KR102319714B1 - 신규 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 이용한 새싹땅콩 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 새싹땅콩 발효물을 포함하는 변비 개선용 조성물 - Google Patents
신규 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 이용한 새싹땅콩 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 새싹땅콩 발효물을 포함하는 변비 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 이용한 새싹땅콩 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 새싹땅콩 발효물을 포함하는 변비 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 새싹땅콩 발효물을 이용하면 배변 활동이 원활하고 대장 내에 남아있는 변의 수를 감소시키므로, 장 기능 및 변비 개선을 위한 건강기능식품 또는 의약품 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 이용한 새싹땅콩 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 새싹땅콩 발효물을 포함하는 변비 개선용 조성물에 관한 것이다.
변비는 서구화된 식사와 불균형한 영양섭취로 인한 영양불량으로 나타나는 대표적인 질환으로 일반적으로 배변이 작거나 건조하고 딱딱한 변의 배출이 어렵거나 변의 배출이 일주일에 2∼3회보다 드문 경우에 나타나는 소화기 질환의 일종으로, 전 인구의 5∼20%에서 호소할 만큼 자주 경험하지만 환자마다 표현하는 내용이 매우 다양하며 하나의 증상군이기 때문에 객관적으로 정의하기 쉽지 않다. 변비환자 중 90% 이상이 원인 질환 없이 특발성으로 발생하는 만성 변비이며 기질적인 장관 내 병소, 대사성 질환, 특정 약물의 복용 등 변비를 유발하는 원인으로 인해 이차적으로 발생하는 변비로 나눌 수 있다. 만성 변비는 삶의 질을 저해하고 결장 및 직장암을 유발하는 위험성과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 변비의 치료에 있어서 중요한 것은 식이요법으로, 충분한 식이섬유 섭취는 변비의 예방 및 치료에 가장 적합하고 일차적으로 사용할 수 있는 것으로 장내 효소에 의해 소화되지 않는 식물 유래 성분이며, 대장 내에서 물을 흡수하여 변을 연하게 하고 부피를 크게 한다. 또한, 대장 내 유익세균의 성장을 도와서 변괴를 크게 하고, 일부 성분은 대장 내 유익세균에 의해 발효되며 그 대사물 역시 변비 완화작용에 도움이 된다. 그 외에 신체적 활동이 많은 사람이 변비가 적다는 보고가 있다. 그러나 식이요법과 운동 등이 용이하지 않은 환자의 경우 이차적으로 약물을 사용하는데 부피형성 완화제 및 삼투성 완화제의 경우 복부팽만, 설사 등이 동반될 수 있으며 자극성 약제의 경우 장기간 사용 시 다양한 합병증을 유발할 수 있다. 이러한 치료약물의 부작용을 고려하였을 때 변비의 예방 및 치료에 효과가 있는 식품 또는 천연소재의 탐색 및 연구가 보다 활발해야 할 것이다.
땅콩(Arachis hypogagea L.)은 콩과(Leguminosae)에 속하는 일년생 초본 식물로 지방질과 단백질을 다량 함유하고 있는 고열량 식품이지만, 발아시켜 새싹땅콩이 되면 비타민 C, 니아신아미드(niacinamide), 피리독신(pyridoxine) 및 티아민(thiamin)의 함량 증가와 함께 항산화에 효과적인 생리활성 물질인 레스베라트롤(resveratrol) 성분이 90배 이상 증가하는 것으로 보고되고 있다. 레스베라트롤은 적포도, 땅콩, 오디 등에 함유되어 생리활성 폴리페놀로서, 씨앗에서 싹이 나와 일주일 정도 발아된 발아채소의 경우 일반채소와 비교하여 크기는 작지만 성숙채소에 비해 레스베라트롤을 포함한 영양소 함량이 성숙채소와 비교하여 월등히 높다는 연구 결과가 보고된 바 있다. 이렇듯 새싹땅콩은 영양소와 생리활성 성분이 풍부하여 기능성 식품소재로서의 이용범위가 광범위할 것으로 기대되는 소재로서, 몇 년 전부터 피토스테롤(phytosterol)에 대한 연구가 활발해지며 국내외 연구자들이 국내에서는 주로 새싹땅콩 및 땅콩 부위별 레스베라트롤 함량에 대한 연구 및 임상실험에 대한 연구가 이루어지고 있으나, 실제로 식품에서는 새싹땅콩을 첨가한 요구르트 정도에 그치고 있는 실정이며, 해외 연구 또한 다양한 식품원료의 레스베라트롤 함량 비교 및 노화억제, 항암효과, 항염증 등의 항산화 활성 연구가 대다수로 새싹땅콩을 이용한 가공제품 연구와 개발은 미미하여 많은 개발 가능성을 가지고 있다.
최근 새싹땅콩의 효능이 알려지면서 땅콩 새싹의 특성과 항비만, 항염증 등에 대한 다양한 연구가 수행되었다. 새싹땅콩의 생리활성으로는 대식세포의 염증 조절인자로 알려진 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 또는 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 억제하여 항염증 작용과 항산화 작용이 대표적이다. 그 외에도 풍부하게 함유된 카페인산이 산화적 손상으로부터 세포를 효과적으로 보호하며, Nrf2(Nuclear respiratory factor 2)의 활성화 및 자외선-B(Ultraviolet-B) 유도 산화 스트레스에 대한 효율적인 세포 보호의 효과가 있다. 또한 신경세포에서 글루타메이트(glutamate)에 의한 보호 효과가 나타나며, 새싹땅콩 추출물은 아디포넥틴의 발현을 조절하는 PPAR-γ(peroxisome proliferator-activated receptor)의 발현을 낮추고 지방세포분화의 중요한 조절 인자인 MMP-2(matrix metalloproteinase-2)와 MMP-9(matrix metallopeptidase 9)를 감소시킴으로써 지방세포 증식과 분화를 억제하는 항비만 효과가 있다. 또한 최근 연구에 의하면 새싹땅콩 추출물은 PDE(phosphodiesterase) 활성을 저해함으로써 발기부전 증상을 완화하고 고환 내 세포의 산화적 스트레스를 완화하며, 테스토스테론(testosterone)과 같은 호르몬 합성을 증가시켜 전립선비대증 외에 호르몬 저하로 인해 발생하는 남성 갱년기 증상에도 효과를 보일 것으로 기대되고 있다.
유산균은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물 중의 한 종류로서, 비병원성균으로 인간의 장내에 서식하면서 정장 및 정균 작용을 할 수 있고 당류를 발효해서 다량의 젖산을 생성하고 낮은 pH 및 혐기적인 조건에서도 잘 생육하며 여러 가지 영양물질을 요구하는 등의 특징을 가지고 있다. 유산균에 의해 채소류가 발효되면 독특한 향과 맛을 내게 되어 관능적 특성이 향상되고, 유기산에 의하여 비타민 C와 여러 생리활성물질이 잘 보존되며, 초기 재료에는 거의 존재하지 않았던 비타민 B12와 비타민 K가 합성되고 부패균과 병원성균의 성장과 증식을 저해하여 위생적인 식품이 되는 등의 장점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 식물성 유산균은 김치와 장류 등의 발효식품 및 과일과 같은 식물성 식품에서 생식하는 유산균으로 우유나 치즈에 함유된 동물성 유산균과는 구분이 된다. 일본 유산균 식품학회지의 자료에 따르면 식물성 유산균의 종류는 200여 종으로 동물성 유산균 10여 종보다 그 수가 더 많으며 무엇보다 가장 큰 특징은 강인한 생존력을 들 수 있다. 특히 식물성 유산균은 인공 위액(pH 2.5) 내 생존율이 90% 이상이나 영양균형이 맞는 환경에서 생식하는 동물성 유산균은 20~30% 정도에 그치는 것으로 알려져 있다. 채식 위주의 식생활을 해온 동양인은 서양인보다 장(腸)의 길이가 더 길어 동물성 유산균에 비해 식물성 유산균을 통한 유산균 섭취가 효과적인 것으로 알려져 있다. 식물성 유산균에 대한 연구는 유산균에 대한 특성을 탐색하는 등 주로 약학적 효과에 대한 연구와 발명, 유산균 배양법 및 발효기간에 따른 특성 등의 연구와 발명 등이 있다.
한편, 한국공개특허 제2015-0139004호에는 '새싹땅콩 다중발효 방법 및 새싹땅콩 다중발효물을 포함하는 조성물'에 대해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2015-0093053호에는 '발아 땅콩에서 레스베라트롤의 함량을 증가시키는 방법, 이를 통해 제조된 발아 땅콩 추출물 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '신규 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 이용한 새싹땅콩 발효물의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 새싹땅콩 발효물을 포함하는 변비 개선용 조성물'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 발효식품으로부터 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주가 β-글루코시다아제 활성이 우수하고, 새싹땅콩 추출물을 포함하는 배지에서 생장능이 우수함을 확인하였다. 상기 DU.La.P-11 균주를 이용하여 새싹땅콩 추출물을 발효함에 있어, 새싹땅콩 추출물 농도, 발효시간 및 부원료인 과채 혼합 농축액 농도 조건을 최적화함으로써 레스베라트롤 함량이 현저하게 증진된 새싹땅콩 발효물을 제조하였으며, 새싹땅콩 발효물 또는 이를 포함하는 음료를 변비가 유도된 동물모델에 식이하였을 때, 변비 개선 효과가 우수하다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 새싹땅콩의 농축액을 준비하는 단계; (2) 상기 (1)단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 과채 혼합 농축액을 혼합하고 살균하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주를 접종하여 발효하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤(resveratrol) 함량이 증진된 새싹땅콩 발효물의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 레스베라트롤 함량이 증진된 새싹땅콩 발효물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 새싹땅콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 변비 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 새싹땅콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 변비 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 새싹땅콩 발효물을 이용하면, 배변 활동이 원활하고 대장 내에 남아있는 변의 수를 감소시키므로, 장 기능 및 변비 개선을 위한 건강기능식품 또는 의약품 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 발효식품으로부터 분리된 11종의 유산균 배양액을 브로모크레졸퍼플(BCP; Bromocresol purple)이 첨가된 MRS 한천배지에 도말하여 배양한 사진이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 4는 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 유산균수에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 5는 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 유산 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 6은 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 레스베라트롤 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 7은 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 유산균수, 유산 함량 및 레스베라트롤 함량에 대한 최적 발효조건에 대해 수퍼임포징(superimposing)한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 8은 새싹땅콩 추출물을 페디오코커스 펜토사세우스 DU.La.P-11 균주를 이용하여 최적 발효조건으로 발효시켰을 때, 발효 전후의 레스베라트롤 크로마토그램 결과이다. (A): 표준크로마토그램, (B): 발효전 새싹땅콩 추출물, (C): 새싹땅콩 발효물.
도 9는 로페라마이드(loperamide) 투여로 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 변의 개수를 측정하여 나타낸 그래프이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 10은 로페라마이드 투여로 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 변의 중량을 측정하여 나타낸 그래프이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 11은 로페라마이드 투여로 인해 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 변의 수분함량을 측정하여 나타낸 그래프이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 12는 로페라마이드 투여로 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 대장 내 남아있는 변의 크기 및 형태를 나타낸 사진이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 2는 본 발명에서 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 4는 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 유산균수에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 5는 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 유산 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 6은 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 레스베라트롤 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 7은 발효시간, 새싹땅콩 추출물의 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액)의 농도에 따른 새싹땅콩 발효물의 유산균수, 유산 함량 및 레스베라트롤 함량에 대한 최적 발효조건에 대해 수퍼임포징(superimposing)한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 8은 새싹땅콩 추출물을 페디오코커스 펜토사세우스 DU.La.P-11 균주를 이용하여 최적 발효조건으로 발효시켰을 때, 발효 전후의 레스베라트롤 크로마토그램 결과이다. (A): 표준크로마토그램, (B): 발효전 새싹땅콩 추출물, (C): 새싹땅콩 발효물.
도 9는 로페라마이드(loperamide) 투여로 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 변의 개수를 측정하여 나타낸 그래프이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 10은 로페라마이드 투여로 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 변의 중량을 측정하여 나타낸 그래프이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 11은 로페라마이드 투여로 인해 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 변의 수분함량을 측정하여 나타낸 그래프이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
도 12는 로페라마이드 투여로 유도된 변비 동물모델을 대상으로 본 발명의 새싹땅콩 발효물 및 이를 포함하는 음료를 식이하였을 때, 대장 내 남아있는 변의 크기 및 형태를 나타낸 사진이다. Normal; 정상군, Control; 로페라마이드 투여로 변비 유발군, PC; 로페라마이드 투여 및 상업용 변비제 식이군, S1; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 식이군, S2; 로페라마이드 투여 및 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이군.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 새싹땅콩의 농축액을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 과채 혼합 농축액을 혼합하고 살균하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주를 접종하여 발효하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤(resveratrol) 함량이 증진된 새싹땅콩 발효물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 새싹땅콩 발효물의 제조방법에서, 상기 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) 균주는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주로, 한국생명공학연구원에 2018년 12월 20일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC13781BP). 상기 기탁된 특정 균주는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성이 높고, 새싹땅콩 추출물이 첨가된 배지에서 생장능이 우수한 균주이며, 상기 균주를 이용하여 새싹땅콩 발효물을 제조할 경우, 특정 기능성 성분인 레스베라트롤(resveratrol) 함량이 증진된 새싹땅콩 발효물을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 새싹땅콩 발효물의 제조방법에서, 상기 과채 혼합 농축액은 바나나 농축액, 복숭아 농축액, 망고 농축액, 딸기 농축액, 무화과 농축액, 토마토 농축액, 당근 농축액, 양배추 농축액 및 브로콜리 농축액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 과채 혼합 농축액은 갈락토올리고당(galacto-oligosaccharide), 말토올리고당(malto-oligosaccharide), 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide) 및 이소말토올리고당(isomaltooligosaccharide)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 첨가하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 새싹땅콩 발효물의 제조방법은, 구체적으로는
(1) 새싹땅콩에 새싹땅콩 중량 대비 5~20배의 물을 첨가하여 추출한 추출물을 감압 농축하여 1~30 Brix의 새싹땅콩 농축액을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 1~20 Brix의 과채 혼합 농축액을 새싹땅콩 농축액 중량 대비 1~20%(v/v) 혼합하고 살균하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 기탁번호가 KCTC13781BP인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주를 상기 혼합물 중량 대비 0.1~20%(v/v) 접종하고 30~45℃에서 50~60시간 동안 발효하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으며,
보다 구체적으로는
(1) 새싹땅콩에 새싹땅콩 중량 대비 7~15배의 물을 첨가하여 추출한 추출물을 감압 농축하여 8~15 Brix의 새싹땅콩 농축액을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 3~10 Brix의 과채 혼합 농축액을 새싹땅콩 농축액 중량 대비 5~18%(v/v) 혼합하고 살균하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 기탁번호가 KCTC13781BP인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주를 상기 혼합물 중량 대비 1~10%(v/v) 접종하고 35~40℃에서 52~58시간 동안 발효하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(1) 새싹땅콩에 새싹땅콩 중량 대비 7~15배의 물을 첨가하여 추출한 추출물을 감압 농축하여 9~11 Brix의 새싹땅콩 농축액을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 4~6 Brix의 과채 혼합 농축액을 새싹땅콩 농축액 중량 대비 5~18%(v/v) 혼합하고 살균하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 기탁번호가 KCTC13781BP인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주를 상기 혼합물 중량 대비 1~10%(v/v) 접종하고 35~40℃에서 53~57시간 동안 발효하는 단계;를 포함하는 것일 수 있으며,
더더욱 구체적으로는
(1) 새싹땅콩에 새싹땅콩 중량 대비 10배의 물을 첨가하여 추출한 추출물을 감압 농축하여 10 Brix의 새싹땅콩 농축액을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 5 Brix의 과채 혼합 농축액을 새싹땅콩 농축액 중량 대비 8.5%(v/v) 혼합하고 살균하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 기탁번호가 KCTC13781BP인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주를 상기 혼합물 중량 대비 2%(v/v) 접종하고 37℃에서 55시간 동안 발효하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 레스베라트롤 함량이 증진된 새싹땅콩 발효물을 제공한다.
본 발명의 새싹땅콩 발효물의 맛과 향을 더욱 향상시키기 위해, 사과, 감, 블루베리, 블랙베리, 블랙커런트, 아사이베리, 복분자, 석류, 포도, 배, 복숭아, 바나나, 딸기, 토마토, 당근, 자두, 매실, 앵두, 다래, 오디, 머루, 키위, 참외, 귤, 오렌지, 자몽, 귤, 멜론, 체리, 멜론, 블랙수퍼베리, 망고, 레몬 및 파인애플로부터 선택되는 하나 이상의 과일 추출물을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 새싹땅콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 변비 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조하거나, 다른 식품 또는 식품의 성분에 첨가하여 제조될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다.
본 발명의 유효성분을 첨가할 수 있는 식품의 일례로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료 제형으로 제조될 경우에는 상기 새싹땅콩 발효물 이외에 프락토올리고당(fructooligosaccharide), 폴리덱스트로스(polydextrose), 구연산(citric acid), 비타민 C(vitamin C), 효소처리 스테비아(enzymatically modified stevia), 현미 농축액 및 포도 농축액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 새싹땅콩 발효물 100 중량부에 대하여 1∼5 중량부의 프락토올리고당(fructooligosaccharide), 1∼5 중량부의 폴리덱스트로스(polydextrose), 0.01∼1 중량부의 구연산(citric acid), 0.01∼1 중량부의 비타민 C(vitamin C), 0.01∼0.05 중량부의 효소처리스테비아(enzymatically modified stevia), 1∼5 중량부의 현미 농축액 및 1∼10 중량부의 포도 농축액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 새싹땅콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 변비 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하여 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 새싹땅콩 발효물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 새싹땅콩 발효물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 새싹땅콩 발효물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 새싹땅콩 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 올리고당, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 새싹땅콩 발효물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 상기 새싹땅콩 발효물은 1일 00001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 새싹땅콩 발효물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험재료 및 방법
1.
유산균 선정
1) 유산균의 분리
유산균 분리에 사용한 발효식품 시료는 가정집 및 음식점에서 담근 김치 수십 종 및 침채류 등을 수집하여 유산균 분리 시료액으로 사용하였으며, 각 시료액을 멸균증류수로 10-1~10-5으로 희석한 후 0.004% 브로모크레졸퍼플(BCP; Bromocresol purple)가 첨가된 시판용 MRS 한천배지에 100㎕씩 분주하여 도말하고, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 독립된 콜로니 중 유산균의 특징적인 콜로니를 순수 분리하였다. 순수 분리한 유산균은 MRS 한천사면배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 4℃ 냉장보관하였다.
2) 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성 균주 선발
베타-글루코시다아제 활성을 갖는 균주의 선발을 위해, 에스쿨린(esculin)이 함유된 에스쿨린 한천배지(esculin 0.1%, peptone 1.8%, ferric citrate 0.1%, agar 2%)에 균주를 접종하여 배지 내에서의 색깔 변화를 관찰하였다. 에스쿨린은 베타-글루코시다아제에 의하여 글루코스(glucose)와 에스쿨레틴(esculetin)으로 분리되며 에스쿨레틴은 페릭 암모니움 시트레이트(ferric ammonium citrate)와 반응하여 콜로니 주위에 검은색 반점(black complex)을 형성하게 된다. 따라서 에스쿨린 한천배지에서 배양된 콜로니 주위에 검은색 반점를 형성하는 균주를 베타-글루코시다아제 활성을 가지는 균주로 판단하여 선별하였다.
3) 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성능 측정
베타-글루코시다아제 활성 측정은 1% 카르복시메틸셀룰로오스(CMC; carboxymethyl cellulose)가 첨가된 시판용 MRS 액체배지에 12시간 전배양한 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 배양액을 4℃에서 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 0.5ml의 상층액을 취하여 5mM ρ-NPG(ρ-nitrophenyl-β-D-glucopynanoside) 용액 1ml과 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액은 1M 탄산나트륨(Na2CO3) 용액 1ml을 첨가하여 반응을 중지시키고, 생성된 파라-니트로페놀(ρ-NP; p-nitrophenol)을 405nm에서 흡광도를 측정한 후 파라-니트로페놀의 검량곡선을 이용하여 농도를 환산하였다.
4) 분리 유산균의 새싹땅콩 추출물 농도에 따른 균 생장실험
새싹땅콩 추출물을 농도별로(5, 10, 15, 20, 50 및 100%(v/w)) 첨가한 MRS 한천배지에 분리 균주를 획선도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균의 생장정도를 관찰하였다.
5) 새싹땅콩 추출물의 발효 검토
분리 균주의 새싹땅콩에 대한 발효능을 조사하기 위해 새싹땅콩 10%(w/v)를 첨가하여 추출한 추출물을 기본 배지로 하여 선별된 유산균을 MRS 액체배지에 12시간 전배양 후 2%(v/v) 접종 후 발효시간을 달리하여 발효하였다.
6) 최종 선별균주의 염기서열 분석 및 계통분류
최종 선별된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 시퀀싱(sequencing) 분석 후, NCBI 데이터베이스를 이용하여 분리 균주와 데이터베이스상의 표준균주(type strain)의 유사성(similarity, %)을 확인하였다.
2. 새싹땅콩 추출 처리 조건
본 발명에서 사용된 새싹땅콩 원료는 2018년에 7월에 수확된 것 중 길이가 10cm 전후의 것을 구입한 후, 일정한 크기로 잘라 10배수의 물을 가하여 68℃에서 7시간 추출하였다. 이들 추출물을 감압 농축하여 최종 농도를 15 Brix로 하여 유산발효를 위한 원료로 농도 조정하여 사용하였다.
3. 새싹땅콩 발효 조건
1) 발효 최적화를 위한 실험계획
새싹땅콩의 발효조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법(RSM; repose surface methodology)을 이용하였다. 발효조건은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)을 이용하였으며, 새싹땅콩의 발효조건은 세 개의 독립변수로 발효시간(X1 : 24, 36, 48, 60, 72 hr), 새싹땅콩 추출물의 농도(X2 : 4, 6, 8, 10, 12 Brix) 및 부원료인 과채 혼합 농축액(60 Brix) 농도(X3 : 2, 4, 6, 8, 10Brix)를 설정하였고, 종속변수는 발효 후 유산균수(Log10 CFU/mL), 유산(lactic acid) 함량 및 레스베라트롤(resveratrol)의 함량을 측정하였다. 또한, 발효 조건이 새싹땅콩 추출물의 종속변수에 미치는 영향을 예측된 모델식을 바탕으로 매스매티카 프로그램(Mathematica program)을 이용하여 4차원 반응표면분석으로 해석하였다.
매개변수 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 |
X1 발효시간(hour) | 24 | 36 | 48 | 60 | 72 |
X2 새싹땅콩 추출물 농도(Brix) | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 |
X3 부원료 농도(Brix) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
실험번호1) | 발효조건 | ||
발효시간(hour) | 새싹땅콩 추출물 농도(Brix) | 부원료 농도(Brix) | |
1 | 60(1) | 10(1) | 8(1) |
2 | 60(1) | 10(1) | 4(-1) |
3 | 60(1) | 6(-1) | 8(1) |
4 | 60(1) | 6(-1) | 4(-1) |
5 | 36(-1) | 10(1) | 8(1) |
6 | 36(-1) | 10(1) | 4(-1) |
7 | 36(-1) | 6(-1) | 8(1) |
8 | 36(-1) | 6(-1) | 4(-1) |
9 | 48(0) | 8(0) | 6(0) |
10 | 48(0) | 8(0) | 6(0) |
11 | 48(0) | 8(0) | 6(0) |
12 | 48(0) | 8(0) | 6(0) |
13 | 48(0) | 8(0) | 6(0) |
14 | 72(2) | 8(0) | 6(0) |
15 | 24(-2) | 8(0) | 6(0) |
16 | 48(0) | 12(2) | 6(0) |
17 | 48(0) | 4(-2) | 6(0) |
18 | 48(0) | 8(0) | 10(2) |
19 | 48(0) | 8(0) | 2(-2) |
1) 중심합성계획에 의한 실험조건 번호
2) 발효
새싹땅콩 추출물을 기본 배지로 하여 실험계획에 따라 부원료인 과채 혼합 농축액의 첨가량을 달리하여, MRS 액체배지에서 12시간 전배양된 신규한 유산균(Pediococcus pentosaceus DU.La.P-11(KCTC13781BP)) 종균으로 하여 2%(v/v) 접종 후 발효시간을 달리하여 발효하였다.
3) 발효물의 생육도, pH 및 산도 측정
발효물의 유산균 생육도는 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys co., Ltd., Korea)로 660nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. pH는 pH미터기(Metter Toledo Group, Switzerland)를 사용하여 측정하였고, 산도는 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3으로 중화 적정하여 소비된 0.1N NaOH 용액을 유산(lactic acid) 함량(%)으로 환산하여 산출하였다.
4) 유산(Lactic acid) 함량 측정
유산 함량 분석을 위해 새싹땅콩 추출물 및 이의 발효물 시료를 0.45㎛의 막여과지로 여과하여 HPLC 분석을 수행하였다. 유산 함량 분석조건은 컬럼 AminexⓡHPX-87H(7.5×300 mm, 9㎛, BIO-RAD Laboratories, USA)를 사용하여 5mM 황산(sulfuric acid)을 유속 0.6mL/min의 조건으로 검출기 PDA 214nm에서 분석하였다. 모든 표준물질은 시그마사(Sigma-Aldrich Co., USA) 제품으로 사용하였다.
5) 레스베라트롤(Resveratrol) 함량 측정
새싹땅콩 추출물 및 이의 발효물의 레스베라트롤 함량은 시료 용액을 0.45㎛의 막여과지로 여과한 후, HPLC 시스템(Alliance e2695, Waters Co., USA)으로 분석하였다(표 3). 표준품은 레스베라트롤(Sigma-Aldrich Co., USA)을 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 함량을 계산하였다.
4. 변비개선 동물실험
1) 실험동물의 사육 및 식이
실험동물은 Sprague Dawley계 4주령 수컷 흰쥐 50마리를 효창 사이언스(Daegu, Korea)에서 구입하였으며, 일주일 간 일반사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하여 적응시켰다. 이때 실험실 환경은 온도 22±1℃, 상대습도 63±5%, 명암은 12시간 주기로 조절하였다. 1주일 간 적응시킨 다음 2주째에 난괴법(randomized block design)에 따라 각 군의 체중이 비슷하도록 각 처리군당 10마리씩 5군으로 나누어 스테인리스 케이지에 3마리씩 분리하여 4주 동안 사육하였다.
로페라마이드(loperamide; Sigma, USA)는 설사를 치료하는 지사제로 일정 기간 연속해서 투여하면 대장 내 점액질 분비와 장 운동이 감소해 통과시간이 길어지는 증상이 나타나 설사를 멈추게 하는 약품이지만, 설사 증상이 없는 정상군에 투여할 경우에는 변비를 유발한다. 따라서 실험군은 일반식이를 급여하는 정상군(normal)과 일반식이를 급여하면서 로페라마이드 투여로 변비가 유도된 대조군(control), 상업용 변비개선제(둘코락스 에스, 한국베링거인겔하임)를 투여한 후 로페라마이드 투여로 변비가 유도된 양성대조군(PC), 본 발명의 새싹땅콩 발효물(제조예 1)을 식이한 후 로페라마이드 투여로 변비가 유도된 실험군(S1), 새싹땅콩 발효물을 함유하는 음료(제조예 2)를 식이한 후 로페라마이드로 변비가 유도된 실험군(S2)으로 구성하였다. 본 동물 실험은 대구대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받고 그 규정에 따라 실행하였다.
동물실험 기간은 총 5주로 1주 동안 환경에 적응시킨 뒤 4주 동안 실험을 진행했다. 흰쥐 식이로 공급한 펠렛형 고형 사료는 AIN-76A 일반 식이를 사용하였다. 정상군과 대조군은 일반 식이만을 급여했고, S1 실험군은 제조예 1의 새싹땅콩 발효물을, S2 실험군은 제조예 2의 새싹땅콩 발효물을 함유하는 음료를 각각 동결건조하여 500mg/kg을 하루에 한번씩 일정시간에 경구 투여하였다. 실험군 중 정상군을 제외한 대조군 및 양성대조군과 S1 및 S2 실험군은 로페라마이드 투여로 변비를 유도시켰다.
2) 실험동물 처치
4주(28일) 간 식이섭취 기간이 끝나고, 29일차부터 33일차까지 5일 동안 변비를 유도시키지 않은 정상군은 0.9% 생리식염수만 경구투여(per oral; p.o) 하였고, 변비를 유도시킨 대조군과 양성대조군, S1 및 S2 실험군은 로페라마이드(5 mg/kg)를 0.9% 생리식염수에 녹인 뒤 하루에 2회씩(오전 9시와 오후 9시), 5일간 경구투여하였다. 실험 33일차에 장 통과시간을 측정한 뒤 34일차에 모든 실험군의 실험동물을 에테르로 흡입 마취해서 희생시켰다.
3) 체중 및 식이효율 측정
실험식이 첫 급여일을 시작으로 1주마다 체중을 측정하였고, 변비 유도기간에는 매일 체중을 측정하였다. 실험 식이는 하루에 한 번 100g씩 일정 시간에 공급하고 24시간 후 남은 양을 측정하여 식이섭취량을 측정하여 그 차이로 섭취한 식이량을 계산하였다.
4) 변 개수, 변 중량 및 변 수분함량 측정
변의 개수, 중량 및 수분함량의 측정값은 변비유발 전과 후 두 기간으로 나누어 측정하였다. 각 실험동물의 케이지에 절식판을 설치한 후, 실험시작 당일과 이후 1주마다 총 4회 수거하였으며, 변비 유도기간 중에는 매일 수거하여 변 개수를 세고 무게를 측정하였다. 변의 수분함량은 변을 70℃의 드라이오븐에서 24시간 동안 건조시켜 중량을 측정하여 변 중량과 건조 후의 변 중량차를 이용해 수분함량을 구하였다.
5) 장관 내 잔류 변 개수 측정과 형태 관찰
장관 내 변 개수는 로페라마이드 투여한 뒤 3일째 되는 날 맹장부터 직장까지 전체 부위를 취해 10% 포름알데히드로 고정해서 대장 안에 남아있는 변 개수를 측정하였으며, 대장 내에 남아 있는 변의 크기와 형태는 눈으로 확인하였다.
6) 혈청 지질 함량 측정
혈청 분석을 위해 실험 종료일에 흰쥐를 마취시켜 개복한 뒤 하대정맥에서 혈액을 채취한 후 헤파린으로 처리한 멸균튜브에 모아 실험에 이용하였다. 채취된 혈액은 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리 한 후 혈청을 분리하여 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 혈중 중성지질의 함량은 중성지질 측정용 키트 시약(AM 157S-K, Asan Pharm. Co., Seoul, Korea), 총 콜레스테롤의 함량은 총 콜레스테롤 측정용 키트 시약(AM 202-K, Asan Pharm. Co., Seoul, Korea), HDL-콜레스테롤 함량은 HDL 콜레스테롤 측정용 키트 시약(AM 203-K, Asan Pharm. Co., Seoul, Korea)으로 측정하였다. 혈중 LDL-콜레스테롤 농도는 Friedewald 공식(LDL 콜레스테롤 = (총 콜레스테롤 - HDL 콜레스테롤) - (중성지질/5))을 이용하여 계산하였다.
7) 간기능 효소 측정
혈중 GOT(Glutamic oxaloacetic transaminase) 및 GPT(Glutamic pyruvic transaminase)의 측정은 라이트만-프란켈의 방법(Reitman, S. et al, 1957,merican Journal of Clinical Pathology 28, 56.63.)을 응용한 GOT 및 GPT 측정용 키트 시약(Asan Pharm. Co., Seoul, Korea)을 사용하여 측정하였다.
8) 통계처리
동물실험의 모든 실험결과는 평균값과±표준편차로 표시하였으며, 통계처리는 Statistical Analysis System(SAS version 9.2, SAS Institute Inc., USA)을 one-way ANOVA 분석을 실시한 후 P < 0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에 의해 유의성을 검증하였다.
제조예 1. 새싹땅콩 발효물 제조
일정한 크기로 절단한 새싹땅콩에 10배수의 물을 가하여 68℃에서 7시간 동안 추출한 새싹땅콩 추출물을 감압 농축하여 최종 농도가 10 Brix인 새싹땅콩 농축액을 수득하였다. 수득한 새싹땅콩 농축액에 5 Brix의 과채 혼합 농축액(바나나 농축액, 복숭아 농축액, 망고 농축액, 딸기 농축액, 무화과 농축액, 토마토 농축액, 당근 농축액, 양배추 농축액 및 브로콜리 농축액)을 8.5% 첨가하여 혼합한 다음 85℃에서 30분 동안 살균하였으며, 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 페디오코커스 펜토사세우스 DU.La.P-11 균주(KCTC13781BP) 배양액(107 CFU/mL)을 2%(v/v) 접종한 후 37℃에서 55시간 동안 발효하여 새싹땅콩 발효물을 제조하였다. 이후에, 살균 처리한 후 여과하여 하기 실시예에 사용하였다.
제조예 2. 새싹보리 발효물 함유 음료 제조
새싹보리 발효물을 함유하는 음료는 상기 제조예 1의 새싹땅콩 발효물 100 중량부에 대하여 3 중량부의 프락토올리고당(fructooligosaccharide), 3 중량부의 폴리덱스트로스(polydextrose), 0.05 중량부의 구연산(citric acid), 0.05 중량부의 비타민 C(vitamin C), 0.02 중량부의 효소처리스테비아(enzymatically modified stevia), 2 중량부의 현미 농축액 및 5 중량부의 포도 농축액을 투입하여 혼합하여 제조하였다.
실시예 1. 신규 유산균의 분리 및 동정
1) 발효식품으로부터 유산균 분리
발효식품으로부터 유산균을 분리하기 위하여 BPB(Bromocresol purple)를 첨가한 MRS 한천배지를 사용하였다. 여러 발효식품 시료를 생리멸균식염수를 이용하여 10-1~10-4의 농도로 희석하여 MRS 한천배지에 도말하여 37℃에서 배양한 후, 균주의 크기, 색, 모양, 투명도 등을 관찰하여 총 11종의 유산균을 분리하였고 계대배양을 실시하여 단독 콜로니를 순수 분리하였고 DU.La.P-1∼11로 명명하였다.
2) 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성 균주 선발
베타-글루코시다아제 활성 균주를 선발하고자 에스쿨린 한천배지(esculin agar)를 이용하여 배양을 실시한 후, 콜로니(colony) 주변에 검은 반점(black complex)을 형성한 균주를 베타-글루코시다아제 활성 균주로 간주하였다. 분리한 균주 중 DU.La.P-1 균주를 제외한 모든 분리 균주에서 콜로니 주변에 검은 반점을 형성하여 베타-글루코시다아제 활성이 있는 것으로 나타났다(도 1). 또한, 분리된 11종의 유산균에 대한 베타-글루코시다아제 활성을 측정한 결과, 에스쿨린 한천배지에서 검은 반점을 형성하지 않은 DU.La.P-1 균주가 베타-글루코시다아제 활성이 2.59 mU/mL로 가장 낮았으며, DU.La.P-11 균주가 베타-글루코시다아제 활성이 5.30 mU/mL로 가장 높게 나타났다(표 4).
분리균주 | 검은 반점 길이(mm) | 베타-글루코시다아제 활성 (unit : mU/ml) |
DU.La.P-1 | 0.00±0.00 | 2.59±0.06 |
DU.La.P-2 | 16.00±1.00 | 4.70±0.10 |
DU.La.P-3 | 11.67±1.53 | 4.52±0.16 |
DU.La.P-4 | 19.33±1.53 | 4.61±0.04 |
DU.La.P-5 | 17.67±0.58 | 4.77±0.13 |
DU.La.P-6 | 13.67±0.58 | 4.88±0.03 |
DU.La.P-7 | 20.33±0.58 | 5.08±0.09 |
DU.La.P-8 | 20.00±2.00 | 4.87±0.15 |
DU.La.P-9 | 22.33±1.53 | 4.60±0.04 |
DU.La.P-10 | 19.33±1.15 | 4.65±0.05 |
DU.La.P-11 | 21.00±1.00 | 5.30±0.03 |
3) 새싹땅콩 추출물 농도에 따른 분리 균주의 생장능
5, 10, 15, 20, 50 및 100%(v/w)의 새싹땅콩 추출물을 함유한 한천배지에서 분리된 유산균들의 생장능을 검토한 결과, DU.La.P-1 및 DU.La.P-3 균주를 제외한 모든 분리 유산균들은 새싹땅콩 추출물이 함유된 배지에서 콜로니가 뚜렷하게 생성된 것을 알 수 있었다(표 5).
분리 균주 | 새싹땅콩 추출물 첨가 농도(%)에 따른 생장능 | |||||
5 | 10 | 15 | 20 | 50 | 100 | |
DU.La.P-1 | ++ | ++ | + | + | + | + |
DU.La.P-2 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-3 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
DU.La.P-4 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-5 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-6 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-7 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-8 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-9 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-10 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
DU.La.P-11 | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
+; 생장능 약함, ++; 생장능 중간, +++; 생장능 강함.
4) 최종균주 선별
분리한 유산균들에 대한 새싹땅콩 발효 여부를 검토하기 위하여 상기 베타-글루코시다아제 활성이 좋았던 3종의 균주(DU.La.P-7, DU.La.P-8 및 DU.La.P-11)를 배양하여 10 Brix의 새싹땅콩 추출물에 접종하여 37℃, 48시간 배양하여 생균수, pH 및 산도를 측정하여 균주의 생장 및 발효능을 확인하였다. 그 결과, 3종의 균주 모두 새싹땅콩에서 생장이 가능한 것으로 나타났으며, DU.La.P-7 및 DU.La.P-11 균주는 24시간 내에 왕성하게 증식하는 것으로 보였으며, 발효 종료 후 DU.La.P-11 균주에서 가장 많은 균수 증가량을 보였다. pH의 경우는 모든 균주에서 발효시간이 경과할수록 감소하는 것으로 나타났으며, 균주 간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 산도의 경우는 균주 간에 큰 차이가 없는 것으로 나타났으며, 발효 24시간 동안 산도가 많이 증가하는 경향을 보이는 것으로 나타났다. 따라서 베타-글루코시다아제 활성이 우수하며 유산균수 증가량과 pH 감소폭이 가장 큰 DU.La.P-11 균주를 땅콩새싹의 발효균주로 최종선정하였다.
발효시간 (day) | 분리균주 | |||
DU. La. P-7 | DU. La. P-8 | DU. La. P-11 | ||
pH | 0 | 5.44±0.00 | 5.37±0.00 | 5.32±0.00 |
1 | 3.70±0.01 | 3.68±0.00 | 3.70±0.00 | |
2 | 3.67±0.01 | 3.67±0.00 | 3.65±0.00 | |
산도(%) | 0 | 0.05±0.00 | 0.05±0.00 | 0.05±0.01 |
1 | 0.22±0.01 | 0.25±0.01 | 0.24±0.01 | |
2 | 0.24±0.00 | 0.26±0.00 | 0.25±0.00 | |
젖산 생균수 (Log10 CFU/ml) |
0 | 10.87±0.01 | 11.08±0.02 | 11.12±0.03 |
1 | 17.47±0.03 | 13.54±0.34 | 17.49±0.01 | |
2 | 18.12±0.03 | 17.29.±0.01 | 18.43±0.01 |
5) 최종 선발균주(DU. La. P-11)의 동정
최종 분리된 균주 중 베타-글루코시다아제 활성과 발효력이 가장 높은 DU. La. P-11 균주의 16s rDNA 유전자의 염기서열(서열번호 1, 도 2)을 분석하여 NCBI blast DB와 비교한 결과, 페디오코커스속(Pediococcus sp.)에 속하는 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)와 99%의 상동성을 보였다(표 7). Bioedit program 및 Clustal X program을 이용하여 염기서열을 정렬한 후 근연관계를 조사해 본 결과, 페디오코커스 펜토사세우스 DSM 20336과 99%의 상동성을 보였다(도 3). 따라서 DU.La.P-11 균주를 페디오코커스 펜토사세우스로 동정하였으며, 이를 페디오코커스 펜토사세우스 DU.La.P-11 균주로 명명하고 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 2018년 12월 20일자로 기탁하였으며 기탁번호 KCTC13781BP를 부여받았다.
표준균주 | 상동성 | 차이 |
Pediococcus pentosaceus DSM 20336 | 1446/1449(99%) | 2/1449(0%) |
Pediococcus stilesii FAIR-E 180 | 1424/1448(99%) | 0/1448(0%) |
Pediococcus acidilactici DSM 20284 | 1421/1449(98%) | 2/1449(0%) |
Pediococcus claussenii ATCC BAA-344 | 1409/1451(97%) | 4/1451(0%) |
Pediococcus argentinicus CRL 776 | 1408/1450(97%) | 4/1450(0%) |
Pediococcus acidilactici NGRI 0510Q | 1411/1455(97%) | 16/1455(1%) |
Pediococcus claussenii P06 | 1406/1451(97%) | 3/1451(0%) |
실시예 2. 새싹땅콩 추출물의 발효조건 최적화
1) 발효조건에 따른 발효적 특성 및 유효성분 함량
새싹땅콩 추출물의 최적 발효조건을 설정하기 위해 발효시간, 새싹땅콩 추출물 농도 및 부원료(과채 혼합 농축액) 농도를 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 19구의 발효조건에서 얻어진 발효물의 특성은 표 8과 같다. 이를 이용하여 반응표면분석을 실시하고, 유산균수, 유산(lactic acid) 함량 및 레스베라트롤(resveratrol) 함량 값에 대한 회귀식을 얻었다(표 9). 또한 변수별 최적 발효조건과 발효 특성값을 예측하여 표 10에 나타냈으며, 이들의 4차원 반응표면분석 결과를 도 5∼도 7에 나타내었다.
중심합성계획법에 따라 표 1과 같이 각 독립변수의 범위를 설정한 후, Design Expert를 이용하여 표 2와 같이 19가지의 발효 조건을 설정하고 새싹땅콩 추출물을 발효하였다. 발효조건에 따른 새싹땅콩 추출물의 유산균 수는 11.75∼14.86 Log10 CFU/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 9와 같다. 유산균수에 대한 R2 값은 0.8574로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의한 수준을 보였다. 한편, 적합결여검정(lack of fit) 값은 모델의 적합도를 검정하는 통계량으로 P 값이 0.05보다 작을 때 모델의 적합성에 문제가 있으며, 이보다 클 때 모델이 적합하다고 판단하는 통계값이다. ANOVA 결과 유산균수 값의 모델에 대한 적합결여검정의 P-value는 0.0981로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 발효조건에 대한 영향에서 유산균수의 경우 새싹땅콩 추출물 농도와 발효시간에 영향을 받는 것으로 나타났으며, 부원료 농도에는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(표 10). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과, 정상점은 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 유산균수의 최댓값은 15.20 log10 CFU/mL이고 이때의 발효조건은 발효시간 61.02시간, 새싹땅콩 추출물 농도 10.86 Brix 및 부원료 농도 5.81 Brix로 나타났다(표 11). 실험조건에 따라 얻은 발효물의 유산균수에 대한 4차원 반응표면은 도 4와 같이 최대점의 형태를 나타내었으며, 새싹땅콩 추출물 농도가 높고, 발효시간이 길수록 증가하는 것으로 나타났다.
실험 번호1) | 발효특성 및 유효성분 함량 | ||
유산균수(Log10 CFU/ml) | 유산 함량(㎎/ml) | 레스베라트롤 함량(㎍/ml) | |
1 | 14.80 | 12.89 | 0.66 |
2 | 14.85 | 13.16 | 0.80 |
3 | 12.12 | 9.59 | 0.37 |
4 | 12.08 | 10.43 | 0.41 |
5 | 13.98 | 11.15 | 0.62 |
6 | 13.84 | 10.80 | 0.87 |
7 | 12.96 | 9.53 | 0.47 |
8 | 12.57 | 8.96 | 0.46 |
9 | 14.03 | 11.07 | 0.65 |
10 | 14.44 | 11.20 | 0.74 |
11 | 14.86 | 11.39 | 0.73 |
12 | 14.74 | 11.73 | 0.66 |
13 | 14.57 | 11.33 | 0.79 |
14 | 14.04 | 11.67 | 0.75 |
15 | 11.75 | 8.87 | 0.63 |
16 | 13.84 | 12.19 | 0.66 |
17 | 12.04 | 9.05 | 0.31 |
18 | 13.41 | 10.21 | 0.54 |
19 | 13.08 | 10.89 | 0.70 |
1)중심합성계획법에 의한 실험번호
유산균수(Log10 CFU/ml) | 유산 함량(㎎/ml) | 레스베라트롤 함량 (㎍/ml) |
|
Intercept(β0) | |||
Linear | -0.576081 | -1.056976 | -1.239189 |
β1 | 0.183941 | 0.187479 | -0.000144 |
β2 | 1.216774 | 0.470498 | 0.341639 |
β3 | 1.219611 | 0.938421 | 0.133260 |
Quadratic | |||
β11 | -0.002836 | -0.001798 | -0.000066864 |
β22 | -0.099291 | -0.042863 | -0.015220 |
β33 | -0.080228 | -0.047238 | -0.006782 |
Cross product | |||
β12 | 0.016458 | 0.013385 | 0.000625 |
β13 | -0.002813 | -0.010573 | 0.000313 |
β23 | -0.010625 | 0.010938 | -0.011250 |
Lack of fit t-value |
4.10 | 2.81 | 2.43 |
P-value | 0.0981 | 0.164 | 0.2047 |
R2 | 0.8754 | 0.9604 | 0.8730 |
Significance | 0.0039 | <.0001 | 0.0042 |
반응변수 | F-Ratio | ||
발효시간(hour) | 새싹땅콩 추출물 농도 (Brix) |
부원료 농도 (Brix) |
|
유산균수(Log10 CFU/ml) | 6.09** | 11.60*** | 2.29 |
유산 함량(㎎/ml) | 21.82*** | 34.48*** | 3.08* |
레스베라트롤 함량(㎍/ml) | 0.19 | 13.84*** | 2.77* |
*; p < 0.1, **; p < 0.05, ***; p < 0.01.
또한, 발효조건에 따른 유산 함량은 8.87∼13.16mg/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 유산 함량의 회귀식은 표 9와 같고 R2 값은 0.9604로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. ANOVA 결과 유산 함량의 적합결여검정의 P-value은 0.1694로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 발효조건에 대한 영향은 표 10에서와 같이 발효시간과 새싹땅콩 추출물 농도의 영향이 가장 크며, 다음으로 부원료 농도의 영향을 받는 것으로 나타났다. 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점은 최대점으로 최대값이 13.65%였고, 이때 발효시간은 62.63시간, 새싹땅콩 추출물 농도는 11.08 Brix 및 부원료 농도 5.26 Brix인 것을 확인되었다(표 11). 4차원 반응표면을 통한 발효조건에 따른 유산 함량의 변화는 도 5와 같다.
발효조건에 따른 레스베라트롤 함량은 0.31∼0.87㎍/mL의 범위로 나타났으며(표 8), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 9와 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.8730로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. ANOVA 결과 레스베라트롤 함량의 발효조건 모델에 대한 적합결여검정의 P-value는 0.2047로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 9). 레스베라트롤 함량은 새싹땅콩 추출물 농도에서 가장 큰 영향을 받고 다음으로 부원료 농도에 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 발효시간에서는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(표 10). 표 11과 같이 레스베라트롤 함량의 예측된 정상점은 최대점으로 최댓값이 0.85㎍/mL이었고, 이때 발효시간은 52.19시간, 새싹땅콩 추출물 농도 10.71 Brix 및 부원료 농도 3.14 Brix인 것으로 확인되었다. 발효물의 레스베라트롤 함량은 발효조건에 따른 4차원 반응표면에서 볼 때 새싹땅콩 추출물 농도와 부원료 농도가 높을수록 레스베라트롤 함량이 증가하는 것으로 나타났다(도 6).
반응변수 | 예측반응 | 형태 |
||||
반응값 | 발효시간 (hour) |
새삭땅콩 추출물 농도(Brix) | 부원료 농도 (Brix) |
결과값 | ||
유산균수 | 최소 | 57.12 | 4.31 | 5.71 | 11.29 | 최대값 |
최대 | 61.02 | 10.86 | 5.81 | 15.20 | ||
유산 함량 | 최소 | 27.07 | 6.50 | 4.73 | 8.67 | 최대값 |
최대 | 62.63 | 11.08 | 5.26 | 13.65 | ||
레스베라트롤 함량 | 최소 | 49.95 | 4.06 | 5.36 | 0.20 | 최대값 |
최대 | 52.19 | 10.71 | 3.14 | 0.85 |
2) 새싹땅콩 추출물의 최적 발효조건 예측 및 실증실험
새싹땅콩 추출물의 발효조건을 설정하기 위하여 유산균수, 유산 함량 및 레스베라트롤 함량을 모두 만족시켜주는 최적 발효조건을 얻고자 각 반응표면을 수퍼임포징(superimposing)하여 도 7의 겹쳐진 부분으로써 최적 조건을 나타내었다. 새싹땅콩 추출물의 최적 발효조건 범위는 발효시간 50~60시간, 새싹땅콩 추출물 농도 8~12 Brix 및 부원료(과채 혼합 농축액) 농도 4~6 Brix로 나타났다(표 12). 따라서 이와 같은 예측 결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건 범위 내에서 임의의 조건 즉, 발효시간 55시간, 새싹땅콩 추출물 농도 10 Brix 및 부원료 농도 5 Brix를 대입하여 실제 발효를 실시하고, 발효물의 유산균수, 유산 함량 및 레스베라트롤 함량을 측정한 결과 예측된 값들과 유사한 수준으로 나타났다(표 13).
발효조건 | 예측된 조건의 범위(최적점) |
발효시간(hour) | 50~60(55) |
새싹땅콩 농도 (Brix) | 8~12(10) |
부원료 농도(Brix) | 4~6(5) |
예측된 조건(A)1) | 실측된 조건(B)2)* | B/A×100(%) | |
유산균수(Log10 CFU/ml) | 15.04 | 14.85±1.05 | 98.73 |
유산 함량(㎎/ml) | 12.75 | 12.16±0.98 | 95.37 |
레스베라트롤 함량(㎍/ml) | 0.81 | 0.75±0.07 | 88.23 |
1)반응변수에 대한 예측식으로 부터 계산된 값.
2)독립변수의 최적조건 : 발효시간 55시간, 새싹땅콩 농도 10 Brix, 부원료 농도 5 Brix
*) 평균값은 3반복 표준편차.
실시예 3. 유산균 발효 전후 새싹땅콩의 유용성분 함량 비교
본 발명에서 분리한 유산균 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주(KCTC13781BP)를 이용하여 새싹땅콩 추출물을 최적발효 조건으로 발효시켰을 때 발효 전후의 새싹땅콩의 유산 및 레스베라트롤 함량 변화를 조사한 결과는 표 14와 같으며, 발효 전후의 레스베라트롤 함량을 HPLC로 분석한 크로마토그램은 도 8과 같다. 발효 특성상 유산의 경우 원료인 새싹땅콩 추출물에서는 전혀 검출되지 않았으나 본 발명의 DU.La.P-11 균주를 이용하여 제조한 발효물에서 발효에 의하여 12.16mg/mL로 나타나 최적조건에서 유산균 발효에 의해 적절한 발효가 일어났음을 알 수 있었으며, 레스베라트롤 함량의 경우, 새싹땅콩 추출물 대비 발효물에서 약 37.5배 증가하였다.
함량 | 새싹땅콩 추출물(9 Brix) | 새싹땅콩 발효물 |
유산(mg/mL) | - | 12.16±0.17 |
레스베라트롤(㎍/mL) | 0.02±0.001 | 0.75±0.03 |
실시예 4. 새싹땅콩 발효물의 효능
1) 체중 변화 및 식이섭취량
실험기간 동안 변비 유발 쥐에 대한 각 군의 체중변화량과 식이섭취량 변화는 표 15에 나타내었다. 체중변화는 실험 종료 시 새싹땅콩 발효물(S1) 및 이를 함유하는 음료(S2)를 경구 투여한 군이 정상군(Normal)에 비해 체중이 감소하는 경향을 보였으며, 특히 새싹땅콩 발효물에서는 정상군보다 유의적으로 체중이 감소한 것으로 나타났다. 반면 대조군(Control)은 정상군에 비해 체중이 증가함을 알 수 있었다. 식이섭취량에서 로페라마이드(loperamide)로 변비를 유도시킨 모든 실험군이 정상군보다 식이섭취량이 유의적인 차이를 보이며 감소하는 것으로 나타났다. 또한 로페라마이드로 변비를 유도시킨 대조군(control)과 새싹땅콩 발효물(S1) 및 이를 함유하는 음료(S2)를 식이한 후 로페라마이드로 변비를 유도시킨 실험군(S1 및 S2)을 비교한 결과, 모든 실험군에서 대조군에 비해 식이섭취량이 많은 것으로 나타났으며, 특히 새싹땅콩 발효물 함유 음료 실험군(S2)에서 유의적으로 증가한 것을 알 수 있었다. 식이효율은 정상군과 로페라마이드로 변비를 유도시킨 대조군(control) 간에 유의적인 차이를 보이며 대조군의 식이효율이 높았으며, 대조군에 비해서 새싹땅콩 발효물(S1) 및 이를 함유하는 음료(S2)를 식이하면서 로페라마이드로 변비를 유도시킨 실험군(S1 및 S2)의 식이효율은 P < 0.05 수준에서 유의적으로 낮았다.
군1) | 체중증가량(g) | 식이섭취량(g/day) | 식이섭취효율(%) |
정상군(Normal) | 173.3±10.31ba | 24.74±1.72a | 0.22±0.01cb |
대조군(Control) | 181.3±16.20a | 23.34±2.21c | 0.27±0.02a |
양성대조군(PC) | 152.7±24.26c | 21.51±1.64c | 0.22±0.04cb |
S1 | 152.5±19.88c | 21.51±1.67c | 0.22±0.03cb |
S2 | 160.9±18.62bc | 21.18±1.88b | 0.21±0.03c |
1)Normal : 정상식이군.
Control : 정상식이 및 로페라마이드 투여군.
PC : 상업용 변비제(둘코락스 에스 정) 식이 및 로페라마이드 투여군.
S1 : 새싹땅콩 발효물 식이 및 로페라마이드 투여군.
S2 : 새싹땅콩 발효물 함유 음료 식이 및 로페라마이드 투여군.
2) 장기 무게
실험동물의 간, 신장 및 비장 무게를 표 16에 나타내었다. 간의 무게는 로페라마이드로 변비를 유도시킨 대조군(control)에서 가장 높게 나타났으며, 새싹땅콩 발효물 또는 이를 함유하는 음료 식이 및 로페라마이드 투여 실험군(S1 및 S2)의 경우 대조군에 비해 간의 무게가 낮게 나타났으며, 정상군(normal)에 비해서는 증가하는 경향을 보였으며 유의적인 차이가 없는 것으로 나타났다. 신장 무게의 경우는 로페라마이드로 변비를 유도시킨 실험군이 정상군(normal)과 대조군(control)에 비해 낮은 경향을 보였으며, 특히 새싹땅콩 발효물 실험군(S1)이 유의적으로 낮게 나타났다. 비장의 무게는 간의 무게와 같은 경향을 나타내 대조군(control)보다는 실험군이 낮게 나타났으며, 정상군(normal)보다는 높았으며, 실험군 간에 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.
군1) | 간 무게(g) | 신장 무게(g) | 비장 무게(g) |
정상군(Normal) | 15.75±1.632)a3) | 2.52±0.24ba | 0.72±0.12a |
대조군(Control) | 17.50±2.06a | 2.64±0.24a | 0.78±0.09a |
양성대조군(PC) | 16.92±2.18a | 2.46±0.25ba | 0.74±0.12a |
S1 | 16.82±2.63a | 2.39±0.27b | 0.72±0.09a |
S2 | 16.91±1.55a | 2.43±0.18ba | 0.76±0.10a |
3) 지방 무게
변비를 유도시키면서 새싹땅콩 발효물(S1)과 새싹땅콩 발효물 함유 음료(S2)를 경구 투여한 흰쥐의 복부지방 무게는 정상군(normal)과 대조군(control)에 비해 낮은 경향을 보였으며, S1 및 S2 실험군에서는 P < 0.05 수준에서 유의성이 인정되었다. 신장지방 무게의 경우도 복부지방 무게와 같은 경향을 보여 실험군(S1, S2)이 정상군과 대조군에 비해 무게가 낮은 것으로 나타났다. 부고환지방 무게의 경우는 변비를 유도시킨 대조군에 비해 변비를 유도시킨 실험군 모두에서 유의적으로 낮은 것으로 나타났다(표 17).
군1) | 복부지방무게(g) | 신장지방 무게(g) | 부고환 지방무게(g) |
정상군(Normal) | 3.42±0.682)ba3) | 1.62±0.29a | 0.18±0.04cb |
대조군(Control) | 3.62±0.70a | 1.65±0.38a | 0.32±0.07a |
양성대조군(PC) | 2.61±0.68c | 1.15±0.0.23c | 0.20±0.02b |
S1 | 2.65±0.54c | 1.43±0.30ba | 0.20±0.03b |
S2 | 2.95±0.44c | 1.34±0.13bc | 0.22±0.03b |
4) 변 개수, 변 중량, 변 수분함량
변비 유도 전과 후로 나눠 실험동물 개체 당 변의 개수, 변의 중량 및 변의 수분함량을 측정하였다. 표 18에 개시한 바와 같이 변비를 유도하기 전 4주 동안 각 군에서 배설한 변 개수는 정상군(normal)과 대조군(Control)간 유의적인 차이가 없었으며, 양성대조군(PC)과 새싹땅콩 발효물 실험군(S1), 새싹땅콩 발효물 함유 음료 실험군(S2)은 대조군보다 변의 개수가 많은 것으로 나타났으나, 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다. 로페라마이드 투여 후 변비가 유도된 실험동물의 변의 개수와 변의 중량, 변의 수분함량을 측정한 결과, 변의 개수는 변비를 유도한 후 대조군의 변의 수가 감소했고, 변비를 유도하지 않은 정상군과 비교했을 때 유의적인 감소를 하였다. 따라서 변비가 제대로 유발됐음을 확인할 수 있었다. 변 개수가 감소한 대조군과 동일하게 변비를 유도한 실험군(S1, S2) 모두가 변비를 유도하기 전보다 감소하였다. 그러나 대조군에 비해서는 변의 개수가 유의적으로 많았으며(도 9), 변 중량 또한 변 개수와 유사한 경향의 결과를 나타내었다(도 10). 변의 수분함량의 경우, 변비 유발 전에 정상군과 대조군보다 새싹땅콩 발효물 실험군(S1)에서 증가한 경향이 있었지만, 유의적인 차이는 없었으며, 또한 변비를 유도한 후, 변의 수분함량은 정상군에 비해서는 감소하였으나. 대조군과 비교하여서는 모든 실험군에서 증가하는 경향을 나타내었다(도 11).
5) 장관 내 잔류 변 개수
실험 마지막 날 모든 실험동물을 희생시켜, 결장 부위에 잔류하고 있는 변의 개수를 측정한 결과, 변비를 유도하지 않은 정상군(normal)에서 0.90±0.57개로 가장 적은 잔류 변 개수를 확인하였고, 로페라마이드로 변비를 유도한 대조군(control)이 5.00±1.25개로 그 수가 유의적으로 많은것을 확인하였다. 그리고 대조군에 비해 새싹땅콩 발효물 실험군인 S1은 3.20±1.14개, 새싹땅콩 발효물 함유 음료 실험군인 S2가 3.56±1.51개로 대조군보다는 장관 내 잔류 변 개수가 유의적으로 적은 것을 확인하였다. 정상군과 대조군의 장관 내 잔류 변개수의 유의적인 차이는 로페라마이드에 의한 변비 유발을 다시 한 번 확인시켜 주었고, 새싹땅콩 발효물 실험군 역시 변비가 유발되었음에도 대조군에 비해 잔류 변 개수가 적음을 확인하여 새싹땅콩 발효물이 배변활동 원활에 효과를 보임을 알 수 있었다(표 19 및 도 12).
군1) | 결장내 변의 개수 (count/day) |
정상군(Normal) | 0.90±0.57c |
대조군(Control) | 5.00±1.25a |
양성대조군(PC) | 2.70±1.42b |
S1 | 3.20±1.14b |
S2 | 3.56±1.51b |
6) 혈청 지질함량 측정
새싹땅콩 발효물 식이가 흰쥐의 혈중 지질 함량에 미치는 영향을 관찰하기 위해 혈액을 채취하여 실험동물의 혈청 중 중성지방과 콜레스테롤의 변화를 측정하였다. 그 결과, 표 20에 개시한 바와 같이 중성지질의 경우는 로페라마이드로 변비를 유도한 대조군에서 가장 높은 59.52±17.38mg/dL로 나타났으며, 실험군(S1, S2) 모두에서 대조군에 비해 그 함량이 유의적으로 적게 나타나는 경향을 나타내었으며, 변비를 유도하지 않은 정상군에 비해서도 그 함량이 적은 경향을 보였지만 유의한 차이를 보이지는 않았다. 그리고 총 콜레스테롤 함량의 경우, 새싹땅콩 발효물 함유 음료 실험군(S2)은 변비를 유발한 대조군에 비해 유의적으로 적은 값을 나타내었다. HDL-콜레스테롤 함량에서는 변비를 유도하지 않은 정상군에서 가장 높은 함량(18.83±3.80mg/dL)을 보였고 로페라마이드로 변비를 유도한 대조군에서 가장 적은 12.90±3.91mg/dL의 함량을 나타내었다. 새싹땅콩 발효물 시험군(S1)의 경우는 정상군에 비해서는 그 함량이 적어지는 경향을 보였으나, 대조군에 비해 높은 함량 결과를 보였다. LDL-콜레스테롤의 함량을 측정값은 대조군에서 37.42±9.40mg/dL로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 실험군(S1, S2) 모두 대조군에 비해 적은 함량을 가지는 것으로 나타났다.
군1) | 중성지질 | 총콜레스테롤 | HDL-콜레스테롤 | LDL-콜레스테롤 |
정상군(Normal) | 50.90±15.22ba | 53.71±7.93bac | 18.83±3.80a | 24.70±11.82bdc |
대조군(Control) | 59.52±17.38a | 62.23±6.24a | 12.90±3.91b | 37.42±9.40a |
양성대조군(PC) | 43.55±11.61bc | 45.87±8.95c | 15.17±2.89ba | 21.99±9.49dc |
S1 | 40.74±7.85bc | 53.61±8.16bac | 15.23±1.60ba | 30.23±7.20bac |
S2 | 39.68±11.76bc | 51.68±9.44bc | 16.40±4.08ba | 27.34±10.13bdc |
7) 혈중 GOT 및 GPT 활성
GOT와 GPT 효소는 세포가 파괴되거나 사멸하면 혈액 속으로 분비되어 혈액 내에서도 일정량이 검출될 수 있다. 지방간이나 알코올의 섭취, 비만 등의 이유로 세포 내의 에너지 공급이 감소됨으로 인해 K-이 세포 밖으로 유출되고, Na-, Ca2- 및 수분이 세포 내로 유입되면서 세포가 팽창되고 세포막이 늘어나 혈중 GOT 및 GPT 효소는 세포질 내에서 외부로 유출되므로 간독성으로 인해 간세포의 괴사와 조직의 파괴가 진행되면 그 함량이 증가하게 된다. 따라서 본 실험에서 간 기능관련 효소활성도를 측정하였다. 그 결과, 표 21에 개시한 바와 같이 혈중 GOT 활성은 로페라마이드로 변비를 유도한 대조군이 38.48±6.49 Kramen/mL로 정상군에 비해 유의적으로 높았으며, 새싹땅콩 발효물(S1) 및 이를 함유하는 음료를 식이한 실험군(S2)의 경우는 정상군에 비해서는 그 함량이 높은 경향을 보였으나, 대조군에 비해서는 다소 낮은 함량 결과를 보였다. GPT 활성을 분석한 결과, 대조군에서 15.64±2.28 Kramen/mL로 가장 높은 함량 값을 나타내었으며, 새싹땅콩 발효물(S1) 및 이를 함유하는 음료를 식이한 실험군(S2) 모두에서 대조군에 비해 그 함량이 유의적으로 낮게 나타나는 경향이었으며, 변비를 유도하지 않은 정상군에 비해서도 그 함량이 유의적으로 낮았다.
군1) | GOT2) activity (Kramen/mL) | GPT activity (Kramen/mL) |
정상군(Normal) | 32.61±4.17b | 12.91±1.30b |
대조군(Control) | 38.48±6.49a | 15.64±2.28a |
양성대조군(PC) | 34.61±3.89ba | 11.81±1.64b |
S1 | 34.58±3.58ba | 11.87±1.65b |
S2 | 32.73±4.97b | 8.81±1.10c |
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Industry Academic Cooperation Foundation, Daegu University
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Pediococcus pentosaceus strain and composition for improving
constipation containing peanut sprout fermentation produced by
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<212> DNA
<213> Pediococcus pentosaceus
<400> 1
gcaagtcgaa cgaacttccg ttaattgatt atgacgtact tgtactgatt gagattttaa 60
cacgaagtga gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcccaga agtaggggat 120
aacacctgga aacagatgct aataccgtat aacagagaaa accgcatggt tttcttttaa 180
aagatggctc tgctatcact tctggatgga cccgcggcgt attagctagt tggtgaggta 240
aaggctcacc aaggcagtga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac 300
tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca 360
agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgt 420
taaagaagaa cgtgggtaag agtaactgtt tacccagtga cggtatttaa ccagaaagcc 480
acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt 540
attgggcgta aagcgagcgc aggcggtctt ttaagtctaa tgtgaaagcc ttcggctcaa 600
ccgaagaagt gcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat 660
gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg 720
tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta 780
gtccatgccg taaacgatga ttactaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag 840
ctaacgcatt aagtaatccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaagaatt 900
gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct 960
taccaggtct tgacatcttc tgacagtcta agagattaga ggttcccttc ggggacagaa 1020
tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttattac tagttgccag cattaagttg ggcactctag tgagactgcc 1140
ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg 1200
ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac gagtcgcgag accgcgaggt taagctaatc 1260
tcttaaaacc attctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc 1320
gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380
ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagccggtgg ggtaaccttt taggagctag 1440
ccgtctaa 1448
Claims (7)
- (1) 새싹땅콩에 새싹땅콩 중량 대비 5~20배의 물을 첨가하여 추출한 추출물을 감압 농축하여 9~11 Brix의 새싹땅콩 농축액을 준비하는 단계;
(2) 상기 (1) 단계에서 준비한 새싹땅콩 농축액에 4~6 Brix의 과채 혼합 농축액을 새싹땅콩 농축액 중량 대비 1~20%(v/v) 혼합하고 살균하는 단계; 및
(3) 상기 (2) 단계에서 살균한 새싹땅콩 농축액 및 과채 혼합 농축액의 혼합물에 기탁번호가 KCTC13781BP인 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DU.La.P-11 균주를 상기 혼합물 중량 대비 0.1~20%(v/v) 접종하고 30~45℃에서 53~57시간 동안 발효하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤(resveratrol) 함량이 증진되고, 변비 개선 효과가 있는 새싹땅콩 발효물의 제조 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 과채 혼합 농축액은 바나나 농축액, 복숭아 농축액, 망고 농축액, 딸기 농축액, 무화과 농축액, 토마토 농축액, 당근 농축액, 양배추 농축액 및 브로콜리 농축액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 레스베라트롤(resveratrol) 함량이 증진되고, 변비 개선 효과가 있는 새싹땅콩 발효물의 제조 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항 또는 제3항의 방법으로 제조된 새싹땅콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 변비 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 또는 제3항의 방법으로 제조된 새싹땅콩 발효물을 유효성분으로 포함하는 변비 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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Nutrition Research and Practice. Vol.7(4), pp.262-266 (2013.)* |
공개특허공보 제10-2016-0081436호(2016.07.08.)* |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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KR20210086178A (ko) | 2021-07-08 |
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