KR100919134B1 - 항비만 효능을 나타내는 저극성 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼을 물 및/또는 저급 알코올로 추출하고, 이를 인공 소화액으로 배양하여 얻어지는 저극성 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물 또는 이의 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 비만세포에서의 지질 축적 감소 효과를 확인하여 항비만용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

인삼 추출물, 저극성 진세노사이드, 비만세포, 항비만

Description

항비만 효능을 나타내는 저극성 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물 및 이의 제조방법{EXTRACT OF ANTIOBESTIC GINSENG WITH ANTI-OBESITY EFFECT COMPRISING HIGH CONCENTRATION OF LESS POLAR GINSENOID AND METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은 인삼을 물 및/또는 저급 알코올로 추출하고, 이를 인공 소화액으로 배양하여 얻어지는 항비만 효능을 나타내는 저극성 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물 또는 이의 제조방법에 관한 것이다.

인삼은 파낙스 속의 뿌리이고, 전 세계적으로 가장 유명한 약초 중 하나이다. 인삼 사포닌인 진세노사이드는 항-고혈압, 항-종양, 항-당뇨의 활성을 포함하는 약학적 및 생물학적 기능을 갖는 주요한 물질이다(Xie, J.T. Kim DH, Moon YS, Lee TH, Jung JS, Suh HW, Song DK. The inhibitory effect of ginseng saponins on the stress-induced plasma interleukin-6 level in mice. Neurosci Lett, 353, pp 13-6, 2003; Xie JT, Mehendale SR, Li X, Quigg R, Wang X, Wang CZ et al. Anti-diabetic effect of ginsenoside Re in ob/ob mice. Biochim Biophys Acta, 1740, pp 319-25, 2005: Hofseth LJ, Wargovich MJ, Inflammation, Cancer, and Targets of Ginseng. J. Nutri. 137, pp 183S-185S, 2007).

30 가지 이상의 진세노사이드는 특징별로 구분되어질 수 있고, 각각은 특별한 약학적 효과를 갖는다. 진세노사이드는 아글리콘 모이어티(moieties)에 기초한 20(S)-protopanaxadiol (ginsenosides Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Rg3) 및 20(S)-protopanaxatriol (ginsenosides Re, Rg1, Rg2, Rh1)기로 분류되어질 수 있다 (도 1 참조).

비만은 현재 가장 흔하게 세계 인구의 건강을 해치는 현저한 요소로 영양 실조 및 감염 질환을 대체하기 시작했다. 비만은 많은 건강 문제를 야기하고 있으나, 특히 제 2형 당뇨병, 관상동맥질환(CHD) 및 골관절염과 연관되어있다 (Bose K, Bhadra M, Mukhopadhyay A. Causes and Consequences of Obesity. Anthropologist Special Volume 3, pp 223-40, 2007). 많은 전통 의학에서는 비만의 치료에 관해 연구해왔고, 몇몇은 체중 감소, 음식 섭취 및 비만과 연관된 단백질의 발현 단계 조절에 효과적인 것을 알아냈다 (Furuyashiki T, Nagayasu H, Aoki Y, Bessho H, Hashimoto T, Kanazawa K, Ashida H. Tea catechin suppresses adipocyte differentiation accompanied by down-regulation of PPARgamma2 and C/EBPalpha in 3T3-L1 cells. Biosci Biotechnol Biochem, 68, pp 2353-9, 2004).

인삼 추출물은 췌장의 리파제 저해제로서 ICR 마우스 및 랫트에서의 고지방식이 유도 비만 억제효과가 알려져 있으나 (Karu N, Reifen R, Kerem Z. Weight gain reduction in mice fed Panax ginseng saponin, a pancreatic lipase inhibitor. J Agric Food Chem, 55, pp 2824-8, 2007), 세포 단계에서의 각각의 진 세노사이드에 대한 비만과 관련된 연구는 아직 실행되지 않았다.

음식 및 경구 투여 약물은 소화 기관을 통과하는 동안 위액에 의해 영향을 미친다. 다양한 연구에서는“시험관 내 소화”또는“모의 소화”와 같은 실험 모델을 이용하여 인간 소화 과정을 실험하였다. 위액 및 췌장액은 흔히 사용되어지는데, 왜냐하면 대부분의 음식 및 구강 투여용 약물은 두 가지 용액에 의해 작용되기 때문이다.

다양한 타입의 천연 물질은 시험관 내 소화 모델에 적용되었고, 소화는 일반적으로 생물활성으로 평가되었다 (Pearson W, Orth MW, Karrow NA, Maclusky NJ, Lindinger MI. Anti-inflammatory and chondroprotective effects of nutraceuticals from Sasha's Blend in a cartilage explant model of inflammation. Mol Nutr Food Res, 51, pp 1020-30, 2007). 인공 위액 및 창자액을 이용하여 표준화 인삼 추출물을 소화하여, 폐혈관 확장에 대한 영향을 측정하였다 (Rimar S, Lee-Mengel M, Gillis CN. Pulmonary protective and vasodilator effects of a standardized Panax ginseng preparation following artificial gastric digestion. Pulm Pharmacol, 9, pp 205-9, 1996).

그러나, 모의 소화 과정에서의 진세노사이드의 복용 처리의 화학적 변화는 연구되어진 바가 없고, 반면에 다른 천연 물질을 이용한 연구는 알려져 있다 (Argyri K, Proestos C, Komaitis M, Kapsokefalou M. Phenolic compounds in red wine digested in vitro in the presence of iron and other dietary factors. Int J Food Sci Nutr, 56, pp 213-22, 2005).

한편, 천연물질을 이용한 안전한 항비만용 조성물이 개발되기 위해서는 보다 많은 연구가 필요한 상태이다.

이에 본 발명자들은 시험관 내 소화된 진세노사이드는 3T3-L1 비만세포에서의 지방 축적 저해 효과를 나타내고, 이것은 저극성 진세노사이드, 특히 진세노사이드 Rg3가 분화된 3T3-L1 비만세포에서의 지질 함량을 현저히 감소시키는 효과를 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인삼을 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출하고, 이를 인공 소화액을 배양하여 얻어진 저극성 진세노사이드를 고농도로 함유하는 인삼 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 인삼 추출물을 포함하는 항비만용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 인삼을 물 및 탄소 수 1 내지 4의 알코올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출하는 단계; 및

상기 추출물을 인공 소화액에 배양하는 단계를 포함하는,

저극성 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물의 제조 방법을 제공한다.

상기 제조 방법에 있어서, 상기 용매는 물 또는 농도 20 내지 99 v/v%의 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 20-40 v/v%의 메탄올 또는 에탄올과, 80 내지 99 v/v%의 메탄올 또는 에탄올을 순차적으로 사용할 수 있다.

상기 인공 소화액은 체내 소화과정과 유사한 환경을 만들어주기 위한 것으로,인공 위액, 인공 장액 및/또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 바람직하게는 생체 내 소화 과정과 유사하게 pH 1.3 내지 2의 인공 위액에서 배양한 후, 인공 장액을 첨가하고 pH를 7 내지 8로 맞추어 배양하는 것이 좋다. 배양 조건도 생체 내 소화 과정과 유사하게 하는 것이 좋으며, 예컨대, 배양 온도는 체온 범위인 36 내지 38℃로, 배양 시간은 소화 시간과 유사하게 인공 위액과 인공 장액 배양의 경우 각각 약 30분 내지 4시간, 바람직하게는 1시간 내지 3시간씩으로 하는 것이 좋다.

상기 인삼은 홍삼, 수삼, 건삼, 장뇌삼 및 산삼으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것으로, 바람직하게는 홍삼을 포함할 수 있다.

상기 저극성 진세노사이드는 Rh1, Rg2, Rg3, Rk1 및 Rg5로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 이 중에서도 Rg3, Rk1 및 Rg5의 활성이 특히 탁월함을 확인하였으므로, 상기 저극성 진세노이드는 중에서도 Rg3, Rk1 및 Rg5로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

또한, 상기 제조 방법에 의하여 제조되는 인삼 추출물은 저극성 진세노사이드 함량이 증가된 것을 특징으로 한다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 저극성 진세노사이드 함량이 전체 추출물 총 중량을 기준으로 35 내지 40 w/w%인 저극성 진세노사이드 고함유 인삼 추출물을 제공한다. 본 발명에서는 저극성 진세노사이드, 특히 Rg3, Rk1 및/또는 Rg5, 바람직하게는 진세노사이드 Rg3 및 Rk1, 더욱 바람직하게는 진세노사이드 Rg3이 지 질 축적 감소에 탁월한 효과를 보이는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 상기와 같은 저극성 진세노사이드 고함유 인삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명의 인삼 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 인삼 추출물은, 건조된 홍삼을 세절하여 무게(㎏)의 약 30 배 내지 80 배, 바람직하게는 약 40 배 내지 50 배의 물 및 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올의 혼합 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올의 혼합용매로, 20 ℃ 내지 80 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 35 ℃의 추출온도에서 약 30분 내지 5 시간, 바람직하게는 약 40분 내지 2 시간 동안 교반 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법, 바람직하게는 초음파 추출의 방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과하여, 용매는 제거하였고, 잔사는 물에 용해시켰으며, 이를 동결 건조하여 본 발명의 인삼 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 인삼은 두릅나무과 약용식물로서, 가공 방법에 따라서 가공하지 아니한 수삼, 수삼을 건조시킨 건삼 (백삼), 수삼을 쪄서 건조시킨 홍삼, 등이 있으며, 재배 방법에 따라서, 인삼밭에서 인위적으로 재배한 재배삼, 인삼씨를 산중에 뿌려서 자연 상태에서 재배한 장뇌삼, 자연상태로 자생한 산삼 등이 있으며, 본 발명에서의 인삼은 상기 모든 인삼 종류를 포함하는 의미로 사용한다. 본 발명에서, 상기 인삼은 4년 내지 6년근인 것이 좋으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 인삼 추출물을 인공 소화액으로 배양하여 이로부터 분리하여 얻어지는 인삼 추출물 내에 상기 진세노사이드 Rh1, Rg2, Rg3, Rk1 및 Rg5 등의 유효성 분이 생성되거나 함량이 증가하여, 보다 증대된 항비만 효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르는 경우 홍삼 이외의 인삼을 사용하는 경우에도 홍삼과 비교하여 동등 이상의 유효성분을 고함량으로 함유할 수 있게 된다는 이점이 있다. 상기 치료 또는 예방용 조성물은 상기 인삼 추출물을 단독 유효성분으로 단독으로 포함하거나, 해당 질병 유효 치료 성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있고, 이외 제형 형태, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약제학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 및/또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 예방 또는 치료용 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아키시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.

상기 예방 또는 치료용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 조성물을 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함될 수 있다. 또한, 상기 추가성분의 함량은 바람직하게는 상기 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 20 중량부 범위에서 추가할 수 있다.

또한, 상기 예방 또는 치료용 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용 할 수 있다.

구체적으로 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물의 제형은 사용방법에 따라 바람직한 형태일 수 있으며, 특히 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 채택하여 제형화할 수 있다. 구체적인 제형의 예로는 과립제, 산제, 시럽제, 액제, 현탁제, 정제, 주사제, 주정제, 카타플라스마제(cataplasma), 캅셀제, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀 등이 있다.

더 나아가 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물의 투여량은, 투여방법, 복용자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일예로, 본 발명의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 조성물을 기준으로 할 때, 0.0001 mg/kg 내지 1000 mg/kg으로, 보다 효과적이기 위해서는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 인삼 추출물 또는 이로부터 분리된 저극성 진세노사이드를 포함하는 식품을 제공한다. 본 명세서에서 식품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 통상의 식품, 음료, 식품 첨가제, 음료 첨가제, 건강기능성 식품 등을 모두 포함하는 의도이다.

본 발명의 식품은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 건강기능식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.

상기 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 건강기능음료를 포함하는 의도이다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기의 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 식품 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 5 내지 12g일 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 추가로 함유할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지 않지만, 본 발명의 항균 조성물 100 중량부 당 0 내지 20 중량부 범위에서 선택될 수 있다.

본 발명에서 건강기능음료란 음료에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 음료의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 음료 군이나 음료 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 음료를 의미한다.

상기 건강기능음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명의 항균 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 5 내지 12 g이다.

본 발명의 식품은 상기 인삼 추출물을 전체 식품 중량의 0.001 내지 50 중량%, 0.01 내지 20 중량%의 양으로 포함할 수 있으며, 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.001 내지 10 g, 바람직하게는 0.1 내지 5g의 비율로 포함할 수 있다.

본 발명의 인삼을 농도 20 내지 99 v/v%의 에탄올로 추출하고, 이를 인공 소화액으로 배양하여 얻어지는 저극성 진세노사이드의 함량이 증가된 인삼 추출물 은 비만세포에서의 지질 축적 감소 효과를 확인하여 항비만용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 인삼 추출물의 제조

인삼 추출물은 문헌에 기재된 방법을 이용하여 제조하였다 (Kim SN, Ha YW, Shin H, Son SH, Wu SJ, Kim YS. Simultaneous quantification of 14 ginsenosides in Panax ginseng C.A. Meyer (Korean red ginseng) by HPLC-ELSD and its application to quality control. J Pharm Biomed Anal 2007;45:164-70). 요약하면, 홍삼 가루 500 g 을 이용하여 50 ml의 70% 에탄올로 60분 동안 3회 초음파 추출하였다. 여과 후, 용매는 제거하였고, 잔사는 물에서 용해시켰다. 수용성 용액은 Sep-Pak®Vac C₁₈ 컬럼을 이용하여 극성 물질을 제거하였다. 용리 용매인 에탄올은 제거되었고, 잔사는 물에 용해시킨 후, 동결 건조시켜, 인삼 추출물 10 g을 수득하였다.

실시예 2. 프로토파낙사트리올계 및 프로토파낙사디올계 분획물의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 홍삼 추출물 3 g을 20ml의 물에 용해시켰다. 그런 후, 1g의 NaOH를 첨가하였고, 부탄올 20ml씩 으로 4회 추출하였다. 부탄올 층은 프로토파낙사트라이올(triols)을 포함한다. 수층은 2N HCl로 중화시켰고, 프로토파낙사디올(diols)을 얻기 위해, 부탄올 20ml씩 으로 3회 추출하였다. 프로토파낙사트 라이올(triols) 또는 프로토파낙사디올(diols)을 포함하는 부탄올 분획물은 농축후 물로 치환하여 동결 건조하여 냉장고에 보관하였다.

실시예 3. 저극성 진세노사이드의 제조

저극성 진세노사이드를 분리하기 위해 문헌에 기재된 방법으로 하기와 같이 제조하였다 (Ha YW, Lim SS, Ha IJ, Na YC, Seo JJ, Shin H, et al. Preparative isolation of four ginsenosides from Korean red ginseng (steam-treated Panax ginseng C. A. Meyer), by high-speed counter-current chromatography coupled with evaporative light scattering detection. J Chromatogr A, 1151, pp 37-44, 2007). 홍삼 농축 과정은 열 및 고압에서 3회 추출하였고, 역상 C₁₈ 오픈 컬럼(open column) (50 cm x 3 cm, 250 ml volume)을 걸었고, 물에 녹인 후, 30% 및 90% 에탄올에 순차적으로 용해시켰다. 저극성 진세노사이드를 포함하는 90% 에탄올 분획물은 증발시켰고, 동결 건조하였다. 제조된 홍삼 추출물, 프로토파낙사트리올(triols), 프로토파낙사디올(diols) 및 저극성 진세노사이드는 HPLC를 이용하여 분석하였고, 이를 하기 실험예의 시료로 사용하였다.

실험예 1. 인삼 추출물의 시험관 내 소화(in vitro digestion) 및 HPLC 분석

상기 실시예 1의 100 mg의 분말 홍삼 추출물은 37℃에서 2시간 동안 10ml의 인공 위액(37mM NaCl, 0.03 M HCl, 3.2 mg/ml pepsin, pH 1.6)을 첨가하여 교반 배 양기에서 배양시켰다. 배양 후, 산도는 0.5 ml의 2.2 M NaOH를 첨가하여 중화시켰다. 그런 후, 10ml의 인공 장액(30 mM K₂HPO₄, 160 mM NaH₂PO₄, 20 mg/ml pancreatin)을 첨가하였고, 0.6 M NaOH and 0.2 M HCl를 이용하여 pH를 7.4로 맞추었다. 혼합물은 37℃의 배양기에서 2시간 이상 교반하였고, 3000 x g에서 30 분 동안 4℃로 원심분리하였고, 여과하였다. 5ml의 여과액을 단백질 및 이온과 같은 극성 물질을 제거하기 위해, Sep-Pak®Vac C₁₈ 컬럼 (Waters, Milford, MA)을 수행하였다. 분석한 시료는 30ml의 물로 씻어낸 후, 15 ml의 메탄올로 용해시켰다. 메탄올은 제거하였고, 잔사는 물에 녹였으며, 동결 건조시켰다. 분말 상태의 인삼 추출물은 메탄올에 용해시켰고, 각각의 진세노이드 함량은 HPLC 분석법을 통해 측정하였다.

홍삼 추출물은 인간 소화 과정과 유사하게 실행하기 위해 인공 위액 및 인공 장액을 순차적으로 배양하였다. 처음에는, 진세노사이드의 안정성을 4시간 동안 37℃의 물에서 측정하였고, 진세노사이드의 구성성분의 현저한 변화는 관찰되지 않았다. 인공적으로 소화된 인삼 추출물로부터 분리된 진세노사이드 각각의 함량은 도 3에 나타내었다(도 3 참조).

실험결과, 도 3에서 나타나는 바와 같이, 시험관 내 소화 후의 각각의 함량은 현저한 변화를 나타내었음을 확인할 수 있었다. 진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, Rb3 및 Rd와 같은 극성 진세노사이드의 함량은 감소된 반면에, 진세노사이드 Rh1, Rg2, Rg3, Rk1 및 Rg5와 같은 저극성 진세노사이드는 증가하였다. 상기 와 같이, 구성성분의 변화는 위액에 의해서 주로 발생되어졌다. 홍삼 추출물이 효소가 없는 인공 소화액과 배양되어졌을 때의 결과는 도 3에서와 다르지 않았다. 이러한 결과로부터, 구강 투여된 진세노사이드는 위산의 저 pH에 의해 저극성 진세노사이드로 변형되어짐을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 3T3-L1 분화 비만세포에서의 진세노사이드의 지질 축적 감소 효과 측정

2-1. 세포 배양

마우스 3T3-L1의 섬유아세포는 ATCC로부터 배양되었고, 비만세포에서 분화된 것을 얻었다. 섬유아세포는 10% FBS, 37℃, 5% CO₂ 의 조건인 DMEM에서 배양하였다. 합류 후, 섬유아세포는 2일 동안 유지시켰다. 분화는 0.5 mM IBMX, 1 ㎛ DEX, 5 ㎍/ml 인슐린을 포함하는 DMEM을 처리함으로써 유도하였고, 10% FBS로 2일 동안 처리하였다. 배양 2일 후, 배지는 5 ㎍/ml 인슐린을 포함하는 10% FBS가 함유된 DMEM 으로 2일 동안 배양하였다 (2일째부터 4일째까지). 그런 후, 배지는 성장 배양액으로 교체되었고, 2일 마다 교체해주었다 (4일째부터 8일째까지). 준비한 홍삼 추출물 및 이의 소화액은 분화 기간(0일째부터 6일째)의 다양한 농도에서 배양액을 처리하였다. 트리올, 디올, 저극성 진세노사이드 분획물, 진세노사이드 Rg3, Rk1, 및 Rg5는 또한 분화된 비만세포에 처리하여 지질 축적에서의 진세노이드 효과를 측정하였다. 비만세포에서의 지질 함량은 Oil red O 염색법을 이용하여 측정하였다. 8일째의 분화된 세포는 PBS로 2회 씻어냈고, 10% 포름알데히드가 함유된 PBS로 1시 간 동안 고정시켰다. 그런 후, 세포는 DW로 2회 씻었고, 여과된 0.5% Oil Red O 용액(in 60% isopropanol)으로 2시간 동안 상온에서 염색하였다. 그 후에, 세포는 60% 이소프로판올로 씻었고, 촬영해두었다. Oil Red O로 염색된 시료는 용리 용액(4% NP-40 in isopropanol, v/v)으로 용해시켰고, 광학 흡광도 490nm에서 측정하여 정량하였다.

2-2. 실험결과

마우스 3T3-L1 섬유아세포는 비만세포로 분화되었다. 분화 상태는 분화 인자의 농도 변화에 의해 최적화되었다.

인삼 시료는 비만에서의 진세노사이드 효과를 측정하게 위해 3T3-L1 섬유아세포로 처리하였다. 다양한 시료는 10, 50, 및 100 ㎍/ml, 뿐만 아니라 10, 50, and 100 μM 농도에서도 준비되었고, 이들은 분화 기간동안 세포에 처리하였고(0일째부터 6일째), 그 결과는 도 4에 나타내었다(도 4 참조).

실험결과, 도 4(A) 내지 (C)에서 나타나는 바와 같이, Rg3, Rk1 및 Rg5 저극성 진세노사이드의 함량이 많은 시료가 지질 축적 감소에 효과적임을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터, 진세노사이드 Rg3, Rk1, 및 Rg5는 효과적인 물질임을 알 수 있고, 그러므로 이의 활성을 확인하기 위해, 3T3-L1 세포에 처리하였다. 도 4에서 나타나는 바와 같이, 진세노사이드 Rg3 및 Rk1, 특히 진세노사이드 Rg3는 용량-의존적으로 지질 축적을 감소함을 알 수 있었다.

실험예 3. 세포독성

3T3-L1 섬유아세포는 성장 배지에서 2일 동안 배양하였다. 그런 후, 새로운 배양 배지를 공급하였고, 다양한 농도의 진세노사이드 시료를 이용하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, CCK-8 용액을 각각의 웰에 첨가하였고, 2시간 동안 배양한 후, 마이크로플레이트 리더기(Molecular Divices, Emax, CA, USA)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 세포독성 분석에서는 다양한 농도에서 어떠한 시료도 3T3-L1 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 통계분석

측정값은 평균값 ±표준 편차(S.D.)로 나타내었다. Bonferron’s test를 갖는 분산 분석(ANOVA)법은 데이터의 배수 비교의 통계학적 분석으로 이용되어왔다. 0.05 이하의 P-측정값은 통계학적으로 유의하게 나타났다.

하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

인삼 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

저극성 진세노사이드 Rg3 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

인삼 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

저극성 진세노사이드 Rk1 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

인삼 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

도 1은 파낙스 속 인삼의 주요 진세노사이드의 구조를 나타낸 도이고, Glc: glucose, Rha: rhamnose, Ara: arabinose, Xyl: xylose

도 2는 홍삼 추출물(A), 프로토파낙시트리올 (B), 프로토파낙시디올 (C) 및 저극성 진세노사이드 분획물(D)의 크로마토그램을 나타낸 도이며, 1: Rg1, 2: Re, 3: Rf, 4: Rh1, 5: Rg2, 6: Rb1, 7: Rc, 8: Rb2, 9: Rb3, 10: Rd, 11: Rg3, 12: Rk1, 13: Rg5, 14: Rh2, IS: internal standard (digoxin).

도 3은 진세노사이드 함량의 변화를 나타낸 도이고, C: 배양 전(control), 1: 인공 위액으로만 배양, 2: 인공 위액 및 인공 장액으로 순차적으로 배양. 극성 진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, Rb3 및 Rd의 함량은 감소하였고, 반면에, 저극성 진세노사이드 Rh1, Rg2, Rg3, Rk1 및 Rg5의 함량은 증가하였다.

도 4는 지방 축적에서의 저극성 진세노사이드의 감소 효과를 나타낸 도이다. (A) 홍삼 추출물 및 이의 분해, (B) 프로토파낙시트리올, 프로토파낙시디올 및 저극성 진세노사이드 분획물, (C) 진세노사이드 Rg3, Rk1, 및 Rg5

Claims (8)

1. 인삼을 20-40 v/v%의 메탄올 또는 에탄올과, 80 내지 99 v/v%의 메탄올 또는 에탄올로 순차적으로 추출하는 추출 단계; 및

   상기 추출물을 pH 1.3 내지 2의 인공 위액에서 배양한 후, 인공 장액을 첨가하고 pH를 7 내지 8로 맞추어 배양하는 배양 단계

   를 포함하는 인삼 추출물의 제조 방법.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서,

   상기 인삼은 홍삼, 수삼, 건삼, 장뇌삼 및 산삼으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인 제조 방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

Images