KR101618953B1

KR101618953B1 - 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101618953B1
Application number: KR1020140054874A
Authority: KR
Inventors: 홍정화; 강성구; 이상현; 송우태; 백승은; 김지영
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2014-05-08
Publication date: 2016-05-09
Also published as: KR20140143692A

Abstract

본 발명은 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 미강 발효 추출물은 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌경색의 크기가 유의적으로 억제되며, 항산화 유전자 또는 신경조절물질의 발현정도를 증가시키고, 뇌의 대뇌피질 또는 선조체 부위의 세포사멸을 억제하여 뇌졸중에 대한 예방 및 치료효과를 나타내므로 뇌손상을 치료하는 뇌보호제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물{Composition containing rice bran fermented extract for prevention or treatment of stroke}

본 발명은 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 및 기능성식품에 관한 것이다.

2005년 통계 기준으로, 우리나라에서 60세 이상의 남녀 모두 사망원인 1위를 차지하는 뇌졸중(stroke)은 뇌에 혈액을 공급하는 혈관이 막히거나 터짐으로써 그 부분의 뇌가 손상되어 나타나는 신경학적 증상을 일컫는 뇌혈관질환으로 단일 질환이라기보다는 다양한 원인에 의해서 발생하며 뇌경색, 뇌출혈, 지주막하 출혈 등 다양한 질환이 포함되어 있다. 이와 같은 뇌졸중은 발병원인이 다양하며 세포생물학적으로 혈액공급의 저하, 신경세포의 손상, 뇌염증세포인 대식세포(macrophage)와 뇌신경교세포(microglia)로부터 분비되는 염증물질, 이로 인한 신경세포사멸이 중요하며 특히 신경교세포의 활성조절과 신경세포보호는 뇌졸중의 예방, 조절 및 치료법 개발의 핵심표적이다.

국내, 외적으로 많은 연구진들이 이러한 신경세포의 사멸에 대한 기전을 연구함으로써 뇌질환을 막고자 하는 노력을 기울여 왔으나, 뇌졸중의 경우 현재 뚜렷한 치료제가 개발되어 있지 못하며, 지금까지 많은 연구진들이 흥분성 신경전달물질인 글루타민산 수용체에 대한 길항제(MK-801)나 항산화제(Edaravone)를 허혈성 뇌졸중 치료제로 개발하고자 하였으나 약효가 미미하고 약물의 독성으로 인하여 현재 사용되지 못하고 있다. 임상적으로는 뇌혈관에 생성된 혈전을 용해하기 위하여 사용되고 있는 tPA(tissue plasminogen activator)가 유일한 약물이지만 많은 임상 의사들이 뇌출혈 등의 심각한 부작용을 우려하여 사용을 꺼리고 있는 실정이다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 뇌졸중 치료제 및 치료방법의 개발이 시급한 실정이다.

대한민국 특허출원 제1182199호

이에 본 발명자들은 미강 발효 추출물을 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 사용할 경우, 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌경색의 크기가 유의적으로 억제되며, 항산화 유전자 또는 신경조절물질의 발현정도를 증가시키고, 뇌의 대뇌피질 또는 선조체 부위의 세포사멸을 억제하여 뇌졸중을 효과적으로 치료할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 조성물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 방법으로 제조된 미강 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 목적은 신규한 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG) KFCC11556P 균주를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미강 발효 추출물은 미강 열수 추출물 100 중량 대비 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)의 배양물을 1 내지 30 중량%로 접종하여 제조할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미강 발효 추출물은 뇌의 대뇌피질(Cortex) 및/또는 선조체(Striatum)의 경색을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미강 발효 추출물은 항산화 유전자(PDI, Nrf2) 및/또는 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현정도를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미강 발효 추출물은 뇌의 대뇌피질(Cortex) 및/또는 선조체(Striatum) 부위에서 세포사멸을 억제 또는 감소시키거나, 뉴런의 수를 증가시킬 수 있다.

본 발명은 미강 발효 추출물은 미강 열수 추출물 100 중량 대비 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)의 배양물을 1 내지 30 중량%로 접종하여 제조시킨 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 개선용 기능성 식품을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 미강과 물을 1 : 9의 중량비로 혼합한 후 110 ~ 130 ℃의 온도로 10 ~ 20분간 열수 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양 하는 단계; (c) 고압멸균기(autoclave)에서 상기 (b)단계의 배양물을 121℃의 온도로 15분간 멸균하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계에서 여과된 미강 발효물을 54 brix의 농도로 농축한 다음 동결건조하는 단계를 포함하는 뇌졸중 또는 뇌질환 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)은 미강 열수 추출물 100 중량 대비 1 내지 30 중량%로 접종하여 제조할 수 있다.

나아가 본 발명은 신규한 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG) KFCC11556P 균주를 제공한다.

본 발명에 따른 미강 발효 추출물은 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌경색의 크기가 유의적으로 억제되며, 항산화 유전자 또는 신경조절물질의 발현정도를 증가시키고, 뇌의 대뇌피질 또는 선조체 부위의 세포사멸을 억제하여 뇌졸중에 대한 예방 및 치료효과를 나타내므로 뇌손상을 치료하는 뇌보호제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 미강 열수 추출물 처리에 따른 뇌경색 총 부피, 대뇌피질 및 선조체에서의 뇌경색 감소 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 미강 발효 추출물 처리에 따른 뇌경색 총 부피, 대뇌피질 및 선조체에서의 뇌경색 감소 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 미강 열수 추출물(A)와 미강 발효 추출물(B) 처리에 따른 mNSS 행동태스트 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 세포사멸 정도를 확인한 결과이다.
도 5는 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 항산화 유전자(PDI, Nrf2)(A)와 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)(B)의 발현정도를 확인한 결과이다.
도 6은 미강 열수 추출물과 미강 발효 추출물 처리에 따른 뉴런 증가 효과가 있는지를 알아보기 위하여 면역조직화학 분석을 한 결과이다.

본 발명은 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 뇌졸중으로 인해 나타나는 뇌경색의 크기가 유의적으로 억제되며, 항산화 유전자 또는 신경조절물질의 발현정도를 증가시키고, 뇌의 대뇌피질 또는 선조체 부위의 세포사멸을 억제시킬 수 있어 뇌졸중을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공할 수 있는 특징이 있다.

본 발명자들은 뇌졸중을 예방 또는 치료할 수 있는 새로운 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중 미강에 주목하였다.

미강 (米糠, rice bran)은 벼의 도정과정 중 발생하는 부산물로서 12 ~ 16%의 단백질과 20 ~ 25%의 셀룰로스(cellulose), 헤미셀룰로스 (hemicellulose) 등의 식이섬유와 16 ~ 22%의 지방을 함유하고 있고 그 밖에 비타민, 미네랄 등의 미량영양소가 풍부하게 함유되어 있으며, 이 외에도 인체에 유효한 폴리페놀(polyphenol) 등의 성분이 풍부하게 함유되어 영양적으로 가치가 매우 높은 것으로 알려져 있다.

최근 미강에 함유되어 있는 다양한 종류의 폴리페놀 (polyphenol) 성분과 헤미셀룰로스(hemicellulose), 베타글루칸(β-glucan), 아라비녹실란 (arabinoxylan) 및 펙틴(pectin) 등의 다당체 성분이 면역기능을 활성화 시켜주고 항암작용 등의 기능을 갖는다는 연구들이 발표되면서 미강의 가치가 새로이 조명되고 있으나 아직까지 미강을 뇌졸중의 치료에 사용한다는 연구는 없다.

이에 본 발명자들은 미강 발효 추출물을 뇌졸중의 예방 및 치료를 위한 용도로 사용할 수 있음을 최초로 규명하였는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면 미강 발효 추출물이 뇌경색 총 부피, 대뇌피질 및 선조체 부위에서 뇌경색을 감소시킬 수 있는지를 확인한 결과, 미강 발효 추출물을 섭취하지 않은 뇌손상 동물군에 비해 월등히 뇌경색 정도가 감소되었으며, 항산화작용, 뇌 혈류량 증가 방지 및 치매 예방에 대한 효과가 알려진 페룰산(Ferulic Acidm, FA)을 섭취한 군과 비슷한 뇌경색 감소 효과를 보임을 알 수 있었다.

미강 발효 추출물 처리에 따른 뇌경색 유도 실험동물의 행동테스트를 하기 위하여 뇌경색 유도 하루 전과 뇌경색을 유도한 후 1, 3일째에 종합적인 행동테스트를 실시한 결과, 미강 발효 추출물을 처리하지 않은 대조군에서는 운동피질(M1과 M2 자리) 부분에서 뇌경색이 보였으나, 20%의 미강 발효 추출물을 섭취한 군에서는 운동피질(M1과 M2 자리) 부분에서 뇌경색이 보이지 않았으며, 20%의 미강 발효 추출물을 섭취한 군과 페룰산을 섭취한 군(FA)에서 행동평가가 유의적으로 개선되었음을 알 수 있었다.

또한, 미강 발효 추출물 처리에 따른 세포사멸 정도를 분석하기 위하여 뇌졸중이 유도된 실험동물군의 뇌의 대뇌피질(Cortex)와 선조체(Striatum) 부위의 세포사멸 정도를 확인한 결과, 미강 발효 추출물을 처리한 동물군에서는 미강 발효 추출물을 섭취하지 않은 뇌손상 동물군에 비해 월등히 세포사멸 정도가 감소하였음을 알 수 있었다.

또한, 미강 발효 추출물 처리에 따른 항산화 유전자(PDI, Nrf2)와 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현정도를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과, 미강 발효 추출물이 처리되지 않은 대조군에서는 항산화 유전자(PDI, Nrf2)와 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현 정도가 거의 없었으나, 본 발명의 미강 발효 추출물군인 RB 그룹 및 페룰산 군(FA)에서는 발현정도가 증가하였음을 알 수 있었다.

나아가 본 발명자들은 미강 발효 추출물 처리에 따른 뉴런 증가 효과 여부를 알아보기 위하여 해마의 Dantate Gyrus, CA1 및 CA3 부위에 존재하는 뉴런(Neuron)의 세포수를 확인한 결과, 미강 발효 추출물을 처리한 동물군에서는 미강 발효 추출물을 섭취하지 않은 뇌손상 동물군의 Dantate Gyrus와 CA1 및 CA3 부위에 비해 월등히 뉴런 수가 증가되었음을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 미강 발효 추출물은 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다. 상기 뇌졸중 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 상기 미강 발효 추출물 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 미강 발효 추출물 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 성인의 경우, 본 발명의 약제학적 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시 1 내지 250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다. 이 투여량은 환자의 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감(增減)하는 것이 바람직하다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

그러나 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구 내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 뇌졸중 예방 또는 치료용 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다.

본 발명의 뇌졸중 예방 또는 치료용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 및 유제품 등이 있다.

이때, 식품에 첨가되는 미강 발효 추출물 양은 전체 식품 중량을 기준으로 0.01 내지 10 중량부가 바람직하다. 특히 식품이 음료류인 경우, 전체 음료 조성물 100㎖를 기준으로 0.001 내지 1g, 바람직하게는 0.1 내지 1g의 비율로 첨가할 수 있다. 첨가하는 양이 0.001g 미만인 경우 뚜렷한 뇌졸중 예방 또는 치료효과를 기대할 수 없으며, 첨가하는 양이 1g을 초과하는 경우 미강 발효 추출물의 맛이 강하여 식품 자체의 맛을 방해하게 된다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 미강 발효 추출물 이외에 통상의 보조제를 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기보조제로는 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 있다.

본 발명은 또한 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 식품을 제공한다.

상기 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 및 유제품 등이 있다.

본 발명은 또한,

(a) 미강과 물을 1 : 9의 중량비로 혼합한 후 110 ~ 130 ℃의 온도로 10 ~ 20분간 열수 추출하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양 하는 단계; (c) 고압멸균기(autoclave)에서 상기 (b)단계의 배양물을 121의 온도로 15분간 멸균하는 단계; (d) 상기 (c)단계에서 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하는 단계; 및 (e) 상기 (d)단계에서 여과된 미강 발효물을 54 brix의 농도로 농축한 다음 동결건조하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 또는 뇌질환 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 (b) 단계에서는 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P) 균주를 미강 열수 추출물 100 중량 대비 1 내지 30 중량%로 접종하여 제조하는 것이 바람직하다.

나아가 본 발명은 신규한 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG) KFCC11556P 균주를 제공하며, 본 발명의 신균주는 다음과 같은 염기서열을 갖는다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

미강 추출물 제조방법

<1-1> 미강 열수 추출물 제조

미강 열수 추출물은 쌀을 도정한 후 남은 껍질부분을 도정 후 어떠한 가공을 하지 않고 제조한 미강 고형물과 물을 1:9의 비율로 섞어준 다음 121℃에서 15분간 추출하였다.

<1-2> 미강 발효 추출물 제조

본 발명자들은 미강 발효 추출물을 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 미강 열수 추출물에 자체 분리 동정한 신균주인 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 5, 10, 20%를 각각 첨가하여 35 진탕배양기(Shaking incubator)에서 120rpm의 속도로 24시간 교반배양 한 다음, 유산균주 불활성화를 위해 오토클레이브(Autoclave)를 이용하여 121℃에서 15분간 멸균처리 하였다. 멸균 처리된 미강발효 샘플을 원심분리(10,000×g, 15min)하여 상층액을 취한 다음 여과지(Whatman No. 40)를 이용하여 감압여과 한 후 54 Brix로 농축한 다음, 동결건조 하여 미강 발효 추출물을 제조하였다.

<실시예 2>

본 발명에 따른 미강 추출물의 항산화능 효과 분석

본 발명의 방법으로 제조한 미강의 추출물을 대상으로 항산화능이 있는지 여부를 알아보기 위하여 TEAC(Trolox equivalent antioxidant) 및 ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capacity)를 이용하여 측정하였다.

먼저 TEAC를 측정하기 위하여 상기 실시예 1에서 수득한 미강 발효 추출물을 농축한 뒤 동결 건조한 샘플 20㎕을 200㎕의 ABTS 시약과 섞은 후 4분간 방치하고 마이크로플레이트리더(micro plate reader)를 이용하여 파장을 734nm로 설정한 다음 흡광도를 측정하였다.

ORAC를 측정하기 위하여 상기 실시예 1에서 수득한 미강 발효 추출물을 농축한 뒤 동결 건조한 샘플 20㎕을 120㎕의 워킹 솔루션(working solution)과 섞은 후 37℃ 인큐베이터에서 15분간 방치한 다음 120㎕의 AAPH시약을 섞어준 후 마이크로 플레이트(micro plate)를 이용하여 37℃에 2시간 방치 한 후 reader는 485nm로 exctitation은 528nm로 파장을 설정하여 흡광도를 측정하였다.

또한, 이때 미강 발효 추출물과 함께 발효시키지 않은 미강 열수 추출물도 함께 TEAC와 ORAC 실험법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였는데, 그 결과, 미강 열수 추출물은 TEAC와 ORAC가 각각 40.43±0.85, 120.49±3.33으로 나타났고 미강 발효 추출물은 각각 46.03±0.96, 136.25±3.81인 것으로 나타났다.

2가지의 추출물 모두 항산화 활성이 있는 것으로 나타났으며, 특히 미강 열수 추출물에 비해 발효 추출물이 더 우수한 항산화 활성이 있는 것을 알 수 있었다. 나아가 본 발명의 미강 발효 추출물은 생산공정 중 유효성분이 산화되는 것을 방지하여 추출물의 가공적성 및 안정성을 확보하기에도 유리하다는 사실을 알 수 있었다(표 1 참조).

<실시예 3>

본 발명에 따른 미강 추출물의 뇌졸중 개선 효과

<3-1> 미강 추출물 처리에 따른 뇌경색 감소 효과

본 발명자들은 본 발명의 미강 발효 추출물 및 미강 열수 추출물이 뇌졸중을 치료할 수 있는 효과가 있는지를 알아보기 위해 뇌경색 유도 동물 모델을 제조하였다.

먼저, 뇌경색 유도 동물 모델을 제조하기 위하여 평균 체중 250±20g의 Sprague Dawley을 사용하였으며, 실험동물 마취 후 사지를 고정시킨 뒤 좌측 총 경동맥을 속목동맥과 바깥목동맥의 분지지점까지 노출시켰다. 속목동맥 양쪽을 묶은 후 중간지점을 자르고 날개구개동맥를 폐쇄시킨 후 바깥목동맥를 묶고 절단한 뒤 절단된 바깥목동맥으로부터 나일론사를 이용해 속목동맥를 폐쇄하고 1시간 동안 중대뇌동맥(MCA)의 혈관폐쇄를 통한 혈액공급의 중단을 유지켰다. 1시간 동안 혈액공급이 중단된 상태에서 혈액을 재관류(reperfusion)시키는 방법으로 중대뇌동맥 결찰(middle cerebral artery occlusion; MCAO)을 시켜 중대뇌동맥 결찰에 의한 뇌손상 유도 실험동물을 제조하였다.

상기 뇌경색이 유도된 마우스를 대상으로 본 발명의 미강 발효 추출물 및 미강 열수 추출물을 각각 섭취하게 하였고 각 마우스의 체중에 대해 섭취량을 달리하여 수행하였다. 3일 후에 실험동물을 치사시킨 뒤 뇌조직을 얻어 금속성의 뇌 복합체(metallic brain matrix)를 이용하여 2mm 두께로 조직을 절편하였으며, 2% TTC용액에 조직을 염색을 하여 뇌경색 정도를 확인하여 비교하였다.

그 결과, 미강 열수 추출물을 섭취하지 않은 대조군에 비해 열수 추출물을 처리한 군이 뇌경색 부피가 감소하는 것으로 나타났으며, 구체적인 결과는 하기 표 2에 기재된 바와 같다(표 2 및 도 1 참조).

또한, 미강 발효 추출물 섭취에 따른 뇌경색 개선 및 치료 효과에 대해서도 상기 기술된 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였는데, 모든 실험 조건을 동일한 상태에서 각 질병 마우스 군에 섭취하게 한 추출물만을 달리하고 동일양을 섭취하게 하여 실험을 수행하였다.

그 결과, 하기 표 3 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 미강 열수 추출물 및 미강 발효 추출물 모두 뇌경색의 부피를 감소시키는 것으로 나타났고, 열수 추출물에 비해 발효 추출물이 더 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다(표 3 및 도 2 참조).

따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 미강 발효 추출물및 미강 열수 추출물을 뇌경색의 증상을 개선시킬 수 있고 나아가 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었으며, 특히 본 발명의 추출물 효과는 항산화작용, 뇌 혈류량 증가 방지 및 치매 예방에 대한 효과가 알려진 페룰산(Ferulic Acidm, FA)을 섭취한 군과 유사 또는 더 우수한 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

<3-2> 미강 추출물 처리에 따른 행동테스트 결과

본 발명자들은 상기 실시예 <3-1>에서 제조된 뇌경색 유도 실험동물의 행동테스트를 하기 위하여 뇌경색 유도 하루 전과 뇌경색을 유도한 후 1, 3일째에 종합적인 행동테스트를 실시하였다.

mNSS(vmodified Neurological Severity Score)는 모터, 지각, 반사, 균형을 시험하는 혼합 테스트로서 본 발명에서는 mNSS로 뇌경색 유도 전과 후의 행동 양상을 비교 및 평가하였는데, 실험 대상 동물을 뇌경색 유도 전에 3일 간 훈련을 시킨 후 실험을 3번 반복하여 평균을 냈다. mNSS 분석에서 신경학적인 기능은 0에서 18점으로 나타냈으며, 정상일 때는 0이고, 최대치의 손상을 18로 나타내었다.

그 결과, 미강 열수 추출물을 섭취하지 않은 대조군에 비해 열수 추출물을 처리한 군이 행동적으로 개선되는 것으로 나타났으며, 구체적인 결과는 하기 표 4에 기재한 바와 같다(표 4 및 도 3 참조).

또한, 미강 발효 추출물 섭취에 따른 행동테스트 결과를 분석하기 위해 상기 기술된 방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였는데, 모든 실험 조건을 동일한 상태에서 각 질병 마우스 군에 섭취하게 한 추출물만을 달리하고 동일양을 섭취하게 하여 실험을 수행하였다.

그 결과, 미강 발효 추출물을 섭취하지 않은 대조군에 비해 발효 추출물을 처리한 군이 행동적으로 개선되는 것으로 나타났으며, 구체적인 결과는 하기 표 5에 기재한 바와 같다(표 5 및 도 3 참조).

따라서 이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 미강 발효 추출물 및 미강 열수 추출물이 행동테스트에서 행동평가가 유의적으로 개선됨을 확인하였고, 열수 추출물에 비해 발효 추출물이 더 우수한 효과가 있는 것으로 나타났음을 확인하였으며, 특히 본 발명의 추출물 효과는 항산화작용, 뇌 혈류량 증가 방지 및 치매 예방에 대한 효과가 알려진 페룰산(Ferulic Acidm, FA)을 섭취한 군에 비해 보다 개선된 행동평가를 보이는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

<3-3> 미강 추출물 처리에 따른 세포사멸 감소 효과

본 발명자들은 미강 발효 추출물 처리에 따른 세포사멸 정도를 분석하기 위하여 본 발명의 실험동물에 중대뇌동맥 결찰행을 시행 후 각 그룹별로 관류(Perfusion)를 시행하였다. 상기 실험동물을 미강 발효 추출물 처리하지 않은 대조군(Vehicle), 미강 열수 추출물(RB)을 섭취한 군, 미강 발효 추출물(Lw)을 섭취한 군 및 페룰산을 섭취한 군(FA)으로 각각 나누었다. 3일 후에 각 실험동물을 치사시킨 뒤 세포 사멸을 확인할 뇌의 대뇌피질(Cortex)와 선조체(Striatum) 부위를 몰딩(molding)한 후 크라이오스태트(Cryostat)로 고정한 뇌조직을 동결절편하였으며, 절편된 조직을 고정하고 TUNEL reagent 을 처리하여 세포사멸이 일어난 세포를 관찰하였다.

그 결과, 미강 추출물을 섭취하지 않은 대조군에 비해 미강 추출물을 처리한 군이 사멸된 세포의 수가 많은 것으로 나타났고, 미강 열수 추출물에 비해 발효 추출물이 사멸된 세포의 수가 많은 것으로 나타났으며, 구체적인 결과는 하기 표 6에 기재한 바와 같다(표 6 및 도 4 참조).

따라서 본 발명의 미강 발효 추출물 및 미강 열수 추출물을 섭취한 군이 미강 발효 추출물 및 미강 열수 추출물을 섭취하지 않은 뇌손상 동물군에 비해 세포사멸 정도가 우수한 효과가 있음을 확인하였고, 특히 본 발명의 추출물 효과는 항산화작용, 뇌 혈류량 증가 방지 및 치매 예방에 대한 효과가 알려진 페룰산(Ferulic Acidm, FA)을 섭취한 군에 비해 보다 우수한 세포사멸 정도를 보이는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

<3-4> 미강 추출물 처리에 따른 항산화 유전자 및 신경조절물질 발현정도 측정

본 발명자들은 미강 열수 추출물 및 미강 발효 추출물 처리에 따른 항산화 유전자(PDI, Nrf2)와 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현정도를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과, 미강 추출물이 처리되지 않은 대조군에서는 항산화 유전자(PDI, Nrf2)와 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현 정도가 거의 없었으나, 본 발명의 미강 열수 추출물군인 RB 그룹, 미강 발효 추출물군인 Lw 그룹 및 페룰산 군(FA)에서는 발현정도가 증가하였음을 알 수 있었고, 미강 열수 추출물 보다 미강 발효 추출물이 발현정도가 보다 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

따라서 본 발명의 미강 발효 추출물은 미강 발효 추출물을 섭취하지 않은 뇌손상 동물군에 비해 항산화 유전자와 신경조절물질 발현정도가 증가함을 확인하였고, 특히 본 발명의 추출물 효과는 항산화작용, 뇌 혈류량 증가 방지 및 치매 예방에 대한 효과가 알려진 페룰산(Ferulic Acidm, FA)을 섭취한 군에 비해 보다 우수한 발현 정도를 보이는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

<3-5> 미강 추출물 처리에 따른 뉴런 증가 효과

본 발명자들은 미강 추출물 처리에 따른 뉴런 증가 효과가 있는지를 알아보기 위하여 면역조직화학 분석을 하였다.

먼저, 실시예 <3-3>에서 사용된 대뇌피질(Cortex)과 선조체(Striatum) 뇌조직에 1차 항체(Primary antibody) 처리와 2차 항체(Secondary antibody) 처리를 하였으며, 여기에 사용된 항체는 신경 영양 인자 유전자인 BDNF, GDNF을 사용하였고, 상기와 같이 면역조직화학분석을 통하여 해마의 Dantate Gyrus, CA1 및 CA3 부위에 존재하는 뉴런(Neuron)의 세포수를 확인하였다.

그 결과, 미강 추출물을 섭취하지 않은 대조군에 비해 미강 추출물을 처리한 군이 뉴런 세포의 수가 많은 것으로 나타났고, 미강 열수 추출물에 비해 발효 추출물이 뉴런 세포의 수가 많은 것으로 나타났으며, 구체적인 결과는 하기 표 7에 기재한 바와 같다(표 7 및 도 6 참조).

따라서 본 발명의 미강 발효 추출물을 섭취하게 한 군은 미강 발효 추출물을 섭취하지 않은 뇌손상 동물군의 Dantate Gyrus와 CA1 및 CA3 부위에 비해 월등히 뉴런 수가 증가되었으며, 특히 본 발명의 추출물 효과는 항산화작용, 뇌 혈류량 증가 방지 및 치매 예방에 대한 효과가 알려진 페룰산(Ferulic Acidm, FA)을 섭취한 군에 비해 유사 또는 더 우수한 뉴런 세포 수 증가 효과가 있는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 대한 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11556P

20130524

Claims

미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 미강 발효 추출물은 미강 열수 추출물 100 중량 대비 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)의 배양물을 1 내지 20 중량%로 접종하여 제조된 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 미강 발효 추출물은 뇌의 대뇌피질(Cortex) 또는 선조체(Striatum)의 경색을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미강 발효 추출물은 항산화 유전자(PDI, Nrf2) 또는 신경조절물질(BDNF, NGF 및 GDNF)의 발현정도를 증가시키는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 미강 발효 추출물은 뇌의 대뇌피질(Cortex) 또는 선조체(Striatum) 부위에서 세포사멸을 억제 또는 감소시키거나, 뉴런의 수를 증가시키는 것을 특징으로 하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
미강 열수 추출물 100 중량% 대비 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)의 배양물을 1 내지 20 중량%로 미강 열수 추출물에 접종하여 제조한 미강 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 및 개선용 기능성 식품.
(a) 미강과 물을 1 : 9의 중량비로 혼합한 후 110 ~ 130 ℃의 온도에서 10 ~ 20분간 열수 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계의 미강 열수 추출물에 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)을 접종하고 교반배양기에서 120rpm의 속도로 24시간 동안 배양하는 단계;
(c) 고압멸균기(autoclave)에서 상기 (b)단계를 통해 수득한 배양물을 121℃의 온도로 15분간 멸균하는 단계;
(d) 상기 (c)단계에서 멸균된 미강 발효물을 원심분리 후 상층액을 여과하는 단계; 및
(e) 상기 (d)단계에서 여과하여 수득한 미강 발효물을 54 brix의 농도로 농축한 다음 동결 건조하는 단계를 포함하는, 뇌졸중 또는 뇌질환 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물을 제조하는 방법.
제7항에 있어서,
상기 (b) 단계의 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG, 기탁번호: KFCC11556P)은 미강 열수 추출물 100 중량% 대비 1 내지 20 중량%의 양으로 접종하여 제조한 것을 특징으로 하는 뇌졸중 또는 뇌질환 치료 효과를 갖는 미강 발효 추출물을 제조하는 방법.
신규한 락토바실러스 프랜타럼 홍(Lactobacillus plantarum HONG) KFCC11556P 균주.