KR102270923B1

KR102270923B1 - 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 조성물

Info

Publication number: KR102270923B1
Application number: KR1020200040332A
Authority: KR
Inventors: 임병우; 박서현
Original assignee: (주) 바이노텍
Priority date: 2020-04-02
Filing date: 2020-04-02
Publication date: 2021-06-30

Abstract

본 발명은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 면역 증진용 조성물은 마우스 대식세포에서 NO생성을 증가시키고, 면역활성에 영향을 주는 MAPK 신호전달을 통해 면역증진관련 사이토카인의 발현을 증가시키는 효과가 있어 면역능력을 증진시키는 효과가 있다.

Description

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 조성물{Composition for improving immunity including fermented blueberry and black rice extracts}

본 발명은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 조성물에 관한 것이다.

블루베리(Blueberry)는 진달래목(Ericales) 진달래과(Ericaceae) 산앵나무속(Vaccinium) 식물로써 북아메리카 원산지로 하이부시 블루베리(V. corymbosum), 로우부시 블루베리(V. angustifolium) 및 래빗아이 블루베리(V. ashei) 등 세가지 종류가 주로 재배되고 있다. 국내에서는 북부 하이부시, 반수고 하이부시, 남부 하이부시, 래빗아이의 4가지 종류의 블루베리가 약 100여 품종 이상 도입되었고, 이 중 북부 하이부시의 재배가 가장 많이 이루어지고 있다.

블루베리에는 비타민, 식이섬유, 칼슘, 칼륨 등 각종 미네랄성분이 풍부할 뿐만 아니라 항산화, 항염증, 함암 등과 같은 생리활성을 가지고 있는 플라보노이드(flavonoid), 페놀산(phenolic acid) 등의 파이토케이컬(phytochemical) 화합물을 다량 함유하고 있다. 특히, 블루베리에 포함된 안토시아닌 색소는 플라보노이드계 물질로 항산화능이 뛰어난 성분이다. 이러한 항산화물질은 세포내 에너지 생산과정에서 발생하는 활성산소종의 활성을 억제하는 물질로서 생체 내 방어시스템에서 아주 중요한 역할을 한다.

흑미는 유색미의 일종으로 검은 빛깔을 띤 쌀을 말한다. 흑미에는 polyphenol, flavonoid, anthocycanin, vitamin 등 기능성 성분들을 함유하고 있으며 이러한 생리활성 성분들은 체내에서 항산화 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 산화적 스트레스는 신진대사와 관련된 질병과 연관되어 있으며, 다른 곡류에 비해 흑미에는 anthocyanin과 같은 색소 성분이 풍부하여 산화적 스트레스 감소와 같은 다양한 항산화적 생리활성이 보고되고 있다.

락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)은 발효식품 특히 김치 및 사람의 장관 내에서 발견되는 미생물로 내산성과 내담즙성이 강하여 장내 생존력이 높고 장 점막에 결합하는 점착성이 높아 유해균 억제와 유익균 증식에 중요한 역할을 하는 것으로 많이 알려져 있다. 락토바실러스 플란타룸은 뮤신분비를 자극하여 장벽을 보호하고 유해균의 성장을 억제하여 장의 염증을 줄여 면역력향상에 도움을 주며, 담즙산 가수분해 효소를 생성하여 체내 콜레스테롤을 조절하는 효능이 있다.

면역은 체내에 존재하는 자기방어체계로서 인체가 외부로부터 침입해오는 각종 물질이나 생명체를 자기 자신에 대한 이물질로 인식하여 제거하고 대사시키는 과정이다, 외부 자극에 의한 손상이나 병원 미생물의 침입으로부터 자신을 방어하기도 하지만, 염증반응 등과 같이 자기 자신의 조직에 손상을 줄 수도 있다. 면역기능의 변화를 조절하여 정상으로 회복시키거나 변화의 폭을 줄여 주는 작용으로 면역기능 억제나 면역기능 증강으로 구분된다. 과민면역 반응 완화는 외부 물질에 대해 불리하게 반응하여 초래되는 알레르기 반응, 자기항원 또는 변형된 자기항원에 대한 반응 등 바람직하지 않게 증가된 면역반응을 억제시키는 것을 의미한다.

사이토카인(Cytokines)은 선천 면역과 적응 면역에 관여하는 세포에서 분비되는 단백질로서 적응면역반응의 활성화 단계에서 림프구의 성장과 분화를 자극하고, 선천면역과 적응면역의 작동 단계에서 여러종류의 작동세포들을 활성화시켜 미생물과 항원들을 제거한다. 그 중 TNF(Tomor necrosis factor)는 선천 면역을 매개하고 조절하는 싸이토카인으로, 활성화된 대식세포에서 주로 생산된다. IL-6(Interleukin-6)는 선천 면역과 적응면역 모두에서 기능을 하는 싸이토카인이다. 선천면역에서 골수 전구세포로부터 호중구의 생산을 유도하며, 적응면역에서는 항체 생산자로 분화된 B 림프구의 성장을 자극한다. 또한 항염증성 싸이토카인의 생산을 자극함과 조절 T림프구의 생성과 작용을 억제하여 세포매개 면역반응을 촉진한다. 대식세포와 내피세포, T림프구에서 생성된다.

최근 건강에 대한 관심이 증대됨에 따라 영양분 섭취와 질병 예방차원에서 각종 천연물을 이용한 다양한 건강기능식품개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 블루베리와 흑미추출물은 항산화 및 항암 효과와 같은 다양한 생리활성 기능이 있는 것으로 알려져 많이 활용되고 있지만, 유산균 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 이용한 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물이 갖는 면역기능 개선에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 락토바실러스 플란타룸으로 발효시킨 흑미 및 블루베리 추출물을 이용하여 독성이 없어 안전하면서도 면역세포활성화를 통한 면역기능을 개선에 대한 우수한 효능을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1935689호

본 발명의 목적은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여,

본 발명은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

나아가 본 발명은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 조성물은 마우스 대식세포에서 NO생성을 증가시키고, 면역활성에 영향을 주는 MAPK 신호전달을 통해 면역증진관련 사이토카인의 발현을 증가시키는 효과가 있어 면역능력을 증진시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 제조과정에 대한 순서도를 나타낸 것이다.
도 2는 RAW 264.7에서 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 농도별로 처리하여 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 처리에 따른 NO 생성을 측정한 결과이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 처리에 따른 IL-6 및 TNF-α 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 5는 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 처리에 따른 iNOS 및 COX-2 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 6은 실시예 1 및 비교예 1 내지 4 처리에 따른 MAPK signal 발현 증가를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

면역 증진용 약학적 조성물

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 또는 개선을 위한 것으로, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예로는 감염성 질환, 염증성 질환, 알러지 질환 또는 만성피로일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은

블루베리 추출물을 제조하는 단계(단계 1);

흑미 추출물을 제조하는 단계(단계 2);

상기 단계 1의 블루베리 추출물 및 상기 단계 2의 흑미 추출물을 8 : 2 내지 6: 4의 중량비로 혼합하는 단계(단계 3); 및

상기 단계 3의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 0.5 내지 5%(v/v)로 첨가하고, 35 내지 40℃, pH 5.0 내지 6.0에서 12 내지 48시간 발효하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 추출물을 제조할 수 있으며, 바람직하게 50% 에탄올 수용액을 이용하여 추출한 뒤 농축하여 추출물을 제조하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 블루베리 추출물은 50 내지 70°Brix가 되도록 농축하여 사용하였으며, 상기 흑미 추출물은 10 내지 30°Brix가 되도록 농축하여 사용하였다.

본 발명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"은 추출 대상을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은 통상의 기술분야에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 약 0.01-1000 mg/kg/일이며, 바람직하게는 0.1-500 mg/kg/일 수 있고, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

건강기능식품 또는 건강식품 조성물

본 발명은 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품 또는 건강식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은

블루베리 추출물을 제조하는 단계(단계 1);

흑미 추출물을 제조하는 단계(단계 2);

본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 건강기능식품 및 건강식품 조성물로 사용하는 경우, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 첨가할 수 있는 건강기능식품의 예로는 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태일 수 있으며, 건강식품의 예로는 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품 및 건강식품 조성물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 및 건강식품 조성물 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 유지를 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트라이톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 및 건강식품 조성물은 천연 과일쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 함유하는 건강기능식품 및 건강식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<준비예 1> 세포 배양

마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행 (Seoul National University, Seoul, Korea)에서 구입하였다. RAW264.7 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건하에 10% FBS (fetal bovine serum) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (PS)을 포함하는 고글루코스 DMEM (WELGENE, KOREA) 배양액에서 배양하였다.

<실시예 1> 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물의 제조

<1-1> 블루베리 추출물의 제조

블루베리(미국산) 중량 대비 30배(wt/v%)의 50% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간동안 추출하였으며, 추출과정을 3회 반복하였다. 상기 블루베리 추출액을 농축하여 최종 당도가 50 내지 70°Brix가 되도록 농축하였다. 농축액을 여과한 뒤, 물을 이용하여 1/14로 희석하였다.

<1-2> 흑미 추출물의 제조

흑미(국내산) 중량 대비 30배(wt/v%)의 50% 에탄올을 첨가하여 실온에서 24시간동안 추출하였으며, 추출과정을 3회 반복하였다. 상기 흑미 추출액을 농축하여 최종 당도가 10 내지 30°Brix가 되도록 농축하였다. 농축액을 여과한 뒤, 물을 이용하여 1/4로 희석하였다.

<1-3> 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물의 제조

상기 실시예 1-1의 블루베리 추출물 및 상기 실시예 1-2의 흑미 추출물을 7 : 3의 중량비로 혼합한 뒤, pH를 6.0으로 조절하였다. 이후 상기 혼합된 농축액에 유산균 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 을 2%(v/v)을 접종하여 37℃, pH 6.0 으로 24시간 동안 배양하여 발효한다. 최종 동결건조를 하여 분말화함으로써 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 분말 형태로 획득하였다.

<비교예 1>

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 흑미 추출물 대신 현미 추출물을 사용하여 비교예 1의 블루베리 및 현미 추출물의 유산균 발효물을 제조하였다.

<비교예 2>

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 대신 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium Longum)을 사용하여 비교예 2의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 제조하였다.

<비교예 3>

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 흑미 추출물 대신 현미 추출물을 사용하고, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 대신 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium Longum)을 사용하여 비교예 3의 블루베리 및 현미 추출물의 유산균 발효물을 제조하였다.

<비교예 4>

상기 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하되, 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum) 대신 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)를 사용하여 비교예 4의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 제조하였다.

<실험예 1> 세포독성 평가

RAW264.7 세포를 96well plate (Corning, USA)에 2×10⁴cells/well의 세포 수가 되도록 100ul씩 분주하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양한 후 실시예 1의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 50, 100, 200, 400㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간동안 배양하였다. 이후 0.2 ㎎/㎖ 농도의 MTT solution을 각 well에 100㎕ 씩 넣고 2시간 동안 배양한 후 상층액을 제거하고 DMSO를 100㎕씩 분주하여 formazan을 잘 녹인 후 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 세포독성을 나타내지 않았다.

<실험예 2> NO 생성 측정

RAW264.7 세포를 6well plate (Corning, USA)에 1×10⁶cells/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양한 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 4를 각각 400㎍/㎖와 LPS 50㎍/㎖ 농도로 처리하여 18시간 동안 배양하였다. 이후 상등액 100㎕와 Griess reagent 100㎕을 혼합하여 상온에서 10분간 반응시킨 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard로 표준곡선을 작성하여 NO의 생성량을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 비교예 4 대비 본 발명의 실시예 1의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 처리할 경우, NO 생성을 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다.

<실험예 3> 사이토카인 생성 측정

면역기능 관련 사이토카인인 IL-6와 TNF-α측정을 위해 RAW264.7 세포를 6well plate (Corning, USA)에 1×10⁶cells/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후, 실시예 1 및 비교예 1 내지 4를 각각 400㎍/㎖ 농도로 처리하여 18시간 동안 CO₂incubator에 배양한 후 배양 상층액을 희석하여 제조사의 지시에 따라 ELISA를 수행하였으며, 450nm 파장에서 마이크로스펙트로포토미터로 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 비교예 1 내지 비교예 4 대비 본 발명의 실시예 1의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 처리할 경우, IL-6와 TNF-α발현을 현저하게 증가시키는 것을 확인하였다.

<실험예 4> iNOS 및 COX-2 발현 측정

RAW264.7 세포를 6well plate (Corning, USA)에 1×10⁶cells/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 실시예 1을 각각 50, 100 및 200㎍/㎖ 농도로 처리하여 18시간 동안 CO₂incubator에 배양하였다. 이후 Protein extraction buffer를 이용하여 단백질을 추출하여 사용하였으며, BSA를 표준으로 하여 Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, California, USA)로 정량하였다. 이후 8-15 % SDS-PAGE로 30㎍의 단백질을 로딩하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% BSA로 blocking한 후 iNOS, COX-2 및 β-Actin ((Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA) 항체를 4 ℃에서 overnight 반응한 후 Washing하고 HRP-conjugated secondary antibody로 1시간 실온에서 반응시킨 후, iBright CL1000 imaging 시스템 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용하여 단백질 발현양을 검출하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 처리할 경우, 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현양이 증가하는 것을 확인하였다.

<실험예 5> MAPK 발현 측정

RAW264.7 세포를 6well plate (Corning, USA)에 1×10⁶cells/well의 세포 수가 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 24시간 배양하였다. 실시예 1을 각각 50, 100 및 200㎍/㎖ 농도로 처리하여 30분동안 CO₂incubator에 배양하였다. 이후 Protein extraction buffer를 이용하여 단백질을 추출하여 사용하였으며, BSA를 표준으로 하여 Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, California, USA)로 정량하였다. 이후 8-15 % SDS-PAGE로 30ug의 단백질을 로딩하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% BSA로 blocking한 후 p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, p38 및 β-Actin ((Cell Signaling Technologies, Massachusetts, USA) 항체를 4 ℃에서 overnight 반응한 후 Washing하고 HRP-conjugated secondary antibody로 1시간 실온에서 반응시킨 후, iBright CL1000 imaging 시스템 (Thermo Fisher Scientific, USA)을 이용하여 단백질 발현양을 검출하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 1의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 처리할 경우, 농도 의존적으로 MAPK 활성이 증가하는 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

약제의 제조예

본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<약제 제조예 1> 산제의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<약제 제조예 2> 정제의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<약제 제조예 3> 캡슐제의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<약제 제조예 4> 주사제의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

<약제 제조예 5> 경비흡수제 (Nasal spray)의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 1.0 g

아세트산나트륨 0.3 g

메틸파라벤 0.1 g

프로필파라벤 0.02 g

염화나트륨 적량

HCl 또는 NaOH pH 조정 적량

정제수 적량

통상의 경비흡수제의 제조방법에 따라, 염수 (0.9% NaCl, w/v, 용매는 정제수) 1 mL당 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 3 mg이 포함되도록 제조하고, 이를 불투명한 스프레이 용기에 충진하고 멸균시켜 경비흡수제를 제조하였다.

<약제 제조예 6> 액제의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라, 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 갈색 병에 충진하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

건강식품의 제조예

본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은 목적에 따라 여러 형태의 건강식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<건강식품 제조예 1> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 0.01-1 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<건강식품 제조예 2> 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 본 발명의 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 진공 농축기에서 감압농축하고 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 34 중량부, 율무 19 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 (2 중량부),

영지(1.5 중량부), 및

지황(1.5 중량부).

건강기능식품의 제조예

본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은 목적에 따라 여러 형태의 건강기능식품으로 제조 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 건강기능식품의 제조방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<건강기능식품 제조예 1> 건강기능식품의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 μg

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μg

비타민 C 10 mg

비오틴 10 μg

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 μg

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능성 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능성 식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능성 식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<건강기능식품 제조예 2> 건강 기능 음료의 제조

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물 100 mg

구연산 100 mg

올리고당 100 mg

매실농축액 2 mg

타우린 100 mg

정제수를 가하여 전체 500 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 또는 개선을 위한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서,
상기 면역기능 저하로 기인되는 질환은 감염성 질환, 염증성 질환, 알러지 질환 및 만성피로로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은
블루베리 추출물을 제조하는 단계(단계 1);
흑미 추출물을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 1의 블루베리 추출물 및 상기 단계 2의 흑미 추출물을 8 : 2 내지 6: 4의 중량비로 혼합하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 0.5 내지 5%(v/v)로 첨가하고, 35 내지 40℃, pH 5.0 내지 6.0에서 12 내지 48시간 발효하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서,
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 형태의 식품인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물을 포함하는 면역 증진용 건강식품 조성물.
제9항에 있어서,
상기 건강식품은 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제에서 선택되는 것을 특징으로 하는 건강식품 조성물.
제7항 또는 제9항에 있어서,
상기 블루베리 및 흑미 추출물의 유산균 발효물은
블루베리 추출물을 제조하는 단계(단계 1);
흑미 추출물을 제조하는 단계(단계 2);
상기 단계 1의 블루베리 추출물 및 상기 단계 2의 흑미 추출물을 8 : 2 내지 6: 4의 중량비로 혼합하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3의 혼합물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 0.5 내지 5%(v/v)로 첨가하고, 35 내지 40℃, pH 5.0 내지 6.0에서 12 내지 48시간 발효하는 단계(단계 4);를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서,
상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 탄소수 4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 것을 특징으로 하는 조성물.