬 밤 추출물 혼합분말, 마테열수추출물, 미역 등 복합추출물(잔티젠), 발효식초석류복합물, 보이차추출물, 서목태(쥐눈이콩) 펩타이드 복합물, 식물성유지 디글리세라이드, 와일드망고 종자추출물, 중쇄지방산(MCFA)함유 유지, 콜레우스포스콜리추출물, 키토산, 키토올리고당, 풋사과추출폴리페놀, 핑거루트추출분말, 히비스커스 복합추출물 등의 체지방감소와 관련된 건강기능식품 소재를 복합하여 비만 및 당뇨의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 인간, 또는 인간을 제외한 동물에게 상기 조성물을 투여하는 비만의 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 비만 및 당뇨의 예방 또는 치료용 의약, 또는 동물용 의약 제조를 위한 병풀 발효 추출물의 신규 용도를 제공한다.
상기 '약학 조성물'또는 '의약'은 유효성분으로 병풀 발효 추출물 이외에, 약학 조성물 등의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 '담체'는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물이다. 상기 '희석제'는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물이다.
상기 담체, 부형제 및 희석제로는 특별히 한정할 필요는 없으나 예를 들어, 유당, 포도당, 설탕, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 사용량은 환자 또는 치료대상 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 무엇보다도, 치료대상 개체의 상태, 치료 대상 질환의 특정한 카테고리 또는 종류, 투여 경로, 사용되는 치료제의 속성에 의존적일 것이다.
상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 체내에서 활성성분의 흡수도, 배설속도, 환자 또는 치료대상 동물의 연령 및 체중, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증정도 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로 1일 0.1 내지 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 내지 500 mg/kg, 더욱 바람직하게는 5 내지 250 mg/kg, 가장 바람직하게는 10 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 바람직하다. 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 개별적으로 예방제 또는 치료제로서 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 약학조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 트로키제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형으로 제형화하여 사용될 수 있다. 제형화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 설탕 또는 유당, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
상기 비만 및 당뇨의 치료방법은 인간, 또는 인간을 제외한 동물, 특히 포유동물에게 상기 조성물을 투여 하는 것으로, 예를 들어 비만인 치료대상 개체에게 상기 조성물을 투여하는 것이다.
상기 치료를 위한 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수는 상기 약학 조성물, 의약, 동물용 약학 조성물 또는 동물용 의약의 투여량, 투여 방법 및 투여 횟수를 참고할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 병풀 발효 추출물
배양액
류코노스톡 메센테로이데스를 MRS broth에 1% 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양하여 배양액으로 사용하였다.
발효 추출물
병풀과 50 부피% 에탄올 수용액을 1 : 10의 중량비로 혼합하여 초음파기(JAC Ultrasinic, Hwaseng, Korea)에 투입 후 60 ℃ 하에서 초음파(40 kHz, 250 W)를 이용하여 30분 동안 추출한 다음 추출물을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 병풀 초음파 에탄올 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 병풀 초음파 에탄올 추출물을 상온에서 식힌 후 병풀 초음파 에탄올 추출물과 류코노스톡 메센테로이데스를 1 : 2의 중량비로 혼합하여 pH를 6.95~7.05로 조절한 후 상기 혼합액 100 중량부에 당 1 중량부를 추가하여 37 ℃에서 48시간 발효시킨 다음 Homogenizer(HG-15A, DAIHAN, Korea)를 이용해 파쇄하고 pH 4.78±0.05로 조절하여 45 ℃에서 48시간 또 발효한 다음 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 병풀 발효 추출물을 수득하였다.
실시예 2. 병풀 발효 추출물_초음파 생략
배양액
류코노스톡 메센테로이데스를 MRS broth에 1% 접종하여 37 ℃에서 24시간 배양하여 배양액으로 사용하였다.
발효 추출물
병풀과 50 부피% 에탄올 수용액을 1 : 10의 중량비로 혼합하여 80 ℃ 하에서 50분 동안 추출한 다음 추출물을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 병풀 에탄올 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 병풀 에탄올 추출물을 상온에서 식힌 후 병풀 에탄올 추출물과 류코노스톡 메센테로이데스를 1 : 2의 중량비로 혼합하여 pH를 6.95~7.05로 조절한 후 상기 혼합액 100 중량부에 당 1 중량부를 추가하여 37 ℃에서 48시간 발효시킨 다음 Homogenizer(HG-15A, DAIHAN, Korea)를 이용해 파쇄하고 pH 4.78ㅁ0.05로 조절하여 45 ℃에서 48시간 또 발효한 다음 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 병풀 발효 추출물을 수득하였다.
비교예 1. 초음파 추출물
병풀과 50 부피% 에탄올 수용액을 1 : 10의 중량비로 혼합하여 초음파기(JAC Ultrasinic, Hwaseng, Korea)에 투입 후 80 ℃ 하에서 초음파(50 kHz, 700 W)를 이용하여 30분 동안 추출한 다음 추출물을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 병풀 초음파 추출물을 수득하였다.
<시험예>
시험예 1. 폴리페놀 함량 및 항산화능 측정
1-1. 폴리페놀 함량(mg GAE/g DW): 폴리페놀은 식물의 2차 대사 산물로서 대표적인 생리활성 기능은 항돌연변이, 항암, 항염증 및 항비만 등이 있으며 최근에는 페놀 화합물이 탄수화물과 지질 분해효소 활성저해로 탄수화물과 지질의 분해와 소화를 지연시켜 항비만 기능성이 있다고 알려져 이에 대한 연구가 주목받고 있다.
Folin-Denis 방법을 변형하여 측정하였으며, folin-ciocalteu's 페놀 용액(Folin & Ciocalteu's phenol; Sigma-Aldrich, USA)을 시료에 첨가하여 폴리페놀 화합물에 의해 환원되어 발생하는 몰리브덴 청색발색 반응을 원리로 하였다. 시료 0.14 ㎖에 0.2 N F.C용액을 첨가하여 10분 동안 방치 후 7.5% Na2CO3 0.56 ㎖을 첨가하여 1시간 동안 반응시켜 흡광도 값을 756 nm에서 측정하였다. 표준물질로 gallic acid(Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였고, 단위는 작성한 gallic acid 검량선과 비교하여 mg gallic acid equivalent(GAE)/g dry weight(DW)로 표시하였다.
1-2. 항산화능(%): 추출물에 0.1 M DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)용액을 첨가 후 암실에 20 min 발색을 시킨 뒤 517 nm 의 파장에서 흡광도를 측정하였고, ascorbic acid를 대조군으로 사용하여 대조군의 흡광도를 기준으로 아래의 계산식을 이용하여 항산화능을 백분율로 표시하였다.
[수학식 1]
라디칼 소거활성(%)=[(1-시료의 흡광도)/대조군의 흡광도)]X100
구분 실시예 1 실시예 2 비교예 1
폴리페놀
(mg GAE/g DW)		 28.10±1.12 21.11±0.85 17.15±0.63
항산화능
(%)		 42.26±2.46 34.15±1.20 25.53±1.43
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 및 2에 따라 제조된 병풀 발효 추출물은 비교예 1에 비하여 항비만 기능성이 있다고 알려진 폴리페놀의 함량 및 항산화능이 우수한 것을 확인하였다.
시험예 2. α-글루코시다아제 저해활성(GAI) 및 리파아제 저해활성(LAI) 측정
2-1. α-글루코시다아제 저해활성(%): α-글루코시다아제 저해제(α-glucosidase inhibitors)는 일부의 식물이나 미생물에 분포하며, 올리고당을 단당류로의 분해를 억제하는 작용을 하는 물질이다. α-글루코시다아제 활성의 저해는 장내에서 당류의 원활한 흡수를 저해함으로써 비만예방과 식후 혈당상승 억제와 같은 효과가 있다.
시료 50 μL에 α-glucosidase와 potassium phosphate buffer (pH 6.8)을 혼합하여 37 ℃에서 15분간 반응시킨 후 기질 p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside을 첨가하여 37 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 반응액에 0.1 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시키고 405 nm에서 흡광도를 측정하여 p-nitrophenol을 측정하였다. 활성 비교를 위해 양성대조군으로 acarbose를 사용하였다.
2-2. 리파아제 저해활성(LAI)(%): 체장에서 분비되는 리파아제(lipase)는 식품을 섭취했을 때 지방인 triacylglycerol를 2-mono acylglycerol과 fatty acid로 가수분해하는 효소로 분해된 2-monoacylglyerol과 fatty acid가 소장의 점막 세포에서 흡수되어 에너지원과 인체 내 구성성분으로 사용되며 다시 triacyglyceol로 합성되어 체내의 지방세포에 축척되므로 비만의 원인이 된다. 지방대사의 주요효소로 작용하는 리파아제 활성의 저해를 통해 triglyceride의 분해를 방지하여 흡수를 방지함으로써 배설을 통해 체내의 지방축적을 통한 비만 예방이 가능하다
LIA 측정은 Porcine pancreatic lipase에 10 mM MOPS와 1 mM EDTA (pH 6.8)와 tris 완충용액을 첨가하여 37 ℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 p-nitrophenyl butyrate를 첨가하여 다시 37 ℃에서 반응을 진행하고 P-Nitrophenyl butyrate가 p-nitrophenol로 가수분해된 정도를 흡광도로 측정하였다. 이때, 활성 비교를 위하여 양성대조군으로 orlistat를 사용하였다.
구분 실시예 1 실시예 2 비교예 1
α-글루코시다아제 저해활성(%) 57.48±3.22 49.66±1.29 37.02±1.30
리파아제 저해활성(%) 61.59±2.06 57.80±2.02 44.42±2.82
위 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1 및 2에 따라 제조된 병풀 발효 추출물은 비교예 1에 비하여 α-글루코시다아제 저해활성이 우수한 것을 확인하였다. 탄수화물 대사의 건효소(key enzyme)로 작용하는 알파아밀레즈의 리파아제(lipase)의 활성을 저해하면 다당류가 분해되지 못하여 체내의 지방축적을 예방할 수 있어 비만예방 효과가 있다. 따라서 실시예 1 및 2의 병풀 발효 추출물이 효과적인 α-글루코시다아제 저해를 통한 단당 생산 저해 및 조절을 통한 비만을 예방하는 가능성이 높을 것으로 판단된다.
또한, 비만은 지방전구세포의 분화 및 지방생성과정에 의하여 지방세포 내 중성지방 (triglyceride, TG)의 축적으로 발생하므로 지방생성기전을 조절하는 것이 비만 치료에 효과적인 방법으로 알려져 있는데, 본 발명의 실시예 1 및 2에 따라 제조된 병풀 발효 추출물이 비교예 1에 비하여 리파아제 저해능이 우수하므로 비만 치료에 효과적이다.
시험예 3. 항비만 단백질 발현 확인(Western-blotting)
3T3-L1 cell을 배양 및 분화시킨 뒤 lysis buffer를 첨가하여 lysis 시킨 후 브래드포드법을 이용하여 단백질을 정량하여 단백질 농도를 동일하게 조정하여 SDS-PAGE를 이용하여 전기영동하였다. 전기영동하여 분리한 단백질은 transfer membrane을 사용하여 transfer buffer를 사용하여 transfer시키고 5% non-fat skim milk solution으로 블록킹한 후 1차 항체 GLUT4, PPAR-α, β-actin 항체 반응을 수행하여 멤브레인에 ECL 탐지 키트로 처리하고 X-ray 필름에 노출하여 현상하여 단백질 발현정도를 비교하였다.
지방전구세포인 3T3-L1은 지방세포를 형성하는 여러 종류의 전사인자와 호르몬으로 인해 세포 내에 중성지방을 축적하게 된다. PPAR-α 단백질은 근육과 간세포에서 발현되어 미토콘드리아 내의 베타 산화과정을 조절하는 기능으로 단백질 발현 증가 시 지방산의 생성과 초저밀도 저단백 콜레스테롤 생산을 감소시킨다. 최근에는 포만감을 형성하여 식욕을 억제시킴으로서 체중 감소를 유도한다는 보고가 있어 비만 치료제의 개발에 있어서 PPAR-α이 항비만 작용에 있어 주요한 단백질로 인식되고 있다. 또한, 혈액 내 포도당을 세포 내로 이동시키는 glucose transporter 4(GLUT4)의 발현을 통해 세포 표면에서 순환 포도당이 농도 구배로 근육과 지방 세포로 확산되는 것을 촉진되어 당의 소비를 촉진시키는 동시에 혈당을 조절하여 항비만과 혈당조절에 중요한 기능을 한다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 병풀 발효 추출물의 glucose transporter 4(GLUT4)의 발현을 나타낸 도면이다.
도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 병풀 발효 추출물이 혈액 내 포도당을 세포 내로 전달하는 역할을 하는 GLUT4(glucose transporter 4)의 발현에 영향을 주는 것으로 인슐린 신호전달체계에 중요한 역할을 하며 glucose transporter 4(GLUT4)의 장애 발생 시, 혈액 내 혈당의 축적으로 인한 고혈당이 초래된다.
실시예 1의 병풀 발효 추출물이 혈액 내 포도당을 세포내로 이동시 주요 단백질인 GLUT4에 미치는 영향을 확인하였을 때, 실시예 1의 병풀 발효 추출물의 농도가 증가함에 따라 GLUT4의 발현이 증가함이 확인하였다. 따라서 실시예 1의 병풀 발효 추출물은 탄수화물과 지질 소화 관련 효소의 활성을 저하시킬 뿐만 아니라 GLUT4 단백질 발현을 증가시켜 항비만 및 혈당강하 효과가 있다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 병풀 발효 추출물의 PPAR-α발현을 나타낸 도면이다.
PPAR-α 단백질은 근육과 간세포에서 발현되어 미토콘드리아 내의 베타 산화과정을 조절하는 기능으로 단백질 발현 증가 시 지방산의 생성과 초저밀도 지단백 콜레스테롤 생산을 감소시킨다. 최근에는 포만감을 형성하여 식욕을 억제시킴으로서 체중 감소를 유도한다는 보고가 있어 비만 치료제의 개발에 있어서 PPAR-α이 항비만 작용에 있어 주요한 단백질로 인식되고 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 병풀 발효 추출물의 항비만 기작 평가를 위해 실시예 1의 병풀 발효 추출물을 0.0-0.8 mg/mL로 처리하고 세포배양 후 PPAR-α 발현 정도를 Western blotting을 이용하여 확인하였다. 그 결과 실시예 1의 병풀 발효 추출물의 농도에 따라 의존적으로 PPAR-α 발현이 증가하므로 항비만 효과가 있다.
실시예 1의 병풀 발효 추출물은 PPAR-α의 발현 증가로 지방베타산화를 활성화시켜 지방산의 대사를 촉진시키며, GLUT4 발현을 통한 혈당 감소를 통해 지방분화의 억제, 지질함량의 감소를 수행하므로, 항비만과 항당뇨 효과가 있음을 확인하였다.
아래에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
실시예 1의 추출물 분말 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2: 정제의 제조
실시예 1의 추출물 분말 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3: 캡슐제의 제조
실시예 1의 추출물 분말 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4: 과립제의 제조
실시예 1의 추출물 분말 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 5: 음료 제형의 제조
실시예 1의 추출물 분말 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

Claims (7)

  1. 병풀(Centella asiatica) 초음파 추출물을 균주로 발효시킨 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 병풀 초음파 추출물은 병풀을 50 내지 80 부피%의 에탄올 수용액 하에서 초음파로 추출한 추출물이고, 상기 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비만 및 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 병풀 초음파 추출물은 병풀을 50 내지 80 부피%의 에탄올 수용액 하에서 20 내지 50 kHz의 진동수 및 50 내지 700 W의 파워의 초음파기로 5 내지 60분 동안 처리한 것을 특징으로 하는 비만 및 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 초음파 처리 시 추출온도는 50 내지 90 ℃인 것을 특징으로 하는 비만 및 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 병풀(Centella asiatica) 초음파 추출물을 균주로 발효시킨 병풀 발효 추출물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 병풀 초음파 추출물은 병풀을 50 내지 80 부피%의 에탄올 수용액 하에서 초음파로 추출한 추출물이고, 상기 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 비만 및 당뇨의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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