KR102242002B1 - 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효된 홍삼 추출물이 지방간 유도 간세포 내 지방축적을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하며, 지방간 마우스 동물시험 모델에서 지방간을 개선하는 효과를 나타내므로, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 또는 간보호용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating fatty liver disease comprising solid phase fermented red ginseng extract by cordyceps}
본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 조성물, 또는 간보호용 조성물에 관한 것이다.
지방간은 지방의 과도환 섭취와 간 내의 축적 및 합성 증가, 배출 감소 등의 원인에 의해 정상적인 지방 대사가 이루어지지 못함으로써, 지질 특히 중성지방이 과도하게 축적되어 간 내 지방의 비율이 5%를 초과하는 경우를 의미한다. 최근 영양상태가 좋아짐에 따라 지방간 및 관련 질환은 비만 유병률의 증가와 더불어 서구 사회 뿐만 아니라 국내에서도 유병률이 급격하게 증가하고 있다. 또한, 일부 환자에서는 지방간염을 거쳐 간경변이나 간암과 같은 고위험성 간 질환으로 진행할 수 있어 이에 대한 예방 및 개선 방안이 중요하게 여겨지고 있다.
지방간의 주 원인은 음주와 비만이며, 혈중 지방질의 농도가 높은 고지혈증이나 당뇨병 등의 질병에 동반되어 나타나기도 하고, 부신피질 호르몬제(스테이로이드제)나 여성 호르몬제 등의 약제도 원인이 될 수 있다. 또한, 심한 영양부족에 의해서도 지방간이 생길 수 있다. 지방간의 증상은 지방의 축적 정도와 축적기간, 그리고 다른 질환의 동반 유무에 따라 달라질 수 있다.
그러나 현재까지 지방간 및 관련 질환 증상 완화 또는 악화 방지를 위해 당뇨병 치료제와 비만 치료제, 항고지혈증 치료제가 의사 재량에 의해 사용되고 있다. 일예로 지방간의 치료제로서 폴리엔포스파티딜콜린이 임상에서 사용되고 있고, 고지혈증 치료제인 클로피브레이트로 대표되는 피브레이트계 약물, 스타틴계 약물이 지방간에 대한 효과가 있다고 알려져 있다. 그러나 피브레이트계 약물은 지방간 beta-산화계 효소를 매개로 고밀도지단백질 콜레스테롤을 증가시키는 등 지질대사를 개선시키는 효과가 있으나, 간기능 장애를 일으키는 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다. 즉, 현재까지 치료 효과가 우수하면서도 부작용을 발생하지 않는 근본적인 예방법 또는 치료법은 부족한 실정이다.
또한, 전 세계적으로 간 보호를 위해 권장되는 식이보충제는 밀크씨슬, 비타민 E 등이 있으나 지방간 예방 및 개선에 특이적인 제품의 개발 및 보급은 현재까지 미비한 상황이다. 일예로 국내의 경우, 간 건강과 관련하여 밀크씨슬 추출물을 비롯하여 총 10가지가 건강기능식품 기능성 원료로 인정받았으나, 이 중 지방간에 특화된 소재는 없는 실정이다.
한편, 국내 대표적 약용작물인 인삼 및 홍삼은 혈행개선, 혈당조절, 면역력기능, 기억력개선 및 피로개선 등의 다양한 기능이 인정된 건강기능식품 기능성원료(고시형)로 알려져 있으며, 효소 및 젖산균 등을 이용하여 액상발효로 생리활성성분의 흡수율을 증가시킨 발효홍삼 제품이 출시되고 있다.
이에, 본 발명자들은 부작용 문제를 유발하지 않는 약용작물을 지방간 개선용 소재로 개발하기 위해 노력한 결과, 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효된 홍삼 추출물이 지방간 유도 간세포 내 지방축적을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하며, 지방간 마우스 동물시험 모델에서 지방간을 개선하는 효과를 나타냄을 확인하여, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 또는 간보호용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1607445호 대한민국 등록특허 제10-1072247호
본 발명의 목적은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 식품 조성물 및 식품 첨가제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호용 건강기능식품, 식품 조성물 및 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물은 지방간 유도 간세포 내 지방축적을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하며, 지방간 마우스 동물시험 모델에서 지방간을 개선하는 효과가 나타내므로, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물, 또는 간보호용 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 지방간 유도 간세포 내 지방축적 억제 효과를 확인한 도이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물과 홍삼 추출물에 의한 지방간 유도 간세포 내 지방축적 억제 효과를 비교한 도이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 지방간 유도 간세포의 지방생합성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 지방간 유도 간세포의 지방산 산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 간세포의 미토파지(mitophagy) 유도 효과를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 7은 지방간 마우스 동물시험 모델에서 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물 투여에 의한 간 중량 및 체중 대비 간 중량 변화를 확인한 도이다.
도 8은 지방간 마우스 동물시험 모델에서 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물 투여에 의한 간 조직 내 중성지방 함량 변화를 확인한 도이다.
도 9는 지방간 마우스 동물시험 모델에서 본 발명에 따라 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물 투여에 의한 혈중 ALT 및 AST 농도 변화를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 '고상발효'란 고체 기질에 일정량의 수분을 함유하게 한 후, 미생물을 키워서 발효시키는 방법을 의미하는 것으로서, '고체발효'라고도 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼은 기 등록된 대한민국등록특허 제10-1797663호에서 확립한 동충하초균사체로 고상발효된 사포닌 함유 생약재 조성물의 제조방법에 따라 제조된다.
구체적으로, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼은 하기의 단계를 거쳐 제조된다:
1) 홍삼을 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지시켜 열처리하고, 건조하는 단계;
2) 상기 건조된 홍삼을 탄소원 분말로 코팅하는 단계;
3) 상기 코팅된 홍삼을 멸균하는 단계;
4) 상기 멸균된 홍삼을 냉각시킨 후 배양하는 단계; 및
5) 상기 배양한 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효하는 단계.
상기 단계 1)에서 열처리는 90 내지 120℃로 가열된 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액(40 내지 80%)에 홍삼을 침지시킨 후 10초 내지 50분, 바람직하게는 30초 내지 40분, 보다 바람직하게는 1분 내지 30분 동안 침지시켜 수행될 수 있다. 또한, 90 내지 120℃로 가열된 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액으로 20 내지 50초 동안 증숙시킬 수 있다.
상기 열처리 시 온도 및 처리 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 항균성분이 제거되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 홍삼의 유효성분이 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액으로 유출될 수 있다.
상기 단계 1)에서 건조는 이후 탄소원 분말이 고르게 코팅되도록 하기 위하여 상기 열처리된 홍삼의 수분함량이 20 내지 30 중량%가 되도록 수행될 수 있다.
상기 수분함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 탄소원 분말이 코팅되지 않는 부분이 존재할 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 탄소원 분말이 뭉쳐서 코팅이 고르게 되지 않을 수 있고 원하지 않는 미생물이 다량 존재하여 이후 멸균공정으로도 일부 미생물이 멸균되지 않을 수 있다.
상기 단계 2)에서 탄소원 분말은 홍삼 1 중량부에 대하여 0.7 내지 1.3 중량부, 바람직하게는 0.8 내지 1.2 중량부의 양으로 코팅시킨다. 탄소원 분말의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 사포닌 함유 생약재의 전체 표면에 탄소원 분말이 코팅되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 단계 4)에서 원하지 않는 다량의 미생물이 발생될 수 있다.
상기 탄소원 분말은 당류, 전분 및 곡물 분말로 이루어진 군에서 선택된 2종 이상을 포함하여, 효모 추출물 분말을 더 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 탄소원 분말은 당류와, 전분 또는 곡물 분말 중 하나가 혼합되는 것이며, 상기 전분으로는 감자전분, 고구마전분 또는 옥수수전분을 들 수 있고, 상기 곡물로는 현미, 백미, 찹쌀 또는 흑미를 들 수 있다.
상기 탄소원 분말은 당류 1 중량부에 대하여 전분 또는 곡물 분말 중 하나가 0.8 내지 15 중량부, 바람직하게는 0.9 내지 12 중량부, 보다 바람직하게는 1 내지 11 중량부로 혼합될 수 있다. 전분의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 동충하초균사체가 생장할 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하지 않는 다른 미생물이 발생할 수 있다.
또한, 효모 추출물 분말은 당류 1 중량부에 대하여 0.8 내지 3 중량부, 바람직하게는 0.9 내지 1.2 중량부로 혼합된다. 효모 추출물 분말의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 동충하초균사체의 생장이 더딜 수 없으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하지 않는 다른 미생물이 발생할 수 있다.
상기 단계 3)에서 상기 탄소원 분말에 의하여 생장될 수 있는 미생물을 사멸시키기 위하여 코팅된 홍삼은 110 내지 140℃ 및 1.0 내지 1.2 kg/㎠의 고온고압하에서 20 내지 50분 동안 멸균을 수행한다. 상기 온도, 압력 및 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 멸균되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 홍삼의 유효성분이 변성될 수 있다.
상기 고온고압하에서 멸균을 수행시 상기 코팅된 홍삼에 수분이 침투하지 않으므로 표면에 탄소원 분말이 그대로 존재한다.
상기 단계 4)에서 상기 높은 온도로 멸균된 홍삼을 5 내지 10℃/분의 속도로 상온까지 냉각시킨다. 냉각 속도가 상기 하한치 미만인 경우에는 상온까지 냉각되는데 오랜 시간이 소요되며, 상기 상한치 초과인 경우에는 원하는 성분의 증대를 가져올 수 없다.
상기 단계 4)에서 배양은 상기 냉각된 홍삼을 밀봉한 후 20 내지 35℃, 바람직하게는 23 내지 25℃에서 20 내지 25일 동안 수행한다. 배양 온도 및 일수가 상기 하한치 미만인 경우에는 진세노사이드 함량이 증가하지 않고 코디세핀이 형성되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 진세노사이드 함량이 오히려 줄어들고 코디세핀이 미량만 생성될 수 있다.
상기 단계 5)에서 접종하는 동충하초균사체는 코디셉스속 동충하초(Cordyceps spp.)이며, 바람직하게는 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 스카라베콜라(Cordyceps scarabaecola), 코디셉스 누탄스(Cordyceps nutans), 코디셉스 스페코세팔라(Cordyceps sphecocephala), 코디셉스 트리센트리(Cordyceps tricentri), 패실로마이세스(Paecilomyceps tenuipes) 및 패실로마이세스 자포니카(Paecilomyces japonica)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있다.
또한, 상기 동충하초균사체에 접종된 홍삼의 수분함량은 30 내지 40 중량%이다. 수분함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 동충하초균사체 생장이 제한되어 발효의 효율이 낮아지고 발효가 중단될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 코디세핀이 형성되지 않을 수 있다.
상기 단계 5)에서 동충하초균사체에 접종된 홍삼은 20 내지 30℃에서 40 내지 70일 동안 고상발효를 수행한다. 고상발효 온도 및 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 발효의 효율이 낮아질 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 홍삼의 유효성분 중 일부가 변성될 수 있다.
본 발명의 유효성분인 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물은 상기와 같이 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼을 이용하여 하기의 단계들을 포함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
A) 상기와 같이 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 및
B) 단계 B)의 추출물을 여과하는 단계.
상기 단계 A)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2의 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하고, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 초음파추출, 진탕추출, Soxhelt 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 분량의 1 내지 30배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 2 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 보다 바람직하다. 추출 온도는 20 내지 110℃인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10분 내지 72시간이 바람직하며, 20분 내지 48시간이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 아울러 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 B)를 거친 후 하기의 단계들을 추가적으로 포함할 수 있다:
C) 단계 B)의 여과물을 감압 농축하는 단계; 및
D) 단계 C)의 농축물을 건조하는 단계.
상기 단계 C)의 감압 농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서, 상기 지방간 질환은 비알콜성 지방간 질환일 수 있다.
또한, 상기 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간, 영양성 지방간, 기아성 지방간, 비만성 지방간, 당뇨성 지방간, 지방간염, 간섬유화 또는 간경화일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명에 따라 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효된 홍삼 추출물을 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 유도 간세포에 처리한 결과, 간세포 내 지방축적이 억제되고, 고상발효되지 않은 홍삼 추출물과 비교하여 지방축적 억제 효과가 보다 우수함을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 유도 간세포에 처리한 결과, 지방간 유도에 의해 증가된 지방생합성 조절 인자 및 지방산 산화 조절 인자의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 간세포에 처리한 결과, 간세포의 미토파지(mitophagy)를 유도하여 미토콘드리아의 기능성을 향상시키는 것을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 염증을 유도한 대식세포에 처리한 결과, 염증 유도에 의해 증가된 염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 6 참조).
아울러, 본 발명자들은 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 마우스 동물시험 모델에 투여한 결과, 지방간이 개선되는 것을 확인하였다(도 7 내지 도 9 참조).
따라서, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 지방간 유도 간세포 내 지방축적을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하며, 지방간 마우스 동물시험 모델에서 지방간을 개선하는 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 혼합생약재에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 환자의 연령, 성별 및 증상의 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 500 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 첨가제를 제공한다.
상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼, 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물, 지방간 질환에 대해서는 상기 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 건강기능식품, 식품 조성물 또는 식품 첨가제의 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
한편, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 지방간 유도 간세포 내 지방축적을 억제하고, 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하며, 지방간 마우스 동물시험 모델에서 지방간을 개선하는 효과를 나타냄을 확인하였으므로, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 지방간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 식품 조성물 또는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 또는 식품 조성물로는 예를 들어, 차, 젤리, 즙, 엑기스, 음료 등의 장 기능 개선을 목적으로 하는 민간요법제를 들 수 있다. 이와 같이 다양한 형태로 가공된 본 발명의 건강기능식품은 인체에 부작용이 없으면서 복용이 용이하고 장기간 보관이 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 얼음과자, 아이스크림류, 우유, 우유 대용품, 크림, 버터, 버터 밀크, 요구르트, 요거트, 치즈를 포함하는 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 슈크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 추출물 100 mL당 일반적으로 0.001 내지 10.0 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0 g이다.
상기 외의 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스, 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지 않지만 본 발명의 추출물은 100 중량부 당 0.001 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명의 추출물을 식품 첨가제로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 간보호용 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명은 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 지방간 유도 간세포 내 지방축적을 억제하고, 간세포의 손상을 유발하는 염증성 사이토카인 및 케모카인 생성을 억제하는 것을 확인하였으므로, 상기 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 간보호용 건강기능식품, 식품 조성물 또는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 제조
<1-1> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼의 제조
기 등록된 대한민국등록특허 제10-1797663호에서 확립한 동충하초균사체로 고상발효된 사포닌 함유 생약재 조성물의 제조방법에 따라 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼을 제조하였다.
구체적으로, 100℃의 물에 홍삼 1 중량부를 30분 동안 침지시킨 후 수분함량이 25 중량%가 되도록 홍삼을 건조시키고, 탄소원 분말(설탕 1 중량부에 대하여 현미분말 10 중량부) 1.2 중량부로 홍삼을 코팅시켰다. 상기 코팅된 홍삼을 121℃, 1.1 kg/㎠으로 30분 동안 멸균시킨 후 7℃/분의 속도로 25℃까지 냉각시킨 다음 냉각된 홍삼을 배양기에 투입하여 25℃에서 20일 동안 배양하였다.
상기 배양된 홍삼의 표면에 동충하초균사체(Cordyceps militaris)를 접종하여 24℃에서 50일 동안 고상발효시켜 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼을 제조하였다.
<1-2> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 제조
상기 실시예 <1-1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 100 g에 증류수 1 L를 넣고 100℃에서 12 시간 동안 열수추출법으로 추출 및 여과하여 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 제조하였다.
< 비교예 1> 홍삼 추출물의 제조
홍삼 100 g에 증류수 1 L를 넣고 100℃에서 12 시간 동안 열수추출법으로 추출 및 여과하여 홍삼 추출물을 제조하였다.
< 실험예 1> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 간세포 내 지방축적 억제 효과 확인
비알콜성 지방간 질환(NAFLD)을 포함한 지방간에 대한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 일차배양한 간세포에 유리지방산을 처리하여 세포성 지방간 질환을 유도한 후, 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 처리하여 지방축적을 확인하였다.
구체적으로, 직접 분리하여 일차배양한 간세포를 10% FBS(fetal bovine serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지로 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포를 12 웰 플레이트에 일정한 수의 세포(1×105 cells/mL/웰)를 분주하였다. 세포를 분주한 후, 세포가 플레이트에 완전히 부착되어 60%의 포화도에 도달하였을 때 실험을 진행하였다. 상기 세포에 유리지방산으로 팔미테이트 200 μM을 24시간 동안 처리하여 지방간 질환을 유도한 후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 0, 31.25 또는 62.5 μg/mL로 각각 처리하고 6시간 경과 후 형광 염색을 수행하여 중성지방의 함량 변화를 측정하였다.
또한, 종래 홍삼 추출물과 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 효과를 비교하기 위하여, 상기에 기재된 방법과 동일한 방법으로 간세포에 팔미테이트 200 μM을 24시간 동안 처리하여 지방간 질환을 유도한 후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물(CRG) 62.5 μg/mL 및 상기 <비교예 1>에서 제조한 홍삼 추출물(RG) 62.5 μg/mL (RG)를 각각 처리하고 24시간 경과 후 형광 염색을 수행하여 중성지방의 함량 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 팔미테이트 처리에 의해 간세포에서 중성지방 함량이 증가하는 반면, 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물 처리에 의해 중성지방 함량이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 홍삼 추출물을 처리한 경우보다 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 처리한 경우 간세포 내 지방축적이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 간세포 내 지방축적을 억제함을 확인하였다.
< 실험예 2> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 간세포 지방생합성 억제 효과 확인
간세포의 지방축적은 크게 세 가지 분자적 기전, 구체적으로 미토콘드리아의 지방산 산화 기전, 간세포의 VLDL 분비 기전 및 지방생합성 기전에 의해 조절된다. 이에 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 간세포 내 지방축적 관련 기전에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 일차배양한 간세포에 유리지방산을 처리하여 세포성 지방간 질환을 유도하고, 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 처리한 후 지방생합성 기전 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 일차배양한 간세포에 팔미테이트(Palmitate, PA)를 6시간 동안 처리하여 세포성 지방간 질환을 유도한 후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물(CRG)을 농도별로 처리하고 6시간 경과 후 세포를 회수하였다. 그 다음, Gene all kit를 이용하여 제조사의 절차에 따라 상기 회수한 세포 각각에서 총 RNA를 추출하고, Toyobo cDAN 합성키트를 이용하여 제조사의 절차에 따라 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 지방생합성 조절 인자인 Fas 및 SREBP1c의 발현을 확인하기 위하여, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 FAS 및 SREBP1c에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. FAS 및 SREBP1c에 대한 프라이머는 하기 [표 1]에 나타내었다.
프라이머 서열(5' → 3')
FAS
 정방향 AGGTGCTAGAGGCCCTGCTA (서열번호 1)
역방향 GTGCACAGACACCTTCCCAT (서열번호 2)
SREBP1c
 정방향 GGAGCCATGGATTGCACATT (서열번호 3)
역방항 AGGAAGGCTTCCAGAGAGGA (서열번호 4)
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 간세포에서 팔미테이트 처리에 의해 증가된 Fas 및 SREBP1c의 발현이 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 처리에 의해 감소되는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 지방생합성 억제 기전을 통해 간세포 내 지방축적을 억제함을 확인하였다.
< 실험예 3> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 간세포 지방산 산화 억제 효과 확인
동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 간세포 내 지방축적 관련 기전에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 일차배양한 간세포에 유리지방산을 처리하여 세포성 지방간 질환을 유도하고, 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 처리한 후 지방산 산화 기전을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 일차배양한 간세포에 팔미테이트를 6시간 동안 처리하여 세포성 지방간 질환을 유도한 후, 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 농도별로 처리하고 6시간 경과 후 세포를 회수하였다. 그 다음, 상기 <실험예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 회수한 세포 각각에서 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 지방산 산화조절 인자인 PPARa 및 Pai-1의 발현을 확인하기 위하여, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 PPARa 및 Pai-1에 대한 프라이를 이용하여 PCR을 수행하였다. PPARa 및 Pai-1에 대한 프라이머는 하기 [표 2]에 나타내었다.
프라이머 서열(5' → 3')
PPARa 정방향 CGACCTGAAAGATTCGGAAA (서열번호 5)
역방향 CTTTCCCGCGAGTATGACC (서열번호 6)
Pai-1
 정방향 TCAGAGCAACAAGTTCAACTACACTGAG (서열번호 7)
역방항 CCCACTGTCAAGGCTCCATCACTTGCCCCA (서열번호 8)
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 간세포에서 팔미테이트 처리에 의해 증가된 PPARa 및 Pai-1의 발현이 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 처리에 의해 감소되는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 간세포 내 과도한 지방축적에 대한 보상반응으로 활성화된 지방산 산화 기전을 억제함으로써, 간세포 내 지방축적을 억제함을 확인하였다.
< 실험예 4> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 미토파지 유도 효과 확인
간세포 내 지방의 분해는 주로 미토콘드리아를 통해서 이루어지는 것으로 알려져 있다. 미토파지(mitophagy)는 상기 미토콘드리아의 기능성을 유지하는 기전으로서, 세포 내 손상 및 노화된 미토콘드리아 및 ROS 생성 미토콘드리아를 선택적으로 분해하는 기전이다. 이러한 기전을 통해 세포는 건강한 미토콘드리아 풀을 유지하고, 세포 내 기능을 유지하게 된다. 이에 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 간세포 내 미토콘드리아 기능 조절에 미치는 영향을 알아보기 위하여, mt-keima 유전자가 도입된 HeLa 세포에 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 처리한 후 미토파지 활성을 모니터링하였다.
구체적으로, mt-Keima 단백질은 미토콘드리아에 존재하면서 pH 의존적으로 형광의 Excitation 파장이 달라진다. 보다 구체적으로, 중성 상태일 때는 440 nm의 Excitation 파장에 의해 활성화되어 620 nm의 Emission 파장을 나타낸다. 산성 상태일 때는 586 nm의 Excitation 파장에서 활성화되어 620 nm의 Emission 파장을 나타낸다. 상기 특징을 이용하여 미토파지 활성을 모니터링하기 위하여, mit-keima 유전자가 도입된 HeLa 세포(ATCC® CCL-2TM)를 입수하고, 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 12 웰 플레이트에 일정한 수의 세포(1×105 cells/mL/웰)로 분주하였다. 상기 세포를 분주한 후, 세포가 12 웰 플레이트에 완전히 부착되어 80%의 포화도에 도달하였을 때 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 형광현미경과 유세포분석기를 이용하여 미토파지를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 간세포의 미토파지 활성이 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 간세포의 미토파지 유도를 통해 미토콘드리아의 기능성을 향상시킴을 확인하였다.
< 실험예 5> 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 염증성 사이토카인 생성 억제 확인
단순 지방간(Simple steatosis)이 만성적으로 유지된 후 일부 환자에서 비알콜성 지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)으로 발전하는 것이 잘 알려져 있다. 특히, 염증에 의한 간세포의 손상이 증가하며 만성염증에 의해 간섬유화로 발전할 수 있어 임상적으로 매우 중요한 단계이다. 이에 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 염증 기전에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 염증을 유도한 대식세포에 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 처리한 후 염증성 사이토카인 및 케모카인의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 대식세포로 Raw 264.7 세포포(ATCC® TIB-71TM)는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지로 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였고, 배양된 세포는 12 웰 플레이트에 일정한 수의 세포(1×105 cells/mL/웰)로 분주하였다. 세포를 분주한 후, 세포가 12 웰 플레이트에 완전히 부착되어 80%의 포화도에 도달하였을 때 LPS 1 ㎛/mL를 처리하여 염증을 유도하고, 동시에 상기 <실시예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 세포를 회수하였다. 그 다음, 상기 <실험예 2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 상기 회수한 세포 각각에서 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 염증성 사이토카인 및 케모카인으로 IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 및 CCL5의 발현을 확인하기 위하여, 상기 합성한 cDNA를 주형으로 IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 및 CCL5에 대한 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 및 CCL5에 대한 프라이머는 하기 [표 3]에 나타내었다.
프라이머 서열(5' → 3')
IL-1β 정방향 CTCGCAGCAGCACATCAACAAG (서열번호 9)
역방향 CCACGGGAAAGACACAGGTAGC (서열번호 10)
IL-6
 정방향 ACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAG (서열번호 11)
역방항 TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC (서열번호 12)
TNF-α
 정방향 AGGGTCTGGGCCATAGAACT (서열번호 13)
역방향 CCACCACGCTCTTCTGTCTA (서열번호 14)
CCL2
 정방향 ATTGGGATCATCTTGCTGGT (서열번호 15)
역방향 CCTGCTGTTCACAGTTGCC (서열번호 16)
CCL5
 정방향 ACTCCCTGCTGCTTTGCCTAC (서열번호 17)
역방향 TGTATTCTTGAACCCACTTCTTCTCTG (서열번호 18)
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 대식세포에서 LPS에 의해 증가되는 IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 및 CCL5의 발현이 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 처리에 의해 감소하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 통해 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 항염증 작용을 가지며, 상기 항염증 작용을 통해 비알콜성 지방간염을 억제할 수 있고, 염증에 의한 간세포 손상을 억제할 수 있음을 확인하였다.
< 실험예 6> 지방간 질환 마우스 동물시험 모델에서 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 효능 확인
<6-1> 지방간 질환 마우스 동물시험 모델의 제작
지방간 질환에 대한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 지방간 질환 마우스 동물시험 모델을 제작하였다.
구체적으로, 서구식 식습관의 증가로 인하여 비만, 대사증후군을 동반하여 지방간 질환이 증가하는 것으로 알려져 있는바, 서구식 인스턴트 식습관을 모방하여 지방간 마우스 동물시험 모델을 제작하였다. 수컷 6주령 C57BL/6J 마우스에 고지방 고탄수화물 식이 및 음수(Fast food diet, FFD)로서 42% kcal 지방 및 0.1% 콜레스테롤(Harlan TD.88137)을 포함하는 고농도 과당-포도당(high fructose-glucose) 용액(SW, 42 g/L)을 8주간 급여하여 지방간을 유도하였다. 그 다음, 하기 [표 4]놔 같이 2 그룹으로 나누고, 시험물질 투여군은 FFD를 지속적으로 급여하면서 시험물질로 상기 <실험예 1>에서 제조한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 6주간 1일 1회 경구투여하였다. 정상대조군은 정상식이(Normal calory diet, NCD)를 급여하였다.
No. 그룹 동물수 비고
1 정상 대조군 8 정상식이 급여
2 지방간 질환 대조군 10 FFD 급여 (지방간 질환 유도)
3 시험물질 투여군 10 FFD 급여 + 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물 300 mg/kg
<6-2> 지방간 질환 마우스 동물시험 모델에서 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물에 의한 지방간 질환 개선 효능 확인
지방간 질환에 대한 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물의 효능을 알아보기 위하여, 상기 실험예 <6-1>에서 제작한 지방간 질환 마우스 동물시험 모델을 이용하여 체중, 간 중량, 간 조직 내 중성지방 함량, 혈중 ALT 및 AST 농도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <6-1>에서 제작한 정상 대조군, 지방간 질환 대조군 및 시험물질 투여군에 급여를 완료한 후 희생하여 간을 적출하고, 간의 중량 및 체중에 대한 간의 상대적인 중량을 측정하였다(도 7).
또한, 상기 적출한 간으로부터 간 조직을 분리하여 작게 조각내어 5% NP-40 용액에 넣어 균질화한 후, 90℃에서 2분간 가열하고 13000 rpm에서 2분간 원심분리하여 얻은 상층액을 이용하여 조각의 무게에 따른 간 조직 내 중성지방의 함량을 측정하였다(도 8).
또한, 상기 3 그룹에 급여를 완료한 후 희생하여 심장에서 혈액을 채취하고 3시간 후 5000 rpm, 4℃에서 7분30초간 원심분리하여 얻은 혈청을 통해 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 acc.To IFCC 키트(Roche, Germany)를 사용하여 Cobas 8000 (Roche, Germany) 기계로 혈중 ALT 및 AST 농도를 측정하였다(도 9).
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 지방간 질환 대조군의 경우 FFD 급여에 의해 간 중량이 유의하게 증가하는 반면, 시험물질 투여군의 경우 간 중량의 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다. 또한, 시험물질 투여군의 경우 체중에 대한 간의 상대적인 중량도 유의하게 억제됨을 확인하였다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 지방간 질환 대조군의 경우 FFD 급여에 의해 간 조직 내 중성지방 함량이 유의적으로 증가하는 반면, 시험물질 투여군의 경우 간 조직 내 중성지방 함량의 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 정상대조군과 비교하여 지방간 질환 대조군의 경우 FFD 급여에 의해 혈중 ALT 및 AST 농도가 증가하는 반면, 시험물질 투여군의 경우 혈중 ALT 및 AST 농도의 증가가 유의하게 억제됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물이 지방간 개선 효과가 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명에 따른 각 제제의 제조예를 예시한다. 하기 제조예는 본 발명의 실시에 대한 이해를 돕기 위한 것이지 본 발명에 따른 제형의 제조방법이 하기 제조예로 한정되는 것을 의미하지 않는다.
< 제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 추출물 100 mg
미결정셀룰로오스 100 mg
유당 100 mg
전분글리콘산 나트륨 18 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 추출물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유 당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 환의 제조
본 발명의 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5> 과립의 제조
본 발명의 추출물 150 mg
대두 추출물 50 mg
포도당 200 mg
전분 600 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 mg을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
< 제조예 2> 식품의 제조
<2-1> 과자 및 분식의 제조
본 발명의 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
<2-2> 유제품의 제조
본 발명의 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<2-3> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 추출물을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 SBE의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
본 발명의 추출물 건조분말(3 중량부),
영지(0.5 중량부), 및 지황(0.5 중량부)
< 제조예 3> 음료의 제조
본 발명의 추출물 1000 mg
구연산 1000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
<110> Nova K Med Co., Ltd. <120> Composition for preventing or treating fatty liver disease comprising solid phase fermented red ginseng extract by cordyceps <130> PB2018-144 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS forward primer <400> 1 aggtgctaga ggccctgcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FAS reverse primer <400> 2 gtgcacagac accttcccat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP1c forward primer <400> 3 ggagccatgg attgcacatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP1c reverse primer <400> 4 aggaaggctt ccagagagga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa forward primer <400> 5 cgacctgaaa gattcggaaa 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPARa reverse primer <400> 6 ctttcccgcg agtatgacc 19 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pai_1 forward primer <400> 7 tcagagcaac aagttcaact acactgag 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pai-1 reverse primer <400> 8 cccactgtca aggctccatc acttgcccca 30 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b forward primer <400> 9 ctcgcagcag cacatcaaca ag 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1b reverse primer <400> 10 ccacgggaaa gacacaggta gc 22 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 11 acaaagccag agtccttcag agag 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 12 ttggatggtc ttggtcctta gcc 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a forward primer <400> 13 agggtctggg ccatagaact 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-a reverse primer <400> 14 ccaccacgct cttctgtcta 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 forward primer <400> 15 attgggatca tcttgctggt 20 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL2 reverse primer <400> 16 cctgctgttc acagttgcc 19 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL5 forward primer <400> 17 actccctgct gctttgccta c 21 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCL5 reverse primer <400> 18 tgtattcttg aacccacttc ttctctg 27

Claims (20)

  1. 하기의 단계를 거쳐 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    1) 홍삼을 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지시켜 열처리하고, 건조하는 단계;
    2) 상기 건조된 홍삼을 탄소원 분말로 코팅하는 단계;
    3) 상기 코팅된 홍삼을 멸균하는 단계;
    4) 상기 멸균된 홍삼을 냉각시킨 후 배양하는 단계; 및
    5) 상기 배양한 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효하는 단계;를 포함하되,
    상기 단계 1)에서 건조는 홍삼의 수분함량이 20 내지 30 중량%가 되도록 수행하고,
    상기 단계 2)에서 탄소원 분말은 당류 1 중량부에 대하여 전분 또는 곡류 중 어느 하나가 0.8 내지 15 중량부 및 효소 추출물 분말은 0.8 내지 3 중량부로 혼합되며,
    상기 단계 4)에서 배양은 20 내지 35℃에서 20 내지 25일 동안 수행하는 단계.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 열처리는 10초 내지 50분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 단계 3)에서 멸균은 110 내지 140℃ 및 1.0 내지 1.2 kg/cm3의 고온고압하에서 20 내지 50분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 단계 4)에서 냉각은 5 내지 10℃/분의 속도로 온도를 낮추는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 제 1항에 있어서, 상기 단계 5)에서 동충하초균사체는 코디셉스속 동충하초(Cordyceps spp.)인 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 단계 5)에서 동충하초균사체에 접종된 홍삼의 수분함량은 30 내지 40 중량%인 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 단계 5)에서 고상발효는 20 내지 30℃에서 40 내지 70일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 지방간 질환은 비알콜성 지방간 질환인 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 비알콜성 지방간 질환은 단순 지방간, 영양성 지방간, 기아성 지방간, 비만성 지방간, 당뇨성 지방간, 지방간염, 간섬유화 및 간경화로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 지방간 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 삭제
  17. 하기의 단계를 거쳐 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는, 지방간 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품:
    1) 홍삼을 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지시켜 열처리하고, 건조하는 단계;
    2) 상기 건조된 홍삼을 탄소원 분말로 코팅하는 단계;
    3) 상기 코팅된 홍삼을 멸균하는 단계;
    4) 상기 멸균된 홍삼을 냉각시킨 후 배양하는 단계; 및
    5) 상기 배양한 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효하는 단계;를 포함하되,
    상기 단계 1)에서 건조는 홍삼의 수분함량이 20 내지 30 중량%가 되도록 수행하고,
    상기 단계 2)에서 탄소원 분말은 당류 1 중량부에 대하여 전분 또는 곡류 중 어느 하나가 0.8 내지 15 중량부 및 효소 추출물 분말은 0.8 내지 3 중량부로 혼합되며,
    상기 단계 4)에서 배양은 20 내지 35℃에서 20 내지 25일 동안 수행하는 단계.
  18. 하기의 단계를 거쳐 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는, 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    1) 홍삼을 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지시켜 열처리하고, 건조하는 단계;
    2) 상기 건조된 홍삼을 탄소원 분말로 코팅하는 단계;
    3) 상기 코팅된 홍삼을 멸균하는 단계;
    4) 상기 멸균된 홍삼을 냉각시킨 후 배양하는 단계; 및
    5) 상기 배양한 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효하는 단계;를 포함하되,
    상기 단계 1)에서 건조는 홍삼의 수분함량이 20 내지 30 중량%가 되도록 수행하고,
    상기 단계 2)에서 탄소원 분말은 당류 1 중량부에 대하여 전분 또는 곡류 중 어느 하나가 0.8 내지 15 중량부 및 효소 추출물 분말은 0.8 내지 3 중량부로 혼합되며,
    상기 단계 4)에서 배양은 20 내지 35℃에서 20 내지 25일 동안 수행하는 단계.
  19. 하기의 단계를 거쳐 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는, 지방간 질환 예방 또는 개선용 식품 첨가제:
    1) 홍삼을 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지시켜 열처리하고, 건조하는 단계;
    2) 상기 건조된 홍삼을 탄소원 분말로 코팅하는 단계;
    3) 상기 코팅된 홍삼을 멸균하는 단계;
    4) 상기 멸균된 홍삼을 냉각시킨 후 배양하는 단계; 및
    5) 상기 배양한 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효하는 단계;를 포함하되,
    상기 단계 1)에서 건조는 홍삼의 수분함량이 20 내지 30 중량%가 되도록 수행하고,
    상기 단계 2)에서 탄소원 분말은 당류 1 중량부에 대하여 전분 또는 곡류 중 어느 하나가 0.8 내지 15 중량부 및 효소 추출물 분말은 0.8 내지 3 중량부로 혼합되며,
    상기 단계 4)에서 배양은 20 내지 35℃에서 20 내지 25일 동안 수행하는 단계.
  20. 하기의 단계를 거쳐 제조된 동충하초균사체로 고상발효된 홍삼 추출물을 유효성분으로 함유하는, 간보호용 건강기능식품:
    1) 홍삼을 물, 에탄올 또는 에탄올 수용액에 침지시켜 열처리하고, 건조하는 단계;
    2) 상기 건조된 홍삼을 탄소원 분말로 코팅하는 단계;
    3) 상기 코팅된 홍삼을 멸균하는 단계;
    4) 상기 멸균된 홍삼을 냉각시킨 후 배양하는 단계; 및
    5) 상기 배양한 홍삼의 표면에 동충하초균사체를 접종하여 고상발효하는 단계;를 포함하되,
    상기 단계 1)에서 건조는 홍삼의 수분함량이 20 내지 30 중량%가 되도록 수행하고,
    상기 단계 2)에서 탄소원 분말은 당류 1 중량부에 대하여 전분 또는 곡류 중 어느 하나가 0.8 내지 15 중량부 및 효소 추출물 분말은 0.8 내지 3 중량부로 혼합되며,
    상기 단계 4)에서 배양은 20 내지 35℃에서 20 내지 25일 동안 수행하는 단계.
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