CN112996526B - 成分含量变化的绿茶提取物及包含其的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种成分含量变化的绿茶提取物，并涉及一种肝毒性得到缓解的绿茶提取物、及包含作为有效成分的所述绿茶提取物的用于改善血液循环、用于抑制肝细胞中脂肪堆积、用于阻碍牙龈炎菌或用于增加脑血流量的组合物。具体地，与现有的绿茶提取物相比，根据本发明一个方面的绿茶提取物通过高温处理使绿茶提取物的成分发生变化，从而使引起肝毒性的浓度低于现有的绿茶提取物，因此可以有效地缓解由现有的绿茶提取物而引起的肝细胞损伤，并且在大量摄入时也具有较高的安全性，包含作为有效成分的这种绿茶提取物的根据本发明的组合物不仅具有高安全性，还表现出优异的改善血液循环的功效、抑制肝细胞中脂肪堆积的功效、阻碍牙龈炎菌的功效或增加脑血流量的功效。

Description

成分含量变化的绿茶提取物及包含其的组合物
技术领域
【相关申请】
本申请要求主张于2018年11月5日申请的、申请号为10-2018-0134620的韩国专利申请；2019年4月1日申请的、申请号为10-2019-0037810的韩国专利申请；以及2019年10月17日申请的、申请号为10-2019-0129034的韩国专利申请的优先权，将它们的全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及一种成分含量变化的绿茶提取物，并涉及一种肝毒性得到缓解的绿茶提取物、及包含作为有效成分的所述绿茶提取物的用于改善血液循环、用于抑制肝细胞中脂肪堆积、用于阻碍牙龈炎菌或用于增加脑血流量的组合物。
背景技术
脂肪肝的主要原因被认为是长期饮酒、暴饮暴食引起的肥胖和糖尿病，此外，服用剧毒药物、怀孕期间抗生素使用不当、或儿童患有发热性感染疾病时以解热目的而滥用阿司匹林也会导致脂肪肝。如果免疫状态等身体条件良好，则这种脂肪肝很容易通过肝细胞的再生而得到恢复，反之会使脂肪堆积在肝细胞中，导致包括核在内的细胞重要组成成分被推向一侧，进而使肝细胞的功能下降，而且因细胞内堆积的脂肪而膨胀的肝细胞会挤压位于肝细胞之间的微血管和淋巴腺，从而导致肝脏内的血液和淋巴液的循环发生紊乱，并且肝细胞因无法正常吸收氧气和营养供给而导致肝功能下降。
关于血液循环疾病，在正常血管中通过平衡止血机制的激活反应和抑制反应而维持体内平衡，但过度的止血作用或血凝块的生成会妨碍血液流动，由此诱发血栓。在正常的血管内皮细胞中会通过释放出如一氧化氮(NO)及前列环素(prostacyclin，PGI2)等抑制因子来保护血管壁，从而起到抑制血小板的附着和激活的作用，但在内皮细胞受损时，会促进血小板的凝固。如上所述的由血栓阻塞血管而引起的疾病统称为血栓症。
牙周炎的发病原因复杂且具有多种症状。其中，引起牙周炎的主要原因之一是口腔中的微生物，它们第一部通过利用糖等而生成不溶性葡聚糖，这些不溶性葡聚糖与各种菌体一同附着在牙齿表面而形成牙结石。这种牙结石会引发蛀牙及牙周炎。因此，可实现预防牙周炎的最有效的方法是使用抑制这些微生物的活性并改善发炎处牙龈的血流的物质。已知，分布在口腔中的微生物会诱发臼齿、牙周疾病等，其中的部分微生物作为机会病原体具有引发疾病的可能性。已知，常驻在口腔中引起牙周炎的致病微生物有多个种，其中，中间普氏菌(Prevotella intermedia)和牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)等是引起牙周炎的主要病原体。
大脑通过接收从心脏喷出的血液来获取氧气和葡萄糖等营养物质，从而发挥其功能。但是，与其他身体组织不同，由于大脑几乎没有能力将氧气和葡萄糖储存在组织中，因此，在脑血管因动脉硬化或血栓等而变窄或闭合导致流向大脑的血流发生障碍时，氧气缺乏和葡萄糖不足会导致包括神经细胞损伤在内的脑部疾病。与这些脑部血流异常直接或间接相关而发病的疾病包括贫血、中风、血管性痴呆、帕金森综合症和亨廷顿病等。
此外，由于绿茶具有减轻体重及降低胆固醇的功效，因此被广泛用作改善肥胖或代谢疾病的辅助食品等。然而，根据最近的研究结果，摄入大量的绿茶提取物可能会损伤肝脏，因此绿茶提取物的安全性问题正在受到关注。因此，有必要研发一种降低绿茶对肝脏损伤的绿茶提取物的组成。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种由绿茶引起的肝毒性、特别是肝细胞损伤得到缓解的绿茶提取物，及包含作为有效成分的所述绿茶提取物的组合物，所述组合物不仅具有高安全性，还具有优异的改善血液循环的功效、抑制肝细胞中脂肪堆积的功效、阻碍牙龈炎菌(gingivalis)的功效或增加脑血流量的功效。
技术方案
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供一种肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在另一个方面，本发明提供一种用于改善血液循环的组合物，其包含作为有效成分的肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明提供一种用于抑制肝细胞中脂肪堆积的组合物，其包含作为有效成分的肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)。
在又另一个方面，本发明提供一种用于阻碍牙龈炎菌的组合物，其包含作为有效成分的肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明提供一种用于增加脑血流量的组合物，其包含作为有效成分的肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
有益效果
根据本发明的一个方面的绿茶提取物通过高温处理使绿茶提取物的成分发生变化，从而使引起肝毒性的浓度低于现有的绿茶提取物，因此可以有效地缓解由现有的绿茶提取物而引起的肝细胞损伤，并且在大量摄入时也具有较高的安全性。
根据本发明的另一个方面的组合物通过包含作为有效成分的所述绿茶提取物，不仅具有高安全性，还具有优异的改善血液循环的功效，从而表现出优异的预防或治疗血栓疾病的功效。
根据本发明的又另一个方面的组合物通过包含作为有效成分的所述绿茶提取物，不仅具有高安全性，还具有优异的抑制肝细胞中脂肪堆积的功效，从而表现出优异的预防或治疗脂肪肝的功效。
根据本发明的又另一个方面的组合物通过包含作为有效成分的所述绿茶提取物，不仅具有高安全性，还具有优异的抑制牙龈卟啉单胞菌的功效，从而表现出优异的预防或治疗牙周炎的功效。
根据本发明的又另一个方面的组合物通过包含作为有效成分的所述绿茶提取物，不仅具有高安全性，还具有优异的增加脑血流量的功效，从而表现出优异的改善认知功能的功效。
附图说明
图1示出了实施例1的普通绿茶提取物(样品1)的色谱图。
图2示出了根据本发明一个方面的高温处理的绿茶提取物(样品2)的色谱图。
图3示出了确认根据实验实施例1的高温处理的绿茶提取物的肝细胞毒性的实验结果。
图4示出了确认根据实验实施例2的高温处理的绿茶提取物对肝细胞损伤的影响的实验结果。
图5示出了确认根据实验实施例4的3种儿茶素EGCG、GCG及EGC对肝细胞损伤的影响的实验结果。
图6示出了评估根据实验实施例5的高温处理的绿茶提取物改善血液循环的功效的实验结果。
图7示出了评估根据实验实施例6的高温处理的绿茶提取物抑制肝细胞中脂肪堆积的功效的实验结果。
图8示出了评估根据实验实施例7的GCG及EGCG抑制肝细胞中脂肪堆积的功效的实验结果。
图9示出了评估根据实验实施例9的高温处理的绿茶提取物增加脑血流量的功效的实验结果。
图10示出了评估根据实验实施例9的高温处理的绿茶提取物增加脑血流量的功效的实验结果。
具体实施方式
在本说明书中，与提取方法、提取溶剂、提取成分或提取物的形态无关地，“绿茶提取物”包含从作为属于茶科的常绿树的茶(Camellia sinensis)提取的物质、或者从接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis spp.)并发酵的茶叶等提取的物质，并包含用特定溶剂对所述提取的物质进行分馏的分馏物。所述茶可包括选自茶树的叶、花、茎、果实、根、茎及根的心材中的一种或多种，并可优选为叶。此外，所述提取物的形态可优选为粉末形式。所述提取或分馏可以使用水、有机溶剂或它们的混合溶剂进行。有机溶剂可使用醇、异丙醇、丙酮、己烷、乙酸乙酯、二氧化碳、或其中的两种或更多种的混合溶剂，但不限于此，并且在绿茶的有效成分不被破坏或使破坏最小化的条件下，可在室温或加热条件下进行提取或分馏。所述醇可为C1～C5的低级醇。提取或分馏的次数或方法没有特别限制，例如可以使用冷提取、超声波提取、回流冷却提取、热水提取等，优选地，可通过冷却或加热来对有效成分进行提取或分馏，并进行过滤后，通过对过滤液进行减压浓缩来获得本发明的绿茶提取物。
在本说明书中，“表儿茶素”包括表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、(-)表儿茶素((-)epicatechin，EC)、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-epigallocatechingallate，EGCG)和表儿茶素3-O-没食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate，ECG)。
在本说明书中，“表儿茶素差向异构体(epimer)”包括没食子儿茶素(gallocatechin，GC)、儿茶素(catechin，C)、(-)-没食子儿茶素没食子酸酯((-)-gallocatechin gallate，GCG)和儿茶素没食子酸酯(catechin gallate，CG)。
在一个方面，本发明可涉及一种肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在另一个方面，本发明可涉及一种缓解肝毒性的方法，其包括将有效剂量的肝毒性得到缓解的绿茶提取物给药于所需受试者，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于缓解肝毒性的组合物中的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物的用于缓解肝毒性的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及一种用于改善血液循环的组合物，其包含作为有效成分的所述绿茶提取物。
在又另一个方面，所述组合物可增加血管内皮细胞中的一氧化氮(NO)，并且可以通过增加血管内皮细胞内的一氧化氮而表现出改善血液循环的功效。
在又另一个方面，本发明可涉及一种改善血液循环的方法，其包括将有效剂量的肝毒性得到缓解的绿茶提取物给药于所需受试者，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于改善血液循环的组合物中的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物的用于改善血液循环的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及一种用于抑制肝细胞中脂肪堆积的组合物，其包含作为有效成分的所述绿茶提取物。
在又另一个方面，本发明可涉及一种抑制肝细胞中脂肪堆积的方法，其包括将有效剂量的肝毒性得到缓解的绿茶提取物给药于所需受试者，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于抑制肝细胞中脂肪堆积的组合物中的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物的用于抑制肝细胞中脂肪堆积的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及一种用于阻碍牙龈炎菌的组合物，其包含作为有效成分的所述绿茶提取物。
在又另一个方面，本发明可涉及一种阻碍牙龈炎菌的方法，其包括将有效剂量的肝毒性得到缓解的绿茶提取物给药于所需受试者，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于阻碍牙龈炎菌的组合物中的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物的用于阻碍牙龈炎菌的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，所述牙龈炎菌可为牙龈卟啉单胞菌。
在又另一个方面，本发明可涉及一种用于增加脑血流量的组合物，其包含作为有效成分的所述绿茶提取物。在又另一个方面，所述组合物可增加脑部血流中的氧气量，具体地，可增加大脑额叶部的血流量。
在又另一个方面，本发明可涉及一种增加脑血流量的方法，其包括将有效剂量的肝毒性得到缓解的绿茶提取物给药于所需受试者，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于增加脑血流量的组合物中的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在又另一个方面，本发明可涉及肝毒性得到缓解的绿茶提取物的用于增加脑血流量的用途，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素(EGC)。
在本发明的一个方面，可根据本说明书所记载的给药方法及给药剂量来进行所述方法的给药。
在一个方面，基于所述提取物的总重量，所述EGC的含量可为8重量％或以下、7重量％或以下、6重量％或以下、5重量％或以下、4.7重量％或以下、4.56重量％或以下、4.3重量％或以下、4重量％或以下、3.53重量％或以下、3.5重量％或以下、3重量％或以下、2重量％或以下、1重量％或以下、0.8重量％或以下、0.5重量％或以下、0.3重量％或以下、或0.1重量％或以下，在另一个方面，基于所述提取物的总重量，所述EGC的含量可为0.0001重量％或以上、0.001重量％或以上、0.01重量％或以上、1重量％或以上、2重量％或以上、3重量％或以上、3.5重量％或以上、3.53重量％或以上、4重量％或以上、4.3重量％或以上、4.56重量％或以上、4.7重量％或以上、5重量％或以上、6重量％或以上、或7重量％或以上。当所述EGC的含量在所述含量范围内时，可表现出优异的缓解肝毒性的功效。
在一个方面，基于提取物的总重量，所述提取物可包含4重量％至15重量％的(-)-没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)及4重量％至15重量％的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)。
基于所述提取物的总重量，所述GCG的含量可为4重量％或以上、5重量％或以上、5.3重量％或以上、5.59重量％或以上、5.7重量％或以上、6重量％或以上、7重量％或以上、8重量％或以上、9重量％或以上、10重量％或以上、11重量％或以上、12重量％或以上、13重量％或以上、或14重量％或以上。在另一个方面，基于所述提取物的总重量，所述GCG的含量可为15重量％或以下、14重量％或以下、13重量％或以下、12重量％或以下、11重量％或以下、10重量％或以下、9重量％或以下、8重量％或以下、7重量％或以下、6重量％或以下、5.7重量％或以下、5.59重量％或以下、5.3重量％或以下、或5重量％或以下。
在一个方面，基于所述提取物的总重量，所述EGCG的含量可为4重量％或以上、5重量％或以上、5.2重量％或以上、5.27重量％或以上、5.5重量％或以上、6重量％或以上、7重量％或以上、8重量％或以上、9重量％或以上、10重量％或以上、11重量％或以上、12重量％或以上、13重量％或以上、或14重量％或以上。在另一个方面，基于所述提取物的总重量，所述EGCG的含量可为15重量％或以下、14重量％或以下、13重量％或以下、12重量％或以下、11重量％或以下、10重量％或以下、9重量％或以下、8重量％或以下、7重量％或以下、6重量％或以下、5.5重量％或以下、5.27重量％或以下、5.2重量％或以下、或5重量％或以下。
在另一个实施例中，基于所述提取物的总重量，GCG及EGCG在所述提取物中的总含量可为30重量％或以下。在一个方面，基于提取物的总重量，所述GCG和EGCG的总含量可为30重量％或以下、25重量％或以下、20重量％或以下、18重量％或以下、16重量％或以下、15重量％或以下、14重量％或以下、12重量％或以下、11重量％或以下、10.86重量％或以下、10重量％或以下、或9重量％或以下。在另一个方面，基于所述提取物的总重量，所述GCG和EGCG的总含量可为8重量％或以上、10重量％或以上、10.86重量％或以上、11重量％或以上、12重量％或以上、13重量％或以上、14重量％或以上、16重量％或以上、18重量％或以上、20重量％或以上、或25重量％或以上。
在另一个实施例中，基于所述提取物的总重量，表儿茶素在所述提取物中的含量可为20重量％或以下。在一个方面，基于所述提取物的总重量，所述表儿茶素的含量可为20重量％或以下、18重量％或以下、16重量％或以下、15重量％或以下、14重量％或以下、12重量％或以下、11.1重量％或以下、或10重量％或以下。在另一个方面，基于所述提取物的总重量，所述表儿茶素的含量可为9重量％或以上、10重量％或以上、11.1重量％或以上、12重量％或以上、13重量％或以上、14重量％或以上、16重量％或以上、或18重量％或以上。
在另一个实施例中，基于所述提取物的总重量，所述提取物中的8种儿茶素的总含量，即，所述提取物中的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、(-)表儿茶素(EC)、表儿茶素3-O-没食子酸酯(ECG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子儿茶素(GC)、儿茶素(C)、及儿茶素没食子酸酯(CG)的总含量可为19重量％至30重量％。在一个方面，基于所述提取物的总重量，所述8种儿茶素的总含量可为19重量％或以上、21重量％或以上、23重量％或以上、24重量％或以上、24.5重量％或以上、25重量％或以上、26重量％或以上、27重量％或以上、28重量％或以上、或者29重量％或以上。在另一个方面，基于所述提取物的总重量，所述8种儿茶素的总含量可为30重量％或以下、29重量％或以下、28重量％或以下、27重量％或以下、26重量％或以下、25重量％或以下、24.5重量％或以下、24重量％或以下、23重量％或以下、或者21重量％或以下。
在又另一个实施例中，所述提取物可为通过选自水、C1-C4醇中的一种或多种物质进行一次或多次提取的提取物。在一个方面，所述醇可为乙醇。在另一个方面，所述醇可以是20％或以上、30％或以上、40％或以上、50％或以上、60％或以上、或70％或以上的乙醇。在又另一个方面，所述醇可以是70％或以下、60％或以下、50％或以下、40％或以下、或30％或以下的乙醇。
在一个实施方式中，所述提取物可包含于保健食品或药物组合物中。
在一个实施例中，基于所述组合物总重量，所述绿茶提取物在所述保健食品或药物组合物中的含量可为1重量％至100重量％。在一个方面，所述提取物在所述组合物中的含量可为1重量％或以上、10重量％或以上、20重量％或以上、30重量％或以上、40重量％或以上、50重量％或以上、60重量％或以上、70重量％或以上、80重量％或以上、或90重量％或以上。在另一个方面，所述提取物在所述组合物中的含量可为100重量％或以下、90重量％或以下、80重量％或以下、70重量％或以下、60重量％或以下、50重量％或以下、40重量％或以下、30重量％或以下、或20重量％或以下。
在另一个实施例中，所述绿茶提取物的给药剂量可为5mg/kg/天至1000mg/kg/天。在一个方面，所述给药剂量可为5mg/kg/天或以上、100mg/kg/天或以上、200mg/kg/天或以上、300mg/kg/天或以上、400mg/kg/天或以上、500mg/kg/天或以上、600mg/kg/天或以上、700mg/kg/天或以上、800mg/kg/天或以上、或900mg/kg/天或以上。在另一个方面、所述给药剂量可为1000mg/kg/天或以下、900mg/kg/天或以下、800mg/kg/天或以下、700mg/kg/天或以下、600mg/kg/天或以下、500mg/kg/天或以下、400mg/kg/天或以下、300mg/kg/天或以下、200mg/kg/天或以下、100mg/kg/天或以下、50mg/kg/天或以下、或10mg/kg/天或以下。
所述食品组合物的剂型没有特别限制，例如，可以制备成片剂、颗粒剂、丸剂、粉末、如饮料的液体、焦糖、凝胶、棒、茶叶袋等。除有效成分外，每种剂型的食品组合物可包含所属领域常规使用的成分，本领域技术人员可以毫无困难地根据剂型或使用目的适当选择这些成分进行配制，并且与其它原料同时使用时可以产生协同效应。此外，所述食品可为保健食品。
所述组合物可以通过例如简单摄取、饮用、注射给药、喷雾给药或挤压给药等多种方法进行给药。
在根据本发明的一个方面的食品组合物中，确定所述有效成分的给药剂量属于本领域技术人员的知识范围内，可根据给药对象的年龄、健康状态、并发症等多种因素有所不同。
根据本发明的一个方面的食品组合物，例如，可为口香糖、焦糖产品、糖果类、冰淇淋类、饼干类等的各种食品；软饮料、矿泉水、酒精饮料等的饮料制品；包含维生素或矿物质等的功能性保健食品。
除了上述以外，根据本发明的一个方面的食品组合物可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成增味剂和天然增味剂等增味剂、着色剂及风味剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，根据本发明的一个方面的食品组合物可包含用于制备天然果汁和果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例并不重要，但在通常情况下，基于100重量份的根据本发明的一个方面的组合物，这些添加剂的含量为0重量份至约60重量份。
根据本发明一个方面的所述食品组合物可为绿茶提取物的肝毒性得到缓解的组合物。更具体地，所述食品组合物可为由绿茶提取物中EGC引起的肝毒性得到缓解的组合物。
根据本发明的一个方面的所述药物组合物可通过口服、肠胃外、直肠、局部、经皮、静脉内、肌内、腹腔内、皮下等给药。用于口服给药的剂型可为片剂、丸剂、软胶囊及硬胶囊、颗粒剂、散剂、细粒剂、液体、乳浊剂或微丸剂，但不限于此。用于肠胃外给药的剂型可为溶液剂、悬浮剂、乳液剂、凝胶剂、注射剂、滴剂、栓剂、贴剂或喷雾剂，但不限于此。按照本领域的常规方法，可容易地制备出所述剂型，并可以进一步包含表面活性剂、赋形剂、可湿性粉剂、乳化剂、悬浮剂、用于调节渗透压的盐或缓冲剂、着色剂、香料、稳定剂、防腐剂、保存剂或其他商用辅助剂。
根据本发明的一个方面的所述药物组合物还可以包含药学上可接受的盐，所述盐可以包括，(1)由例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸形成的；或由例如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2,2,2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡萄糖酸、谷氨酸、羟萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等的有机酸形成的酸加成盐(acidaddition salt)；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被取代而形成的盐。
根据本发明的一个方面的所述药物组合物的施用量或给药剂量将根据接受给药的受试者的年龄、性别、体重、病理状态及其严重程度、给药途径或处方者的判断而变化。基于这些因素确定有效成分的给药剂量属于本领域技术人员的知识范围内。
以下，将通过实施例、实验实施例及剂型实施例，更为详细地描述本说明书的组成和效果。但是，提供这些实施例的目的仅在于帮助理解本说明书，本说明书的范畴和范围并不限于此。
【实施例1】普通绿茶提取物和高温处理的绿茶提取物的制备
向100g的绿茶(Camellia sinensis，济州Osulloc农场)中加入1000ml的50％乙醇，并在60℃下回流搅拌1小时。将所述样品的温度降至室温，进行过滤，然后对所得溶液进行减压蒸馏，从而获得23g呈深棕色粉末的普通公告型绿茶提取物(GT-LE-35CAT，样品1)(成品率：23％)。
另外，为了制备高温处理的绿茶提取物，向100g的绿茶(Camellia sinensis，济州Osulloc农场)中加入1000ml的50％乙醇，并在60℃下回流搅拌1小时，然后进行过滤及减压蒸馏，以获得第一绿茶提取物，将其浓缩，然后在1.5kgf/cm2的蒸汽中搅拌1小时至7小时。然后，将温度降低至室温，过滤不溶性物质，并进行减压浓缩，从而获得10g的高温处理的绿茶提取物。此时，通过使用下表1所示的装置，对不同的所述搅拌时间(1小时至7小时)下得到的所述高温处理的绿茶提取物测定8种儿茶素的含量变化，并确认了在5小时时，EGCG因受热而转化为GCG的量最大，并且8种儿茶素的量也不会再减少。将此时所得的10g高温处理的绿茶提取物(High temperature processed green tea extract，HTP-GTE)用作样品2。
所得的所述两种提取物的组成分析条件和结果分别示于下表1(样品1和2的组成分析条件)、表2(样品1的组成分析结果)和表3(样品2的组成分析结果)。另外，所述两种提取物的色谱图如图1(样品1)和图2(样品2)所示。即，证实了样品2的组成与现有的绿茶提取物的组成不同。具体地，可确认到样品2中EGC(3.53重量％)、EGCG(5.27重量％)和总儿茶素(24.41重量％)的含量显著低于样品1，而且还生成了在样品1中未发现的4种表儿茶素差向异构体。
【表1】
Figure BDA0003052204650000111
【表2】
Figure BDA0003052204650000121
【表3】
Figure BDA0003052204650000122
(在所述表2和表3中，GC是没食子儿茶素，EGC是表没食子儿茶素，C是儿茶素，EC是(-)表儿茶素，GCG是没食子儿茶素没食子酸酯，EGCG是表没食子儿茶素没食子酸酯，CG是儿茶素没食子酸酯，ECG是表儿茶素3-O-没食子酸酯。)
(所述表2和表3中的单位均为该物质相对于绿茶提取物(样品1和样品2)总重量的重量百分比。)
【实验实施例1】高温处理的绿茶提取物的肝细胞毒性的确认实验
将购自韩国细胞株银行的肝细胞系(HepG2细胞系)以每孔1×105个的量接种(seeding)在96孔板(FALCON)中，并在37℃、5％CO2的培养箱中进行24小时的培养，然后分别用5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的样品1和样品2进行处理，并进一步培养24小时后，除去培养基，接着通过使用CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS，Promega公司，美国威斯康星州麦迪逊市)测定细胞存活率，以确认由所述实施例1中所得的高温处理的绿茶提取物(样品2)引起的肝毒性。将20μl的CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖检测试剂溶液加入到100μl的RPMI1640(Lonza)中，并处理在细胞上，然后通过测定490nm处的吸光度来定量活细胞数。细胞数或细胞存活率(％)通过以下等式计算。
细胞存活率(％)＝(样品处理组的吸光度-反应试剂的吸光度)/(未处理组的吸光度-单独的反应试剂的吸光度)×100
其结果如图3所示，可确认到根据本发明的样品2的肝细胞毒性低于作为普通绿茶提取物的样品1。
【实验实施例2】高温处理的绿茶提取物对肝细胞损伤的影响的确认实验
通过使用分析程序(MILLIPLEX Analyst，密理博公司)来分析因肝细胞损伤而导致肝细胞酶外流至细胞外部的程度，以确认所述实施例1中所得的高温处理的绿茶提取物(样品2)对肝细胞损伤的影响。实验条件与实验实施例1相同，用样品1和样品2进行处理并经过24小时之后，测定细胞培养液中MDH1(苹果酸酶1)、GSTα(α-谷胱甘肽S-转移酶)、SDH(山梨醇脱氢酶)的水平。
其结果如图4所示，当处理高温处理的绿茶提取物(样品2)时，三种酶在细胞培养液中的水平均低于处理普通绿茶提取物(样品1)时的水平。
即，可确认到根据本发明的样品2的绿茶提取物对肝细胞损伤的影响低于普通绿茶提取物。
【实验实施例3】8种儿茶素的肝细胞毒性的确认实验
将购自韩国细胞株银行的肝细胞系(HepG2细胞系)以每孔1×105个的量接种在96孔板(FALCON)中，并在37℃、5％CO2的培养箱中进行24小时的培养，然后分别用10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的8种儿茶素(EGCG、GCG、EGC、GC、ECG、CG、EC、C)进行处理，并进一步培养24小时后，除去培养基，接着通过使用CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖检测试剂盒(MTS，Promega公司，美国威斯康星州麦迪逊市)测定细胞存活率，以确认由存在于普通绿茶提取物或高温处理的绿茶提取物中的8种儿茶素(EGCG、GCG、EGC、GC、ECG、CG、EC、C)的肝毒性。将20μl的CellTiter 96AQueous单溶液细胞增殖检测试剂溶液加入到100μl的RPMI1640(Lonza)中，并处理在细胞上，然后通过测定490nm处的吸光度来定量活细胞数。按照与所述实验实施例1中相同的等式来计算细胞数或细胞存活率(％)。基于根据浓度的存活率，计算出LD50(半数致死剂量)值，其结果示于下表4中。
【表4】
EGCG GCG EGC GC ECG CG EC C
LD50(μM) 355.5 212.7 183.9 236.2 209.0 260.8 505.0 569.0
从所述表4的结果可知，8种儿茶素中EGC的LD50值最低，因此EGC的肝细胞毒性最强。
【实验实施例4】3种儿茶素对肝细胞损伤的影响的确认实验
通过使用分析程序(MILLIPLEX Analyst，密理博公司)来分析因肝细胞损伤而导致肝细胞酶外流至细胞外部的程度，以确认8种儿茶素中的EGCG、GCG及EGC三种成分对肝细胞损伤的影响。实验条件与实验实施例3相同，用EGCG、GCG、EGC进行处理并经过24小时之后，测定细胞培养液中MDH1(苹果酸酶1)、GSTα(α-谷胱甘肽S-转移酶)、SDH(山梨醇脱氢酶)的水平。
其结果如图5所示，当处理EGC时，三种酶在细胞培养液中的水平均最高，均高于处理EGCG、GCG时的水平。
即，与EGCG及GCG相比，可确认到EGC对肝细胞损伤的影响最大。
【实验实施例5】高温处理的绿茶提取物改善血液循环的功效的评估实验
eNOS(内皮型一氧化氮合酶)存在于人的血管内皮细胞中，其通过增加活性来生成一氧化氮(NO)，从而发挥扩张血管并促进血液循环的作用。因此，将人血管内皮细胞(HUVEC)进行培养后，用各个样品在培养基中进行处理，并对生成的NO的量进行比较，以评估所述实施例1的样品1及样品2的绿茶提取物改善血液循环的功效。
具体地，将血管内皮细胞以每孔2×104个的量接种在底部透明、壁呈黑色的96孔板(FALCON)中，并在37℃、5％CO2的培养箱中进行24小时的培养，然后利用除去胎牛血清(FBS)的无酚红(phenol red free)培养基对细胞进行4小时的绝食(starvation)，然后除去培养基并使用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2回。然后，将DAF-2DA以5μM的浓度溶解于HBSS(汉克平衡盐溶液)，并将100μl处理于细胞中，然后使用箔纸遮挡光线，并在37℃、5％CO2的培养箱中进行20分钟的培养。在样品处理之前先测定荧光(激发：485nM，发射：535nM)，用6μg/ml、20μg/ml、60μg/ml的样品1和样品2分别在各个孔中处理100μl后，通过使用酶标仪(Tecan Salzburg公司，奥地利)来测定荧光。此外，作为样品1和样品2的代替，在对照组中使用0.1％(v/v)的DMSO(二甲亚砜)进行处理。通过以下等式计算出相对的NO生成量。
相对的NO生成量＝(样品处理组的吸光度-单独的反应试剂的吸光度)/(对照组(DMSO处理组)的吸光度-单独的反应试剂的吸光度)
其结果如图6所示，可确认到样品1和样品2均浓度依赖性地使血管内皮细胞中的NO增加，但在相同浓度下，根据本发明的样品2的高温处理的绿茶提取物的NO生成量显著高于样品1的普通绿茶提取物。
综合上述实验实施例1和实验实施例2可知，与现有的普通绿茶提取物相比，根据本发明的高温处理的绿茶提取物因肝毒性低而具有高安全性，同时在血管内皮细胞中能以更少的量生成大量的NO，因此，表现出优异的改善血液循环的功效。
【实验实施例6】高温处理的绿茶提取物抑制肝细胞中脂肪堆积的功效的评估实验
将作为人肝癌细胞系(human hepatoma cell line)的HepG2进行培养之后，用各个样品在培养基中进行处理，并对脂肪堆积阻碍能力进行比较，以评估所述实施例1的样品1及样品2的绿茶提取物在肝细胞中抑制因脂肪酸而脂肪堆积的功效。
具体地，将肝细胞系(HepG2细胞系)以每孔1×106个的量接种在12孔板(FALCON)中，并在37℃、5％CO2的培养箱中进行24小时的培养，然后分别用3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml的所述样品1及样品2与100μM的共轭(conjugation)有牛血清白蛋白(BSA)的硬脂酸一同进行处理，并进行48小时的培养。除去培养基并用PBS洗涤后，利用4％甲醛进行固定。用100％的丙二醇进一步培养5分钟后，在每个孔中添加500μL的油红O溶液(sigma公司)并进行2小时的培养，以对细胞内脂肪进行染色。除去油红O溶液后，用85％的丙二醇进行5分钟的培养，然后用60％的异丙醇进行15分钟的培养，以提取出进入到堆积于细胞中的脂肪的油红O溶液。将200μL的异丙醇转移至96孔板后，通过测定485nM处的吸光度来定量细胞中堆积的脂肪量。通过以下等式计算出相对于对照组(DMSO 0.1％(v/v))的相对的油红O量(％)。
油红O量(％)＝(样品处理组的吸光度-对照组的吸光度)X100
其结果如图7所示，可确认到在样品1的情况下，当处理3μg/ml时脂肪堆积反而会增加，当处理10μg/ml及30μg/ml时会浓度依赖性地阻碍脂肪堆积。相反地，可确认到在根据本发明的样品2的情况下，从处理浓度为3μg/ml开始就会浓度依赖性地抑制脂肪堆积，并且样品2的脂肪堆积阻碍能力显著高于样品1。
综合上述实验实施例1和实验实施例2可知，与现有的普通绿茶提取物相比，根据本发明的高温处理的绿茶提取物因肝毒性低而具有高安全性，同时在肝细胞中抑制脂肪堆积的能力显著优异，因此，表现出优异的预防脂肪肝的功效。
【实验实施例7】GCG及EGCG抑制肝细胞中脂肪堆积的功效的评估实验
除了用GCG和EGCG代替样品1和样品2进行处理以外，按照与所述实验实施例6相同的方法进行实验。
其结果如图8所示，可确认到在相同的浓度下GCG抑制肝细胞中脂肪堆积的功效显著优于EGCG。由此可知，由于根据本发明的高温处理的绿茶提取物的EGCG含量大幅低于普通绿茶提取物，并且含有普通绿茶提取物中未发现的GCG成分，因此表现出优异的抑制肝细胞中脂肪堆积的功效。
【实验实施例8】经高温处理的绿茶提取物用于阻碍牙龈炎菌的功效的评估实验
按照如下表5所示的成分和组成比例进行混合来准备样品，以评估高温处理的绿茶提取物阻碍牙龈炎菌的功效。用相应含量的100倍储备液(stock)来准备每个样品，并将其用于实验中，样品2中的各成分含量与所述表3中的8种儿茶素的含量相同。
【表5】
Figure BDA0003052204650000161
将牙龈卟啉单胞菌接种在包含维生素K(1μg/mL)、血红素(5μg/mL)、5％脱纤维马血(defibrinated horse blood)的布氏琼脂(Becton Dickison公司，法国Le Pont-de-Claix)中，并在37℃、厌氧条件下进行40小时的培养。进行培养后，通过离心分离进行集菌，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)对其沉淀部洗涤3回。向所述表5的每种样品中添加100μl的牙龈卟啉单胞菌并达到2x105CFU/mL，并在37℃条件下进行16小时或以上的培养，然后测定未表现出混浊度的最小阻碍浓度，其结果示于下表6中。
【表6】
Figure BDA0003052204650000171
从所述表6的结果可确认到，与包含4种表儿茶素的样品及包含4种表儿茶素差向异构体的样品相比，根据本发明的高温处理的绿茶提取物的阻碍牙龈卟啉单胞菌的功效显著优异。尤其，可以确认到在包含4种表儿茶素的样品的情况下，阻碍牙龈卟啉单胞菌的功效大幅降低；在包含4种表儿茶素差向异构体的样品的情况下，虽然表现出阻碍牙龈卟啉单胞菌的功效，但其功效显著低于根据本发明的样品2。
综合上述实验实施例1和实验实施例2可知，与现有的普通绿茶提取物相比，根据本发明的高温处理的绿茶提取物因肝毒性低而具有高安全性，同时抑制牙龈卟啉单胞菌的功效优异，因此，表现出优异的预防牙周炎的功效。
【实验实施例9】高温处理的绿茶提取物增加脑血流量的功效的评估实验
通过近红外光谱法(NIRS)，可以测定出反映根据神经活性的血液内血红蛋白的氧化程度的信号，从而可无创确认脑血流量。
具体地，通过使用多通道近红外光谱仪器fNIRS(functional near infraredspectroscopy，NIRSIT，OBELAB公司)测定额叶中血红蛋白的饱和度，从而观察脑血流量的变化。首先，当受试者到达时，填写参与研究的同意书，然后介绍整个实验过程。穿戴NIRSIT后对3分钟的休息状态进行测定，以测定基本活性度，此后开始执行本课题，测定30秒的休息状态后，总共解答10道乘法题。课题结束后，与足够的水一同服用样品2的高温处理的绿茶提取物或对照组药物(450mg/2片)。受试者共为23名(12名女性、11名男性)，以盲法及随机法来分配至测试组(共12名；6名女性、6名男性；年龄：32.17±1.84岁)或对照组(共11名；6名女性、5名男性；年龄：30.55±1.26岁)。服用后采取45分钟的休息和吸收期间，然后再次穿戴NIRSIT并测定3分钟的休息状态，此后开始执行本课题。在测定30秒的休息状态(Baseline)后，总共解答30道乘法题(Math arithmetics，MA)。此时，利用近红外光谱法所测定的结果可通过0.1Hz(LPF(DCT 0.1))的低通滤波器(LPF)、0.005Hz(HPF(DCT 0.005))的高通滤波器(HPF)或无高通滤波器(HPF X)的条件下进行分析，从而确认了不同时间段的血红蛋白总量(图9)及整个课题期间的氧化血红蛋白的量(图10)。
其结果如图9和图10所示，与服用对照组相比，可确认到在服用根据本发明的样品2的高温处理的绿茶提取物的情况下，服用45分钟后执行MA课题时，大脑额叶部的血红蛋白总量及被氧化的血红蛋白的量得到显著增加。
综合上述实验实施例1和实验实施例2可知，与现有的普通绿茶提取物相比，根据本发明的高温处理的绿茶提取物因肝毒性低而具有高安全性，同时增加大脑额叶部的血流量，从而表现出优异的改善认知功能的功效。

Claims (9)

1.一种绿茶肝毒性得到缓解的绿茶提取物，其中，基于提取物的总重量，所述绿茶提取物包含8重量％或以下的表没食子儿茶素，
其中基于提取物的总重量，所述提取物包含4重量％至15重量％的(-)-没食子儿茶素没食子酸酯和4重量％至15重量％的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯，并且
其中基于所述提取物的总重量，所述提取物中的(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素、(-)表儿茶素、表儿茶素3-O-没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、儿茶素、及儿茶素没食子酸酯的总含量为19重量％至30重量％。
2.根据权利要求1所述的绿茶提取物，其特征在于，所述提取物为通过选自水及C1-C4醇中的一种或多种物质进行一次或多次提取的提取物。
3.根据权利要求1或2所述的肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于缓解绿茶肝毒性的组合物中的用途。
4.根据权利要求1或2所述的肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于改善血液循环的组合物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述肝毒性得到缓解的绿茶提取物增加血管内皮细胞中一氧化氮。
6.根据权利要求1或2所述的肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于抑制肝细胞中脂肪堆积的组合物中的用途。
7.根据权利要求1或2所述的肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于阻碍牙龈炎菌的组合物中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述牙龈炎菌为牙龈卟啉单胞菌。
9.根据权利要求1或2所述的肝毒性得到缓解的绿茶提取物在制备用于增加脑血流量的组合物中的用途。
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