KR102091757B1 - 혈당저하와 스트레스 완화에 유효한 락토바실러스 플랜타럼 ｌｒｃｃ５３１４ 균주 및 이의 용도 - Google Patents

혈당저하와 스트레스 완화에 유효한 락토바실러스 플랜타럼 ｌｒｃｃ５３１４ 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 알파-아밀레이스 또는 알파-글루코시다아제 저해 활성을 갖고, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능을 가지며, 혈당 강하, 항당뇨, 항염증, 또는 항스트레스 효과가 있는, 전통 발효 식품인 김치로부터 분리된 신규한 유산균이므로, 프로바이오틱 조성물을 비롯하여 당뇨 또는 염증 작용에 의해 유발되는 질환을 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 식의약 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

혈당저하와 스트레스 완화에 유효한 락토바실러스 플랜타럼 ＬＲＣＣ５３１４ 균주 및 이의 용도{Lactobacillus plantarum LRCC5314 useful for lowering blood glucose and relieving stress and use thereof}
본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 알파-아밀레이스(α-amylase) 또는 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 갖고, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능을 가지며, 혈당 강하, 항당뇨, 항염증, 또는 항스트레스 효과가 있는, 전통 발효 식품인 김치로부터 분리된 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 우리나라의 식생활 습관이 서구화됨에 따라 과도한 지방 섭취로 인해 제2형 당뇨병을 비롯하여, 비만이나 고지혈증과 같은 성인병이 증가되고 있다. 한국의 70대 연령층에서 당뇨병 발병률은 최근 10% 비율로 크게 증가되었으며, 이에 따른 당뇨병 사망률은 OECD 국가 중 최고 수준으로, 우리나라 인구 10만명당 32.3명으로 OECD 평균 22.8명에 비해 약 10명 높아 국내 사망 원인 중 6위에 해당된다.
일반적으로 당뇨병 환자의 경우 식후에 급격한 혈당 상승으로 인하여 심각한 합병증이 초래되므로 식후의 혈당 상승의 억제가 치료제에 있어서 필수적으로 요구되고 있다. 특히 당뇨병 환자의 식후 혈당치가 급격히 상승함으로써 심혈관계의 문제를 야기하며 나아가 사망에 이르게 되기도 한다.
알파-아밀레이스(α-amylase)는 탄수화물의 α-D-(1,4)-글루칸 결합을 분해하는 효소로서, 식품의 탄수화물을 분해하여 체내에 흡수되기 쉬운 형태의 당으로 변환시켜 생명유지를 위한 탄소원 및 에너지원을 만든다. 이는 동물 뿐만 아니라 곤충, 미생물 등의 탄수화물 대사에 필수적인 효소이다 (Kim et.al., Kor. J. Microbiol. Biotechnol., 2:183-189 (2010)). 알파-글루코시다아제(α-glucosidase)는 소장 상피세포의 미세융모막(brush-border membrane)에 존재하는 효소로서, 이당류나 다당류를 단당류(탄수화물이 소화 흡수되기 위한 상태)로 가수분해하는 역할을 한다. 그러나 종종 전분 분해효소들의 과잉반응이 당의 급격한 생성 등을 야기하여 당뇨, 비만 등의 질병을 유발한다. 이에, 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통하여 당의 소화 및 흡수를 제어하며 조절할 수 있는 혈당 강하용 제제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 기존의 제품인 알파-아밀레이스 억제제들은 알파-아밀레이스를 과다 억제함으로써 복부 팽만, 설사 및 소화장애 등의 부작용이 심하게 나타나는 문제점이 있다. 또한, 알파-글루코시다아제 저해제가 종래에 알려진 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등과 같은 일부 낫토균에서 생산되는 것으로 알려져 있으나, 바실러스 서브틸리스는 호기성 균으로 장내에서 서식하기 힘들기 때문에, 바실러스 서브틸리스의 증식으로 알파-글루코시다아제 저해제를 장내에서 공급받기는 어렵고, 낫토의 섭취를 통해 알파-글루코시다아제 저해제를 공급받기 위해서는 다량 섭취해야 한다는 문제점이 있다. 따라서 이와 같은 부작용을 최소화하고 문제점을 개선시킬 수 있는 혈당 강하용 또는 인슐린 저항성 개선용 천연 의약품 혹은 기능성 식품소재 개발이 매우 시급한 실정이다.
한편, 현대사회에서는 스트레스가 과도하게 발생하고 있기 때문에 스트레스는 매우 중요한 사회적 문제로 대두되고 있다.
스트레스를 유발하는 원인과 그 신체의 변화는 다양하지만 공통적으로는 교감신경계인 뇌하수체-부신계(HPA)의 기능을 항진시켜 호르몬 분비를 유발하여 부신의 기능항진과 비장의 기능저하를 일으키고, 그 결과 스트레스에 의한 모든 증상이 나타나는 것으로 알려지고 있다. 스트레스가 부가되면 비장은 면역기능의 감퇴로 인하여 무게가 현저히 줄어들며, 부신피질자극호르몬에 의하여 부신의 기능이 항진되어 무게가 증가되며, 지질감소현상이 일어나고, 코르티졸(cortisol)의 분비가 촉진된다. 코르티졸의 양은 연령 및 스트레스에 따라 증가하는 경향이 있으며 이는 또한 비만에 기여한다. 또한, 스트레스가 부가되면 부신은 호르몬을 분비하여 혈액 내에서 콜레스테롤, 혈당, 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase: LDH) 등을 증가시킨다.
스트레스 예방을 위한 특별한 약물이 개발되어 있는 것은 아니며, 스트레스에 의해 발생되는 정신적, 신체적 질병의 증상을 경감하기 위한 목적으로 주로 신경안정제, 항불안제 및 수면제 등의 화학합성 약물이 사용되고 있으나, 이들 약물은 습관성이 있고 장기 복용시 각종 부작용이 따르는 문제점이 있어, 최근 천연소재를 이용하여 스트레스 완화를 목적으로 하는 기능성 식품의 개발이 다양하게 시도되고 있다.
유산균은 사람의 소화관에 서식하면서 우리 몸의 면역 능력을 활성화 시키고, 비타민 K, 비타민 B군 등을 합성할 뿐 아니라 유해성분의 합성, 체내로의 흡수 및 에너지 대사 등을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히 살아있는 유산균, 즉 프로바이오틱스는 전통적으로 장내 균총 정상화를 통한 정장 작용에 우수하다고 알려져 있었으나, 최근 면역 증강, 간경화 개선, 알러지 및 아토피 개선, 콜레스테롤 저하 등 다양한 효능이 알려지고 있다. 또한 최근에는 당뇨와 비만과 관여된 마이크로바이옴(microbiome), 즉 장내 균총 유전자를 조절하는 프로바이오틱스가 연구되고 있으며, 비만을 억제하고 이를 통해 비만에 의해 유도된 혈당 증가를 억제하여 혈당을 조절한다고 보고되어 있다 (Havenaar R. et.al., Probiotics: A general view. Vol.1, pp. 151-170. In: The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease. Wood BJB (ed). Elsevier, New York, NY, USA (1992)).
Kim et.al., Kor. J. Microbiol. Biotechnol., 2:183-189 (2010) Havenaar R. et.al., Wood BJB (ed). Elsevier, New York, NY, USA, 1: 151-170 (1992)
상기와 같은 배경하에서, 본 발명자들은 발효 식품으로부터 프로바이오틱스로서 사용될 수 있고, 스트레스를 완화시킬 수 있으며, 종래 당뇨병을 예방 및/또는 개선하기 위한 제품에 대한 문제를 해결 가능한 균주를 도출하고자 예의 노력한 결과, 전통 발효 식품인 김치로부터 분리한 신규 유산균이 체내 혈당 조절에 관여하는 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제의 활성을 저해하고, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능을 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 혈당 강하용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 완화용 식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해 질 것이며, 특허청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 하기의 해결 수단을 제공한다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 알파-아밀레이스(α-amylase) 또는 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 갖는, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능을 가지는, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 혈당 강하, 항당뇨 또는 항염증 효과를 가지는, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 제공한다.
본 발명의 일측면에 있어서, 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열을 포함하는, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 혈당 강하용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 완화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 상기 스트레스 완화용 식품 조성물은 코르티졸 과다분비를 억제하는, 스트레스 완화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일측면에 따른 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주는 전통 발효 식품인 김치로부터 분리되어 안전성이 높고, 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통하여 당의 소화 및 흡수를 제어하고 조절함으로써 혈당을 강하시키는 효과가 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 내산성, 내담즙성 및 장 세포 부착성이 우수하므로, 프로바이오틱 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통해 당의 소화 및 흡수를 제어하고 조절하여 혈당을 강하시킴으로써, 궁극적으로 혈당 조절을 통해 항당뇨 효과를 나타내므로, 당뇨를 예방, 개선 또는 치료하는데에 유용한 식의약 소재로 사용될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 NO 생성을 저해함으로써 항염증 효과를 나타내므로, 염증 작용에 의해 유발되는 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 식품 및 의약품 등에 이용될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 코르티졸 과다분비를 억제하는 효과를 나타내므로, 스트레스를 완화시키기 위한 식품 등에 이용될 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 본 발명에서 분리한 신규 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주의 알파-아밀레이스 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-글루코시다아제 저해 활성 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 pH 2.0의 인공위액 조건하에서의 생장성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 인공담즙액 조건하에서의 생장성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 Caco-2 세포에 대한 장 부착 정도를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 Raw 264.7 세포에 대한 세포독성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 염증 진행에 중요한 매개 인자인 산화질소(NO) 생성 저해 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 H295R 세포에 대한 코르티졸(cortisol) 분비량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
이상의 본 발명의 목적들, 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 첨부된 도면과 관련된 이하의 바람직한 실시예들을 통해서 쉽게 이해될 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 통상의 기술자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 알파-아밀레이스(α-amylase) 또는 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 갖고, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능을 가지며, 혈당 강하, 항당뇨, 항염증, 또는 항스트레스 효과가 있는, 전통 발효 식품인 김치로부터 분리된 신규한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주를 제공한다.
상기 "락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주"는 수탁번호 KCCM12540P로 한국미생물보존센터(국외)에 2019년 6월 20일자로 기탁된, 김치로부터 분리된 신규한 유산균 균주이다. 상기 균주는 알파-아밀레이스(α-amylase) 및 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 가질 뿐 아니라, 프로바이오틱스 균주의 기능과 관련된 내산성, 내담즙성 및 장부착능 특징 또한 가진다. 뿐만 아니라, 상기 균주는 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통하여 당의 소화 및 흡수를 제어하고 조절함으로써 혈당을 강하시키고, 이에 따라 궁극적으로 혈당 조절을 통해 항당뇨 효과를 가진다. 아울러, 상기 균주는 염증 진행에 중요한 매개 인자인 산화질소(NO) 생성을 저해함에 따라 항염증 효과 역시 가진다. 또한, 상기 균주는 스트레스가 부가되면 분비가 촉진되는 코르티졸(cortisol)의 분비를 억제함에 따라 항스트레스 효과를 가진다.
한편, 상기 균주는 16S rDNA로 서열번호 1에 기재된 염기서열을 포함하고, 탄소원으로 D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노오스(D-mannose), N-아세틸 글루코사민(N-acethyl glucosamine), 아미그달린(amygdalin), 알부틴(arbutin), 에스큘린(esculin), 살리신(salicin), D-셀리오비오스(D-celiobiose), D-말토오스(D-maltose), D-사카로오스(D-saccharose (sucrose)), D-트레할로스(D-trehalose), D-멜레지토스(D-melezitose), 젠티오바이오스(Gentiobiose), 및 D-투라노스(D-turanose)를 이용한다.
본 발명의 일실시예에서, 김치로부터 분리·동정한 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주가 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 활성을 가짐을 확인하였다 (도 1 및 도 2). 또한, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 pH 2.0의 인공위액 조건하에서도 120분 이상 높은 안정성을 가지는 내산성을 지닌 균주임을 확인하였으며 (도 3), 인공담즙액 조건하에서도 12시간 이상 높은 안정성을 가지는 내담즙성을 지닌 균주임을 확인하였다 (도 4). 아울러, 대장 상피세포인 Caco-2 세포에 대해 부착능을 보유하고 있음을 확인하였으며 (도 5), 이에 생균제(probiotics)로 개발 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱 조성물을 제공한다.
상기 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 전술한 바와 같다.
용어 "배양물"은 배양액 및/또는 배양된 균주를 포함하는 물질로, 이에 제한되지는 않으나, 상기 상기 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 포함하여 배양한 배양액 또는 균주 그 자체일 수 있다. 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일례로 액체 또는 고체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 '배양액'은 균주를 배양시킨 다음, 균주를 제외하고 남은 세포 배양용액 또는 배양배지를 의미한다.
용어 "파쇄물"은 상기 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 계면활성제(detergent) 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물(cell lysate)을 의미한다.
용어 "프로바이오틱스"는 '생균제'와 혼용하여 사용될 수 있으며, 적당량을 섭취했을 때 인체에 이로움을 주는 살아있는 세균을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익을 주는 균을 의미한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균이다. 프로바이오틱스인 유산균이나 이로운 세균들은 몸 안의 위산과 담즙산에서 살아남아서 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착한다. 정착한 장 안에서 건강에 이로운 효과를 나타내며, 이러한 프로바이오틱스는 독성이 없고 비병원성이어야 한다.
용어 "조성물"은 통상적인 식품, 기능성 식품 또는 건강 보조 식품뿐만 아니라 의약품으로 허가되는 것까지 포함하는 개념이다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 내산성, 내담즙성 및 장 세포 부착성이 우수하므로, 생균제(probiotics)로서 갖추어야 할 상기 조건을 모두 유의적으로 만족하므로, 생균제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 생균제 조성물 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 동결건조되거나 캡슐화된 형태 또는 배양 현탁액이거나 건조 분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 트레할로스(Trehalose), 옥수수 전분(corn starch), 콩기름(soybean oil), 미세결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 바람직하고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starch glycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone) 중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-시클로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 다양한 유산균 발효유 및 발효 제품을 생산하기 위한 종균으로 사용할 수 있으며, 이때 상기 발효유 식품으로는 요구르트, 칼피스, 치즈, 버터 등을 들 수 있고, 발효 제품으로는 두부, 된장, 청국장, 젤리, 김치 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발효유 및 발효 제품은 통상적인 제조 방법에서 균주만을 본 발명의 유산균 균주로 대체함으로써 용이하게 제조할 수 있다.
상기와 같이 본 발명의 조성물은 식품 또는 식품용 첨가제일 수 있고 식품은 바람직하게는 발효 식품이다. 또한, 본 발명의 조성물은 분말 또는 과립 형태일 수 있고 분말 또는 과립 형태는 당업계에서 통상의 방법으로 용이하게 제조할 수 있다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 혈당 강하용 조성물을 제공한다.
용어 "혈당"은 혈액 속에 포함되어 있는 포도당으로서, 인체로 공급된 혈당은 인슐린의 도움을 받아 세포 내부로 들어가 정상적인 기능을 유지하는데 필요한 에너지를 만들어낸다. 정상인은 식사 후 혈당이 일시적으로 올라간 후, 인슐린에 의하여 다시 정상 수준으로 내려가게 되지만, 췌장에서 인슐린 분비에 이상이 있거나 그 기능을 못하면 혈당이 정상 수준으로 내려가지 않게 되면 체내에서 포도당을 에너지로 쓰지 못하고 밖으로 배출하게 된다.
용어 "혈당 강하"는 혈당을 낮추는 것으로, 즉 '혈당 상승의 억제'는 알파-글루코시다아제가 알파-아밀레이스에 의해 분해된 당질을 최종적으로 단당류로 전환시킨다. 이러한 효소의 활성 저해는 당질 가수분해와 흡수과정을 지연시켜 식후 당 농도를 제한하게 된다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통해 당의 소화 및 흡수를 제어하고 조절함에 따라, 혈당을 강하시킬 수 있으므로, 혈당 강하용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 혈당 강하용 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 첨가제, 식품 조성물(특히 기능성 식품 조성물), 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서 유효성분인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
용어 "당뇨"는 인슐린의 상대적 부족으로 혈액 중의 포도당 농도가 비정상적으로 높아 소변 중에 당이 배설되는 만성 대사 질환이다. 즉, 소화기관 내의 탄수화물은 소화 효소인 알파-아밀레이스와 알파-글루코시다아제에 의해 분해되며 소장에서 최종적으로 글루코스와 프럭토스 등으로 분해되어 흡수된다. 이에 이러한 효소들의 과잉 반응은 당의 급격한 생성을 야기하여, 당뇨와 같은 질병을 유발하게 된다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통해 당의 소화 및 흡수를 제어하고 조절하여 혈당을 강하시킴으로써, 궁극적으로 혈당 조절을 통해 항당뇨 효과를 가질 수 있으므로, 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
알파-아밀레이스는 탄수화물의 α-D-(1,4)-글루칸 결합을 분해하는 효소로서, 식품의 탄수화물을 분해하여 체내에 흡수되기 쉬운 형태의 당으로 변환시켜 생명유지를 위한 탄소원 및 에너지원으로 이용된다. 이를 통해 알파-아밀레이스와 같은 전분 분해 효소의 대사적 중요성을 알 수 있으나, 종종 전분 분해 효소들의 과잉 반응은 당의 급격한 생성과 이에 따른 유기산 생성을 야기하며, 당뇨, 비만 및 산독증(acidosis) 등의 질병을 유발하게 된다. 따라서, 알파-아밀레이스의 활성을 조절, 즉 저해하는 경우 당뇨, 비만 및 산독증(acidosis) 등의 질병 치료에 효과적이다.
알파-글루코시다제는 세포 내에서 다당류내의 당과 당, 당과 지질, 또는 당과 단백질간의 글리코시드 결합을 절단하는 기능을 가지고 있어, 글루코시다제 효소 반응을 저해하는 경우 소장에서 당의 흡수가 지연되어 당뇨 치료에 효과적이다.
상기 약학 조성물은 알파-아밀레이스 또는 알파-글루코시다아제 저해 활성으로 조절되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 균주는 알파-아밀레이스 또는 알파-글루코시다아제 저해 활성을 나타내어 당뇨병 등의 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물은 당뇨의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있는 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 섭취량에 관계없이 체내에 안전하게 흡수된다. 투여량 또는 섭취량은 약학 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 인체에 투약하는 경우, 화학적으로 합성된 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해제 함유 식품 및 의약품에 비해 부작용의 우려가 없다. 본 발명의 식품 또는 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에도 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다. 약제학적 또는 식품에서 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당업계의 적정한 방법으로, 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라, 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 과립제, 피복정, 정제, 캡슐제, 탕제, 엑기스제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물에서 유효성분인 신규 유산균, 즉 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물의 함량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물 외에 당뇨병, 비만, 지방간, 고지혈증, 심혈관 질환, 고혈압, 동맥경화증 또는 대사증후군의 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당업계의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 작용을 통해 당의 소화 및 흡수를 제어하고 조절하여 혈당을 강하시킴으로써, 궁극적으로 혈당 조절을 통해 항당뇨 효과를 가질 수 있으므로, 당뇨 예방 또는 개선용 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 "식품 조성물"은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 용어 "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 용어 "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예:스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
용어 "항염증"은 염증를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 염증 반응의 조절은 대단히 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구 체계의 증강 및 손상을 감소시키기 위한 것으로 알려져 있다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증 반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS와 RNS가 과다 생성되고 그 결과로 영구적인 유전자의 변형이 야기된다. 이처럼 ROS와 RNS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다. 염증 과정 중에는 많은 양의 염증유도 사이토카인(proinflammatory cytokines), 산화질소(nitric oxide, NO) 그리고 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)이 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)와 사이클로옥시게나아제(cyclooxygenase-2, COX-2)에 의해 생성된다. 염증은 다양한 염증성 질환을 유발하는 원인으로써, 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물를 포함하는 조성물은 항염증 작용을 통해 다양한 염증성 질환에 대한 예방 및 개선 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, Raw 264.7 세포에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 배양액 처리 시, 세포 생존에는 영향을 미치지 않으면서, LPS로 염증이 유도된 대조군과 비교하여 LPS가 처리된 Raw 264.7 세포에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 배양액 처리 시, 염증 진행에 중요한 매개 인자인 NO 생성 정도가 저해됨을 확인하였다 (도 6 및 도 7). 즉, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 세포 독성은 유발하지 않으면서, 염증이 유발된 세포에서 NO 생성량을 크게 감소시켜 항염증 효과를 가짐을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 항염증 효과는 NO 생성 저해에 의해 달성되는 것일 수 있다.
본 발명의 균주는 NO 생성 저해능을 나타내어 염증성 질환에 대해 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물은 항염증용 약학 조성물, 즉 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있는 것이다.
상기 '염증성 질환'은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 이에 제한되지는 않으나, 알러지성 천식, 알러지성 비염, 알러지성 점막염, 두드러기 및 아나필락스(anaphylax)를 포함하는 알러지성 질환, 경피증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis) 및 포함체 근육염(inclusion body myositis)을 포함하는 근병증, 관절염, 아토피성 피부염, 건선, 천식, 다발성 경화증, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 경피증, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 자가 면역 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 급성 및 만성 기관지염, 및 인플루엔자 감염증일 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 나아가, 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태의 피부 외용제의 형태로 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명의 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 용어 "개체"란 는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 바람직하게는, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
상기 항염증에 대해서는 전술한 바와 같으며, 본 발명의 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 식품 조성물로 사용될 경우, 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 자체를 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 전통 발효 식품인 김치로부터 유래한 신규 유산균을 유효성분으로 하므로 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다.
본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 일측면은 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 완화용 식품 조성물을 제공한다.
용어 "스트레스"는 외부 자극에 의해 발생되는 유기체에 대한 해로운 반응 또는 변화를 의미한다. "스트레스 완화"는 '항스트레스'와 혼용하여 사용가능하고, 스트레스에 대한 저항 작용을 통칭하여 나타내는 용어로서, 예를 들어, 스트레스의 예방 효과, 스트레스 감소 효과 또는 스트레스로 인한 다양한 증상(예컨대, 우울증, 인지기능 또는 학습능력 감소, 두통, 소화불량, 피로, 피부의 거칠어짐, 신경증, 위궤양 등)의 억제 및 개선 효과를 나타내는 용어이다.
본 발명의 상기 스트레스 완화용 식품 조성물은 코르티졸 과다분비를 억제할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 인간 부신피질세포인 H295R 세포에 스트레스 유발 물질로 알려져 있는 LPS를 처리하고, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 함께 처리한 결과, 양성 대조군으로서 LPS만이 처리된 H295R 세포에 비해 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 함께 처리된 H295R 세포의 경우 코르티졸 분비량이 3배 이상 감소된 바, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 항스트레스 효과가 우수함을 알 수 있었다 (도 8).
상기 식품 조성물의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등의 건강기능성 식품이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품 조성물을 모두 포함한다.
상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 전통 발효 식품인 김치로부터 유래한 신규 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 유효성분으로 하므로 프로바이오틱 조성물, 약학 조성물 또는 식품 조성물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로 안전하게 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 분리 및 동정
실시예 1-1: 김치로부터의 유산균 균주 분리
전통 발효식품인 김치로부터 채취한 시료에 멸균 증류수를 첨가하여 희석액을 만든 뒤, 분쇄균질기(Stomacher, Pro-Media SH-001, ELMEX)로 시료 내부를 균질화하였다. 멸균 식염수를 이용하여 상기 희석액을 10배 희석법으로 단계별로 희석한 뒤 0.1mℓ를 취하였다. 이를 0.002중량%의 BCP(Bromocresol purple)와 1.5중량%의 한천 (agar)이 첨가된 MRS 고체배지에 도말하여 37℃가 유지되는 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 노란색의 환이 나타나는 콜로니(colony)를 선별하여 개체별로 동일한 배지에 2~3회 계대배양함으로써 각 균주를 순수 분리하였다. 분리된 균주 개체별로 MRS 액체배지에 접종하여 37℃에서 48시간 동안 재배양한 뒤 4℃로 냉장 보관하면서 사용하였다.
실시예 1-2: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 동정
16S rDNA 서열 분석을 통하여 상기 실시예 1-1에서 분리한 균주의 16S rDNA 유전자 염기서열을 분석하여 상기 분리 균주를 동정하였다. 16s rDNA 유전자 염기서열은 서열번호 1과 같았으며, 염기서열 분석 결과 상기 균주는 락토바실러스 속 균주와 최대 99% 상동성을 가지는 것으로 확인되었다. 상기 동정된 신규 락토바실러스 플랜타럼 균주를 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314)로 명명하고, 한국미생물보존센터에 2019년 6월 20일자로 기탁하여 수탁번호 KCCM12540P를 부여받았다.
실시예 2: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-아밀레이스 저해 활성 평가
상기 실시예 1에서 김치로부터 분리 및 동정한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-아밀레이스(α-amylase) 저해 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리한 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 배양 용해액(lysate)을 제조하였다.
구체적으로, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 MRS 한천 배지를 이용하여 활성화시킨 다음, TSB 배지[박토 트립톤(Bacto Tryptone) 17g, 박토 소이톤(Bacto soytone) 3g, 글루코즈(Glucose) 2.5g, 염화 나트륨(Sodium chloride) 5g, 인산일수소칼륨(Dipotassium hydrogen phosphate) 2.5g, 증류수(D.W.) 1000 ㎖]에 접종하여 30℃에서 배양하였다.
상기 배양한 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 알파-아밀레이스 저해 활성 테스트에 사용하기 전에 2회 계대 배양하였으며, 2회 계대 배양 후 원심분리하여 PBS(phosphate buffer saline, pH6.9)로 2회 세척하고, 초음파 분쇄기(sonicator)로 용해하여 사용하였다. 용해 전에 상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 1×108 CFU/㎖의 농도로 조정하여 사용하였다.
상기 초음파 분쇄기로 분쇄한 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 용해액과 10U/㎖의 돼지 췌장(porcine pancreas) 유래의 알파-아밀레이스 효소액을 혼합하여 상온(25℃)에서 10분간 전(pre)-배양하였다. 이후, 기질로서 1% 전분(starch)을 첨가한 후 상온(25℃)에서 10분간 배양하였다. 배양액에 DNS 발색시약[0.5M 수산화나트륨(sodium hydroxide) 중 타르타르산 칼륨 나트륨(sodium potassium tartrate)을 함유한 40mM의 3,5-디니트로살리실산(3,5-dinitrosalicylic acid)]을 첨가하고, 100℃의 끓는 물에서 5분간 가열하여 발색시킨 후 꺼내어 충분히 냉각시켰다. 이를 마이크로플레이트 리더(microplate reader; model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고 알파-아밀레이스 저해율(%)을 계산하였다.
저해율(%)= 100-[(시료를 첨가한 흡광도 / 시료를 첨가하지 않은 흡광도)×100]
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-아밀레이스 저해 활성을 분석해 본 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 용해액을 시료로 첨가한 시험군은 시료를 첨가하지 않은 대조군(Pos; 양성 대조군)과 비교하여 63%의 알파-아밀레이스 저해 활성을 보였으며, 대조군과 뚜렷한 유의적 차이(*p<0.05)를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-글루코시다아제 저해 활성 평가
알파-글루코시다아제(α-glucosidase)의 활성을 저해하여 십이지장과 소장에서의 소당류 분해를 억제하면 혈당이 급격이 증가하는 것을 막을 수 있음이 알려져있다(Joubert et al., 1987). 따라서 알파-글루코시다아제 활성 저해율은 혈당을 조절하는 데 있어 주요한 지표로 이용되고 있다.
이에, 상기 실시예 1에서 김치로부터 분리 및 동정한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-글루코시다아제 저해 활성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 배양 용해액(lysate; 1×108 CFU/㎖ 농도)을 제조하였다.
상기 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 용해액과 1U/㎖의 알파-글루코시다아제 효소액을 혼합하고 37℃에서 10분간 전-배양하였다. 상기 배양액에 3mM의 p-니트로페닐-α-D-글루코피라노사이드(pNPG; p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside)를 가하고 37℃에서 20분간 반응시켰다. 이후, 1M의 탄산나트륨(sodium carbonate(Na2CO3))을 가하여 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더(model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 405 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고 알파-글루코시다아제 저해율(%)을 계산하였다.
저해율(%)= 100-[(시료를 첨가한 흡광도 / 시료를 첨가하지 않은 흡광도)×100]
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 알파-글루코시다아제 저해 활성을 분석해 본 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 용해액을 시료로 첨가한 시험군은 시료를 첨가하지 않은 대조군(Pos; 양성 대조군)과 비교하여 51%의 알파-글루코시다아제 저해 활성을 보였으며, 대조군과 뚜렷한 유의적 차이(*p<0.05)를 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 특성 분석
프로바이오틱스(probiotics)는 충분한 양이 섭취되었을 경우, 인간이나 동물 등 숙주에게 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물을 의미하며, 유산균은 가장 잘 알려진 프로바이오틱스이다.
특정 유산균이 체내에 들어가서 프로바이오틱스로서의 역할을 수행하기 위하여서는 일반적으로 위장의 위산, 담낭의 담즙 및 소장에서 분비되는 각종 소화효소와 같은 저해환경으로부터 저항력을 가지며 대장과 소장에 안정하게 도달해 증식하고 정착하는 능력을 구비해야 한다.
이에, 상기 실시예 1에서 김치로부터 분리 및 동정한 유산균인 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5134 균주의 체내 전달 안정성 특성을 파악하고자, 체내 전달에 따른 각각의 단계, 즉, 위, 담낭, 장에 도달할 때까지의 각 단계에서 유산균의 생존율에 스트레스로 작용할 것으로 예상되는 환경 조건을 가하여 상기 균주의 안정성을 시험 평가하였다.
실시예 4-1: 인공위액에 대한 저항성
프로바이오틱스로의 기능을 발휘하기 위해서는 소화관 내의 조건에서 생존해야한다. 순수한 위액의 pH는 1.4∼2.0 정도로 유지되어 대부분의 미생물은 위액 내에서 사멸되거나 원래 지니고 있던 활성이 저하된다. 구강을 통해 섭취된 프로바이오틱스는 위액과 각종 효소가 존재하는 위를 통과하고, 담즙이 존재하는 십이지장을 거쳐 최종 목적 부위인 장에 도달해야 기능적인 효과를 나타낼 수 있다. 그중에서도 위산과 같은 낮은 pH에서 생존하기 위해서 인공위액에 대한 내산성을 나타내어야 한다. 따라서 국내 전통발효식품인 김치에서 분리된 식용 가능 균주로 선발된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 인공위액에 대한 저항성을 확인하였다.
구체적으로, MRS 고체배지 상에 스트리킹(streaking)하여 배양하고 냉장보관하여 둔 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 액체배지에 접종하여 16시간 동안 전배양을 진행하였다. 낮은 pH 환경에 대한 내성을 확인하기 위해 pH 2.0으로 조절한 MRS 액체배지에서 16시간 동안 전배양한 상기 LRCC5314의 균체 배양액 1%를 접종하여 37℃의 환경에서 120분 동안 배양하였다. 이때, pH를 조정하지 않은 pH 6.8 조건하에서 배양한 것을 대조군으로 하였다.
생장 정도를 확인하기 위해 상기 LRCC5314 균주를 접종한 후 0분, 15분, 30분, 60분, 120분이 경과한 시점에서 마이크로플레이트 리더(model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 600 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 인공위액에 대한 저항성, 즉 낮은 pH 환경에 대한 내성을 120분 동안 대조군(control)과 흡광도를 비교하여 분석해 본 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, pH를 조정하지 않은 pH 6.8 조건하에서 배양한 대조군과 통계적 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 pH 2.0의 인공위액 조건하에서도 120분 이상 높은 안정성을 가짐을 확인하였으며, 내산성을 지닌 균주임을 알 수 있었다.
실시예 4-2: 인공 담즙액에 대한 저항성
상기 실시예 4-1에서 실시한 인공위액에 대한 저항성 여부 확인 테스트와 마찬가지로 MRS 고체배지 상에 스트리킹하여 배양하고 냉장보관하여 둔 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 MRS 액체배지에 접종하여 16시간 동안 전배양을 진행하였다. 장내 담즙산 농도와 유사한 0.1%의 담즙성 환경에 대한 내성을 확인하기 위해, 옥스갈(oxgall)을 각각 0.2% 및 0.4% 첨가한 MRS 액체배지에서 16시간 동안 상기 LRCC5314 균주를 전배양하고, 이의 배양액을 각각 1%씩 접종하여 37℃에서 12시간 동안 배양하였다. 이때, 옥스갈을 첨가하지 않은 조건하에서 배양한 것을 대조군으로 하였다.
생장 정도를 확인하기 위해 상기 LRCC5314 균주를 접종한 후 0시간, 3시간, 6시간, 9시간, 12시간이 경과한 시점에서 마이크로플레이트 리더(model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 600 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하였다.
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 인공담즙액에 대한 저항성을 12시간 동안 대조군(control)과 흡광도를 비교하여 분석해 본 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 옥스갈을 첨가하지 않은 조건하에서 배양한 대조군과 통계적 차이를 보이지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 0.2% 및 0.4%의 옥스갈이 각각 포함된 인공담즙액 조건하에서도 12시간 이상 높은 안정성을 가짐을 확인하였으며, 내담즙성을 지닌 균주임을 알 수 있었다.
실시예 4-3: 장관상피세포 부착능
프로바이오틱스로의 특징을 지니려면 위와 십이지장을 통과하여 최종목적 부위인 장에 도달하여 장내 상피세포에 정상적으로 부착되어야 증식이 가능하고 그 기능을 할 수 있다. 이에, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 장관상피세포 부착능을 평가하기 위하여 대장 상피세포인 Caco-2 세포를 배양하여 활용하였다.
구체적으로, Caco-2 세포는 한국세포주은행(Korea cell line bank, KCLB 30037.1)로부터 분양 받았으며, 2×104 세포/웰(well)의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고, 96-웰 플레이트 상에 고르게 분포되도록 2주 동안 배양을 진행하였다. 상기 Caco-2 세포 배양을 위한 배지는 20㎍/㎖ 젠타마이신(Gentamicine Reagent Solution, Gibco BRL)과 10% FBS(Gibco BRL)가 함유된 MEM(Minium Essential Media) 배지를 이용하였으며, 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다. 상기 배양한 Caco-2 세포를 PBS로 2회 세척하고, 이후 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 농도가 1×107 세포/웰이 되도록 FBS가 함유되지 않은 새로운 MEM 배지로 현탁하여 상기 Caco-2 세포에 처리하였다. 처리 후, 2시간 동안 배양하였으며, 2시간의 반응 후, 트립신-EDTA(Trypsin-EDTA, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 부착되어 있는 세포들을 탈착하였다. 장 정착능을 측정하기 위해 탈착한 세포들을 PBS에 희석한 뒤, MRS 아가 플레이트(MRS agar plate)에 배양하여 콜로니(colony) 수를 측정하여 부착 정도를 계산하였다.
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 Caco-2 세포에 대한 장 부착 정도를 측정, 즉, 접종한 초기 균수(initial) Log 7 CFU/㎖ 대비 2시간 반응 후 Log 6.2 CFU/㎖의 부착 균수(adherent)를 보였으며, 하기 식에 따라 산출해 본 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대장 상피세포인 Caco-2 세포에 대해 약 17% 정도의 부착능을 보유하고 있음을 확인하였다.
% 부착능(adhesion) = [(CFU/㎖120min) / (CFU/㎖0min)] × 100
따라서, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 장내 적응성을 가진다는 점을 확인하였으며, 향후 생균제(probiotics)로 개발 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 탄수화물 대사 및 효소 활성 분석
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 생화학적 특성을 분석하고자, API50CHB 키트(BioMerieux사, France) 및 API 20E 키트(BioMerieux사, France)를 이용하여 탄소원 이용성 여부 및 효소 활성을 측정하였다.
실시예 5-1: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 탄소원 이용성 여부 분석
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 탄소원 이용성은 API50CHB 키트(BioMerieux사, France)에 의한 당 발효 시험으로 분석하였다.
구체적으로, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 MRS 고체배지에서 배양한 다음, 콜로니를 일정량 채취하여 API 50 CHB/E 배지(medium) 5 ㎖에 현탁하였다. 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 현탁된 CHB/E 배지를 API 50CH 스트립(strip)의 튜브에 접종하고, 37℃ 온도 조건에서 48시간 동안 배양한 후 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 탄수화물 대사 유무 결과를 확인하였다. 이때, 하기 표 1에서 "+"는 탄소원 이용성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 탄소원 이용성이 음성인 경우를 나타내고, "w"는 탄소원 이용성 여부가 약한 경우를 나타내었다.
API50CHB 키트를 이용하여 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 탄수화물 대사를 분석해 본 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, D-글루코스(D-glucose), D-프럭토스(D-fructose), D-만노오스(D-mannose), N-아세틸 글루코사민(N-acethyl glucosamine), 아미그달린(amygdalin), 알부틴(arbutin), 에스큘린(esculin), 살리신(salicin), D-셀리오비오스(D-celiobiose), D-말토오스(D-maltose), D-사카로오스(D-saccharose (sucrose)), D-트레할로스(D-trehalose), D-멜레지토스(D-melezitose), 젠티오바이오스(Gentiobiose), 및 D-투라노스(D-turanose)를 대사하는 것, 즉, 상기 탄소원들을 이용하는 것으로 나타났다. 또한, 상기 탄소원들 이외에 D-리보스(D-ribose), D-만니톨(D-manitol), D-솔비톨(D-sorbitol), D-멜리바이오스(D-melibiose), 및 5-케토-글루코네이트(5-keto-gluconate)를 약하게 대사하는 것으로 나타났다.
Figure 112019097768179-pat00001
실시예 5-2: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 효소 활성 평가
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 효소 활성을 측정하기 위해 API 20E 키트를 이용하여 실험하였다.
구체적으로, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주를 MRS 고체배지에서 배양한 다음, 콜로니를 일정량 채취하여 API 현탁 배지 5 ㎖에 현탁하였다. 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 현탁된 API 현탁 배지를 API 20E 스트립에 접종하고, 혐기적인 조건을 요구하는 항목은 미네랄 오일(mineral oil)을 큐플에 채워 혐기적인 조건을 조성하여 주었으며, 37℃ 온도 조건에서 24시간 동안 배양한 후 각각의 효소 항목에 따라 API 20E 시약, 및 보조 시약인 TDA 시약, VP1 시약, VP2 시약, JAMES 시약, Zn 시약, NIT 1 시약, NIT2 시약을 이용하여 효소 활성 결과를 확인하였다. 이때, 하기 표 2에서 "+"는 효소 활성이 양성인 경우를 나타내고, "-"는 효소 활성이 음성인 경우를 나타내고, "w"는 효소 활성 여부가 약한 경우를 나타내었다.
API 20E 키트를 이용하여 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 효소 활성을 분석해 본 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 효소 중 ONPG(Ortho-nitro-phl-ß-D galactopyranodide(ONPG)isopropylthiogalcto-pyranosoide(IPTG))를 기질로 하는 ß-갈락토시다아제(ß-galactosidase), 아르기닌을 기질로 하는 ADH(arginine dihydrolase), 라이신을 기질로 하는 LDC(lysine decarboxylase), 우레아를 기질로 하는 URE(urease), 트립토판을 기질로 하는 TDA(tryptophane deaminase), 젤라틴을 기질로 하는 GEL(gelatinase)에 대한 효소 활성을 가지고 있지 않음을 확인하였다.
Figure 112019097768179-pat00002
실시예 6: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 세포독성 평가 및 항염증 효과 분석
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 안정성 및 항염증 효과를 평가하고자, MTT 어세이 및 NO(nitric oxide) 어세이를 수행하여 실제 세포 수준에서 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 세포독성 여부 및 항염증 효과를 확인하였다.
이때, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 세포독성 평가 및 항염증 효과 분석에는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 분양받은 RAW 264.7(ATCC TIB-71) 마우스 대식세포를 이용하였다. RAW 264.7 세포는 수령 후 2~3일에 걸쳐 1주일 동안 세포계대를 진행하였다. 세포 배양을 위한 배지는 20μg/㎖의 젠타마이신(Gentamicine Reagent Solution, Gibco BRL)과 10% FBS(Gibco BRL)를 함유한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 이용하였으며, 37℃, 5% CO2의 배양 조건하에서 배양하였다.
실시예 6-1: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 세포독성 평가
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 세포독성을 평가하고자, MTT 어세이를 수행하였다.
구체적으로, RAW 264.7 세포를 5×105 세포/웰(cells/well)의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다. FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지를 이용하여 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 농도가 1×108 세포/웰(CFU/㎖/well)이 되도록 조정한 후, 이를 세포에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 염증을 유발시키는 것으로 알려진 LPS를 0.1μg/㎖ 처리한 군과 무처리군을 대조군으로 하여 동일하게 실험하였다. Raw 264.7 세포주의 생존율을 측정하기 위해 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 시약을 사용하였으며, 마이크로플레이트 리더(model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 590 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고 세포 생존율(%)을 계산하였다.
세포 생존율(%) = (균주 배양액 처리군의 흡광도 / 균주 배양액 무처리군의 흡광도) × 100
MTT 어세이를 수행하여 Raw 264.7 세포에 대한 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 세포독성 정도를 측정해 본 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 배양액 1×108 CFU/㎖ 처리 시, Raw 264.7 세포의 생존율이 오히려 무처리군에 비해 약 10% 정도 증가하는 것으로 나타났다. 특히 LPS 처리 시, 생존율이 급격히 감소한 것에 비하여 매우 뚜렷한 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 세포독성을 나타내지 않아 생체 부작용을 유발하지 않고 안정성을 지니고 있음을 알 수 있었다.
실시예 6-2: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 항염증 효과 분석
상기 실시예 2 및 3에서 각각 확인한 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 활성에 따른 혈당 상승 억제 효과 이외에, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 추가적인 효과를 확인하고자, NO 어세이를 수행하여 항염증 효과 여부를 추가 분석하였다.
구체적으로, RAW 264.7 세포를 배양하여 5×105 세포/웰의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지에 염증 유발 물질로 알려진 LPS를 0.1μg/㎖이 되도록 첨가하고, 여기에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 농도가 1×108 세포/웰(CFU/㎖/well)이 되도록 현탁하여 세포에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 이때, LPS만을 처리한 군과 무처리군을 대조군으로 하여 동일하게 실험하였다. 24시간 후 세포의 상등액에서 NO 생성을 측정하기 위해 그리스(Griess) 시약을 상등액과 1:1로 혼합하여 넣고, 10분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 540 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하고 NO 생성능(%)을 계산하였다.
NO 생성능(%)= 100-[(균주 배양액 처리군의 흡광도 / 균주 배양액 무처리군의 흡광도)×100]
NO 어세이를 수행하여 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주에 의한 NO 생성 저해 정도를 측정해 본 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, LPS로 염증이 유도된 대조군과 비교하여 LPS가 처리된 Raw 264.7 세포에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 배양액 1×108 CFU/㎖ 처리 시, 염증 진행에 중요한 매개 인자인 NO 생성 정도가 60% 정도로 저해됨을 확인하였다. 즉, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주는 염증이 유발된 세포에서 NO 생성량을 크게 감소시킬 수 있으므로, 항염증 효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
실시예 7: 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 항스트레스 효과 분석
상기 실시예 2 및 3에서 각각 확인한 알파-아밀레이스 및 알파-글루코시다아제 저해 활성에 따른 혈당 상승 억제 효과와 상기 실시예 6-2에서 확인한 항염증 효과 이외에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 추가적인 효과를 확인하고자, 코르티졸 분비 정도를 확인하여 항스트레스 효과 여부를 추가 분석하였다.
구체적으로, 인간 부신피질세포인 H295R 세포는 100U/㎖의 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin 10,000U/㎖, Gibco BRL) 및 10% FBS(Gibco BRL)를 함유한 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2의 환경에서 1주일에 2~3회 계대배양하여 증식시켰다. 상기 H295R 세포는 ATCC(American Type Culture collection, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다.
상기 증식시킨 H295R 세포를 5×105 세포/웰(well)의 농도로 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 37℃, 5% CO2의 환경에서 배양하였다. 스트레스 유발 물질(stressor)로 알려져 있는 LPS(10ng/㎖)를 양성 대조군으로서 사용하였으며, 이를 FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지와 혼합하여 처리하였다. 실험군은 LPS(10ng/㎖)가 처리된 플레이트 웰에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 농도가 1×108 세포/웰이 되도록 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상등액에서 세포주의 스트레스 관련 인자인 코르티졸(cortisol)의 생성 정도를 확인하였다. 이때, 코르티졸 생성 정도는 코르티졸 파라미터TM 어세이 키트(Cortisol ParameterTM assay Kit; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다. 코르티졸 생성 정도는 상기 키트 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였으며, 코르티졸 분비량은 마이크로플레이트 리더(model Infinite® F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 450 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 산출하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군으로서 LPS(10ng/㎖)만 처리된 H295R 세포로부터는 12.5ng/㎖의 코르티졸이 분비된 반면, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 처리된 H295R 세포로부터는 오로지 3.8ng/㎖의 코르티졸이 분비되었다.
즉, 양성 대조군으로서 LPS만이 처리된 H295R 세포에 비해 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주가 함께 처리된 H295R 세포의 경우 코르티졸 분비량이 3배 이상 감소된 바, 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주의 항스트레스 효과가 우수함을 알 수 있었다.
제조예 1: 약학 조성물의 제조
하기의 약학 조성물 제조에서 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 배양물은 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 자체 또는 이의 파쇄물로 대체가 가능하다.
제조예 1-1: 산제의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 20 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제조예 1-2: 정제의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제조예 1-3: 캡슐제의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 10 ㎎
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
유당 15 ㎎
스테아린산 마그네슘 0.2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제조예 1-4: 환의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 10 ㎎
유당 150 ㎎
글리세린 100 ㎎
자일리톨 50 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
제조예 1-5: 과립의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 15 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
제조예 1-6: 주사제의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 10 ㎎
소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎
메틸파라벤 0.8 ㎎
프로필파라벤 0.1 ㎎
주사용 멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합한 후, 이중 2㎖를 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
제조예 2: 식품 조성물의 제조
하기의 식품 조성물 제조에서 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 배양물은 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 균주 자체 또는 이의 파쇄물로 대체가 가능하다.
제조예 2-1: 밀가루 식품의 제조
밀가루 100 중량부에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 0.5 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
제조예 2-2: 유제품(dairy products)의 제조
우유 100 중량부에 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 0.5 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제조예 2-3: 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 17 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물(1 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부).
제조예 2-4: 건강음료의 제조
액상과당(0.5 g), 올리고당(4 g), 설탕(2 g), 식염(0.5 g), 물(77 g)과 같은 부재료와 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 1 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
제조예 2-5: 야채 주스의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 2 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
제조예 2-6: 과일 주스의 제조
락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314 배양물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12540P 20190620
<110> LOTTE FOODS CO.,LTD <120> Lactobacillus plantarum LRCC5314 useful for lowering blood glucose and relieving stress and use thereof <130> DP-2019-0116 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LRCC5314_16S rDNA <400> 1 tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 60 cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 120 tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 180 cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 240 ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 300 cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 360 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac 420 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt 480 cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 540 taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg 600 gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 660 tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga 720 gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 780 aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 840 gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt 900 ttaggaacca gccgcctaag gtgggacaga tgattagggt gaagtcgtaa caagggtaac 960 960

Claims (13)

  1. 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주로,
    상기 균주는 김치로부터 분리되고, 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열을 포함하며,
    60% 이상의 알파-아밀레이스(α-amylase) 저해 활성 또는 50% 이상의 알파-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해 활성을 갖고,
    D-글루코스, D-프럭토스, D-만노오스, N-아세틸 글루코사민, 아미그달린, 알부틴, 에스큘린, 살리신, D-셀리오비오스, D-말토오스, D-사카로오스, D-트레할로스, D-멜레지토스, 젠티오바이오스 및 D-투라노스로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 탄소원을 이용하는, 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성, 내담즙성 또는 장부착능을 가지는, 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 혈당 강하, 항당뇨 또는 항염증 효과를 가지는, 균주.
  5. 삭제
  6. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 프로바이오틱 조성물.
  7. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 혈당 강하용 조성물.
  8. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 당뇨 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  10. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 약학 조성물.
  11. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 항염증용 식품 조성물.
  12. 제1항의 수탁번호 KCCM12540P로 기탁된 락토바실러스 플랜타럼 LRCC5314(Lactobacillus plantarum LRCC5314) 균주, 이의 배양물 또는 이의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는, 코르티졸 과다분비 개선용 식품 조성물.
  13. 삭제
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