KR102122439B1 - 간 보호 활성을 갖는 발효홍삼농축액 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
간 보호 활성을 갖는 발효홍삼농축액 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 a) 홍삼으로부터 추출물을 준비하는 단계; b) 상기 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효하는 단계; c) 상기 발효액을 고온으로 열처리 하는 단계; 및 d) 여과하여 농축하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효한 후, 상기 발효액을 고온으로 열처리한 후 여과 및 농축하여 제조되는 홍삼발효농축액의 경우, 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가되고 간보호 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따르면, 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효한 후, 상기 발효액을 고온으로 열처리한 후 여과 및 농축하여 제조되는 홍삼발효농축액의 경우, 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가되고 간보호 활성을 나타낼 수 있다.
Description
본 발명은 간 보호 활성을 갖는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 a) 홍삼으로부터 추출물을 준비하는 단계; b) 상기 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효하는 단계; c) 상기 발효액을 고온으로 열처리 하는 단계; 및 d) 여과하여 농축하는 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액의 제조방법에 관한 것이다.
간은 인체에서 가장 중요한 장기 중의 하나로 외부에서 유입되는 독성물질을 해독시키는 중요한 역할을 담당하고 있다. 사회적인 문제로 대두 되는 만성적인 알코올의 섭취는 간세포에 산화스트레스에 의한 독성을 유발한다. 간에서 알코올의 대사 과정 중에 유도되는 cytochrome P450 2E1(CYP2E1)은 활성산소를 생성하여 산화스트레스를 야기하고, 지질과산화, 미토콘드리아 기능저하, DNA 손상을 일으킨다. 이러한 간질환은 한국인에 있어서 암, 당뇨병과 함께 가장 발생빈도가 높은 것으로 조사되고 있다.
인삼은 식물 분류학상 오가피나무과(Aralaiaceae)의 인삼 속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있으며, 과거 수천 년 전부터 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 등에서 주로 건강증진을 위한 목적으로 널리 사용하여 왔다. 최근에는 수삼을 증기로 수차례 쪄서 가공하여 인체에 유용한 미량의 진세노사이드를 함유한 홍삼의 효능이 뛰어나다고 알려져 있다. 인삼의 대표적인 유효성분인 사포닌(saponine)은 배당체(ginsenoside)라 불리는 화합물의 일종이다. 인삼을 물과 에탄올로 추출한 인삼추출물의 주요 효능을 나타내는 사포닌은 30 종류 이상의 진세노사이드로 구성된다. 진세노사이드는 홍삼추출물의 주요성분으로 면역력강화, 항염증작용, 항알러지작용, 항암효과, 혈압강하작용, 항콜레스테롤작용, 항혈전작용, 성인병 및 노화에 대한 예방 및 치료효과가 있음이 보고되어 있다.
체내에 섭취된 사포닌은 장내에 있는 미생물에 의해 분해되어 체내로 흡수된다[Panta Med. 62, pp453-457, 1996]. 진세노사이드 Rg3의 경우, 장내 미생물에 의해 진세노사이드 Rb1, Rd, Rg3로 순차적으로 전환된다. 인삼의 사포닌을 분해하는 장내 미생물은 사람의 체질에 따라, 식습관에 따라 그 존재의 유무와 보유하고 있는 정도가 다르며, 대사산물로 전환하는데 차이가 있으므로 인삼을 복용 후 효능이 나타나는 데에 차이가 나타날 수 있다. 또한 장내 미생물 균총이 사람마다 다르기 때문에 진세노사이드의 전환율과 생체이용률은 다를 수밖에 없다[J. Pharm. Pharmacol., 50, pp1155-1160, 1998]. 따라서 장내 미생물의 차이로 인한 효능과 흡수율의 차이를 없애기 위해, 미생물을 이용한 인삼추출물의 유산균 발효물을 이용하는 것은 개인차를 극복하고 체내 흡수율을 증대시키는 효과가 있다. 수많은 연구자들이 전환율을 높이기 위한 연구를 진행해 왔다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효한 후, 상기 발효액을 고온으로 열처리한 후 여과 및 농축하여 제조되는 홍삼발효농축액의 경우, 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가 되고 간 보호 활성을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가 되고 간 보호 활성을 갖는 발효홍삼농축액의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼농축액을 포함하는 간 보호 활성 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼농축액을 포함하는 건강기능식품을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법을 제공한다:
a) 홍삼으로부터 추출물을 준비하는 단계;
b) 상기 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효하는 단계;
c) 상기 발효액을 고온으로 열처리하는 단계; 및
d) 여과하여 농축하는 단계
본 발명에서, 상기 용어 “발효홍삼농축액”은 홍삼추출물에 미생물, 특히 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하고, 배양하여 얻어진 생성물을 일컫는다. 또한, “진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된”이란 진세노사이드 Rg3의 함량이 발효 및 열처리 과정을 거치지 않은 홍삼추출물에 비해 증가 된다는 것을 의미한다.
인삼추출물의 주요 효능을 나타내는 사포닌은 30 종류 이상의 진세노사이드로 구성되어 있는데, 이 진세노사이드는 홍삼추출물의 주요성분이다. 체내에 섭취된 사포닌은 장내에 있는 미생물에 의해 분해되어 체내로 흡수되며, 진세노사이드 Rg3의 경우에는 장내 미생물에 의해 진세노사이드 Rb1, Rd, Rg3로 순차적으로 전환된다. 사포닌을 분해하는 장내 미생물은 사람의 채질 및 식습관에 따라 그 존재의 유무와 보유하고 있는 정도가 다르기 때문에 인삼을 복용 후 효능을 나타내는 데에 차이가 있을 수 있다.
따라서 본 발명자들은 장내 미생물의 차이로 인한 효능과 흡수율의 차이를 없애기 위해 발효홍삼농축액을 제조한 결과, 발효하지 않은 홍삼추출물보다 높은 진세노사이드 Rg3의 함량을 갖고 간 보호 활성에 효과가 있다는 점을 발명하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계는 홍삼을 60 ~ 80% 주정으로 추출하여 농축하는 단계 및 추출물을 10 ~ 30%로 희석한 후 90 ~ 120℃로 살균한 다음 35 ~ 40℃로 냉각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 발효홍삼농축액 제조 시, 고형분 60%의 홍삼추출물을 20%로 희석하는데 이는 홍삼추출물이 걸쭉한 상태에서는 유산균이 자라기 힘들기 때문에 홍삼추출물을 10 ~ 30%로 희석하여 사용한다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 상기 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액을 첨가한 후 35 ~ 40℃에서 24 ~ 48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 유산균의 배양 온도에서 벗어나게 되면 균의 증식이 어렵다. 또한, 균을 48시간이상 배양하면 균이 자가 분열하여 죽게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillu plantarum) 배양액은 엠알에스 배지(MRS medium)에 접종 후 진탕 배양기에서 배양 후 홍삼추출액에 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액은 홍삼추출액 대비 2 ~ 10%(v/v) 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기 균의 접종량이 적으면 균이 증식을 못하고 죽어서 발효가 이루어지지 않고, 균이 너무 많으면 growth curve에서 정점에 도달하는 시점이 빨리 오게 된다. 미생물에 의한 대사과정에 의해 배당체(ginsenoside)의 전환이 이루어지는 것인데 초기 균수가 많아서 균만 많이 자라면 배양 종료시점을 정하기가 어렵고, 대사과정이 미흡하고, 유산을 다량 제조해서 신맛이 많이 날 수가 있다.
본 발명에 있어서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양시에 무통기 배양으로 교반속도는 20 ~ 100rpm으로 교반하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 c)단계는 100 ~ 150℃에서 1 ~ 5시간 동안 열처리 하는 것을 특징으로 한다.
상기와 같이 고온에서 열처리를 하면 진세노사이드 Rg3의 전구체인 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rd의 함량이 0.1mg/g 이하로 떨어지고, 진세노사이드 Rg3가 10mg/g 이상으로 전환된다. 본 발명의 실험예에 따르면, 도 4에서 나타나는 바와 같이 발효를 하지 않은 홍삼추출물(비교예 1)의 경우, 진세노사이드 Rg3의 함량이 0.5mg/g으로 미량 존재하지만 본원발명의 발효홍삼농축액(실시예 1)의 경우, 진세노사이드 Rb1가 진세노사이드 Rg3로 전환되면서 함량이 증가 되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 1과 열처리의 온도 및 시간을 다르게 하여 열처리한 실시예 2의 경우, 열처리를 하지 않았을 때 보다(비교예 1) 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가 되지만 실시예 1보다는 적게 증가 되는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 발효홍삼농축액이 홍삼추출물보다 고함량의 진세노사이드 Rg3를 함유한다는 것을 알 수 있다(시험예 1).
본 발명에 있어서, 상기 발효홍삼농축액은 전세노사이드 Rg3 함량이 10mg/g 이상, 바람직하게는 10 ~ 30mg/g 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 홍삼추출물(비교예 1)보다 발효홍삼농축액(실험예 1)이 고함량의 진세노사이드 Rg3를 함유한다는 것을 알 수 있으며 이러한 결과로 볼 때, 본원발명 홍삼발효농축액이 더 뛰어난 효능을 가질 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 제 1항에의 제조방법에 의해 제조된 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 포함하는 간 보호 활성 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 발효홍삼농축액은 에탄올에 대한 간 보호 활성, 아세트알데하이드(acetaldehyed)에 대한 간 보호 활성 및 비알코올성 지방간에 대한 간 보호 활성을 나타내는 특징으로 한다.
에탄올은 간에서 분해되면서 함께 만들어지는 활성산소가 간 손상의 원인으로 작용한고 Acetaldehyde는 알코올 대사산물이며, 반응성이 커서 단백질, DNA 등에 결합능력이 뛰어나서 세포기능을 저하시키는 물질이며 지방산은 비알콜올성 지방간을 야기하여 간에 독성을 일으키는 원인 물질이다.
본 발명의 실험예에 따르면, HepG2 cell(간암유래의 세포)에서 알코올성 산화적 스트레스에 대한 간 보호 활성을 확인한 결과, 홍삼추출물(비교예 1)의 경우 에탄올 처리군과 비슷한 세포생존률을 보이거나 세포독성을 나타내었으나, 발효홍삼농축액(실시예 1)의 경우 모든 농도에서 100% 이상의 세포생존률을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 본원발명의 발효홍삼농축액이 알코올성 산화적 스트레스에 대한 간 보호 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있다(시험예 2 및 도 1).
또한, HepG2 cell(간암유래의 세포)세포에서 아세트알데하이드(acetaldehyde)의 세포독성에 대한 간 보호 효과를 확인한 결과, 홍삼추출물(비교예 1)의 경우 아세트알데하이드 처리군과 비슷한 세포생존률로 개선효과를 확인하기 어려웠으나, 본원발명의 발효홍삼농축액(실시예 1)의 경우 모든 농도에서 아세트알데하이드 처리군보다 30 ~ 50% 세포생존률을 나타내었다. 이러한 결과로 볼 때, 본원발명의 발효홍삼농축액이 아세트알데하이드의 세포독성에 대한 간 보호 효과를 나타낸 다는 것을 알 수 있다(시험예 3 및 도 2).
더욱이, HepG2 cell(간암유래의 세포)세포에서 비알코올성 지방간에 대한 간 보호 활성을 확인한 결과, 홍삼추출물(비교예 1)의 경우 지방축척 억제효과를 확인할 수 없었지만, 본원발명의 발효홍삼농축액(실시예 1)의 경우, 농도의존적으로 지방축척을 억제하였으며 이러한 결과로 볼 때, 본원발명의 발효홍삼농축액이 비알코올성 지방간에 대한 간 보호 활성을 타나낸 다는 것을 알 수 있다(시험예 4 및 도 3).
본 발명의 홍삼발효농축액은 그 사용 목적 및 용도에 따라 분말화, 과립화, 정제화 또는 액상화하여 제조될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다. 또한, 홍삼발효농축액 조성물의 사용량은 사용목적과 적용형태 및 적용대상물품 등에 따라 적절히 사용될 수 있으며, 예컨대 전제 조성물 기준으로 0.01 내지 50 중량부를 포함할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼추출액을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말(podwer), 환제(pill), 과립제(granules), 캡슐제(capsule), 정제(tablet), 음료(drink)중에서 선택된 어느 하나의 형태로 제형화 된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 발명의 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우에는 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 추출물 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적의하게 선택하여 배합할 수 있으며, 유효 성분은 1종 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 발효홍삼농축액의 경우, 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가되고 에탄올, 아세트알데하이드 및 지방산에 대한 간 보호 활성을 나타냄으로 건강기능식품 또는 의약 분야에서 다양하게 활용이 가능하다.
도 1은 알코올성 산화적 스트레스에 대한 간 보호 활성에 대한 도표이다.
도 2는 acetaldehyde의 세포 독성에 대한 간 보호활성에 대한 도표이다.
도 3은 비알코올성 지방간 억제활성에 대한 도표이다.
도 4는 진세노사이드 분석 차트이다.
도 2는 acetaldehyde의 세포 독성에 대한 간 보호활성에 대한 도표이다.
도 3은 비알코올성 지방간 억제활성에 대한 도표이다.
도 4는 진세노사이드 분석 차트이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
본 발명에서 발효홍삼농축액은 홍삼추출물을 발효시켜서 진세노사이드 Rb1, Rb3, Rd가 단계적으로 전환과정을 거쳐서 진세노사이드 Rg3의 함량이 높인 것을 의미한다. 보다 구체적으로는 진세노사이드의 Rg3 함량이 10mg/g 이상 일 수 있다. 또한, 간 보호 활성에 대한 시험은 진세노사이드 Rg3의 함량이 가장 높은 실시예 1로 시험하였다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.
비교예
1 : 홍삼추출물 제조
풍기인삼협동조합으로부터 구입한 홍삼 1kg에 70% 주정 10L를 첨가하여 80℃에서 8시간 환류추출 하였다. 추출액을 여과하여 고형분 60%로 농축하여 427g을 제조하였다.
실시예
1 :
발효홍삼농축액의
제조
비교예 1에서 제조한 방법과 동일하게 제조된 홍삼추출물 200g에 상수 400ml을 첨가하여 고형분 20%로 희석한 후 100℃에서 30분간 살균하였다. 37℃로 냉각한 후에 MRS 배지에 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum, KCCM11019P)을 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 30ml를 첨가하여 50rpm으로 36시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 121℃에서 2시간 동안 열처리 한 후 50℃로 냉각하여 여과하였다. 고형분 60%로 농축하여 발효홍삼농축액 171g을 제조하였다.
실시예
2 :
발효홍삼농축액의
제조
비교예 1에서 제조한 방법과 동일하게 제조된 홍삼추출물 200g에 상수 400ml을 첨가하여 고형분 20%로 희석한 후 100℃에서 30분간 살균하였다. 37℃로 냉각한 후에 MRS 배지에 락토바실러스 플란타룸(lactobacillus plantarum, KCCM11019P)을 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 30ml를 첨가하여 50rpm으로 36시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 100℃에서 30분 동안 열처리 한 후 50℃로 냉각하여 여과하였다. 고형분 60%로 농축하여 발효홍삼농축액 175g을 제조하였다.
시험예
1 :
고성능액체크로마토그래피를
이용한 추출물의
진세노사이드
분석
상기 비교예 1과 실시예 1, 2에서 제조한 홍삼추출물 및 발효홍삼농축액에 함유된 진세노사이드 성분의 함량을 측정하기 위해, 고성능액체크로마토그래피(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC, Waters)를 이용하였다. 진세노사이드의 함량 측정을 위한 실험과정은 하기에 자세히 나타내었다.
먼저, 비교예 1의 홍삼추출물 및 실시예 1, 2의 발효홍삼농축액을 각각 1g을 50 mL의 매스플라스크에 정량하여 넣은 후, 이온수로 용해하였다. 상기용해액을 활성화시킨 C18 카트리지(Sep-Pak Plus, WAT020515, Waters, USA)에 통과시켜 물과 30%(v/v) 메탄올로 세척한 후, 메탄올 20 mL로 용리한 다음 60℃이하에서 감압농축하고 메탄올 2mL로 용해하여 분석 시 사용하였다. 표준으로는 진세노사이드 Rb1, Rg3-S, Rg3-R를 각각 1mg/ml의 농도로 메탄올에 녹여 스톡(stock) 용액으로 하여 1.0, 0.1, 0.01mg/ml의 검액을 제조하여 검량선용 표준용액으로 사용하여 검량선을 작성하였다. 각 추출물들의 측정 결과는 표 1에 나타내었다.
| ginsenoside Rb1 (mg/g) | ginsenoside Rg3 (mg/g) | |
| 비교예 1 | 28.9 | 0.5 |
| 실시예 1 | 0.05 | 12.5 |
| 실시예 2 | 19.2 | 3.4 |
그 결과, 표 1 및 도 4에서 나타낸 것과 같이, 실시예 2의 진세노사이드 Rg3의 함량은 약 6.8배 증가하였고, 실시예 1에서 진세노사이드 Rg3의 전구체가 되는 진세노사이드 Rb1의 함량이 98.3% 줄어들면서, 진세노사이드 Rg3의 함량은 25배 증가하였다. 이는 발효홍삼농축액 제조시 발효의 전환과 더불어 발효 후 고온에서의 열처리할 경우 진세노사이드 Rg3함량을 높이는 것을 보여주었다.
시험예
2 : 알코올성
산화적
스트레스에 대한 간 보호 활성
HepG2 cell을 24 well plate에 5×104 cells/well이 되도록 seeding하고 24시간 배양한 후, 기존의 배지를 제거하고 FBS 5%, 0.015 ug/ml의 PMA를 포함하는 배지 900㎕와 각각의 시료(비교예 1 및 실시예 1)를 상수에 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml로 희석하여 농도별로 100㎕를 첨가한 후 2시간 동안 배양한 다음 300mM의 에탄올을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 조작을 3일간 매일 1회씩 반복한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척 후 새로운 배지로 교체한 다음 50uL의 MTT solution을 첨가, 2시간 배양하였다. 배지를 제거하고 세포내 형성된 formazan crystal을 500ul의 DMSO를 첨가하여 용해시킨 후 microplate reader(BIORAD 680, BIORAD, USA)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 나타나는 바와 같이 300mM의 에탄올 처리군에서는 54.4%의 세포생존율을 나타내었고, 비교예 1에서는 0.1mg/ml에서 70.7%로 개선되었고, 1 mg/mL에서는 오히려 37.6%로 감소하였다. 즉, 저농도에서는 알코올성 간 보호 활성을 나타내었고, 고농도에서는 세포독성이 일부 발생하였다. 반면에, 본원발명의 발효농축액인 실시예 1의 경우에는 모든 농도에서 100% 이상의 세포생존율을 나타내었다. 이처럼 실시예 1의 경우 고농도에서 독성이 나타나지 않았다.
시험예
3 :
Acetaldehyde
의 세포 독성에 대한 보호효과
HepG2 cell을 24 well plate에 5×104 cells/well이 되도록 seeding하고 24시간 배양하였다. 각각의 시료를 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml로 상수에 희석하여 농도별로 100㎕를 처리하고 24시간 배양한 다음 배지를 교체한 후 4mM의 acetaldehyde를 처리하여 24시간 배양하였다. 상기 조작을 3일간 매일 1회씩 반복한 후 배지를 제거하고 PBS로 2회 세척 후 새로운 배지로 교체한 다음 50㎕의 MTT solution을 첨가, 2시간 배양하였다. 배지를 제거하고 세포내 형성된 formazan crystal을 500ul의 DMSO를 첨가하여 용해시킨 후 microplate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에서 나타나는 같이 acetaldehyded의 세포독성에 대한 간 보호효능을 측정한 결과 10mM의 acetaldehyde에 의해 세포생존율이 55.5%까지 감소하였고, 비교예 1의 경우 개선효과를 확인하기가 어려웠다. 반면의, 실시에 1의 경우 농도에 따라 30 ~ 50%의 간 보호 활성을 확인하였다.
시험예
4 : 비알코올성 지방간 억제 활성
HepG2 cell을 24 well plate에 2×104 cells/well이 되도록 seeding한 후 24시간 배양하였다. 각각의 시료를 0.1, 0.5, 1.0 mg/ml로 상수에 희석하여 농도별로 100㎕를 처리하고 24시간 배양한 다음 배지를 제거하였다. PBS로 2회 세척한 후 900㎕와 1% BSA solution에 용해시킨 3mM oleic acid를 100㎕ 첨가하여 24시간 배양하고 다음과 같이 Oil Red O(ORO) staining을 실시하였다. 각 well의 배지를 제거하고 ice PBS로 2회 세척한 후 200㎕의 10% formalin을 1시간 동안 처리하고, 증류수로 2회 세척한 후 ORO working solution 200㎕를 처리하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. ORO solution을 제거하고, 증류수로 2회 세척하여 염색되지 않은 ORO를 제거하고, 염색된 ORO는 300㎕의 isopropanol을 첨가하여 용해시킨 후 96 well plate에 100㎕씩 옮겨 microreader를 이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 control군에 대한 백분율로 나타내었다. 양성대조군으로는 oltipraz를 5ug/mL를 처리하였다.
그 결과, 도 3에서 나타나는 같이 양성대조군인 oltipraz는 5 ug/mL에서 약 20% 지방축적을 억제하였다. 비교예 1은 거의 억제효과를 확인할 수 없었지만, 실시예 1에서는 농도의존적으로 활성을 확인하였다. 실시예 1의 1 mg/mL에서 약 15%의 지방축적을 억제하였다.
Claims (12)
- 하기 단계를 포함하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법:
a) 홍삼으로부터 추출물을 준비하는 단계;
b) 상기 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 발효하는 단계;
c) 상기 발효액을 110 ~ 150℃에서 1 ~ 5시간 동안 열처리 하는 단계; 및
d) 여과하여 농축하는 단계.
- 제 1항에 있어서, 상기 a) 단계는 홍삼을 60 ~ 80% 주정으로 추출하여 농축하는 단계 및 추출물을 10 ~ 30 중량%로 희석한 후 90 ~ 120℃로 살균한 다음 35 ~ 40℃로 냉각하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 b) 단계는 상기 홍삼추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액을 첨가한 후 35 ~ 40℃에서 24 ~ 48시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액은 엠알에스 배지(MRS medium)에 접종 후 진탕 배양기에서 배양 후 홍삼추출액에 첨가하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양액은 홍삼추출액 대비 2 ~ 10%(v/v) 첨가하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법.
- 제 3항에 있어서, 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 배양시에 무통기 배양으로 교반속도는 20 ~ 100rpm으로 교반하는 것을 특징으로 하는 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 제조하는 방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 발효홍삼농축액은 전세노사이드 Rg3 함량이 10 ~ 30mg/g 함유하는 것을 특징으로 하는 발효홍삼 농축액 제조방법.
- 제 1항에의 제조방법에 의해 제조된 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼농축액을 포함하는 간 보호 활성 조성물.
- 제 9항에 있어서, 상기 발효홍삼농축액은 에탄올에 대한 간 보호 활성, 아세트알데하이드(acetaldehyed)에 대한 간 보호 활성 및 비알코올성 지방간에 대한 간 보호 활성을 나타내는 특징으로 하는 간 보호 활성 조성물.
- 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 진세노사이드 Rg3의 함량이 증가된 발효홍삼추출액을 포함하는 건강기능식품.
- 제 11항에 있어서, 상기 건강기능식품은 분말(podwer), 환제(pill), 과립제(granules), 캡슐제(capsule), 정제(tablet), 음료(drink)중에서 선택된 어느 하나의 형태로 제형화 된 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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