KR20200051452A - 성분 함량이 변화된 녹차 추출물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 성분 함량이 변화된 녹차 추출물로서 간독성이 완화된 녹차 추출물을 개시한다. 구체적으로, 본 발명의 일 측면에 따른 녹차 추출물은 고온처리를 통해 녹차 추출물의 성분 변화를 시킴으로써, 기존의 녹차 추출물에 비하여 간독성을 일으키는 농도가 낮아, 기존의 녹차 추출물에 의한 간세포 손상을 효과적으로 완화시킬 수 있고 다량 섭취 시에도 안전성이 높다.

Description

성분 함량이 변화된 녹차 추출물{GREEN TEA EXTRACT WHICH HAS MODIFIED AMOUNTS OF INGREDIENTS}
본 발명은 성분 함량이 변화된 녹차 추출물로서, 간독성이 완화된 녹차 추출물에 관한 것이다.
간은 외부에서 들어온 생체 외 물질로부터 전신을 방어하는 기능을 수행하고 있으며, 건강에 유익한 영양분뿐만 아니라 독성물질에 노출될 위험이 다른 장기보다 많아 손상될 확률도 매우 높다. 간은 재생이 우수한 장기이나, 손상이 지속될 경우 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고, 그 기능이 저하되어 정상 간으로서의 기능을 발휘하기 어려운 상태가 되며, 이와 관련된 질환은 간섬유화, 간경화, 간암 등이 있다. 이러한 만성적 간질환은 질환으로 발병되기 전에 자각증상이 없는 경우가 대부분으로, 간 손상 정도가 심한 정도가 되어야 자각증상이 나타나 고 치료가 이루어지므로 그 치료와 완치가 매우 어렵다.
한편, 녹차는 체중감량 및 콜레스테롤 저하 효능을 가지고 있어 비만 혹은 대사 질환을 개선시키기 위한 보조 식품 등으로 널리 쓰인다. 하지만 최근 다량의 녹차 추출물을 섭취하게 되면 간에 손상을 줄 수 있다는 연구 결과들이 보고되고 있어 녹차 추출물에 대한 안전성 이슈가 대두되고 있다. 따라서 녹차의 간 손상을 줄인 녹차 추출물의 조성 발굴이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 제10-2009-0003832호 대한민국 등록특허공보 제10-1900304호
본 발명은 녹차에 의한 간독성, 구체적으로 간세포 손상이 완화된 녹차 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 측면에서, 추출물 총 중량을 기준으로, 8 중량% 이하의 에피갈로카테킨(EGC)을 포함하는, 간독성이 완화된 녹차 추출물을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 녹차 추출물은 고온처리를 통해 녹차 추출물의 성분 변화를 시킴으로써, 기존의 녹차 추출물에 비하여 간독성을 일으키는 농도가 낮아, 기존의 녹차 추출물에 의한 간세포 손상을 효과적으로 완화시킬 수 있고 다량 섭취 시에도 안전성이 높다.
도 1은 실시예 1의 일반 녹차 추출물(시료 1)에 대한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 측면에 따른 고온처리 녹차 추출물(시료 2)에 대한 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 1에 따른 고온처리 녹차 추출물의 간세포 독성 확인 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실험예 2에 따른 고온처리 녹차 추출물의 간세포 손상에 대한 영향 확인 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 4에 따른 3종의 카테킨 EGCG, GCG 및 EGC의 간세포 손상에 대한 영향 확인 실험 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서 "녹차 추출물"은 추출방법, 추출용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 차과에 속하는 상록수인 차(카멜리아 시넨시스; Camellia sinensis)로부터 추출한 것 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis spp.)를 접종하고 발효시킨 차잎 등으로부터 추출한 것을 포함하고, 상기 추출한 것을 특정 용매로 분획한 분획물을 포함한다. 상기 차는 차나무 잎, 꽃, 줄기, 열매, 뿌리, 줄기, 및 뿌리의 심재로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 포함되며, 바람직하게는 잎일 수 있다. 또한, 상기 추출물의 형태는 바람직하게는 분말형태일 수 있다. 상기 추출 또는 분획은 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 할 수 있다. 유기용매는 알코올, 이소프로판올, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 이산화탄소, 또는 이들 중 둘 이상의 혼합용매를 사용할 수 있으나 이에 한정되지는 않으며, 녹차의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출 또는 분획할 수 있다. 상기 알코올은 C1~C5의 저급 알코올일 수 있다. 추출 또는 분획의 횟수나 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출 등의 방법을 사용할 수 있고, 바람직하게는 냉침 또는 가온하여 유효성분을 추출 또는 분획하고 여과한 다음, 그 여과액을 감압농축하여 본 발명의 녹차 추출물을 얻을 수 있다.
본 명세서에서 "에피 카테킨"이란, 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC), (-)에피카테킨((-)epicatechin, EC), (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate, EGCG), 및 에피카테킨 3-O-갈레이트(epicatechin-3-O-gallate, ECG)를 포함하는 것이다.
본 명세서에서 "에피 카테킨 에피머"란, 갈로카테킨(gallocatechin, GC), 카테킨(catechin, C), (-)-갈로카테킨 갈레이트((-)-gallocatechin gallate, GCG) 및 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG)를 포함하는 것이다.
본 발명은 일 측면에서, 추출물 총 중량을 기준으로, 8 중량% 이하의 에피갈로카테킨(EGC)을 포함하는, 간독성이 완화된 녹차 추출물에 관한 것일 수 있다.
일 측면에서, 상기 EGC는 상기 추출물 총 중량을 기준으로 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4.7 중량% 이하, 4.56 중량% 이하, 4.3 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3.53 중량% 이하, 3.5 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.8 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.3 중량% 이하 또는 0.1 중량% 이하일 수 있으며, 다른 측면에서 상기 EGC는 상기 추출물 총 중량을 기준으로 0.0001 중량% 이상, 0.001 중량% 이상, 0.01 중량% 이상, 1 중량% 이상, 2 중량% 이상, 3 중량% 이상, 3.5 중량% 이상, 3.53 중량% 이상, 4 중량% 이상, 4.3 중량% 이상, 4.56 중량% 이상, 4.7 중량% 이상, 5 중량% 이상, 6 중량% 이상 또는 7 중량% 이상일 수 있다. 상기 EGC가 상기 함량 범위로 포함되는 경우에 우수한 간독성 완화 효능을 나타낼 수 있다.
일 측면에서, 상기 추출물은 추출물 총 중량을 기준으로 4 내지 15 중량%의 (-)-갈로카테킨 갈레이트((-)-gallocatechin gallate, GCG) 및 4 내지 15 중량%의 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate, EGCG)를 포함할 수 있다.
상기 GCG는 상기 추출물 총 중량을 기준으로 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 5.3 중량% 이상, 5.59 중량% 이상, 5.7 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7 중량% 이상, 8 중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상 또는 14 중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 GCG는 상기 추출물 총 중량을 기준으로 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5.7 중량% 이하, 5.59 중량% 이하, 5.3 중량% 이하 또는 5 중량% 이하일 수 있다.
일 측면에서, 상기 EGCG는 상기 추출물 총 중량을 기준으로 4 중량% 이상, 5 중량% 이상, 5.2 중량% 이상, 5.27 중량% 이상, 5.5 중량% 이상, 6 중량% 이상, 7중량% 이상, 8중량% 이상, 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상 또는 14 중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 EGCG는 상기 추출물 총 중량을 기준으로 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 13 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5.5 중량% 이하, 5.27 중량% 이하, 5.2 중량% 이하 또는 5 중량% 이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 추출물 내의 GCG 및 EGCG의 총 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 30 중량% 이하일 수 있다. 일 측면에서 상기 GCG 및 EGCG의 총 함량은 추출물 총 중량을 기준으로 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 18 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11 중량% 이하, 10.86 중량% 이하, 10 중량% 이하 또는 9 중량% 이하일 수 있다. 다른 측면에서 상기 GCG 및 EGCG의 총 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 8 중량% 이상, 10 중량% 이상, 10.86 중량% 이상, 11 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 16 중량% 이상, 18 중량% 이상, 20 중량% 이상 또는 25 중량% 이상일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 추출물 내의 에피 카테킨 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 20 중량% 이하일 수 있다. 일 측면에서 상기 에피 카테킨 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 20 중량% 이하, 18 중량% 이하, 16 중량% 이하, 15 중량% 이하, 14 중량% 이하, 12 중량% 이하, 11.1 중량% 이하 또는 10 중량% 이하일 수 있다. 다른 측면에서 상기 에피 카테킨 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 9 중량% 이상, 10 중량% 이상, 11.1 중량% 이상, 12 중량% 이상, 13 중량% 이상, 14 중량% 이상, 16 중량% 이상 또는 18 중량% 이상일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 추출물 내의 8종 카테킨의 총 함량, 즉, 상기 추출물 내의 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate, EGCG), 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC) (-)에피카테킨((-)epicatechin, EC), 에피카테킨 3-O-갈레이트(epicatechin 3-O-gallate, ECG), 갈로카테킨 갈레이트(gallocatechin gallate, GCG), 갈로카테킨(gallocatechin, GC), 카테킨(catechin, C) 및 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG)의 총 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 19 내지 30 중량%일 수 있다. 일 측면에서 상기 8종 카테킨의 총 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 19 중량% 이상, 21 중량% 이상, 23 중량% 이상, 24 중량% 이상, 24.5 중량% 이상, 25 중량% 이상, 26 중량% 이상, 27 중량% 이상, 28 중량% 이상 또는 29 중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 8종 카테킨의 총 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 30 중량% 이하, 29 중량% 이하, 28 중량% 이하, 27 중량% 이하, 26 중량% 이하, 25 중량% 이하, 24.5 중량% 이하, 24 중량% 이하, 23 중량% 이하 또는 21 중량% 이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 추출물은 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상에 의해 1회 이상 추출한 추출물일 수 있다. 일 측면에서 상기 알코올은 에탄올일 수 있다. 다른 측면에서 상기 알코올은 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 또는 70% 이상의 에탄올일 수 있다. 또 다른 측면에서 상기 알코올은 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하 또는 30% 이하의 에탄올일 수 있다.
일 실시양태로서, 상기 추출물은 식품 또는 약학 조성물에 함유될 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 식품 또는 약학 조성물 내 상기 녹차 추출물의 함량은 상기 조성물 전체 중량 대비 1 중량% 내지 100 중량% 일 수 있다. 일 측면에서, 상기 조성물 내 상기 추출물의 함량은 1 중량% 이상, 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상 또는 90 중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 조성물 내 상기 추출물의 함량은 100 중량% 이하, 90 중량% 이하, 80 중량% 이하, 70 중량% 이하, 60 중량% 이하, 50 중량% 이하, 40 중량% 이하, 30 중량% 이하 또는 20 중량% 이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 녹차 추출물의 투여량은 5mg/kg/일 내지 1000mg/kg/일일 수 있다. 일 측면에서, 상기 투여량은 5mg/kg/일 이상, 100mg/kg/일 이상, 200mg/kg/일 이상, 300mg/kg/일 이상, 400mg/kg/일 이상, 500mg/kg/일 이상, 600mg/kg/일 이상, 700mg/kg/일 이상, 800mg/kg/일 이상, 또는 900mg/kg/일 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 투여량은 1000mg/kg/일 이하, 900mg/kg/일 이하, 800mg/kg/일 이하, 700mg/kg/일 이하, 600mg/kg/일 이하, 500mg/kg/일 이하, 400mg/kg/일 이하, 300mg/kg/일 이하, 200mg/kg/일 이하, 100mg/kg/일 이하, 50mg/kg/일 이하 또는 10mg/kg/일 이하일 수 있다.
상기 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 환제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바, 티백 등으로 제형화될 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업계의 통상의 기술자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다. 또한 상기 식품은 건강기능식품일 수도 있다.
상기 조성물은 단순 섭취, 음용, 주사 투여, 스프레이 투여 또는 스퀴즈 투여 등 다양한 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물에 있어서, 상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업계의 통상의 기술자의 수준 내에 있으며, 투여하고자 하는 대상의 연령, 건강 상태, 합병증 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능식품 제품일 수 있다.
상기 외에, 본 발명의 일 측면에 따른 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 일측면에 따른 식품 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않으나 본 발명의 일측면에 따른 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 60 중량부의 범위에서 포함되는 것이 일반적이다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 식품 조성물은 녹차 추출물의 간독성이 완화된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 식품 조성물은 녹차 추출물 중 EGC에 의한 간독성이 완화된 것일 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 약학 조성물은 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위한 제형은 정제(錠劑), 환제(丸劑), 연질 및 경질 캅셀제, 과립제(顆粒劑), 산제, 세립제, 액제, 유탁제(乳濁濟) 또는 펠렛제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 용액제, 현탁제, 유액제, 겔, 주사제, 점적제, 좌제(坐劑), 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 제형은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 계면 활성제, 부형제, 수화제, 유화 촉진제, 현탁제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제, 착색제, 향신료, 안정화제, 방부제, 보존제 또는 기타 상용하는 보조제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따른 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수도 있는데, 상기 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기산으로 형성되거나; 또는 아세트산, 프로파이온산, 헥사노산, 시클로펜테인프로피온산, 글라이콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 1,2-에테인-디설폰산, 2-히드록시에테인설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄퍼설폰산, 4-메틸바이시클로 [2,2,2]-oct-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로파이온산, 트리메틸아세트산, tert-부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 히드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염(acid addition salt); 또는 (2) 모 화합물에 존재하는 산성 프로톤이 치환될 때 형성되는 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 일측면에 따른 상기 약학 조성물의 적용량 또는 투여량은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 유효성분 투여량 결정은 당업계 통상의 기술자의 수준 내에 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 제1 녹차 추출물을 75 내지 100℃의 스팀을 1 내지 2 kgf/cm2의 압력으로 1 내지 7시간 동안 처리하여 교반시키는 고온처리 단계를 포함하는, 상기 간독성이 완화된 녹차 추출물의 제조방법에 관한 것일 수 있다.
일 측면에서, 상기 고온처리 단계 이전에, 녹차에 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상을 가하고 50 내지 65℃에서 30분 내지 4시간 동안 추출하여 제1 녹차 추출물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 추출 후 여과 및 감압하여 상기 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 고온처리 단계 이전에 녹차에 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상을 가하고 50℃ 내지 65℃에서 30분 내지 4시간 동안 추출 후 여과 및 감압농축시켜서 제1 녹차 추출물을 수득하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 C1 내지 C4의 알코올은 에탄올일 수 있다.
일 측면에서, 상기 에탄올은 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 또는 70% 이상의 에탄올일 수 있다. 다른 측면에서 상기 에탄올은 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하 또는 30% 이하의 에탄올일 수 있다.
일 측면에서 상기 제1 녹차 추출물을 수득하는 단계의 추출 온도는 50℃이상, 55℃이상, 60℃이상, 62℃이상 또는 64℃이상일 수 있으며, 또한, 65℃이하, 62℃이하, 60℃이하, 55℃이하 또는 52℃이하일 수 있다.
일 측면에서 상기 제1 녹차 추출물을 수득하는 단계의 추출 시간은 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 60분 이상, 70분 이상, 80분 이상, 90분 이상, 100분 이상, 120분 이상, 140분 이상, 160분 이상, 180분 이상, 200분 이상 또는 220분 이상일 수 있으며, 240분 이하, 220분 이하, 200분 이하, 180분 이하, 160분 이하, 140분 이하, 120분 이하, 100분 이하, 90분 이하, 80분 이하, 70분 이하, 60분 이하, 50분 이하 또는 40분 이하일 수 있다.
일 측면에서 상기 고온처리 단계의 스팀 온도는 75℃ 이상, 80℃ 이상, 90℃ 이상, 95℃ 이상 또는 98℃ 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 고온처리 단계의 온도는 100℃ 이하, 95℃ 이하, 90℃ 이하, 85℃ 이하, 83℃ 이하 또는 80℃ 이하일 수 있다.
일 측면에서 상기 고온처리 단계의 스팀 압력은 1 kgf/cm2 이상, 1.2 kgf/cm2 이상, 1.4 kgf/cm2 이상, 1.5 kgf/cm2 이상, 1.7 kgf/cm2 이상 또는 1.8 kgf/cm2 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 고온처리 단계의 스팀 압력은 2 kgf/cm2 이하, 1.8 kgf/cm2 이하, 1.7 kgf/cm2 이하, 1.5 kgf/cm2 이하, 1.4 kgf/cm2 이하 또는 1.2 kgf/cm2 이하일 수 있다.
일 측면에서 상기 고온처리 단계의 교반 시간은 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 고온처리 단계의 교반 시간은 7시간 이하, 6시간 이하, 5시간 이하, 4시간 이하, 3시간 이하 또는 2시간 이하일 수 있다.
일 측면에서, 상기 고온처리 단계 이후에 여과 및 감압농축 시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예, 실험예, 및 제형예를 들어 본 명세서의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 예는 본 명세서에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 명세서의 범주 및 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 일반 녹차 추출물과 고온처리 녹차 추출물의 제조
100g의 녹차(Camellia sinensis, 제주 오설록 농장)에 50% 에탄올 1000ml 를 가하여 60℃에서 1시간 환류 교반하였다. 상기 시료의 온도를 실온으로 낮추고 여과하여 얻은 용액을 감압증류하여 진한갈색분말의 일반 고시형 녹차 추출물(GT-LE-35CAT, 시료 1) 23g을 수득하였다(수율 23%).
한편, 고온처리 녹차 추출물을 제조하기 위하여, 100g의 녹차(Camellia sinensis, 제주 오설록 농장)에 50% 에탄올 1000ml 를 가하여 60℃에서 1시간 환류 교반하고 여과 및 감압증류하여 제1 녹차 추출물을 수득한 후 이를 농축한 다음 스팀 1.5 kgf/cm2에서 1~7시간 동안 교반시켰다. 이후 온도를 실온으로 낮추고 불용성물질을 여과하고 감압농축하여 고온처리 녹차 추출물 10g을 수득하였다. 이 때, 상기 교반 시간대(1~7시간) 별로 얻은 상기 고온처리 녹차 추출물에 대해 하기 표 1과 같은 장치를 이용하여 8종 카테킨의 함량 변화를 측정하였고, 5시간 째에 열에 의한 EGCG의 GCG로의 전환이 가장 많으면서, 8종 카테킨의 양도 더 이상 줄어들지 않음을 확인하였다. 이때 수득한 고온처리 녹차 추출물 10g(High temperature processed green tea extract, HTP-GTE)을 시료 2로 하였다.
수득된 상기 두 종류의 추출물의 조성을 분석한 조건과 결과는 각각 하기 표 1(시료 1 및 2의 조성 분석 조건), 표 2(시료 1의 조성 분석 결과) 및 표 3(시료 2의 조성 분석 결과)와 같다. 또한, 상기 두 종류의 추출물에 대한 크로마토그램은 도 1(시료 1) 및 도 2(시료 2)와 같다. 즉, 시료 2의 경우 기존의 녹차 추출물과는 조성이 다르다는 것을 확인하였다. 구체적으로, 시료 2의 경우 시료 1에 비해 현저하게 낮은 EGC(3.53중량%), EGCG(5.27중량%) 및 총 카테킨(24.41중량%)을 함유하는 반면, 시료 1에서는 발견되지 않은 성분인 4종의 에피카테킨 에피머가 추가로 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
컬럼 Thermofisher C18 5um, 4.6 X 250mm
디텍터 UV 280nm
희석 그래디언트(Gradient) A-0.1% TFA (Trifluoro acetic acid) 내의 물B-아세토나이트릴(Acetonitrile)
그래디언트 프로파일 (Gradient profile) 0 min A(90) : B(10)
30min A(85) : B(15)
42min A(80) : B(20)
44min A(5) : B(95)
49min A(90) : B(10)
속도 (Flow rate) 1ml/min
주입량 (Injection volumn) 20μl
시료 1 GC EGC Caffeine C EC GCG EGCG CG ECG 에피 카테킨 총량 에피
카테킨
에피머
총량
8종
카테킨
총량
0 9.16 3.21 0 3.63 0 20.93 0 2.62 36.34 0 36.34
시료 2 GC EGC Caffeine C EC GCG EGCG CG ECG 에피
카테킨
총량
에피 카테킨
에피머 총량
8종카테킨
총량
4.9 3.53 3.9 1.57 0.95 5.59 5.27 1.3 1.3 11.05 13.36 24.41
(상기 표 2 및 표 3에서, GC는 갈로카테킨, EGC는 에피갈로카테킨, C는 카테킨, EC는 (-)에피카테킨, GCG는 갈로카테킨 갈레이트, EGCG는 에피갈로카테킨 갈레이트, CG는 카테킨 갈레이트, ECG는 에피카테킨 3-O-갈레이트)
(상기 표 2 및 표 3의 단위는 모두 녹차 추출물(시료 1 및 2) 전체 중량 대비 해당 물질의 중량%)
[실험예 1] 고온처리 녹차 추출물의 간세포 독성 확인 실험
상기 실시예 1에서 수득한 고온처리 녹차 추출물(시료 2)에 의한 간독성을 확인하기 위하여, 한국세포주은행에서 구한 간세포주(HepG2 cell line)를 96웰 플레이트(well plate, FALCON)에 웰 당 1X105씩 시딩하고(seeding), 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양 후, 상기 시료 1과 시료 2를 각각 5, 10, 25, 50, 100 μg/ml로 처리하여 24시간 동안 추가 배양한 뒤 배지를 제거하고 CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(MTS, Promega Co. Madison, WI, USA)를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다. RPMI1640 (Lonza) 100 μl에 CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 용액 20 μl를 첨가하여 세포에 처리 후 490 nm에서 흡광도를 확인하여 살아있는 세포의 수를 정량화 하였다. 세포 수 또는 세포 생존율(%)은 하기 식에 의해 계산되었다.
세포 생존율 (%) = (시료 처리군 흡광도 - 반응시약만의 흡광도) / (무처리군 흡광도 - 반응시약만의 흡광도) X 100
그 결과는 도 3과 같으며, 본원 발명에 따른 시료 2는 일반 녹차 추출물인 시료 1에 비하여 간세포 독성이 낮음을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 고온처리 녹차 추출물의 간세포 손상에 대한 영향 확인 실험
상기 실시예 1에서 수득한 고온처리 녹차 추출물(시료 2)의 간세포 손상에 대한 영향을 확인하기 위하여, 간세포 손상으로 인하여 세포 외로 간세포 효소가 유출된 정도를 분석 프로그램(MILLIPLEX Analyst, Millipore)을 사용하여 분석하였다. 실험 조건은 실험예 1과 같으며, 시료 1과 시료 2를 처리하고 24시간 후 세포 배양액에서 MDH 1(malate dehydrogenase 1), GSTα(α-glutathione S-transferase), SDH(sorbitol dehydrogenase)의 레벨을 측정하였다.
그 결과는 도 4와 같으며, 고온처리 녹차 추출물(시료 2)을 처리한 경우, 일반 녹차 추출물(시료 1)을 처리한 경우에 비하여 세 효소 모두 세포 배양액에서의 레벨이 낮은 것으로 나타났다.
즉, 본 발명에 따른 시료 2의 녹차 추출물이 일반 녹차 추출물에 비하여 간세포 손상에 미치는 영향이 낮은 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 3] 카테킨 8종의 간세포 독성 확인 실험
일반 녹차 추출물 또는 고온처리 녹차 추출물에 존재하는 카테킨 8종(EGCG, GCG, EGC, GC, ECG, CG, EC, C)에 의한 간독성을 확인하기 위하여, 한국세포주은행에서 구한 간세포주(HepG2 cell line)를 96웰 플레이트(well plate, FALCON)에 웰 당 1X105씩 시딩하고(seeding), 24시간 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양 후, 카테킨 8종(EGCG, GCG, EGC, GC, ECG, CG, EC, C)을 각각 10, 50, 100, 200 μM로 처리하여 24시간 동안 추가 배양한 뒤 배지를 제거하고 CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(MTS, Promega Co. Madison, WI, USA)를 이용하여 세포 생존율을 확인하였다. RPMI1640 (Lonza) 100 μl에 CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit(MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 용액 20 μl를 첨가하여 세포에 처리 후 490 nm에서 흡광도를 확인하여 살아있는 세포의 수를 정량화 하였다. 세포 수 또는 세포 생존율(%)은 상기 실험예 1에서의 식과 동일한 식에 의해 계산되었다. 농도에 따른 생존율을 바탕으로 LD50(lethal dose 50) 값을 구하였으며, 그 결과는 하기 표 4와 같다.
EGCG GCG EGC GC ECG CG EC C
LD50 (μM) 355.5 212.7 183.9 236.2 209.0 260.8 505.0 569.0
상기 표 4의 결과로부터, 8종의 카테킨 중에서 EGC의 LD50 값이 가장 낮은 것으로 나타났으며, 이에 따라 EGC의 간세포 독성이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 4] 카테킨 3종의 간세포 손상에 대한 영향 확인 실험
8종의 카테킨 중 EGCG, GCG, EGC 세 성분의 간세포 손상에 대한 영향을 확인하기 위하여, 간세포 손상으로 인하여 세포 외로 간세포 효소가 유출된 정도를 분석 프로그램(MILLIPLEX Analyst, Millipore)을 사용하여 분석하였다. 실험 조건은 실험예 3과 같으며, EGCG, GCG, EGC를 처리하고 24시간 후 세포 배양액에서 MDH 1(malate dehydrogenase 1), GSTα(α-glutathione S-transferase), SDH(sorbitol dehydrogenase)의 레벨을 측정하였다.
그 결과는 도 5와 같으며, EGC를 처리한 경우, 나머지 EGCG, GCG를 처리한 경우에 비하여 세 효소 모두 세포 배양액에서의 레벨이 가장 높은 것으로 나타났다.
즉, EGC가 EGCG 및 GCG에 비하여 간세포 손상에 미치는 영향이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

Claims (12)

  1. 추출물 총 중량을 기준으로, 8 중량% 이하의 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC)을 포함하는, 간독성이 완화된 녹차 추출물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 추출물 총 중량을 기준으로 4 내지 15 중량%의 (-)-갈로카테킨 갈레이트((-)-gallocatechin gallate, GCG) 및 4 내지 15 중량%의 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate, EGCG)를 포함하는, 녹차 추출물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 추출물 내의 (-)-에피갈로카테킨 갈레이트((-)-epigallocatechin gallate, EGCG), 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC) (-)에피카테킨((-)epicatechin, EC), 에피카테킨 3-O-갈레이트(epicatechin 3-O-gallate, ECG), 갈로카테킨 갈레이트(gallocatechin gallate, GCG), 갈로카테킨(gallocatechin, GC), 카테킨(catechin, C) 및 카테킨 갈레이트(catechin gallate, CG) 의 총 함량은 상기 추출물 총 중량을 기준으로 19 내지 30 중량%인, 녹차 추출물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상에 의해 1회 이상 추출한 추출물인, 녹차 추출물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 간독성 완화용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 녹차 추출물은 조성물 총 중량 대비 1 내지 100 중량%의 양으로 포함되는, 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인, 조성물.
  8. 제1 녹차 추출물을 75 내지 100℃의 스팀을 1 내지 2 kgf/cm2의 압력으로 1 내지 7시간 동안 처리하여 교반시키는 고온처리 단계를 포함하는, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 간독성이 완화된 녹차 추출물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 고온처리 단계 이전에,
    녹차에 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상을 가하고 50 내지 65℃에서 30분 내지 4시간 동안 추출하여 제1 녹차 추출물을 수득하는 단계를 더 포함하는, 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 추출 후 여과 및 감압하여 상기 물 및 C1 내지 C4의 알코올 중 어느 하나 이상을 제거하는 단계를 더 포함하는, 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 C1 내지 C4의 알코올은 에탄올인, 제조방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 고온처리 단계 이후에 여과 및 감압농축 시키는 단계를 더 포함하는, 제조방법.
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