KR101081460B1

KR101081460B1 - 항알러지, 항염증 또는 항천식 활성을 가진 류코노스톡 메센테로이드 ｅ―１을 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR101081460B1
Application number: KR1020080121091A
Authority: KR
Inventors: 이형규; 안경섭; 권옥경; 이미영; 김소영; 오세량; 이상구; 이중구; 육지은; 김희성
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-02
Filing date: 2008-12-02
Publication date: 2011-11-08
Also published as: KR20100062449A

Abstract

본 발명은 항알러지, 항염증 또는 항천식 활성을 갖는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 캐피어 그레인(Kefir grain)에서 분리한 균주인 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 난백알부민(ovalbumin)-유도 천식 동물 모델에서 기관지 폐포세척액의 사이토카인(IL-4 및 IL-13)의 생산과 호산구 증가를 억제하며, 점액분비를 억제함으로써 알러지, 염증 또는 기관지 천식 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 또는 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 이용할 수 있다.

류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1, 항알러지, 항염증, 항천식.

Description

항알러지, 항염증 또는 항천식 활성을 가진 류코노스톡 메센테로이드 Ｅ―１을 함유하는 조성물{Composition comprising Leuconostoc mesenteroides Ｅ―１ of having anti―allergy, anti―inflammatory and anti―asthma activity}

본 발명은 캐피어 그레인(Kefir grain)에서 분리한 균주인 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.

류코노스톡 메센테로이드 E-1은 캐피어 그레인(Kefir grain)에서 분리한 다당 생성능이 우수한 효모 균주로서(대한민국 등록특허 제 10-0663785호 참조) 다른 종류의 유산균(Lactobacillus 속, Leuconostoc 속, Streptococcus thermophilus, Acetobacter aceti, Acetobacter rasens 등)과 효모(Kluyveromyces marxianus var. marxianus 뿐아니라 Saccharomyces kefir, Torula kefir, Candida kefir 등)가 다당과 함께 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 캐피어 그레인은 캐피어(Kefir)라는 코카서스 산간지방에서 유래한, 일명 티벳버섯으로 알려져 있는 발 효유에서 유산균과 효모의 복합체로 이루어져 있고 젤리와 같은 알갱이 형태(grain)를 말한다. 지금까지는 캐피어의 생리활성이 주로 항균효과, 정장작용, 그리고 면역증강 및 항암효과에 탁월하다고 알려져 있어서(Meydani SN, et al., Am J Clin Nutr., 71(4), pp861-72, 2000), 락토바실러스와 스트렙토코커스가 주요 구성분인 요구르트와 효능이 유사한 발효유라는 인식이 있었다. 그러나, 요구르트에 대한 임상실험에서는 인터페론-감마와 면역글로불린 E 농도에 별로 변화가 일어나지 않았고(Trapp CL, Chang CC et.al. Int. J. Immunotherapy, 9, pp53-64, 1993), 그 후에 수행된 임상실험에서도 요구르트 섭취가 천식이나 폐질환의 치료에 아무런 효과가 없는 것으로 판명되었다(Wheeler JG, Bogle ML et.al. Ann. J. Med. Sci., 313, pp120-3, 1997).

그러나, 최근에 캐피어 분말 및 이의 추출물, 및 그로부터 분리된 캐퍼란이 마우스 천식모델에서 항알러지, 항염증 및 항천식 활성을 가지고 있음이 보고된 바 있으나(대한민국 등록특허 제 10-0685285호 참조; Lee MY, Ahn KS, Kwon OK et al. Immunobiology, 212, pp647-54, 2007) 상기 캐피어로부터 분리된 개별 미생물 단독으로 상기 약리활성을 확인한 보고는 아직 없었다.

전 세계적으로 그 발병률이 증가하고 있는 알러지성 질환에는 과민증(anaphylaxis), 알러지성 비염(allergic rhinitis), 및 천식(asthma), 아토피성 피부염(atopic dermatitis) 및 두드러기(urticaria)가 있다(Wuthrich B. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 90, pp3-10, 1989). 이러한 알러지성 질환 중 천 식(asthma)은 여러 가지 자극에 대한 기도의 과민반응성(bronchial hyperresponsiveness)을 그 특징으로 하는 질환으로 만성 기도염증(chronic airway inflammation)을 일으키며 기도의 광범위한 협착에 의해 발생하는 천명(喘鳴), 호흡곤란, 기침 등의 임상 증세들이 나타나는데 이는 자연히 혹은 치료에 의해 가역적으로 호전될 수 있다(Minoguchi K and Adachi M. Pathophysiology of asthma. In: Cherniack NS, Altose MD, Homma I, editors. Rehabilitation of the patient with respiratory disease. New York: McGraw-Hill, pp97-104, 1999).

일반적으로 천식은 TH2 타입 면역세포가 생성하는 인터루킨-4, 5, 13에 의해 염증세포가 증식, 분화 및 활성화되어 기도 및 기도주변 조직으로 이동, 침윤하여 나타나는 만성 염증질환으로 인식되고 있다(Elias JA, et al., J. Clin. Invest., 111, pp291-297, 2003). 이 경우 활성화된 호산구, 비만세포, 폐포 대식세포 등의 염증세포가 다양한 염증매개인자들(시스테인 류코트리엔, 프로스타글란딘 등)을 분비하면서 강력한 기관지 수축작용이 과정에서 중요한 역할을 한다(Maggi E., Immunotechnology, 3, pp233-244, 1998; Pawankar R., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 1, pp3-6, 2001; Barnes PJ, et al., Pharmacol Rev., 50, pp515-596, 1998).

따라서 염증세포 활성화에 관여하는 IL-4, IL-5, IL-13 등 사이토카인 및 면역글로불린 E의 생산과 이들의 작용으로 호산구 등 염증세포에서 분비되는 시스테인 류코트리엔 생합성 등은 염증 및 알러지 반응과 이로 인한 천식을 유발하는 주요 원인이므로 이들의 생산을 억제하기 위한 약물을 개발하고자 많은 연구가 진 행되고 있다. 특히, 천식 및 비결막염을 비롯한 알레르기성 질병에 대한 이해는 동물모델을 사용한 연구로부터 많이 얻어지고 있다. 동물모델을 사용한 연구를 통해 알레르기의 바탕인 면역학적 기전에 대한 이해가 가능하게 되었을 뿐만 아니라, 개발중인 치료제의 평가도 가능하게 되었다. 이에 본 발명에서도 현재 천식모델로 가장 널리 사용되고 있는 마우스에서의 난백알부민을 항원으로 사용한 동물모델을 이용하였다.

이에, 본 발명자들은 캐피어의 공생균체의 일원인 류코노스톡 메센테로이드 E-1 단독으로도 캐피어에 버금가는 항알러지, 항염증 및 항천식 효과가 있다는 놀라운 사실을 확인하였다. 구체적으로 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 난백알부민으로 감작된 천식 동물 모델에서 기관지 폐포세척액의 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13)의 생산을 억제하고, 캐피어에서 확인하지 못했던 기도과민성 개선효과와 RBL-1이라는 동물세포에서 프로스타글란딘 E2의 생산을 저해하는 효과를 확인하였다. 또한, 호산구 증가를 억제하며, 점액분비를 억제하는 효과를 확인함으로써 알러지, 염증 또는 천식 치료제로서의 효능성을 입증하였다.

본 발명의 목적은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증 또는 천식 질환 예방 및 치료용 조성물, 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 알러지, 염증 또는 천식 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 난백알부민(ovalbumin) 유도 천식 동물 모델에서 기관지 폐포세척액의 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13)의 생산을 억제하는 활성, 호산구 증가를 억제하는 활성, 및 기관지 점액분비를 억제하는 활성을 가짐으로써 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 또는 건강기능식품의 유효성분으로 유용하게 이용될 수 있다.

이전에 캐피어 분말이 항알러지, 항염증 및 항천식 활성을 가지고 있다고 보고된 바 있으나 캐피어의 공생균체의 일원인 류코노스톡 메센테로이드 E-1 단독으로도 이와 유사하거나 그 이상의 활성을 가지고 있음은 당업자가 용이하게 예측할 수는 없다. 또한, 캐피어 분말은 복잡한 과정을 통해 제조되기 때문에 대량 생산에 있어서 비용이 많이들고 비효율적인 반면에, 류코노스톡 메센테로이드 E-1 자체는 저가로 용이하게 생산할 수 있으므로 경제적이고 효율적인 대량생산이 가능하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 알러지, 염증 또는 천식의 형성을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료" 및 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 알러지, 염증 또는 천식의 증상이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"는 본 발명의 조성물을 투여하여 알러지, 염증 또는 천식의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1(기탁번호 KCTC 10724BP)은 캐피어 그레인(Kefir grain)에서 분리 및 동정한 균주인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 캐피어 그레인에 우유를 첨가한 후 배양하여 배양액을 제조한 다음, 상기 배양액으로부터 MRS 배지를 이용하여 형태학적으로 유산균으로부터 분리한 다음, 생화학적 특성을 이용한 API kit로 동정하여 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 수득하였다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 염증세포, 특히 호산구의 증가를 억제하는 활성, 사이토카인인 IL-4 및 IL-13의 증가를 억제하는 활성, 및 기관지 점액분비의 증가를 억제하는 활성을 가지고 있다.

본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 염증 관련 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 난백알부민으로 감작된 동물모델을 이용하여 기관지폐포세척액의 호산구수 및 그 외 염증 세포수를 측정하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 처리하는 경우 난백알부민의 감작에 의해 증가되는 염증 세포수를 약 20 ~ 25% 정도 감소시켰으며, 호산구수 역시 25 ~ 30% 정도 감소시켰다(표 1 및 도 1 참조).

본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 염증에 관련된 사이토카인에 미치는 영향을 알아보기 위해, 난백알부민으로 감작된 동물모델을 이용하여 기관지폐포세척액의 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13)의 함량을 측정하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 처리하는 경우 난백알부민의 감작에 의해 증가되는 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 생산량을 각각 약 90 ~ 95% 및 55 ~ 60% 정도로 현저하게 감소시켰다(표 2, 도 2 및 도 3 참조).

본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 기도 과민성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 난백알부민으로 감작된 동물모델에서 기도저항측정기를 이용하여 기도 과민성 반응을 측정하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 처리하는 경우 난백알부민의 감작에 의해 증가되는 기도 과민성이 호전되는 것을 확인할 수 있었다(표 3 및 도 4 참조).

본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 기관지 염증세포 및 상피세포에 미치는 영향을 알아보기 위해, 난백알부민으로 감작된 동물모델의 폐조직을 조직병리학적으로 관찰하였다. 그 결과, 폐조직의 페포와 세기관지는 난백알부민에 의해 천식이 유발되었고, 상피세포가 손상되었으며, 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤된 반면에, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 처리한 경우는 호산구를 비롯한 염증세포가 현저하게 감소되었고 상피세포의 손상도 거의 보이지 않았다. 이는 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1에 의한 기도폐포세척액으로부터 검사한 세포수의 감소현상과 일치한다는 것을 알 수 있다(도 5 참조).

본 발명에서는 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 기관지 점액 분비에 미치는 영향을 알아보기 위해, 난백알부민으로 감작된 동물모델의 폐조직으로부터 고블렛(goblet) 세포의 과증식을 관찰하였다. 그 결과, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 처리하는 경우 난백알부민의 감작에 의해 증가되는 점액분비를 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 7 참조).

따라서, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 난백알부민 유도 천식 동물 모델에서 기관지 폐포세척액의 사이토카인(IL-4 및 IL-13)의 생산을 억제하고, 호산구 증가를 억제하며, 점액분비를 억제함으로써 알러지, 염증 또는 기관지 천식 질환의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 의약품으로 사용하는 경우, 추가 로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 임상 투여 시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 실제 임상 투여 시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 류코노스톡 메센테로이드 E-1의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 조성물은 류코노스톡 메센테로이드 E-1에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 류코노스톡 메센테로이드 E-1의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

상기 방법은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 유효성분으로 함유하는 알러지, 염증 또는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 난백알부민 유도 천식 동물 모델에서 기관지 폐포세척액의 사이토카인(IL-4 및 IL-13)의 생산을 억제하고, 호산구 증가를 억제하며, 점액분비를 억제함으로써 알러지, 염증 또는 기관지 천식 질환의 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로 이용할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도 당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 류코노스톡 메센테로이드( Leuconostoc mesenteroides ) E-1의 제조

캐피어 그레인(Kefir grain)은 대전과 충청남도 지역 민가에서 소지한 캐피어 그레인을 분양 받아 멸균수로 세척한 후 우유에 2%씩 접종하여 25℃에서 20 ~ 24시간 정치 배양하였으며 발효 후 냉장고에서 2 ~ 7일간 숙성시키는 방법으로 계속적으로 캐피어 발효를 통해 캐피어 그레인을 보존하였다. 그리고, 상기 캐피어 그레인에 존재하는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 분리하기 위해, 캐피어 그레인에 우유를 첨가한 후 25℃에서 18시간 동안 배양한 다음, 배양액으로부터 MRS 배지(Difco. USA)를 이용하여 형태학적으로 구별되는 콜로니(colony)를 선별하였다. 상기 형태학적으로 유산균으로부터 분리된 효모의 생화학적 특성을 통한 1차 동정을 위하여, API 50CHL kit(Biomerieux, France)를 이용하여 효모를 동정하였다. 보다 정확한 동정을 위하여 16S rDNA sequencing을 수행하였다(대한민국 등록특허 제 10-0663785호 참조).

상기 캐피어 그레인에 존재하는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 배양하기 위해, 캐피어 그레인에서 분리한 균주를 Difco.(USA)회사의 락토바실리 MRS 배지(Proteose Peptone No. 3 10.0 g/L, 쇠고기추출물 10.0 g/L, 효모추출물 5.0 g/L, 덱스트로스 20.0 g/L, Polysorbate 80 1.0 g/L, 시트르산 암모늄 2.0 g/L, Sodium Acetate 5.0 g/L, MgSO₄ 0.1 g/L, MnSO₄ 0.05 g/L, Dipotassium Phosphate 2.0 g/L)에서 30℃, 24시간 동안 seed 배양(100 mL medium/500 mL flask)하였고, 5 L 발효조(Hanil science industrial., Korea)를 이용하여 seed를 10% 접종하여 30℃, 0.5 vvm, 200 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 그리고 균체를 얻기위해 배양액을 6000 rpm 속도로 20분간 원심분리하였고, 이렇게 침전된 균주는 다시 액상 50 ml의 부형제 현탁액(증류수 100ml에 식물성크림 50g, 탈지분유 50g을 현탁)과 혼합하여 -80℃ 이하에서 동결건조한 후 분말화하였다.

<실험예 1> 기관지페포세척액의 호산구 분석

<1-1> 실험동물의 기도 감작과 항원 투여

8주된 특정병원체 미감염 백서 암컷(Balb/c)(무게: 약 20g)을 (주)오리엔트(Seoul, Korea)에서 구입한 후, 2주 간격으로 2 mg 수산화알루미늄(Sigma A8222)과 난백알부민 20㎍(Sigma A5503)을 현탁한 인산완충용액(pH 7.4) 100 ㎕을 2회 복강에 주입하여 감작시켰다. 실험 시작 후 28일, 29일, 30일째 초음파분무기를 사용하여 1% 난백알부민을 첨가한 인산완충용액을 20분간 마우스가 들어있는 밀폐된 용기에 분무하였으며, 음성 대조군으로 기도감작도 일으키지 않은 마우스군(5마리), 대조군으로 기도감작 후 PBS 50 mg/kg를 투여한 군(5마리), 양성대조군으로 항천식약인 덱사메타손 4 mg/kg 투여군(5마리), 실험군으로서 상기 <실시예 1>에서 수득한 류코노스톡 메센테로이드 E-1 50 mg/kg을 인산완충용액에 현탁한 후에 항원투여하기 1시간 전에 경구투여한 군(5마리)으로 실험을 하였다. 마지막 항원투여 후 24시간 뒤에 과량의 펜토바비탈(pentobarbital, Sigma P3761)을 투여하여 치사시킨 후 기관지 절개를 수행하였다. 기관지폐포세척액(BALF)은 기관에 카뉼 라(cannula) 삽입방법으로 0.5 ㎖씩 3회 흡입하여 수득하였다.

<1-2> 난백알부민으로 감작된 동물모델에서 기관지폐포세척액의 호산구 분석 실험

상기 실험예 <1-1>에서 수득한 각 실험군의 기관지폐포액 100 ㎕를 슬라이드에 놓고 사이토스핀(cytospin) 기기(한일, 한국)를 사용하여 원심분리를 하여 세포를 슬라이드에 고정하였다. 트리판블루(Trypan blue)로 염색하여 죽은 세포를 제외한 총 세포수를 헤모사이토미터를 이용하여 계산하였으며 3번 반복하여 측정하였다(Daigle I, et al, Swiss Med. Wkly., 131, pp231-237, 2001). 호산구 수는 디프-퀵(Diff-Quick) 시약(Sysmex, Cat No. 38721, Switzerland)으로 염색한 후 판별하고 총세포수와 동일한 방법으로 계산하였다. 통계학적인 분석은 Student's t-test로 수행하였으며 유의성 판별은 p 값으로 표현하였다.

상기 실험 수행의 결과, 표 1 및 도 1에서 보는 바와 같이 음성 대조군으로서 기도 감작하지 않은 경우의 기관지폐포액의 총 염증세포(inflammatory cell) 수는 1.9 ± 0.8 × 10⁴ cells/mouse 이었으며, 그 중 호산구(eosinophil)는 14.8 ± 4.0%이었다. 양성대조군으로서 난백알부민으로 감작시키고 PBS 투여후 항원투여한 군에서는 총 염증세포수가 34.8 ± 22.9 × 10⁴ cells/mouse로 10배 이상 증가하였다. 류코노스톡 메센테로이드 E-1의 경우 총 염증세포수가 27.0 ± 8.0× 10⁴ cells/mouse 으로 22.2% 감소하였으며, 호산구 수 역시 27.6% 감소한 것으로 관찰 되었다(표 1 및 도 1).

종류	마우스 1마리당 총 염증세포수 (천)	마우스 1마리당 호산구 수 (천)
정상 마우스	16 이하	관찰되지 않음
난백알부민 감작-인산완충용액 처리구	348 ± 229	163 ± 83
난백알부민 감작-류코노스톡 메센테로이드 E-1 처리구	270 ± 80	118 ± 51
난백알부민 감작-덱사메타손 처리구	24 ± 0	4 ± 0

<실험예 2> 사이토카인(IL-4, IL-13) 분석

상기 실험예 <1-1>에서 수득한 각 실험구의 기관지폐포액의 사이토카인(cytokine)인 인터루킨-4(IL-4) 및 인터루킨-13(IL-13)의 함량을 측정하기 위하여 상기 사이토카인에 특정 반응하는 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 사용하였으며, 제조사의 방법에 따라 각 사이토카인의 함량을 측정하였다.

상기 실험 결과, 표 2, 도 2 및 도 3에서 보는 바와 같이 난백알부민으로 감작된 쥐의 경우 기관지폐포액의 인터루킨-4 및 인터루킨-13의 생산이 크게 증가됨이 관찰되었으며, 류코노스톡 메센테로이드 E-1 처리군에서는 인터루킨-4와 인터루킨-13의 함량 측정 결과, 각각 92.8% 및 57.8% 정도의 현저한 억제 효과가 있음을 확인하였고, 인터루킨-4의 경우, 캐피어의 52.5%의 저해효과와 비교하면 월등한 효과임을 알 수 있었다(표 2, 도 2 및 도 3).

종류	IL-4 (pg/ml)	IL-13 (pg/ml)
정상쥐	3.28 ± 2.63	12.50 ± 7.05
난백알부민 감작-인산완충용액 처리구	11.35 ± 7.75	67.75 ± 5.29
난백알부민 감작 -류코노스톡 메센테로이드 E-1 처리구	0.82 ± 1.50	28.59 ± 2.06
난백알부민 감작-덱사메타손 처리구	1.80 ± 3.00	39.35 ± 5.82

<실험예 3> 호흡률 측정

본 발명에서는 상기 실험예 <1-1>에서 1% OVA/PBS 용액의 3일 연속 분무 흡입 후 24시간 뒤에 in vivo 상태에서 마취를 하지 않고 자연상태의 운동을 유지하면서 체적변동 측정기(whole body plethysmograph)를 사용하여 수학적으로 계산된 기도의 폐색을 반영하는 수치인 Enhanced Pause(Penh)를 측정하는 방법(Tomkinson A, et al., Am. J. Respir Crit Care Med., 163, p721-730, 2001)을 이용하여 기도과민성 반응을 측정하였다. 기도과민성의 기저치는 3분 동안의 측정치의 평균을 사용하고, 이후 메타콜린을 6.25 mg/ml에서 25 mg/ml까지 점차적으로 높여가면서 각 농도마다 3분씩 초음파연무기를 사용하여 흡입시킨 후, 3분 동안 각각의 기도 과민성의 정도를 기도저항측정기로 측정하였다. 기도 과민성의 정도는 각각의 메타콜린을 투여한 후 측정한 Penh값과 PBS를 흡입한 후, 측정한 Penh값과 비교하여 증가된 비율로 표시하였다.

상기 실험 결과, 표 3 및 도 4에서 보는 바와 같이 류코노스톡 메센테로이드 E-1 처리구가 메타콜린의 농도에 따라 기도 과민성이 호전되었으며, 양성대조군인 덱사메타손 처리구보다 효과가 우수함을 확인하였다(표 3 및 도 4).

종류＼메타콜린(mg/ml)	0	6.25	12.5	25
정상쥐	0.40 ± 0.10	0.51 ± 0.10	0.79 ± 0.11	1.67 ± 0.68
난백알부민 감작 -인산완충용액	0.62 ± 0.21	2.80 ± 0.36	4.88 ± 0.88	5.52 ± 0.61
난백알부민 감작 -류코노스톡 메센테로이드 E-1	0.48 ± 0.15	1.46 ± 0.25	2.43 ± 0.24	3.02 ± 0.76
난백알부민 감작 -덱사메타손	0.46 ± 0.07	0.98 ± 0.19	3.01 ± 0.49	3.29 ± 0.69

<실험예 4> 조직병리학적 방법을 이용한 항천식 효과 규명

조직병리학적 실험을 위해서는 쥐 폐조직을 10% 중성완충-포르말린으로 24시간 고정한 후 파라핀 포매(embedding) 를 실시하였다. 포매 조직은 4 mm 두께로 절단하여 절편을 만들고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신 와이(Eosin Y; ThermoShandon, Pittsburgh, PA) 로 염색하였고 곧 이어 Dako-봉입액 (Dakocytomation, Denmark) 으로 봉입하였다. 염색과 봉입이 끝난 슬라이드는 광학현미경으로 검경하였으며 기관지 염증세포 침윤은 이중맹검(double-blind screen)법으로 정량화하였다.

상기 실험 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 폐조직의 페포와 세기관지는 난백알부민에 의해 천식이 유발되고, 인산완충용액만을 투여한 대조군에서는 상피세포가 손상되어 있는 것을 알 수 있으며, 세기관지 주변에 호산구를 비롯한 많은 염증세포가 침윤되어 있는 것을 알 수 있다. 반면에, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 투여한 실험군에서는 호산구를 비롯한 염증세포가 현저하게 감소되었고 상피세포의 손상도 거의 보이지 않았다. 이는 상기 <실험예 1>에서 류코노스톡 메센테로이드 E-1에 의한 기도폐포세척액으로부터 검사한 세포수의 감소현상과 일치함을 확인할 수 있었다(도 5).

<실험예 5> 기관지 점액 억제 효과

기관지 재형성(remodeling) 이 일어나면 끈끈한 점액분비가 과도하게 일어난다. 도 6은 점액을 분비하는 세포인 고블렛(goblet) 세포가 과도하게 증식되었는지를 조사하기 위해 상기 <실험예 4>에서 실시한 폐 조직 절편을 Periodic acid-Schiff(PAS, IMEB INC)로 염색한 결과이다.

상기 실험 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 난백알부민-유도 쥐의 기관지에서는 고블렛세포의 과증식(hyperplasia)이 일어나는데 반해 인산완충용액(PBS)만을 처리한 대조군에서는 과증식이 나타나지 않았다. 도 7에서 보는 바와 같이 PAS 염색수치는 난백알부민군에서 46.06 ± 4.18% 로 매우 높게 나타난 반면, 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 투여한 실험군에서는 31.59 ± 0.05%로 그 수치가 낮아지는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 점액분비 억제 활성이 있음을 나타내는 결과였다(도 6 및 도 7).

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.

<제조예 1> : 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

류코노스톡 메센테로이드 E-1 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

2. 정제의 제조

류코노스톡 메센테로이드 E-1 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

3. 캡슐제의 제조

류코노스톡 메센테로이드 E-1 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

4. 환의 제조

류코노스톡 메센테로이드 E-1 1 g

유당 1.5 g

글리세린 1 g

자일리톨 0.5 g

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.

5. 과립의 제조

류코노스톡 메센테로이드 E-1 150 ㎎

대두추출물 50 ㎎

포도당 200 ㎎

전분 600 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.

<제제예 2> : 식품의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

1. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

3. 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

5. 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

류코노스톡 메센테로이드 E-1(3 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

<제제예 3> : 음료의 제조

1. 건강음료의 제조

액상과당(0.5 %), 올리고당(2 %), 설탕(2 %), 식염(0.5 %), 물(75 %)과 같은 부재료와 본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

2. 야채쥬스의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3. 과일쥬스의 제조

본 발명의 류코노스톡 메센테로이드 E-1 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명은 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1을 함유하는 알러지, 염증 또는 기관지 천식 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품, 및 건강기능식품 개발에 이용될 수 있다.

도 1은 기도 감작한 후 기관지 폐포 세척액의 총염증세포수와 호산구수에 대한 류코노스톡 메센테로이드 E-1이 미치는 영향을 나타낸 그래프이다:

PBS: PBS만 투여한 음성대조군의 경우,

OVA: 난백알부민으로 감작시킨 대조군의 경우,

LM: 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 투여한 후 난백알부민으로 감작시킨 실험군의 경우, 및

Dex: 덱사메타손을 투여한 후 난백알부민으로 감작시킨 양성대조군의 경우.

도 2는 폐포 세척액의 인터루킨 4의 함량을 나타낸 그래프이다(P값(^**)은 0.05 이하):

PBS: PBS만 투여한 음성대조군의 경우,

OVA: 난백알부민으로 감작시킨 대조군의 경우,

도 3는 폐포 세척액의 인터루킨 13의 함량을 나타낸 그래프이다(P값(^#)은 0.0005 이하):

PBS: PBS만 투여한 음성대조군의 경우,

OVA: 난백알부민으로 감작시킨 대조군의 경우,

도 4는 기도 감작한 후 메타콜린 흡입으로 인한 기관지 수축의 완화정도를 나타낸 그래프이다.

도 5은 기도 감작한 후 기관지 폐포의 조직화학적 분석한 그림이다:

A: 기도 감작하지 않은 경우,

B: 난백알부민으로 기도 감작한 경우,

C: 류코노스톡 메센테로이드 E-1을 처리한 후 난백알부민으로 기도 감작한 경우, 및

D: 덱사메타손을 처리한 후 난백알부민으로 기도 감작한 경우.

도 6은 기도 감작후 기관지를 PAS 염색한 것을 나타낸 그림이다:

A: 기도 감작하지 않은 경우,

B: 난백알부민으로 기도 감작한 경우,

도 7은 도 6에서 나타난 고블렛 세포의 과증식을 정량화한 그래프이다:

PBS: PBS만 투여한 음성대조군의 경우,

OVA: 난백알부민으로 감작시킨 대조군의 경우,

Claims

류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1(기탁번호 KCTC 10724BP)을 유효성분으로 함유하는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 캐피어 그레인(Kefir grain)에서 분리한 균주인 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 염증세포 수의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 염증세포는 호산구인 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 IL-4 및 IL-13의 생산 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 기관지 점액분비의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 포함하는 천식 질환의 치료용 약학 조성물.
약학적으로 유효한 양의 제 1항의 조성물을 포함하는 천식 질환의 예방용 약학 조성물.
류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) E-1(기탁번호 KCTC 10724BP)을 유효성분으로 함유하는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 9항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 캐피어 그레인(Kefir grain)에서 분리한 균주인 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 9항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 염증세포 수의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 11항에 있어서, 상기 염증세포는 호산구인 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 11항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 IL-4 및 IL-13의 생산 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 11항에 있어서, 상기 류코노스톡 메센테로이드 E-1은 면역반응에 의한 기관지 점액분비의 증가를 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.