JP5282340B2

JP5282340B2 - 天然素材の抗酸化作用および／またはリパーゼ阻害活性を増強させる方法、ならびに当該活性が増強された天然素材

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Publication number: JP5282340B2
Application number: JP2008064942A
Authority: JP
Inventors: 圭一郎杉本; 泉高石; 一弥中川; 浩宇山; 博乾
Original assignee: Nagaoka Co Ltd; Osaka University NUC; Osaka Prefecture University
Current assignee: Nagaoka Co Ltd; Osaka University NUC; Osaka Prefecture University
Priority date: 2008-03-13
Filing date: 2008-03-13
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2028-03-13
Also published as: JP2009221116A

Description

本発明は、オキシダーゼを用いる酵素反応により、食品・医薬品・化粧品用天然素材の抗酸化作用、リパーゼ阻害活性を増強させる方法、ならびに当該活性が増強された天然素材に関する。

糖尿病などに代表される生活習慣病は、遺伝因子と環境因子の相乗作用により発症する。生活習慣病は動脈硬化症等の深刻な疾患に進行することが多く、わが国における保険医療費は増加の一途を辿っている。このような状況下、生活習慣病の前症状であるメタボリックシンドローム段階での予防が注目されているが、わが国におけるメタボリックシンドロームは未病扱いとなっているため、保険が適用できない。そのため、副作用が現れやすい合成または高純度に精製された治療薬を用いない方法で、メタボリックシンドロームの予防を目指す必要がある。
メタボリックシンドロームの増悪化は、食後の血糖値や中性脂肪の上昇にともなう酸化的ストレスの亢進によって促進されることが知られている。

一方、わが国では和漢薬や植物抽出物を利用した化粧料等、伝統的に天然物を疾病の改善や健康維持に利用する伝統がある。１９８０年代に文部省（現・文部科学省）の「食品機能の系統的解析と展開」研究班は食品の機能として３つの概念を提唱した。すなわち栄養素としての働き（一次機能）、風味食感等嗜好面での働き（二次機能）のほか、三次機能として生体の健康を維持・増進する生体調節機能であり、近年はこの三次機能に注目が集まっている。医療の分野においても医療費高騰・副作用等近代医学への反省から、それを補完代替する代替医療が再評価されつつある。
従って、食後の酸化的ストレスの抑制（以下、「食後抗酸化」という）作用を有する食品・医薬品・化粧品・飼料用天然素材を開発・実用化することは、メタボリックシンドロームの増悪化を予防する手段として優れており、これまでに多数研究されている。

しかしながら、食品・医薬品・化粧品・飼料用原料として用いられる天然素材は、それらの病態を抑制するのに十分な作用を有するものが少なく、極端に多量摂取しないと効果が現れないものが多い。

一方ポリフェノールは、体内に摂取、蓄積された悪玉のLDLコレステロールの酸化を阻害し、高血圧、動脈硬化および動脈硬化を原因とした脳血管障害、心臓病などを予防する効果があることから、機能性食品や化粧料等の素材として広く用いられている。緑茶カテキンに代表される天然ポリフェノールの大部分は単量体であるが、紅茶やぶどう等には生理活性に優れた多量体（オリゴマー）が微量含まれている。多量体の生体調節機能は単量体より優れていることが多く、機能性食品素材としての開発が望まれているが、含有量が低く、かつ化学構造も多岐にわたり複雑であるために、抽出等の方法を用いて、品質を一定かつ安価に多量体の含量を高めた製剤を製造するのは困難であることが多い。このような理由から天然ポリフェノールの多量体は高価であるものが多く、日常生活においてメタボリックシンドローム予防の手段として普遍的に常用されるものはほとんどないのが実情である。

このような問題を解決すべく、特許文献１には、ポリフェノールとアルデヒドの重縮合、または酸化重合することにより合成されるポリフェノール重合物を含有する抗酸化剤が記載されている。ポリフェノールの具体例としては、カテキンおよびルチンが挙げられており、これらの重合体が一定の抗酸化作用を有することが特許文献１に示されている。

また、メタボリックシンドロームの予防として重要なのが肥満対策である。問題となる内臓脂肪型肥満の主たる要因は栄養脂肪の過剰摂取である。また、脂肪の過剰摂取は、肥満のみならず、肥満に起因する糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化等を発症させることが知られている。

肥満を予防するためには、食事制限により摂取カロリーを減らすことが有効な手段ではあるものの、日常生活において実行することは困難である場合が多い。そこで、食事由来の脂肪が体内に吸収されることを安全かつ健康的に抑制することは、肥満及びそれに関連する疾患の治療あるいは健康増進の目的で、現実的で有用な方策であると考えられる。

そのため、植物由来のリパーゼ阻害活性物質、特にリパーゼ阻害活性を有するポリフェノール類が注目されている。特許文献２には、茶に含まれる種々のポリフェノールのリパーゼ阻害活性を評価した結果、プロアントシアニジン類、特にガレート基を有するプロアントシアニジン類が強いリパーゼ阻害活性を有すると記載されている。
また、特許文献３には、茶に含まれるエピガロカテインガレート（ＥＧＣＧ）の2量体がリパーゼ阻害活性を有すると記載されている。

特開２００３−１３８２５８号公報特開２００６−１９０９号公報特開２００６−１６３６７号公報

しかしながら、これらは天然物から精製されたものであり、製造に高度な精製工程が加わるため、製造にかかるコストが高くなりがちである。また、安全性を考えると、食品等として利用するには精製物よりも常食される天然物を原料としたほうが好ましい場合も考えられる。

本発明は、安全性の高い天然素材を用いて、該天然素材の抗酸化作用ならびにリパーゼ阻害作用を増強させる方法、および当該作用が増強された食品・医薬品・化粧品・飼料用天然素材を提供することを目的とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、酸化酵素としてオキシダーゼ類を用いて天然素材を処理することにより、高い抗酸化活性およびリパーゼ阻害活性を有する天然素材の重合体が得られ、これによって天然素材の抗酸化作用ならびにリパーゼ阻害作用が増強されるという新たな事実を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明に係る天然素材の抗酸化作用および／またはリパーゼ阻害活性を増強させる方法は、オキシダーゼを用いる酵素反応により、食品、医薬品、化粧品または飼料用の天然素材を処理することを特徴とする。

前記オキシダーゼは、ラッカーゼであるのがよい。前記天然素材としては、オリーブ、ジャスミン、ハッカ、ホップ、ユーカリ、リンゴ、カカオおよびブドウから選ばれる少なくとも１種が挙げられる。

また、本発明に係る抗酸化作用および／またはリパーゼ阻害活性が増強した食品、医薬品、化粧品または飼料用の天然素材は、オキシダーゼを用いる酵素反応により処理したことを特徴とする。

さらに本発明の抗酸化剤は、オキシダーゼを用いる酵素反応により処理した天然素材を含有することを特徴とする。本発明のリパーゼ阻害剤は、オキシダーゼを用いる酵素反応により処理した天然素材を含有することを特徴とする。

これらの抗酸化作用および／またはリパーゼ阻害活性が増強した天然素材は、食品、医薬品、化粧品または動物用飼料に使用するのに好適である。

本発明の方法に係るオキシダーゼ処理した天然素材は、高い抗酸化活性および／またはリパーゼ阻害活性を有するので、抗酸化剤および／またはリパーゼ阻害剤として、これを飲食料、動物飼料、医薬組成物、動物用飼料などに含有させることにより、メタボリックシンドローム予防の手段として、特に肥満対策に有用であり、糖尿病、高脂血症、高血圧、動脈硬化および動脈硬化を原因とした脳血管障害、心臓病等を予防する効果が期待される。本発明に係るオキシダーゼ処理した天然素材は、高い抗酸化活性およびリパーゼ阻害活性を有するため、化粧料としても有用である。
また、本発明におけるオキシダーゼ処理天然素材は、従来報告されたオキシダーゼ等を用いて重合化されたポリフェノール類のように、高度に精製された化合物または合成された化合物ではなく、食品等として使用経験が豊富な天然物を原料とするため安全性が高いという効果がある。また、入手が容易で安価に調達できる利点も挙げられる。

本発明の天然素材は、とくに限定されないが、ポリフェノールを多く含むものが望ましく、具体例を挙げると、本発明の抗酸化剤は、オリーブ、ジャスミン、ハッカ、ホップ、ユーカリ、リンゴ、カカオ、ブドウの抽出物から選ばれる少なくとも１種をラッカーゼ等のオキシダーゼで処理して得られる生成物を含有するのがよい。また、このような抗酸化剤は、飲食料、動物飼料、医薬組成物、化粧料または動物用飼料に含有して使用される。

本発明における食品・医薬品・化粧原料・飼料は、それぞれの原料となる天然物に酵素液を噴霧する等直接酵素を接触させることが考えられるが、適当な溶媒に懸濁し、オキシダーゼを作用させて製造する方法がある。

本発明における天然素材は、とくに限定されないが、ポリフェノールを多く含むものが望ましく、さらに望ましくはポリフェノール含量を高めるべく抽出・精製等の処理を加えると効率よく目的物が得られる。具体例を挙げると、本発明のリパーゼ阻害剤は、オリーブ、ジャスミン、ハッカ、ホップ、ユーカリ、リンゴ、カカオ、ブドウから選ばれる少なくとも１種の抽出物をラッカーゼ等のオキシダーゼで処理して得られる生成物を含有するのがよい。また、このようなリパーゼ阻害剤は、飲食料、動物飼料、医薬組成物または化粧料に含有して使用される。

オキシダーゼ処理の対象となる天然素材は、とくに限定されず、任意のものを用いることができ、例えば食品・医薬品・化粧原料等として市販されているものを原料にしてもよい。好ましくはリパーゼ阻害作用、抗酸化作用を効率よく高めるためにポリフェノール含量が多いものが望ましい。原料をそのままオキシダーゼ処理してもかまわないが、ポリフェノール含量を高めるために含水または有機溶媒等を用いて抽出した抽出物を用いるのが望ましい。さらに、物理・化学的性質、風味等を改善するため、部分的に精製等の加工を加えることも考えられる。

ポリフェノール含量を高めるために行う抽出操作は、特に制限されるものではなく、通常用いられる方法により製造することができる。また、抽出条件も特に制約はなく、原料をそのまま、または裁断、粉砕もしくは細紛した後、搾取または溶媒で抽出することにより製造される。

このうち、溶媒を用いた抽出は、一般に使用する溶媒に合わせて常圧〜加圧下で常温〜溶媒の沸点の温度条件下で１０分〜１週間程度行えばよい。抽出に使用する溶媒としては、植物種や処理工程にあわせて通常用いられる溶媒を適宜選択して用いればよく、例えば、水やアルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノール等の低級アルコール、又はプロピレングリコール、１,３−ブチレングリコール等の多価アルコール）、アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、その他キシレン、ベンゼン、クロロホルム等の有機溶媒が挙げられる。なお、食品として用いる場合のように、有機溶媒の残留が好ましくない場合は、特に水、エタノール、含水エタノール等を使用することが好ましい。これらの溶媒は単独で用いることもできるが、２種類以上を任意に組み合わせて使用することもできる。抽出方法としては、特に制限はなく、常温ホモジナイズ抽出、還流抽出、超臨界流体抽出、過熱水蒸気を用いる抽出等が使用可能である。

具体的には、例えば以下の方法が使用できる。すなわち、食品・医薬品・化粧品原料の原体あるいは乾燥物を細砕し、抽出溶媒を５〜２０倍量加え、常圧下、室温で１週間程度静置、又は抽出溶媒の沸点付近で１０〜３０分程抽出してから濾過して得られた濾液を減圧乾固あるいは凍結乾燥して抽出物を得る。

上記のようにして得られた抽出物はそのままの状態でオキシダーゼ処理に使用することもできるが、必要に応じ、その効力に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良い。このような精製処理としては、通常の手段を任意に選択して行えば良く、例えば濾過又はイオン交換樹脂や活性炭カラム等を用い、吸着・脱色・精製等を行なえば良い。更に、凍結乾燥又は濃縮処理等により溶液状、ペースト状、ゲル状、又は粉末状の精製物を得ることができる。

本発明に用いられる原料は、食品・医薬品・化粧品・動物用飼料等の原料に用いられるものであれば特に限定されないが、好ましくはポリフェノール含量を高めたオリーブ、ジャスミン、ハッカ、ホップ、ユーカリ、リンゴ、カカオ、ブドウ等の溶媒抽出物、好ましくは熱水または含水エタノール抽出物が挙げられる。
（１）オリーブ
学名：Olea europaea L.
（２）ジャスミン
学名：Jasminum officinale
（３）ハッカ
学名：Menta spp.（M. arvensis、M. piperita、M. spicata等）
（４）ホップ
学名：Humulus lupulus
（５）ユーカリ
学名：Eucalyptus spp.（E. globulus, E. robusta, E. citriodra等）
（６）リンゴ
学名：Malus pumila
（７）カカオ
学名：Theobroma cacao
（８）ブドウ
学名：Vitis spp.（V. labrusca、V. vinifera等）

本発明で使用される触媒としては、天然素材に含まれるフェノール類の酸化を促進するオキシダーゼを使用するのが好ましい。オキシダーゼとしては、例えばラッカーゼ（EC 1.10.3.2）、カテコールオキシダーゼ（EC 1.10.3.1）、チロシナーゼ（EC 1.14.18.1）、ビリルビンオキシダーゼ（EC 1.3.3.5）などが挙げられる。これらの酵素は種々の起源のものが使用でき、特に制限はなく、例えば植物由来、細菌由来、坦子菌類由来のものを使用することができる。これらの中で、ラッカーゼは酸化能が高く、しかも酸化剤として空気中の酸素（分子状酸素）が利用できるために、特に好適である。ラッカーゼの例としては、キノコや野菜等の搾汁、果物の果汁等のほか、漆の木から得られるラッカーゼ、またはPyricularia属、Pleurotus属、Pycnoporus属、Polystictus属、Mycelopthora属もしくはNeurospora属の微生物ラッカーゼを挙げることができる。特にPycnoporus属、Mycelopthora属のラッカーゼを好ましく使用できる。
なお、オキシダーゼに代えてペルオキシダーゼを使用することも考えられるが、ペルオキシダーゼでは、必ずしもオキシダーゼのような生理活性の増強は認められない。

使用する触媒は、精製・未精製を問わない。触媒量は原料モノマー１ｇに対して通常１〜１，０００，０００ユニット、好ましくは３〜５００，０００ユニット、さらに好ましくは５〜２００，０００ユニットである。

酵素反応を行うために原料にオキシダーゼを接触させる方法はとくに限定されないが、例えばオキシダーゼを含む液体を原料に噴霧する等の方法が考えられる。好ましくは、原料を溶媒に懸濁または溶解し、オキシダーゼを添加して、撹拌・酵素反応させるのがよい。

オキシダーゼの酵素反応に使用される溶媒としては、原料と触媒が共に懸濁分散または溶解するものが好ましく、水または有機溶媒と水の混合溶媒が挙げられる。水は蒸留水やイオン交換水でもよいが、水の代わりに緩衝液を用いてもよい。緩衝液を用いる場合はｐＨ２〜１２の範囲が望ましい。緩衝液の種類としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

混合溶媒を用いる場合の有機溶媒は水と相溶する溶媒がより好ましい。水と相溶する有機溶媒として、メタノール、エタノール、エチレングリコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリドン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、ピリジン、１，４−ジオキサン、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。これらは単独あるいは混合物として使用される。また、有機溶媒−水の混合比はモノマーと酵素触媒が共に溶解する任意の量を用いることができる。好ましくは１：９９〜９０：１０、特に好ましくは１：９９〜７０：３０の範囲が望ましい。

反応温度は、酵素触媒が不活性化しない温度が望ましい。好ましくは０〜１００℃の範囲であり、より好ましくは１０〜６０℃の範囲である。反応温度が高い場合は、一般に酵素は失活するが、混合溶媒系によっては酵素を安定化するので、その場合は高い反応温度も採用可能となる。
上記重合反応によって得られる酸化重合体の数平均分子量は通常５００〜５０，０００の範囲である。

次に本発明にかかるリパーゼ阻害剤を説明する。このリパーゼ阻害剤は、例えばオリーブ、ジャスミン、ハッカ、ホップ、ユーカリ、リンゴ、カカオ、ブドウから選ばれる少なくとも１種をオキシダーゼ処理して得られる素材を含有する。

これらオキシダーゼ処理した天然素材は、処理する前の原料に比べて高いリパーゼ阻害活性と共に、抗酸化活性にも優れている。

従来報告された純度の高いポリフェノール原料をオキシダーゼ処理して得られる重合体に比べて、本発明で見出された天然素材を原料にオキシダーゼ処理した場合は、複数成分による相乗効果、あるいは未知成分の反応により、はるかに強いリパーゼ阻害活性、抗酸化作用を持つ生成物が得られることがあり、前述した安全性、価格面も合わせてより汎用性が高いといえる。

本発明に係る前記オキシダーゼ処理天然素材は、あらゆる飲食料に添加することができる。本発明に係る食品の具体例としては、ジュース等の清涼飲料、コーヒー、紅茶、リキュール、牛乳、乳清飲料、乳酸菌飲料、キャンデー、チューインガム、チョコレート、ビスケット、飴、グミ、ヨーグルト、アイスクリーム、プディング等が挙げられる。重合体の食品への含有量は、０．５〜１００ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲よりも多量に配合しても安全性や効果に問題はない。

本発明に係る前記オキシダーゼ処理天然素材は、動物飼料にも含有させることができる。動物飼料の具体例としては、家畜用飼料、キャットフード、ドッグフード等のペットフード等が挙げられる。前記重合体の動物飼料への配合量は０．５〜１００ｍｇ／ｇの範囲が適当であるが、この範囲よりも多量に配合しても安全性や効果に問題はない。

本発明に係る前記オキシダーゼ処理天然素材は医薬品の形態で使用することもできる。医薬品として使用する際には、治療及び予防に有効な量の前記重合体が製薬学的に許容できる担体または希釈剤とともに製剤化されるとよい。製剤中の有効成分の量も限定されるものではないし、本発明の効果を損なわない範囲内で他の薬剤と併用することも可能である。

また、当該医薬品は経口または非経口のいずれでも投与できる。非経口投与として静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、関節膣などの投与経路が挙げられる。投与量は年齢、個人差、病状等に依るので特に限定されないが、０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）で、通常、一日量を１回又は数回に分けて投与する

本発明に係る前記オキシダーゼ処理天然素材は、その抗酸化機能に基づき、例えば抗老化用の外用薬または化粧料として用いるのに好適である。また、本発明に係る前記オキシダーゼ処理天然素材は、そのリパーゼ阻害機能に基づき、例えば微生物性のリパーゼを阻害してニキビ，皮膚炎，フケなどを抑制または予防する外用薬または化粧料として用いるのに好適である。すなわち、皮脂腺の肥大増殖や毛嚢孔の角化亢進等が原因となって皮脂が溜まると、毛嚢の毛漏斗に存在する皮膚常在菌のニキビ桿菌や皮膚ブドウ状球菌が増加し、これらの菌のリパーゼが皮脂を構成している皮質成分の内のトリグリセリドを分解して遊離脂肪酸に変え、この遊離脂肪酸が上皮に作用し、各種の酵素を産生して、ニキビ，皮膚炎，フケ等の要因になり得る。本発明のリパーゼ阻害用外用薬または化粧料は、局所適用等で微生物性リパーゼに対する阻害効果を有効に発揮し得る。

本発明に係る前記オキシダーゼ処理天然素材を外用薬または化粧料として用いる場合、当該オキシダーゼ処理天然素材に加えて、本発明の効果を損なわない範囲内で、通常の外用薬や化粧品に用いられる他の成分、例えば油性成分、界面活性剤、アルコール類、水、保湿剤、美白剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

また、外用薬や化粧料の形態は特に限定されるものではなく、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、ゲル等の任意の形態が適用される。具体的には、例えば化粧水、乳液、クリーム、パック、ファンデーション、毛髪用化粧料等に適用することができるが、これらに限定されるものではない。

以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。

なお、各実施例における測定値は以下の方法にて求めた。
１．数平均分子量（Ｍｎ）の測定
東ソー社製のゲルろ過クロマトグラフィを用いて重合体の数平均分子量（Ｍｎ）を測定した。測定条件は以下の通りである。
溶離液：０．１ｍｏｌ／ＬのＬｉＣｌを含むＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）溶液
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：６０℃
基準物質：ポリエチレンスタンダード
供試試料は全てアセチル化物をＤＭＦに溶解し、メンブレンフィルターにてろ過したのち測定に供した。

２．風味
パネラー３名がそれぞれ試料３ｍｇを口に入れて風味を評価した。甘味、塩味、苦味、酸味、辛味、旨味の各要素に対して官能強度を点数化した。また、風味上の特徴を記述してもらい、原料と重合化物とで比較した。

３．抗酸化性〔スーパーオキシド消去能（ＳＯＤ様活性）〕の評価
キサンチン／キサンチンオキシダーゼ系を用いてスーパーオキシドアニオンを発生させ、化学発光法で検出することによりＳＯＤ様活性を評価した。０．０５ｍＭＥＤＴＡを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて０．１５Ｕ／ｍｌキサンチンオキシダーゼ（from Butter milk,0.23 U/mg）溶液を調製した。またキサンチン７．５ｍｇを１ＮＮａＯＨ６００μｌに溶解させた後、蒸留水７．５ｍｌを加え、さらにリン酸緩衝液１６．９ｍｌを加えて希釈し、２ｍＭとした。試料のポリフェノールは３０％のＤＭＳＯを含む蒸留水で各濃度に調製した。ＭＰＥＣ(2-methyl-p-methoxyphenylethynylimidazopyrazinon) ２．８ｍｇはメタノール１０ｍｌに溶解させ、使用時に蒸留水で３倍に希釈した。
発光測定装置（コロナ電気株式会社製）にキサンチン溶液を導入した。９６ｗｅｌｌプレートに試料溶液１０μlとリン酸緩衝液１７０μｌ、キサンチンオキシダーゼ溶液６０μｌ、ＭＰＥＣ溶液１０μｌを混合し、キサンチン溶液５０μｌ分注後の発光量を３０秒間測定した。ＳＯＤ様活性はＥＣ₅₀（対照〔３０％ＤＭＳＯ〕に対して活性酸素を５０％消去するのに必要な試料量）として測定した。

４．リパーゼ阻害活性の評価
リパーゼ活性の測定は、基質に蛍光性の４−メチルウンベリフェロンのオレイン酸エステル（４−ＵＭＯ）を使用し、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより実施した。測定にあたり、緩衝液は、１５０ｍＭＮａＣｌ、１．３６ｍＭＣａＣｌ２を含む１３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ８．０) を用いた。基質である４−ＵＭＯ（Ｓｉｇｍａ社製）は０．１ＭのＤＭＳＯ溶液として調製したものを上記緩衝液で１０００倍希釈したものを、また、リパーゼはブタ膵リパーゼ（Ｓｉｇｍａ社製）を、同様に上記緩衝液を用い４００Ｕ／ｍｌ溶液として調製したものを酵素測定に供した。
酵素反応は、２５ ℃条件下において、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに５０μlの４−ＵＭＯ緩衝液溶液、２５μｌの３０％ＤＭＳＯ（あるいは試料溶液）を添加し混合した後に、２５μｌのリパーゼ緩衝液溶液を添加することにより開始させた。３０分間反応を行った後に、１００μｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）を添加して反応を停止させ、反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を９６ｗｅｌｌマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ社製ＳｙｎｅｒｇｙＨＴ）を用い測定した。
被験試料の阻害活性は、ＩＣＩＣ₅₀（対照〔３０％ＤＭＳＯ〕の活性に対して５０％阻害を与える試料量）として求めた。

（天然素材の製造）
オリーブ（使用部位：葉）、ジャスミン（使用部位：花）、ハッカ（使用部位：地上部）は、原料５００ｇを４．５ｋｇの５０％ＥｔＯＨで２時間還流を行い、室温まで冷却後ろ過した。ホップ（使用部位：穂）、ユーカリ（使用部位：葉）は、原料５００ｇを４．５ｋｇの３０％ＥｔＯＨで２時間還流を行い、室温まで冷却後、ろ過した。
それぞれ得られたろ液を一晩冷蔵放置した。ついで、ろ液をさらにろ過し、得られたろ液を減圧濃縮し、さらに凍結乾燥して各抽出物を得た。
なお、以下の試料は、市販の原料を使用した。
リンゴ…商品名：アップルフェノン（ニッカウヰスキー製）（使用部位：果実）
カカオ…商品名：カカオ・ポリフェノール（台糖製）（使用部位：果実）
ブドウ…商品名：グラヴィノール（キッコーマン製）（使用部位：種子）
（オキシダーゼ処理天然素材の製造方法）

オリーブ抽出物４００ｍｇに４０ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に４０μｌのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物１８５．２ｍｇを得た。

ジャスミン抽出物２００ｍｇに５ｍｌのエタノールと１５ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に２０μlのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物９０．０ｍｇを得た。

ハッカ抽出物４００ｍｇに４０ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に４０μｌのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物１５６．１ｍｇを得た。

ホップ抽出物４００ｍｇに１０ｍｌのエタノールと３０ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に４０μｌのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物１０８．３ｍｇを得た。

ユーカリ抽出物４００ｍｇに４０ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に４０μｌのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物２２７．９ｍｇを得た。

リンゴ抽出物（アップルフェノン）２００ｍｇに１０ｍｌのエタノールと１０ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に２０μlのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物１４２．９ｍｇを得た。

カカオ抽出物（カカオポリフェノール）４００ｍｇに４０ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に４０μlのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物２４４．０ｍｇを得た。

ブドウ抽出物（グラヴィノール）４００ｍｇに５ｍｌのエタノールと３５ｍｌの酢酸緩衝液（ｐＨ＝５）を加えて溶液を調製した。この溶液に４０μlのラッカーゼを加え、空気下、室温で撹拌した。２４時間後、排除分子量１０００の透析チューブを用いて、反応混合物の透析を行った。透析後、透析チューブ内の溶液を凍結乾燥しラッカーゼ処理物２０２．５ｍｇを得た。

これらの実施例で得た重合体の重合条件、性状、ＥＣ₅₀およびＩＣ₅₀を測定した。その結果を表１〜２に示す。また、比較のため、それぞれのラッカーゼ未処理原料についても同様の評価を行ったので、その結果も併せて表１〜２に示す。

表２から明らかなように、実施例２〜９で得た処理物は、その由来する天然原料に比べて、ＳＯＤ様活性およびリパーゼ阻害活性が著しく増強されている。しかも、風味が原料よりも改善されていることがわかる。
このことから本発明で見出された方法を用いて製造されたオキシダーゼ処理天然素材は、日常的に食品等に使われる使用経験が豊富な天然素材を原料にするため安全性が高く、安価かつ簡便に抗酸化作用、リパーゼ阻害活性が実用に堪えるレベルまで増強されるので、メタボリックシンドローム予防食品・医薬品または化粧用素材として、幅広く利用することが期待される。

Claims

オリーブ、ハッカおよびユーカリから選ばれる少なくとも１種の抽出物にオキシダーゼを作用させて酵素反応処理を行う、当該抽出物が有するリパーゼ阻害活性の増強方法。
前記オキシダーゼが、ラッカーゼである請求項１に記載の方法。
オキシダーゼを用いて酵素反応処理したオリーブ、ハッカおよびユーカリから選ばれる少なくとも１種の抽出物を含有するリパーゼ阻害剤。