KR102040470B1 - 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체 배양물을 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체를 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 동충하초 주성분인 코디세핀(Cordycepin)과 단백질 분해 효소(Protease)를 접합시킨 접합체를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 건강기능 식품 조성물, 사료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 코디세핀-단백질분해효소 접합체는 미토콘드리아, B 세포 및 T 세포를 활성화 시킴으로써, 세포 사멸을 방지하고 세포 재생을 촉진하며, 면역 증강 효과를 가진다. 본 발명은 기존의 코디세핀 보다 더욱 증가된 면역 증강 효과를 기대할 수 있고, 인체에 부작용이 극히 적어 종래의 면역 증강용 조성물의 단점을 보완할 수 있다.

Description

코디세핀-단백질 분해 효소 접합체 배양물을 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 조성물{composition for immune enhancement comprising cordycepin-protease conjugates fermentation product}

본 발명은 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체 배양물을 유효성분으로 함유하는 면역활성 증강용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 동충하초 주성분인 코디세핀(Cordycepin)과 단백질 분해 효소(Protease)를 접합시킨 접합체의 배양물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 건강기능 식품 조성물, 사료 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

동충하초(冬蟲夏草, vegetable worms)는 곤충을 기주로 하여 자실체를 발생하는 버섯으로 현재 전 세계적으로 수백여 종이 존재하며(Mycologia, 50, 169~222, 1985), 국내에서는 80여종이 있다고 알려져 있다(Kyo-Hak publishing co. Seoul, 13~18, 1996). 그 중에서 특히 자낭균강 맥각균과 코디셉스속(Cordyceps sp.)의 동충하초가 고대로부터 결핵, 천식, 마약중독해독, 자양강장제 등의 한약재로 사용된 것으로 보고된 바 있다(Sci. Rept. Tokyo Bunrika daikaku Sect. B., 5, 253~260, 1940; Icons of Medicinal Fungi from China Science Press China., p.575, 1989 ; USDA Agricultural Reserch Service, 1990). 약용으로 이용되는 대표적인 동충하초는 주로 코디셉스 시넨시스(Cordyceps sinensis), 코디셉스 밀리타리스(Cordyceps militaris), 코디셉스 오피오글로쏘이데스(Cordyceps ophioglossoides), 코디셉스 소보리페라(Cordyceps sobolifera), 코디셉스 베아우베리아(Cordyceps beauveria) 또는 코디셉스 바씨아나(Cordyceps bassiana) 등이 있다.

한편 상기 동충하초의 유용성분으로 가장 주목받고 있는 코디세핀(cordycepin)은 1950년 쿠닝햄(Cunningham) 등에 의해 밝혀진 이후, 약리 활성에 관해 많은 연구가 이루어졌다. 코디세핀은 m-RNA의 합성을 저해하고 항세균, 항진균, 면역증강 및 항암효과가 있는 것으로 주로 알려져 있다(Nature, 166, 949~954, 1950; Cancer Res., 21, 216~220, 1961 ; Biochem. Biophys. Acta., 80, 640~647, 1964).

면역이란 동물체 내에 존재하는 자기방어 체계로서, 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별해내어 이 침입자를 제거하는 생물학적 현상이다. 이러한 자기방어를 위한 감시체계는 선천성 면역과 적응성 면역(adaptive immunity)으로 대별할 수 있다.

적응성 면역은 B 세포나 T 세포에 의한 면역반응으로 일단 체내로 침입한 항원에 대하여 반응을 하되, 반드시 같은 종류의 항원이 계속 존재하거나 반복 침입해왔을 경우에 작용하는 면역체계이다. 따라서, 이러한 면역반응은 특정 항원에 대한 특이한 반응이다. 이에 반해, 선천성 면역은 체내에는 어떤 항원에 대해 노출된 경험이 없는 경우라도 직접적으로 반응하여 공격세포를 파괴하는 비특이적(non-specific) 면역반응으로, 단핵세포/대식세포(monocytes/macrophages) 및 중성구(neutrophils)와 같은 식세포(phagocyte) 등이 관여하여 공격대상 세포의 종류에 별로 구애됨이 없이 다양한 기능을 발휘하는 것이 특징이며, 진화적으로 보다 오래된 자기방어 체제이다.

대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 일산화산소(NO)를 생성하여 면역체계에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 LPS(Lipopolysaccharide), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산하여, NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 활성화된 대식세포에 의한 슈퍼옥사이드 음이온(superoxide anion, O2-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)와 같은 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 및 일산화질소(nitric oxide, NO)의 생산은 비특이적 면역에 있어서 중요한 세포독성 및 세포활성 억제기작이다. 대식세포에 의한 ROS 및 NO의 생성에 어떤 천연화합물이 영향을 미치는지 많은 연구들이 수행되어 왔다. 대식세포는 항원을 제시하거나(antigen-presenting), 종양을 없애거나(tumoricidal) 미생물세포를 죽이는(microbicidal) 세포로서, 세포매개(cell-mediated) 또는 체액성 면역(humoral immunity)에 중심적인 역할을 하는 조절세포로, 활성화된 대식세포에서 생산되는 NO는 비특이적 숙주방어기작인 대식작용, 그리고 세균 및 암세포의 증식억제활성을 보인다(Dawson T.M., et al., Annu. Rev. Med, 47, pp.219-227, 1996).

대식세포는 많은 라이소솜을 가지고 있고 이들은 산성가수분해효소와 과산화효소를 함유하고 있다. 또한, 유리면과 플라스틱 표면에 강하게 부착하는 성질이 있으며 미생물이나 종양세포 등을 활발하게 탐식한다. 상기 세포는 IFN-γ등의 사이토카인 수용체를 가지고 있다. 이들은 보체성분, 인터페론, 인터루킨-1 및 종양괴사인자 같은 사이토카인을 생산하며 T-세포로부터 생산되는 여러 가지 사이토카인에 의해 기능이 증강 될 수 있다(Richard A. Goldsby, et al., KUBY Immunology. 2000).

면역증강제란 숙주의 특이 또는 비특이, 세포성 및 체액성 면역반응을 상승시키는 모든 물질을 말하는데, 최근에 감염이나 종양의 치료에 면역강화가 이용되면서 많은 관심을 불러일으키고 있다. 부작용이 없으면서 유용한 면역증강 효과를 나타내는 물질의 개발은 대단히 중요한 의미를 가져, 그 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한국공개특허 제2011-0054264호 한국등록특허 제10-1242596호

따라서 본 발명의 목적은 장기간 사용에도 인체에 안전하면서 면역증대 효과가 우수한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 장기간 사용에도 인체에 안전하면서 면역증대 효과가 우수한 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 장기간 사용에도 인체에 안전하면서 면역증대 효과가 우수한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 장기간 사용에도 생체에 안전하면서 면역세포의 기능을 증가시켜 질병감염에 대한 저항성을 높일 수 있는 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 장기간 사용에도 생체에 안전하면서 면역세포의 기능을 증가시켜 질병감염에 대한 저항성을 높일 수 있는 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체를 0 내지 10 ℃ 온도에서 1 내지 3일간 저온 발효한 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코디세핀은 동충하초로부터 추출된 물질일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 코디세핀은 동충하초를 초음파 추출하여 수득된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 사포닌, 글루코오스, 가시오가피 추출물, 황칠나무 추출물, 폴리사카라이드 및 코디세핀산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 0 내지 10 ℃ 온도에서 1 내지 3일간 저온 발효한 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 5 ℃ 온도에서 2일간 저온 발효한 것일 수 있다. 0 ℃ 이하의 온도에서 발효할 경우, 발효가 이뤄지지 않을 수 있으며, 10 ℃ 이상의 온도에서 발효할 경우, 면역증강 효과가 감소될 수 있다. 저온 발효 시에는 추가적으로 사포닌, 글루코오스, 가시오가피 추출물, 황칠나무 추출물, 폴리사카라이드 및 코디세핀산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하여 발효될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 코디세핀-단백질 분해효소 접합체는 CDAP 접합 방법, 시아닐레이션 접합 방법 또는 고분사 합성 방법을 사용하여 접합된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체는 일산화질소(NO)의 생성 증가 효과; TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현 증대 효과; 비장세포 증식촉진 효과; 및 비장 내 T-림프구와 B-림프구의 증식 촉진 활성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 단백질 분해 효소를 준비하는 단계; (b) 동충하초를 초음파 추출하여 코디세핀을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (a)와 (b) 단계에서 준비된 단백질 분해 효소와 코디세핀을 공유결합 형태로 접합시키는 단계를 포함하는 면역활성 증강용 조성물의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 코디세핀-단백질분해효소 접합체 배양물은 미토콘드리아, B 세포 및 T 세포를 활성화 시킴으로써, 세포 사멸을 방지하고 세포 재생을 촉진하며, 면역 증강 효과를 가진다. 본 발명은 기존의 코디세핀 보다 더욱 증가된 면역 증강 효과를 기대할 수 있고, 인체에 부작용이 극히 적어 종래의 면역 증강용 조성물의 단점을 보완할 수 있다.

도 1은 코디세핀-단백질 분해 효소(실시예 1)의 농도에 따른 RAW 264.7 대식세포의 세포 생존율을을 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 1 내지 10 및 비교예 1 내지 5의 RAW264.7 대식세포의 NO 생성량을 나타내는 그래프이다.
도 3은 실시예1, 3, 6, 9 및 비교예1, 2의 RAW264.7 대식세포의 싸이토카인 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예 1 및 9의 T-림프구 및 B-림프구 증식능을 나타낸 그래프이다.

본 발명을 충분히 이해하기 위해서 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명한다. 본 발명의 실시예는 여러 가지 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상세히 설명하는 실시예로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이다. 따라서 도면에서의 요소의 형상 등은 보다 명확한 설명을 강조하기 위해서 과장되어 표현될 수 있다. 각 도면에서 동일한 부재는 동일한 참조부호로 도시한 경우가 있음을 유의하여야 한다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 기술은 생략된다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 약학적 조성물을 제공한다.

발명의 조성물에서 이용되는 코디세핀(ocrdycepin)은 동충하초에 추출 용매를 처리하여 수득할 수 있다. 이 경우, 다양한 추출 용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

본 발명에서 제공하는 조성물은 추가적으로 사포닌, 글루코오스, 가시오가피 추출물, 황칠나무 추출물, 폴리사카라이드 및 코디세핀산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로

본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체를 0 내지 10 ℃ 온도에서 1 내지 3일간 저온 발효한 배양물을 유효성분으로 포함하며, 상기 단백질 분해 효소는 메탈로프로테아제, Sterptomyces griseus 유래 단백질 분해효소, Bacillus Licheniformis 유래 단백질 분해효소 및 Bacillus sp. 유래 단백질 분해효소로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역활성 증강용 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 글루코오스, 가시오가피 추출물, 황칠나무 추출물, 폴리사카라이드 및 코디세핀산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함할 경우, 면역 증강 효과를 더욱 강화시키는 것을 확인하였다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 0 내지 10 ℃ 온도에서 1 내지 3일간 저온 발효한 것일 수 있다. 이 경우, 면역 증강 효과를 더욱 강화시키는 것을 확인하였다. 보다 바람직하게는 5 ℃ 온도에서 2일간 저온 발효한 것일 수 있다. 0 ℃ 이하의 온도에서 발효할 경우, 발효가 이뤄지지 않을 수 있으며, 10 ℃ 이상의 온도에서 발효할 경우, 면역증강 효과가 감소될 수 있다. 저온 발효 시에는 추가적으로 사포닌, 글루코오스, 가시오가피 추출물, 황칠나무 추출물, 폴리사카라이드 및 코디세핀산으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가로 포함하여 발효될 수 있다.

상기 코디세핀-단백질 분해효소 접합체는 CDAP 접합 방법, 시아닐레이션 접합 방법 또는 고분사 합성 방법을 사용하여 접합된 것일 수 있다.

본 발명의 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체는 일산화질소(NO)의 생성 증가 효과; TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 유전자 발현 증대 효과; 비장세포 증식촉진 효과; 및 비장 내 T-림프구와 B-림프구의 증식 촉진 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 단백질 분해 효소로는 이에 한정하지는 않으나, 수 있다. 바람직하게는 메탈로프로테이제일 수 있다. 메탈로프로테아제, Sterptomyces griseus 유래 단백질 분해효소, Bacillus Licheniformis 유래 단백질 분해효소 또는 Bacillus sp. 유래 단백질 분해효소일 수 있다.

본 명세서에서 용어 ‘유효성분으로 포함하는’이란 하기의 코디세핀-단백질 분해 효소의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 천연식물재료인 동충하초로부터 추출한 코디세핀을 포함하는 조성물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체 조성물이 포함된 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 코디세핀-단백질 분해효소는 대식세포를 대상으로 실시한 세포독성실험에서 세포 독성을 나타내지 않았다(실험예 1).

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

발명의 코디세핀-단백질 분해효소 접합체 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물은 (ⅰ) 대식세포에 대한 세포독성실험을 나타내지 않고(실험예 1); (ⅱ) 산화질소(Nitric Oxide)의 생성을 증가시키며(실험예 2); (ⅲ) IL-2, IL-4 및 IFN-γ의 면역능 관련 사이토카인의 발현을 증가시키고(실험예 3); (ⅳ) T세포 및 B세포 증식을 촉진시키는(실험예 4); 효과를 갖는다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 g/kg 내지 5 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 외용제제에는 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 코디세핀-단백질 분해효소 접합체 조성물을 유효성분 포함하는 면역증강용 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 코디세핀 및 단백질 분해효소뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 김 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 면역증강용 조성물은 건강기능식품으로 제조될 수 있다. 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강보조식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 식품제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토 스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민류, 광물(전해질), 식이성분, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 면역증강용 조성물은 면역증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 조성물과 함께 사용될 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 개선 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은, 식품 또는 음료의 제조 시에 식품 또는 음료의 원료 100 중량부에 대하여 0.1 내지 70 중량부, 바람직하게는 2 내지 50 중량부 첨가될 수 있다. 상기 추출물의 유효용량은 상기 약학적 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 식품 조성물은 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 액제, 현탁제 등과 같은 경구투여용 제제의 형태로 이용될 수 있으며, 이들 제제는 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 경구투여용 제제의 경우에는 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 가용화제, 상기 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제, 기타 영양제 등을 들 수 있으나 이들 종류의 식품으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명은 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 사료 조성물을 제공한다. 본 발명의 사료 조성물은 바람직하게는 사료 첨가제일 수 있다.

본 발명에서 용어, "사료첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 혈액순환 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 사료용 조성물은 혈액순환 관련 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 것이든 적용가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 조류 및 어류 등이 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 어느 개체에도 적용이 가능하다.

본 발명은 (a) 단백질 분해 효소를 준비하는 단계; (b) 동충하초를 초음파 추출하여 코디세핀을 준비하는 단계; 및 (c) 상기 (a)와 (b) 단계에서 준비된 단백질 분해 효소와 코디세핀을 공유결합 형태로 접합시키는 단계를 포함하는 면역활성 증강용 조성물의 생산 방법을 제공한다.

이하 본 발명의 실시예에 따른 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체 및 이의 배양물에 대하여 자세히 설명한다.

[준비예] 시료의 제조

준비예 1. 코디세핀의 추출

코디셉스 밀리타리스 동충하초는 경동시장(서울, 한국)에서 구입한 것을 건조하여 사용하였다.동충하초를 세척하고, 수분 5% 이하가 되도록 잘 건조시켰다. 그 후, 40% 1,3-부틸렌글라이콜 수용액 400 ml을 첨가하고, 실온에서 초음파 추출기(내추럴솔루션)로 4시간 동안 추출하였다. 여과지(Whatman Paper Filter No.3)를 이용하여 감압 농축하고, 원심분리 하여 정제하였다. 그 후, 크로마토그래피를 수행하여 코디세핀 단일 물질을 수득하였고, 그 외 부가물들을 제거하기 위하여 삼투압 정제를 실시하여 최종 코디세핀 화합물을 수득하였다.

준비예 2. 단백질 분해 효소 준비 및 그 외 첨가물 구입

단백질 분해 효소와 그 외 첨가물들은 sigma-aldrich에서 구입하여 사용하였다. 단백질 분해 효소는 총 4가지를 구매하였는데, 메탈로프로테아제-2 인간(MDL number: MFCD01324322), Sterptomyces griseus 유래 단백질 분해효소(cas number: 9036-06-0), Bacillus Licheniformis 유래 단백질 분해효소(cas number: 9014-01-1) 및 Bacillus sp. 유래 단백질 분해 효소(MDL number: MFCD00132092)를 주문하여 구입하였다.

그 외 첨가물로 사포닌(cas number: 8047-15-2) 및 D-(+)-글루코오스(cas number: 50-99-7)를 추가로 구입하였다.

준비예 3. 코디세핀-단백질 분해 효소 접합체 제조

상기 준비예 1 및 2에서 획득한 코디세핀과 단백질 분해 효소를 고분자 촉매제(CMC)와 함께　실온에서　50마력 이상의 원심력을 가하는 원심분리기를 통해 고분사 합성하였다. 이 고분사 합성법은 원심력이 가해진　코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합을 생성할 수 있어서 효과적인 접합체 제조 방법이다.

준비예 4. 가시오가피 추출물의 제조

가시오가피를 채취하여 세척하고, 수분 5% 이하가 되도록 잘 건조시켰다. 그 후, 파우더 형태로 분쇄한 다음 40% 1,3-부틸렌글라이콜 수용액 400 ml을 첨가하고, 실온에서 초음파추출기(내추럴솔루션)로 4시간 동안 추출하였다. 여과지(Whatman Paper Filter No.3)를 이용하여 1차 감압 농축하고, 원심분리 하여 정제하여 최종 가시오가피 추출물을 얻었다.

준비예 5. 황칠나무 추출물의 제조

황칠나무의 잎, 줄기, 뿌리 부분을 채취하여 세척하고, 수분 5% 이하가 되도록 잘 건조시켰다. 그 후, 파우더 형태로 분쇄한 다음 40% 1,3-부틸렌글라이콜 수용액 400 ml을 첨가하고, 실온에서 초음파추출기(내추럴솔루션)로 4시간 동안 추출하였다. 여과지(Whatman Paper Filter No.3)를 이용하여 1차 감압 농축하고, 원심분리 하여 정제하여 최종 황칠나무 추출물을 얻었다.

[실시예1-10 및 비교예1-5]

하기 표 1과 같이 실시예1-10 및 비교예1-5를 제조하였다.

구분	구성	추가성분	기타
실시예1	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	-	고분사 합성으로 접합
실시예2	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	-	시안화(cyanylation) 접합
실시예3	코디세핀-Sterptomyces griseus 유래 단백질 분해효소 접합체	-	고분사 합성으로 접합
실시예4	코디세핀-Bacillus Licheniformis 유래 단백질 분해효소 접합체	-	고분사 합성으로 접합
실시예5	코디세핀-Bacillus sp. 유래 단백질 분해효소 접합체	-	고분사 합성으로 접합
비교예1	코디세핀	-	-
비교예2	메탈로프로테아제	-	-
비교예3	Sterptomyces griseus 유래 단백질 분해효소	-	-
비교예4	Bacillus Licheniformis 유래 단백질 분해효소	-	-
비교예5	Bacillus sp. 유래 단백질 분해효소	-	-
실시예6	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	사포닌, 글루코오스	고분사 합성으로 접합
실시예7	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	가시오가피 추출물, 글루코오스	고분사 합성으로 접합
실시예8	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	황칠나무 추출물, 사포닌	고분사 합성으로 접합
실시예9	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	사포닌, 글루코오스	고분사 합성으로 접합, 5℃에서 2일간 추가 저온 숙성
실시예10	코디세핀-메탈로프로테아제 접합체	황칠나무 추출물, 사포닌	고분사 합성으로 접합, 5℃에서 2일간 추가 저온 숙성

[실험예 1] 세포생존율 실험

상기 실시예 및 비교예 시료의 면역증진효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 대식세포에 대한 세포독성을 하기와 같이 실험을 수행하였다.

실험예 1-1. 세포 배양

RAW264.7은 마우스 유래의 대식세포(TIB-71, ATCC)이고, YAC-1(TIB-160, ATCC) 세포는 마우스 림프종 유래 세포로 두 세포주 모두 경희대학교 의학영양학과(Suwon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 배지의 조성은 RAW264.7 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA)에, YAC-1 세포는 RPMI1640(Roswell Park Memorial Institute 1640, Hyclone Laboratories)에 각각 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Hyclone Laboratories)과 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

실험예1-2. 세포 생존율 실험

코디세핀-단백질 분해효소 접합체의 RAW264.7 세포에 대한 최적 처리 농도를 결정하기 위하여 WST(Water soluble Tetrazolium Salt) 시약인 키트(EZ-CYTOX Cell Viability assay kit, EZ1000, DAEILLAB SERVICE CO., LTD, Seoul, Korea)를 이용하여 살아 있는 세포의 양을 측정하였다.

RAW254.7 세포는 1×10⁴ cells/웰이 되도록 96 웰 세포 배양 플레이트에 분주하여 안정화시킨 후 코디세핀-단백질 분해효소 접합체(실시예 1)를 0, 10, 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800 및 1000 ㎍/㎖의 농도로 DMEM 배지에 희석하여 48시간 배양하였다. WST 시약을 20 ㎕씩 각 웰에 넣고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 3시간 동안 반응시킨 후 판독기(microplate reader, SpectraMAX340PC384, Molecular Devices, CA, USA)에서 450 ㎚로 흡광도를 측정하였다.

코디세핀-단백질 분해효소 접합체를 최저 농도 0 ㎍/㎖부터 최고농도 1000 ㎍/㎖까지 RAW264.7 세포에 처리 한 결과, 최고 농도에서도 48시간까지 독성을 나타내지 않았다. 세포독성 시험 결과는 도 1에 제시하였으며, 독성실험 결과에서 확인된 안전농도 범위 안에서 이 후의 실험을 진행하였다.

[실험예 2] 산화질소(Nitric Oxide) 유도능 평가

상기 실시예 시료의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 산화질소(Nitric Oxide) 유도능에 미치는 영향을 하기와 같이 실험을 수행하였다.

실험예 2-1. 산화질소(Nitric Oxide) 유도능 평가

RAW264.7 세포(TIB-71, ATCC)를 1×10⁴ cells/웰이 되도록 96웰 세포 배양 플레이트에 분주하여 안정시킨 후 DMEM 배지에 각각 준비한 시료를 80 ㎍/㎖의 농도로 처리하였고, 양성대조군으로 1 ㎍/㎖의 LPS(Lipopolysaccharide, L4291, Sigma, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 24시간 배양하였다. 새로운 96웰 플레이트에 세포배양 상등액 50 ㎕와 동량의 그리스 시약(Griess reagent; G4410, Sigma, St. Louis, MO, USA) 시약을 넣어 상온에서 15분 동안 반응시킨 후 판독기(microplate reader; Molecular Devices, CA, USA)에서 흡광도 540 ㎚로 측정하였다. 산화질소(NO)의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite, S2252, NaNO₂, Sigma, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 얻은 표준곡선으로 계산하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 코디세핀 단독 처리 시에는 NO 분비에 변화가 없었던 반면, 코디세핀-단백질 분해효소 접합체 처리시에는 유의하게 NO의 분비가 증가하는 것으로 나타났다. 코디세핀-단백질 분해효소 접합체의 NO 분비능은 양성대조군인 LPS 처리군 보다는 모두 낮은 증가를 보였다.

[실험예 3] 사이토카인(cytokine) 발현능 평가

상기 실시예 및 비교예 시료의 면역증진 효과를 확인하기 위하여 문헌에 개시된 방법을 응용하여 시토킨(cytokine) 발현능에 미치는 영향을 하기와 같이 실험을 수행하였다.

RAW264.7 세포(TIB-71, ATCC)를 60 ㎜ 세포 배양 디쉬에 5×10⁶ cells/웰의 농도로 분주하여 안정화시킨 후, 준비한 시료 80 ㎍/㎖를 4시간 동안 처리 한 후 RNeasy 추출 키트(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)를 제조사의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다. 양성 대조군으로는 LPS 1 ㎍/㎖을 사용하였다. 분리된 RNA로 PrimeScript^TM 리버스 트랜스크립타아제(TAKARA BIO INC., Shiga, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 패스트스타트 유니버살 SYBR 그린 마스터(FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 이용하여 실-시간 PCR을 PIKOREAL 96(Thermo SCIENTIFIC, MA, USA) 기기를 이용하여 실시하였다. 분석에 사용한 각각의 프라이머의 염기서열은 GAPDH 정방향 5’-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3’(서열목록 1), 역방향 5’-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3’(서열목록 2), IL-2 정방향 5′-CCT GAG CAG GGA GAA TTA CA-3′(서열목록 3), 역방향 5′-TCC AGA ACA TGC CGC AGA-3′(서열목록 4), IL-4 정방향 5’-AGA TGG ATG TGC CAA ACG TCC TCA-3’(서열목록 5), 역방향 5’-AAT ATG CGA AGC ACC TTG GAA GCC-3’(서열목록 6), IFN-γ 정방향 5’-GGC CAT CAG CAA CAA CAT AAG CGT-3’(서열목록 7), 역방향 5’-TGG GTT GTT GAC CTC AAA CTT GGC-3’(서열목록 8)과 같다.

실험 결과, 도 3에 나타난 바에 따르면, IL-2, IL-4 및 IFN-γ 측정한 결과로 코디세핀-단백질 분해효소 접합체는 유의하게 IL-2, IL-4 및 IFN-γ의 발현이 증가하는 것으로 나타났으나, 양성대조군인 LPS를 처리한 결과보다는 발현양이 적게 나타났다.

[실험예 4] 마우스 비장 내 T-림프구 및 B-림프구 증식능 평가

본 발명의 실시예 1 및 실시예 9의 접합체 조성물이 비장 내 면역세포인 T-림프구와 B-림프구 증식에 미치는 영향을 알아보았다.

실험동물은 7주령 암컷 C57BL/6 마우스(오리엔트 바이오, 경기도 가평군, 대한민국)를 사용하였으며, 각 시험군당 6마리씩 총 42마리를 사용하였다. 구입한 동물은 온도 21±3℃, 상대습도 50±5%, 조도 200-300 룩스(Lux) 조건의 실험실에서 일주일 간 적응기간을 거친 후 시험에 사용하였으며, 시험에 사용된 동물들 모두에서 심한 체중변화나 이상반응은 관찰되지 않았다. 모든 시료는 생리식염수(중외제약, 대한민국)를 사용하여 현탁하였으며, 시료의 투여는 100 mg/kg씩 하루 1회, 총 7일간 경구 투여하였다. 정상대조군은 동량의 생리식염수를 같은 방법으로 투여하였다. 투여가 끝난 실험동물로부터 비장을 적출하여 비장세포를 분리한 다음, 96 웰 플레이트에 세포를 5×10⁵ cells/well로 접종하였다. 이 후 T-림프구 증식능 측정을 위해서 각 웰에 5 ㎍/ml 농도의 concanavalin A (Con A; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을, B-림프구 증식능 측정을 위해서 15 ㎍/ml 농도의 LPS(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 각각 10 ㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 반응시켰다. 반응이 끝난 세포 배양액에 Cell titer 용액 (Promega, USA)을 20 ㎕씩 첨가하여 4시간 추가 배양한 다음, fluorescence Multi-Detection Reader ((BIO-TEK Instruments Inc., Power wave X340, Winooski, VT, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, T-림프구 및 B-림프구 증식 정도는 본 발명의 실시예 1 및 실시예 9 조성물 투여군 모두에서 증가됨을 확인하였다. 또한 실시예 1 투여군보다 실시예 9 투여군에서 비장 내 T-림프구 및 B-림프구 증식 촉진효과가 우수한 것으로 확인되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

[제조예 1] 약학적 제제의 제조

[제조예 1-1] 산제의 제조

코디세핀-단백질 분해 효소 분말 1 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

[제조예 1-2] 정제의 제조

코디세핀-단백질 분해 효소 분말 100 ㎎

미결정셀룰로오스 100 ㎎

유당 100 ㎎

전분글리콘산 나트륨 18 mg

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

[제조예 1-3] 캡슐제의 제조

코디세핀-단백질 분해 효소 분말 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

[제조예 1-4] 환의 제조

코디세핀-단백질 분해 효소 분말 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

[제조예 1-5] 과립의 제조

코디세핀-단백질 분해 효소 분말 150 ㎎

대두 추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

[제조예 2] 식품의 제조

[제조예 2-1] 과자 및 분식의 제조

본 발명의 코디세핀-단백질 분해 효소 분말을 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

[제조예 2-2] 유제품의 제조

본 발명의 코디세핀-단백질 분해 효소 분말을 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

[제조예 2-3] 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 코디세핀-단백질 분해 효소 분말을 진공 농축기에서 감압 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 SBE의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명의 코디세핀-단백질 분해 효소 분말(3 중량부),

영지(0.5 중량부), 및 지황(0.5 중량부)

[제조예 3] 음료의 제조

코디세핀-단백질 분해 효소 분말 200 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강식품 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

<110> YOON, younghoon <120> composition for immune enhancement comprising cordycepin-protease conjugates fermentation product <130> PJC18039 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 1 catggccttc cgtgttccta 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 2 gcggcacgtc agatcca 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 forward primer <400> 3 cctgagcagg gagaattaca 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 reverse primer <400> 4 tccagaacat gccgcaga 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 forward primer <400> 5 agatggatgt gccaaacgtc ctca 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 reverse primer <400> 6 aatatgcgaa gcaccttgga agcc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma forward primer <400> 7 ggccatcagc aacaacataa gcgt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN-gamma reverse primer <400> 8 tgggttgttg acctcaaact tggc 24

Claims (1)

1. 코디세핀과 단백질 분해 효소가 공유결합으로 접합된 접합체를 0 내지 10 ℃온도에서 1 내지 3일간 저온 발효하여 제조한 발효물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 단백질 분해 효소는 메탈로프로테아제, Sterptomyces griseus 유래 단백질 분해효소, Bacillus Licheniformis 유래 단백질 분해효소 및 Bacillus sp. 유래 단백질 분해효소로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나이며,
   상기 접합은 고분사 합성법 또는 시안화법으로 접합된 것이고,
   상기 저온 발효 시, 사포닌, 글루코오스, 가시오가피 추출물 및 황칠나무 추출물로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역활성 증강용 조성물.

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