상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 물, 알코올, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 헛개나무속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 헛개나무속 식물의 물, 알코올 또는 이들의 혼합물의 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름 및 부탄올 순으로 추출하여 각 단계에서 얻은 분획물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 물, 에탄올, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 헛개나무속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 헛개나무속 식물의 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물의 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름 및 부탄올 순으로 추출하여 각 단계에서 얻은 분획물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 유효성분인 헛개나무속 식물 추출물은 하기의 단계로 이루어진 제조방법에 의해 제조된다.
1) 건조한 헛개나무속 식물을 물, 알코올, 유기용매 또는 이들의 혼합물에 침지시켜 반복 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 감압농축하는 단계; 및
3) 단계 2)의 감압농축액을 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계,
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 헛개나무속 식물은 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg), 코리아나 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai), 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 및 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하며, 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 헛개나무속 식물은 이의 씨 또는 열매가 사용되는 것을 특징으로 한다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 알코올은 C1 내지 C4 저급 알코올을 이 용하는 것을 특징으로 하며, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 한다. 상기 에탄올은 그 농도가 50 %인 것이 바람직하며, 메탄올은 농도가 100 %인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 메탄올인 경우는 상온에서 추출하는 것이 바람직하며, 50 % 에탄올 및 열수 추출인 경우는 70 내지 80 ℃에서 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 증류수, 에탄올, 메탄올을 각각 건조된 헛개나무 열매 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 아울러 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하고, 2회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 유기용매는 핵산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름 및 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 감압농축과 단계 3)의 건조과정은 당업계에서 사용되는 통상의 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 유효성분인 헛개나무속 식물 추출물의 분획물은 하기의 단계로 이루어진 제조방법에 의해 제조된다.
1) 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 이용하여 건조한 헛개나무속 식물의 추출물을 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 유기용매로 용해시키는 단계;
3) 단계 2)의 용해물을 분리하여 분획물을 수득하는 단계;
4) 단계 3)의 분획물을 감압농축하는 단계; 및
5) 단계 4)의 감압농축액을 건조시켜 건조분말을 수득하는 단계,
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 헛개나무속 식물의 추출물은 상기 기재된 추출물 방법에 따라 제조가 가능하다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 유기용매는 핵산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름 및 부탄올 순으로 가하는 것이 바람직하다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 3)의 분획물은 분별깔대기를 이용하여 분획하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 각 유기용매 층의 분획물을 모두 이용할 수 있으며, 부탄올 층의 분획물을 이용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 헛개나무속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 실험예에서는 헛개나무 열매 추출물을 이용하여 B형 간염 바이러스 e 항원 및 s 항원 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 낮은 농도로 처리하여도 e 항원 및 s 항원의 활성을 감소시킴을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조). 또한 상기 헛개나무 열매의 메탄올 추출물이 간세포 표면에 있는 수용체(receptor)와 B형 간염 바이러스가 부착하는 것을 방해하는지를 알아보기 위하여 조사한 결과, 낮은 농도로 처리하여도 수용체와 B형 간염 바이러스의 결합을 감소시킴을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 헛개나무속 식물의 추출물 의 부탄올 분획을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 실험예에서는 상기 제조된 헛개나무속 식물 열매의 메탄올 추출물을 대상으로 핵산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름 및 부탄올 순으로 용매를 가하여 수득한 부탄올 분획을 이용하여 B형 간염 바이러스의 e 항원의 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, B형 간염바이러스의 e 항원의 활성을 감소시켰으며, 또한 상기 헛개나무 열매의 메탄올 추출물의 부탄올 분획이 간세포 표면에 있는 수용체(receptor)와 B형 간염 바이러스가 부착하는 것을 방해하는지를 알아보기 위하여 조사한 결과, 수용체와 B형 간염 바이러스의 결합을 감소시킴을 확인하였다(도 4 및 도 6 참조).
본 발명의 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물은 헛개나무속 식물 추출물 또는 이의 분획물을 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 헛개나무속 식물의 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 약학적 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1~6회 투여될 수 있다.
본 발명의 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단된다. 본 발명의 간염 예방 및 치료용 약학적 조성물은 B형 간염의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 헛개나무속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 헛개나무속 식물 추출물의 분획물을 유효성분으로 함유하는 B형 간염 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 헛개나무속 식물 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 헛개나무속 식물의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 헛개나무속 식물의 추출물은 열수 및 에탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하며, 상기 에탄올의 농도는 50%인 것이 바람직하다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약학적 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 헛개나무속 식물 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 약학적 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01~0.04 g, 바람직하게는 약 0.02~0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 헛개나무속 식물의 추출물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 헛개나무속 식물의 추출물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
헛개나무(
Hovenia dulcis Thunberg
)의
물을 이용한 추출물 제조
건조된 10 Kg의 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg) 열매에 70~80 ℃인 증류수 25ℓ를 가한 후 2회 반복 추출한 후 회전 감압농축기로 추출액을 농축, 건조시켜 건조 분말 652 g을 수득하였다.
<
실시예
2>
헛개나무(
Hovenia dulcis Thunberg
)의
50 % 에탄올을 이용한 추출물 제조
건조된 10 Kg의 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg) 열매에 70~80 ℃인 50 % 에탄올 25ℓ를 가한 후 2회 반복 추출한 후 회전 감압농축기로 추출액을 농축, 건조시켜 건조 분말 635 g을 수득하였다.
<
실시예
3>
헛개나무(
Hovenia dulcis Thunberg
)의
100 % 메탄올을 이용한 추출물 제조
건조된 10 Kg의 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg) 열매에 상온의 100 % 메탄 올 25ℓ를 가한 후 2회 반복 추출한 후 회전 감압농축기로 추출액을 농축, 건조시켜 건조 분말 600 g을 수득하였다.
<
실시예
4> 코리아나 나카이(
Hovenia
dulcis
var
Koreana
Nakai
)의 50 % 에탄올을 이용한 추출물 제조
건조된 10 Kg의 코리아나 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai) 열매에 70~80 ℃인 50 % 에탄올 25ℓ를 가한 후 2회 반복 추출한 후 회전 감압농축기로 추출액을 농축, 건조시켜 건조 분말 605 g을 수득하였다.
<
실시예
5>
라티폴리아
나카이(
Hovenia
dulcis
var
Latifolia
Nakai
)의 50 % 에탄올을 이용한 추출물 제조
건조된 10 Kg의 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 열매에 70~80 ℃인 50 % 에탄올 25ℓ를 가한 후 2회 반복 추출한 후 회전 감압농축기로 추출액을 농축, 건조시켜 건조 분말 600 g을 수득하였다.
<
실시예
6>
토멘텔라
마키노(
Hovenia
dulcis
var
tomentella
Makino
)의 50 % 에탄올을 이용한 추출물 제조
건조된 10 Kg의 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino) 열매에 70~80 ℃인 50 % 에탄올 25ℓ를 가한 후 2회 반복 추출한 후 회전 감압농축기로 추출액을 농축, 건조시켜 건조 분말 610 g을 수득하였다.
<
실시예
7> 헛개나무(
Hovenia dulcis Thunberg
)의
메탄올 추출물의
분획물
제조
실시예 3에서 수득한 메탄올 추출물 600 g을 차례로 핵산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름을 가하여 용해되는 분획물을 얻은 후, 나머지에 부탄올을 가하여 용해되는 층을 취하여 회전 감압기로 압축, 농축한 후 추출액을 건조시켜 건조분말을 52 g을 수득하였다.
<
실험예
1>
헛개나무속
식물 추출물 및 이의
분획물을
효소면역 측정법으로 항 B형 간염 바이러스 활성 측정
본 발명의 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg), 코리아니 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai), 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 및 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino) 열매로부터 분리정제된 상기 추출물 및 이의 분획물의 B형 간염 바이러스에 대한 항 간염 바이러스 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 이를 B형 간염 바이러스가 자라나는 인간의 간 조직 유래의 동물세포(HepG2.2.15)에서 농도별로 헛개나무속 식물 추출물을 처리한 후, e 항원 및 s 항원 생성 억제 효과를 살펴보았다.
<1-1> 2.2.15 세포의 배양
상기 활성을 조사하기 위하여, 인간의 간조직에서 유래된 HepG2세포(human hepatoblastoma cell)에 B형 간염 바이러스 유전자가 삽입되어 있어 B형 간염 바이 러스의 s 항원(HBsAg)과 e 항원(HBeAg)을 배지로 배출하는 2.2.15. 세포주(Keui Ueda et al ., Virology 169, 213-21, 1989)를 사용하였다. 2.2.15. 세포는 지름 10 cm 페트리디쉬에 4 ㎍/ml 겐타마이신(gentamicin, Sigma, USA)과 10 %의 열처리된 우태아 혈청(Fetal bovine serum, Gibco, USA)이 첨가된 MEM 배지(Gibco, USA)를 사용하여 배양하는데, 37 ℃. 5 % C02 배양기에서 증식시켜 세포 단층이 형성되면 3 내지 4일 간격으로 트립신을 처리하여 계대하였다.
<1-2> B형 간염 바이러스 e 항원의 효소면역 측정(
HBeAg
ELISA
)
B형 간염 바이러스 e 항원의 경우 B형 간염 항원 진단용 시약(Enzygnost HBeAg monoclonal, Behring, Germany)을 이용하여 효소면역 측정법을 실시하였다. 96 웰 플레이트에 웰당 2 × 104 개의 2.2.15. 세포를 FBS가 포함되지 않은 MEM 배지 배양액 100 ㎕과 함께 첨가하고 37 ℃, 5 % C02 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후 농도별로 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg), 코리아나 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai), 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 및 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino) 열매의 추출물을 처리하였다. 추출물을 처리한 후 24 시간이 지난 다음 배양액만을 취하고 이 배양액을 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포 분리물을 제거하였다. 이때 얻은 상층 배양액만을 B형 간염 항원(HBeAg)에 대한 모노클로날 항체(HBeAb)가 도말되어 있는 진단시약 플레이트에 일정량씩 분주한 다음 37 ℃ 배양기에 1 시간 동안 방치하였 고 이 진단시약 플레이트를 인산 완충욕액으로 3회 세척하여 퍼록시다아제(peroxidase)가 표지되어 있는 B형 간염 항원과의 2차 결합이 이루어지도록 하였다. 결합되지 않은 잉여분의 항체는 인산 완충용액으로 3회 세척하여 제거하였으며 퍼옥시다아제에 의해 발색반응을 일으키는 TMB(tetramethyl benzidine dihydrochloride, TMB)기질이 포함된 용액을 100 ㎕로 분주하여 발색 반응을 유도하였다. 반응이 완료된 진단시약 플레이트는 450 nm에서의 흡광 정도를 읽어들여 e 항원(HBeAg)의 변화를 평가하였다.
그 결과 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg), 코리아나 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai), 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 및 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino) 열매 추출물은 1 ug/ml의 농도 만으로도 세포외부로 분비되는 e 항원 생성을 급격히 저하시켰으며, 분획물은 항 B형 간염 바이러스 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 2 참조).
본 발명자들은 HepG2.2.2.15 세포에서 e 항원 생성을 50 % 방해하는 약물 농도(IC50)를 결정하여 표 1에 나타내었다.
구분 |
IC50(㎍/㎖) |
실시예 1 |
2.4 |
실시예 2 |
2.6 |
실시예 3 |
2.2 |
실시예 4 |
3.2 |
실시예 5 |
3.0 |
실시예 6 |
3.4 |
실시예 7 |
2.4 |
또한, 상기 실시예 3의 추출물을 헥산, 에틸 아세테이트산, 클로로포름 및 부탄올 순으로 추출하여 얻은 각 용매별 분획물을 상기와 같은 방법으로 B형 간염 바이러스 e항원에 대한 효소 면역 측정법을 실시하였다.
각 용매별 분획물이 모두 억제효과가 있음을 확인하였으며, 이들 분획물들 중 부탄올 분획물이 가장 높은 억제효과가 있음을 확인하였다.
그 결과 부탄올 분획물은 2 ug/ml의 농도 만으로도 세포외부로 분비되는 e 항원 생성을 급격히 저하시킴으로써 항 B형 간염 바이러스 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 4 참조).
<1-3> B형 간염 바이러스 s 항원의 효소 면역 측정(
HBsAg
ELISA
)
B형 간염 바이러스 s 항원의 경우, e 항원(HBeAg)의 효소 면역 측정법과 같은 원리의 샌드위치 방법으로 효소 면역 측정법을 실시하였다.
그 결과 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg), 코리아나 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai), 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 및 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino) 열매 추출물은 1 ug/ml의 농도 만으로도 세포외부로 분비되는 s 항원 생성을 급격히 저하시킴으로써 항 B형 간염 바이러스 활성을 나타냄을 알 수 있었다(도 3 참조).
본 발명자들은 HepG2.2.2.15 세포에서 s 항원 생성을 50 % 방해하는 약물 농도(IC50)를 결정하여 표 2에 나타내었다.
구분 |
IC50(㎍/㎖) |
실시예 1 |
2.4 |
실시예 2 |
2.4 |
실시예 3 |
2.2 |
실시예 4 |
3.0 |
실시예 5 |
2.8 |
실시예 6 |
3.2 |
실시예 7 |
2.2 |
<
실험예
2> B형 간염 바이러스 수용체 함유 세포주 이용 B형 간염 바이러스
수용 체
결합 억제 분석(
receptor
-
binding
inhibition
assay
)
헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg) 열매의 메탄올 추출물과 이의 분획물이 간세포 표면에 있는 수용체(receptor)에 B형 간염 바이러스가 부착하는 것을 방해하는지를 알아보기 위하여 수용체(receptor)를 가지고 있는 세포주 HepG2(human hepatoblastoma cell line)세포와 수용체(receptor)를 가지고 있지 않은 세포주 U937(human histiocytic lymphoma cell line)를 이용하여 수용체 결합 분석(receptor binding assay)을 실시하였다.
HepG2, U937의 원형질막(plasma membrane)을 분리하여 50 ㎍/ml 농도로 플레이트에 코팅(coating)하였다. 밤새 코팅한 뒤 플레이트를 0.05 %가 함유된 PBS로 다섯 번 세척하였다. 그리고 10 % BSA 가 들어있는 PBS를 200 ㎕ 씩 플레이트에 채워 실온에서 6 시간 동안 블로킹(blocking) 시킨 다음 PBST로 다섯 번 세척하여 플레이트를 준비해두었다. 합성해둔 바이오틴-preS1 21-47 펩티드를 100 ㎍/ml되게 플레이트에 넣고, 농도별로 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg) 열매의 메탄올 추출물과 이의 분획물을 처리해서 밤새 4 ℃에서 반응시키고, 다음날 아침 플레이트를 PBS-Tween(PBS-T)로 4회 세척하고 바이오틴-preS1 펩티드를 50 ㎕씩 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 1 시간 뒤 플레이트를 PBST로 4회 세척하고 스트렙트아비딘-HRP를 100 ㎕씩 넣고 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 30분 뒤 플레이트를 PBS-T로 4회 세척하고 TMB 작업용액(working solutio n) 72 ㎕씩 넣고 10-30분간 반응시킨 뒤, 75 ㎕의 고정용액(stop solution)을 넣고 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, HepG2 세포는 급격히 감소 되었으며, U937 세포는 감소 되지 않음을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6 참조).
<
실험예
3>
헛개나무속
식물 추출물의 세포 독성 검사
상기한 실시예로부터 분리된 헛개나무(Hovenia dulcis Thunberg), 코리아니 나카이(Hovenia dulcis var Koreana Nakai), 라티폴리아 나카이(Hovenia dulcis var Latifolia Nakai) 및 토멘텔라 마키노(Hovenia dulcis var tomentella Makino) 열매 추출물의 활성을 검증하여 세포내 미치는 독성을 확인하기 위하여 공지의 방법(Korba, B, E, et al ., 19, 55-70, 1992)을 이용하여 세포 독성을 하기와 같이 조사하였다.
24-웰 플레이트에 웰당 2 X 104개의 세포를 100 ㎕ 부피로 첨가하고 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양한 다음 여러 농도의 헛개나무속 식물의 열매 추출물을 3일 동안 세포주에 처리하였다. 배양액을 제거하고 20 ㎕의 염색 용액[테트라졸리움 화합물(tetrazolium compound), 염(inner salt) 및 페나진에톨설페이트(phenazine etho sulfate)]을 분주하고 1 시간 동안 배양기에서 반응시켰다. 이후 인산 완충용액으로 2회 세척하여 여분의 염색 용액을 제거하고 20 ㎕의 정착용액[50% 에탄올, 1 % 차가운 아세트산(glacial acetic acid)]을 가하여 30분 동안 교반시켰다. 510 nm에서의 흡광도를 스펙트로포토메터로 측정하였으며 추출물이 첨가되지 않은 음성 대조군 세포의 흡광도와 비교하여 50 %의 흡광도 감소를 유발하는 추출물의 농도를 CC50(50 % 세포독성 농도: cytotoxic concentration)으로 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
구분 |
CC50(㎍/㎖) |
실시예 1 |
432 |
실시예 2 |
424 |
실시예 3 |
390 |
실시예 4 |
410 |
실시예 5 |
404 |
실시예 6 |
406 |
실시예 7 |
388 |
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실험예
4>
헛개나무속
식물 추출물의 경구투여 급성 독성실험
본 발명자들은 헛개나무속 식물 추출물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 헛개나무속 식물 추출물은 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 5 g/kg/15 ㎖의 용량으로 경구 투여하였다. 실험 물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 관찰하여 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.
실험 결과, 실험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다.
그 결과, 랫트에서 5 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소 치사량(LD50)은 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
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제제예
1> : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
실시예 1의 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
실시예 1의 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
실시예 2의 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 환의 제조
실시예 2의 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
5. 과립의 제조
실시예 2의 추출물 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30 % 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
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제제예
2> : 식품의 제조
본 발명의 헛개나무 열매의 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 실시예 1의 추출물을 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
2. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 실시예 1의 추출물을 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
3. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 실시예 2의 추출물을 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 실시예 2의 추출물을 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
5. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 실시예 2의 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 실시예 2의 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
실시예 2의 추출물(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
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제제예
3> : 음료의 제조
1. 건강음료의 제조
액상과당(0.5 %), 올리고당(2 %), 설탕(2 %), 식염(0.5 %), 물(75 %)과 같은 부재료와 본 발명의 실시예 1의 추출물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.
2. 야채쥬스의 제조
본 발명의 실시예 1의 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
3. 과일쥬스의 제조
본 발명의 실시예 1의 추출물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.