KR20090003832A - 세포 독성 개선 및 간손상 억제 활성을 갖는 독활 추출물을함유하는 간질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포독성 개선 및 간손상 억제활성을 갖는 독활 추출물을 함유하는 간질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 독활 추출물을 함유하는 본 발명의 조성물은 tBHP(tert butyl hydroperoxide) 및 사염화 탄소로 유발한 간세포에서 GSH(glutathione) 함량이 회복되고, 활성산소(ROS) 생성 및 지질과산화 정도가 감소하며, 유독성 화학물질 대사체의 체외 배출을 촉진하는 항산화 효소(GST, HO-1, NQO1)의 활성을 증가시켜 세포 독성 개선효과 및 ALT(alanine amino transferase) 및 AST(aspartate alanine amino transferase) 효소활성의 감소에 의한 간 손상 보호 효과를 확인하여, 간질환 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

독활, 간질환

Description

세포 독성 개선 및 간손상 억제 활성을 갖는 독활 추출물을 함유하는 간질환의 예방 및 치료용 조성물{A Composition comprising the extract of Aralia continentalis improving cytotoxicity and liver injury for preventing and treating of liver disease}

본 발명은 독활 추출물을 함유하는 세포독성 개선 및 간손상 억제효과를 갖는 간질환 치료 및 예방용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Hsiao et al., J. Agric . Food Chem ., 51, pp 3302-3308, 2003

[문헌 2] Song et al., J. Agric . Food Chem., 51, pp 1571-1577, 2003

[문헌 3] Rush et al., Toxicol . Appl . Pharmacol. 78, p.473, 1985

[문헌 4] Altman et al., Mutat . Res. 306, pp 35, 1994

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[문헌 14] J Nutr . Biochem. 11, pp 509-514, 2000

간 보호 활성에 관한 연구는 주로 두 가지 경로에 초점을 맞추어 이루어진다. 한 가지는 사염화탄소 (CCl₄), tBHP(tert butyl hydroperoxide), 아세트아미노펜 (acetaminophen), 티오아세트아마이드 (thioacetamide), 타크린 (tacrine), 그리고 루브라톡신 B (rubratoxin B)와 과산화수소 (H₂O₂)와 같은 독성 간독소의 해독반응 뿐만 아니라, 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제 (superoxide dismutase), 카탈라아제 (catalase), 그리고 글루타치온 퍼록시다아제 (glutathione peroxidase)와 같은 신체 항산화 방어계 및 phase II 효소계를 함께 평가하는 것이고 다른 하나는 간 손상에 의해 방출된 혈청 글루타메이트 피루베이트 아미노기 전이효소 (serum glutamate pyruvate transaminase; GPT, alanine amino transferase; ALT)와 혈청 글루타메이트 옥살로아세테이트 아미노기전이효소 (serum glutamate oxaloacetate transaminase; GOT, aspartate alanine amino transferase; AST)를 포함하는 혈청조절효소의 수준과 활성을 평가하는 것이다. 시토크롬 P450 (Cytochrome P450) 시스템과 관련된 사염화탄소 (CCl₄) 물질대사인 트리클로로메틸 프리 라디칼 (trichloromethyl free radical, CCl₃·)과 트리클로로메틸퍼록시 라디칼 (trichloromethyl peroxy radicals, CCl₃OO·) 같은 자유 라디칼 (free radicals)에 대한 소거 그리고/또는 억제활성은 산화 방지에 대한 세포기관과 세포막에서의 간 보호 활성과 연관 지을 수 있을 것이다(Hsiao et al., J. Agric . Food Chem ., 51, pp 3302-3308, 2003; Song et al., J. Agric . Food Chem., 51, pp 1571-1577, 2003).

지질과산화를 일으키는 대표적인 물질인 tBHP는 간세포에서 시토크롬 P-450 효소에 의해 세포 구성물들을 산화시킬 수 있는 알콕시(alkoxy-, RO)나 퍼록시(peroxy, ROO)로 분해되며, 이러한 산물들이 DNA의 손상을 가져와 결국 세포를 죽이는 결과를 초래한다(Rush et al., Toxicol . Appl . Pharmacol. 78, p.473, 1985). 또한 tBHP는 간세포에서 ALT, AST, LDH leakage, MDA(malondialdehyde)형성 및 GSH의 결손을 초래한다고 보고되었다(Altman et al., Mutat. Res. 306, pp 35, 1994). 사염화탄소 (CCl₄)도 역시 간의 마이크로좀내 사이토크롬 P450에 의해서 트리클로로메틸 프리 레디칼을 생성함으로서 세포독성을 일으킨다고 보고되었다(Toxicology, 112, pp 131-140.)

독활 (땅두릅; Aralia continentalis Kitagawa)은 오갈피나무과 (Araliaceae)에 속하는 낙엽 활엽 관목으로 전국 산지의 양지에 자생하며, 일반적으로 민가에서는 4월에 새순을 채취하여 나물로 식용하고 있으며, 민간약이나 한방에서는 근, 과실 및 수피를 해소, 위암, 당뇨병 및 위장장애에 이용되고 있으며 한방에서는 뿌리를 많이 사용하고 있다. 독활의 생리활성은 동의보감의 탕약편에 보면 독활의 성질은 평하고, 맛은 달고 쓰며, 인체 무독하다고 하다고 보고되어 있으며 민간에서는 줄기와 잎을 열 내림, 기침, 염증해소, 신경쇠약, 성기능 저하, 신 장병, 당뇨병, 고혈압치료 등에 쓰기도 하며, 뿌리줄기 껍질의 알코올 추출액은 중추신경 계통에 대한 흥분작용이 있고 혈압 강하작용이 있다고 보고되어 있다. 특히 독활 뿌리에는 사포닌과 우르소산(ursolic acid) 등이 함유되어 있어 세포의 산화적 손상에 대한 보호활성과 간기능 개선 효능이 예상되나 독활 추출물을 함유하는 간질환 예방 및 치료용 조성물에 대해서는 어떠한 연구 문헌이나 기타 자료가 없을 뿐만 아니라 연구 자체도 이루어지지 않은 실정이다.

이에 본 발명은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 간 손상을 예방하고 만성 간 손상에 의한 간경화나 간질병을 치료하기 위한 소재를 찾던 중 독활 추출물이 간 내외부에서 유입되는 tBHP 및 사염화탄소와 같은 간 손상을 유발시키는 화학물질의 대사에 의해 형성되는 유독성 화학물질 대사체의 체외 배출을 촉진하는 항산화 효소(GST:glutathione S-transferase , HO-1:heme oxygenase-1, NQO1: NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1)의 활성을 증가시켜 간독성을 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 독활(Aralia continentalis Kitagawa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매 가용 추출물이며, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합 용매 가용 추출물을 포함한다.

상기 간질환은 자가면역성 간질환, 약물유인성 간질환, 알코올성 간질환, 감염성 간질환, 선천성대사성 간질환, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화, 지방간 또는 간암, 바람직하게는 알코올성 간질환 또는 간암을 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 독활 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

본 발명의 독활을 세절하여 준비한 시료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 5 내지 15배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜, 바람직하게는 물 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(v/v)를 갖는 물과 에탄올의 혼합용매로, 실온에서 약 0.5 내지 48시간, 바람직하게는 1 내지 15시간 동안 교반 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 상온 추출, 가온 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 교반 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 독활 추출물을 수득할 수 있다.

상기 제조공정으로 얻어진 독활 추출물은 tBHP(tert butyl hydroperoxide) 및 사염화 탄소로 간손상을 유발한 간세포에서 GSH 함량이 회복되고, ROS 생성 및 지질과산화 정도가 감소하며, 유독성 화학물질 대사체의 체외 배출을 촉진하는 항산화 효소(GST, HO-1, NQO1)의 활성을 증가시켜 세포 독성 개선효과 및 ALT 및 AST 효소활성의 감소에 의한 간 손상 보호 효과를 나타내어 탁월한 간질환 예방 및 치료 효과를 가지고 있음을 확인하였다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 독활 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 간질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전 분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.

또한, 본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 추출물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 간질환의 예방 및 개선효과를 갖는 상기한 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 간질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기와 같이, 본 발명의 독활 추출물은 tBHP 또는 사염화탄소로 유발한 간세포에서 GSH 함량이 회복되고, ROS 생성 및 지질과산화 정도가 감소하며, 유독성 화학물질 대사체의 체외 배출을 촉진하는 항산화 효소(GST, HO-1, NQO1)의 활성을 증가시켜 세포 독성 개선효과 및 ALT 및 AST 효소활성의 감소에 의해 간 손상 보호 효과를 확인하여, 간질환 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 독활 추출물의 제조

1-1. 독활 뿌리 에탄올 추출물의 제조

경남 산청군에서 제공한 독활 뿌리 1㎏을 세절하여 70% 에탄올 7000㎖에 혼합 후 실온에서 5일 동안 침지 추출한다. 상기 추출액(5530㎖, 22.3Brix)을 여과한 후, 에탄올추출물을 감압ㆍ농축하여 총 추출물 180㎖(47Brix)을 수득하였다.

1-2. 독활 뿌리 열수 추출물의 제조

경남 산청군에서 제공한 독활 뿌리 1㎏을 세절하여 물 7000㎖와 함께 95℃에서 4시간동안 추출하여 추출액(3850㎖, 5.3Brix)을 수득하였다. 상기 추출액을 여과한 후, 열수추출물을 감압ㆍ농축하여 총추출물 280㎖(31Brix)을 수득하였다.

1-3. 독활 잎 에탄올 추출물의 제조

경남 산청군에서 제공한 독활 잎 1㎏을 세절하여 70% 에탄올 7000㎖에 혼합 후 실온에서 5일 동안 침지 추출하였다. 상기 추출액(3710㎖, 22.3Brix)을 여과한 후, 에탄올추출물을 감압ㆍ농축하여 총 추출물 150㎖(31Brix)을 수득하였다.

참고예 1. 실험동물 및 처리

실험동물은 (주)대한바이오링크로부터 구입한 SPF(특정병원균미감염) ICR(Institute of Cancer Research) 생후 8주된 25~30g의 수컷 마우스(mouse)를 사용하였고, 사료(purina korea)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21~24℃, 상대습도는 40~80%로 유지하였다. 또한 12 시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다. tBHP(tert butyl hydroperoxide),사염화 탄소(CCl₄), 알라닌 아미노 트랜스퍼라제(alanine amino transferase, ALT)와 아스파레이트 아미노 트렌스퍼라제(aspartate amino transferase, AST)키트, 티오바비튜릭산 (Thiobarbituric acid, TBA), 프탈디알데하이드 (O-Phthaldiadehyde), 페닐메톡실 설포닐 플로라이드 (phenylmethoxyl sulfonylfloride)와 글루타티온 (Glutathione, GSH)은 시그마사 (Sigma chemical Co)에서 구입하였다.

참고예 2. 세포배양

마우스 간세포 세포주(mouse hepatocytes cell line)인 hepa1c1c7 cell을10 % FBS(fetal bovine serum), 2 mM L-글루타민(glutamine), 100 units/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)이 함유된 알파(alpha)-MEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

참고예 3. MTT Assay

간세포를 96-웰(well) 미량역가판(microtiter plate)에 세포농도 5× 10⁶ cells/㎖로 조절하여 100 ㎕씩 웰에 넣은 다음 독활 및 tBHP를 농도별로 처리 한 다음 24 시간 배양하였다. 배양액을 교환한 후 MTT 표지시약(labeling reagent)에 EC(electron coupling reagent)를 첨가하여 준비한 MTT 표지 혼합액(labeling mixture)을 각 웰당 10 ㎕씩 (최종농도 0.5㎎/㎖) 1시간 처리한 후 550 nm 파장에서 흡광도를 이용하여 독활 자체의 세포독성을 조사하였다.

참고예 4, 배양액 내 LDH(Lactate dehydrogenase) 측정

LDH 활성은 기질 피루브산(pyruvate)이 젖산(lactate)으로 감소되는 정도를 조사하여 측정하였다. 이 감소는 환원된(reduced) NADH가 산화되고, 340 nm에서 최대 흡광도를 나타낸다. 0.1 M 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.5) 2.7 ㎖을 cuvette에 넣고 0.1㎖ 배지(culture media)를 첨가하고, 0.02 M 피루빈산 나트륨(sodium pyruvate) 0.1 ㎖을 넣은 후, NADH (0.2 ㎎) 0.1 ㎖을 첨가하여 잘 섞어준 후 340 nm 흡광도에서 2분 동안 흡광도를 측정하였다.

실험예 1. 세포독성 실험

1-1. 독활의 세포독성 실험결과

시험관내(in vitro) 세포내 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 조사하기 위하여 간세포를 이용하여 독활(Aralia continentalis Kitagawa)의 세포독성 실험 결과 400μg/ml 의 농도에서도 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(하기 도 1 및 2). 따라서 세포 독성이 나타나지 않는 농도(400μg/ml 이하)에서 시험관내(in vitro) 세포내 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 확인할 수 있었다.

1-2. tBHP 에 의해 유도된 세포독성에 대한 독활의 간보호 효과

tBHP(tert butyl hydroperoxide)는 간 손상을 일으키는 대표적인 화합물로 잘 알려져 있으며, 그 작용 기작으로 세포 내 물질 대사계 중 Phase Ⅰ에 해당되는 시토크롬 P450의 효소계인 2E1에 의해 아세트아미노펜(acetaminophen)이 NAPQI(N-acetyl-p-benzoquinone imine)의 eletrophile 한 물질로 전환되고, 이 물질이 세포독성을 유발시킨다. tBHP에 의한 간 손상은 간장내의 P450 2E1에 의한 대사 활성체 형성이 주된 원인 물질로 작용하며 이들 대사체는 간장내의 글루타티온(GSH)과 포합되어 독성을 상실하게 된다.

간세포에서 산화적 손상을 일으키는 tBHP 에 대한 독활의 간 보호 효과를 알아보기 위해 세포독성 측정 지표인 MTT assay 와 LDH leakage를 측정한 결과, tBHP 에 의해서 증가된 세포독성이 독활의 뿌리(에탄올추출, 열수추출) 및 잎(에탄올추출) 추출 성분 모두 간세포 보호효과를 나타내었으며(하기 도 3) tBHP 에 의해서 증가된 LDH leakage 가 독활 추출물질에 의해서 간세포 독성이 감소하였음(하기 도 4)을 확인할 수 있었다(**P<0.01, *,#,&P<0.005).

실험예 2. GSH ( glutathion )함량 측정

GSH는 ROS에 의해 야기되는 산화적 스트레스에 대항하여 세포방어에 관여하 며, 촉매작용을 하는 heavy subunit(γ-GCSH)와 조절작용을 하는 light chain으로 구성되어 있는 γ-GCS(γ-glutamylctstein synthetase)에 의해 합성되며 이는 GSH 수치(level)를 적절하게 지속시키는데 중요한 역할을 하며 세포내 GSH가 산화 환원반응의 조절에 중요한 역할을 한다.

2-1. tBHP 투여군

GSH(glutathion)함량을 측정하기 위해 독활 추출물을 1시간 전 처리한 후 tBHP을 0.5 mM 농도로 1시간 동안 처리하였다. OPA(O-phthaldialdehyde)를 3.725 mM을 처리한 다음 실온에서 20분 동안 방치 후 excitation 파장 320 nm, emission 파장 426 nm에서 형광(fluorescence)을 측정하였다.

실험결과, tBHP의 처리에 의해 감소한 세포 내 GSH 함량이 독활 추출물에 의해서 회복된 것을 확인할 수 있었다(하기 도 5: 시험관내(in vitro 및 하기 도 6: 생체 내(in vivo)참조, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

2-2. 사염화 탄소( CCl ₄ ) 투여군

상기 실시예 2-1번과 같이 사염화 탄소를 투여하여 실험한 결과, CCl₄만을 단독 처리한 군에서 감소한 GSH 함량이 독활 추출물 전처리에 의해서 GSH 함량이 회복된 것을 확인 할 수 있었다(하기 도 7, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

실험예 3. 간세포 내 활성산소( ROS ) 측정

외부 자극에 의해 고농도로 발생하는 유해성 활성산소종(ROS)은 세포손상의 원인이 되며, 신경세포질환과 암등의 발병 원인이 되기도 하며, 히드록실 라디칼이나 초과산화물(superoxide), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂) 등의 물질은 DNA의 손상을 유발한다.

간 세포 내 ROS의 양은 형광 프로브(probe)인 DCF-DA을 사용하여 측정하였다. 배양액에 DCF-DA (2',7'-Dichlorofluorescein diacetate)를 웰당 25μM로 처리하여 15분간 배양한 후 독활 추출물과 세포 내 ROS를 유발시키는 tBHP(0.5 mM)를 처리하였다. 반응 후 형성된 세포내 과산화물은 여기excitation 파장 485 nm, emission 파장 530 nm에서 형광(fluorescence)을 측정하였다.

실험결과, tBHP의 처리에 의해 증가한 ROS생성 정도가 독활 추출물에 의해 감소함을 확인할 수 있었다(하기 도 8, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

실험예 4. 지질과산화 수준 측정

4-1. tBHP 투여군

독활 추출물을 1시간 전 처리한 후 tBHP을 0.5 mM 농도로 1시간 동안 처리하였다. 배양액을 버리고, ice-cold PBS로 두차례 세척한 후 고무 씻기 막대(rubber policeman)로 긁어모아서 고압균질기(Homogenizer)로 균질화 한 다음 지질과산화(Lipid Peroxidation)의 지표로써 MDA의 양을 측정하였다. 수합한 세포를 0.5 ml 취해 0.37% (w/v) TBA(2-Thiobarbituric acid), 15%(w/v) TCA(Trichloroacetic acid)이 포함 된 0.25M HCl 용액을 첨가하여 80℃로 15분간 가열하고, 동량의 부탄 올을 첨가한 후 4000 g로 5분간 원심분리 하였다. 상층액을 취해 530 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과 tBHP의 처리에 의해 증가한 지질과산화 정도가 독활 추출물에 의해서 감소함을 확인할 수 있었다(하기 도 9: 시험관 내(in vitro) 및 하기 도 10: 생체 내(in vivo)참조, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

4-2. 사염화탄소 투여군

상기 실시예 4-1번과 같이 사염화탄소(CCl₄)를 투여하여 실험한 결과, CCl₄만을 단독 처리한 군에서 증가한 지질과산화가 독활 추출물 전처리에 의해서 지질과산화 정도가 감소하였음을 확인할 수 있었다(하기 도 11, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

실험예 5. 간 기능 관련 항산화 효소계 Phase Ⅱ 효소의 활성 측정

Phase I에서 발생하는 유해 성분들은 대부분이 Phase II 효소에 의해 무독화 되어 몸 밖으로 배출되게 되며 Phase II 효소의 활성이나 발현을 증가시키는 물질은 산화적 스트레스 등의 자극을 통해 몸 안에서 발생하는 유해물질을 효과적으로 무독화 시켜 몸 밖으로 빠르게 배출 할 수 있도록 한다. 이 물질의 일부는 N-아세틸 시스테인(N-acetylcystein, 메르캅투산(mercapturic acid) 포합체)과의 포합 형태로 배설되고 이러한 포합체는 일반적으로 이물질에 글루타티온이 일차적으로 포합되고 글루타밀(glutamyl)과 글리시닐(glycinyl)기가 대사되어 떨어진 후 cyctein 부위가 caetyl화됨으로써 형성되며, 초기 포합반응은 GST(glutathione-S-transferase)에 의해 촉매 하게 되며, 글루타티온 포합은 메르캅투산(mercapturic acid)으로 대사되기 전에 변화되지 않은 상태로 담즙 속에 배설되며, 방향족 및 지방족 화합물은 대사를 받아 화학적으로 반응성이 있는 중간물질이 생성되면 글루타티온과의 포합반응이 일어나고, 따라서 반응성 친 전자가 제거되어 효과적인 무독화가 일어나며, 대표적인 phase Ⅱ 효소인 HO-1의 경우 AP-1 관련 부위가 산화적 스트레스에 의해 촉진되어진 MAPK 경로를 통해 유전자가 발현하는 것으로 알려져 있다(Brattin, W.J. et al., Free Radical Biology and Medicine 1, pp 2738. 1985; Williams, A.T. et al., Seminars in Liver Disease 10, pp 279284, 1990; Brent, J.A. et al., 11. Clinical Toxicology 31, pp 173196, 1993; T. Nguyen et al., Annu . Rev. Pharmacol . Toxicol. 43, pp 233260, 2002; Jeong-Sang Lee et al., Cancer Letters, 224, pp pp 171-184, 2005).

간 기능 관련 항산화 효소계에 대한 영향을 조사하기 위하여 간 세포 배양을 통해 간기능 개선 관련 항산화 효소계인 제2상 물질대사효소 GST(glutathione S-transferase), NQO1( NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1) 및 HO-1(heme oxygenase-1) 유전자의 발현을 확인하였다(M.M. Bradford, Anal. Biochem. 72, pp. 248254, 1976).

간실질세포인 hepa1c1c7c 세포에 독활추출물을 각각 12시간 처리 한 후 독활추출물이 항산화 효소의 발현에 미치는 영향을 확인 한 결과 독활추출물들에 의해서 항산화효소의 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(하기 도 12).

실험예 7. 혈액 내 ALT(alanine amino transferase) 및 AST(aspartate amino transferase)의 활성도 측정

간 손상시 혈액으로 유리되어 나오는 ALT(alanine amino transferase)와 AST(aspartate amino transferase) 활성도 양을 하기에 기재된 문헌에 따라 실험을 수행하였다(Reitman - Frankel, J Ethnopharmacol. 66, pp 263-269, 1999; J Ethnopharmacol. 66, pp 355-361, 1999; J Nutr . Biochem. 11, pp 509-514, 2000). 독활 추출물을 3일 동안 경구투여 후 tBHP(20 mg/kg) 또는 사염화탄소(CCl₄)(20 mg/kg)를 복강투여로 처리하고 18시간 후에 심장으로부터 채취한 혈청을 ALT 및 AST 각각의 기질액과 37℃에서 30분 동안 반응시켜 피루빅산(pyruvate)을 생성시킨 후, 발색액을 넣고, 20분 후 0.4 N-수산화나트륨 (NaOH)을 섞어서 동정색의 발색이 되면 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.

7-1. tBHP 투여군

tBHP에 의한 간 손상으로 간세포에서 혈청으로 유리된 ALT 및 AST 효소의 활성 변화를 측정한 결과, tBHP만을 단독 처리한 군에 비해 독활 추출물을 전 처리한 군들의 처리 농도에 의존적으로 ALT 및 AST 효소 활성이 감소하였다(하기 도 13 및 14, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

7-2. 사염화탄소(CCl ₄ ) 투여군

사염화탄소(CCl₄)에 의한 간 손상으로 간세포에서 혈청으로 유리된 ALT 및 AST 효소의 활성 변화를 측정한 결과, CCl₄만을 단독 처리한 군에 비해 독활추출물을 전 처리한 군들의 처리 농도에 의존적으로 ALT 및 AST 효소 활성이 감소하였다(하기 도 15 및 16, **P <0.01, *,#,&P <0.005).

본 발명의 독활 추출물을 함유하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 정제의 제조

독활 추출물 100mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 2. 산제의 제조

독활 추출물 25mg

DDB 50mg

유당 30mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진하고 씰링하여 산제를 제조하였다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

독활 추출물 25mg

DDB 50mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 4. 현탁제의 제조

독활 추출물 500mg

이성화당 10g

설탕 30mg

나트륨 CMC 100mg

레몬향 적량

정제수 적량 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조하고 100ml 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

제제예 5. 연질캅셀제의 제조 (연질캅셀제 1정 중 함량)

독활 추출물 500mg

폴리에틸렌글리콜 400 400mg

농글리세린 55mg

정제수 35mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60℃로 유지한 상태에서 플라본을 넣고 교반기로 약 1,500rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합한 후 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거하고 연질캅셀의 내용물로 한다.

연질캅셀의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132mg, 농글리세린 52mg, 디솔비톨액 70% 6mg 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제방법으로 제조한다.

제제예 6. 주사제의 제조

독활 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄·12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 7. 건강식품의 제조

독활 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 8. 건강 음료의 제조

독활 추출물 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 MTT Assay를 이용한 독활의 세포독성을 측정한 도이고,

도 2는 독활의 LDH(Lactate dehydrogenase)활성 감소효과를 측정한 도이며,

도 3은 tBHP 유도에 의한 독활의 간보호 효과를 세포 생존율로 알아본 도이고,

도 4는 tBHP 유도에 의한 독활의 간보호 효과를 LDH leakage로 알아본 도이며,

도 5는 마우스의 간세포에서 독활의 간보호 효과를 GSH(glutathione)의 함량을 측정하여 알아본 도이고,

도 6은 tBHP로 유도된 마우스 간에서의 GSH함량을 측정한 도이며,

도 7은 사염화탄소로 유도된 마우스 간에서의 GSH함량을 측정한 도이고,

도 8은 tBHP에 의한 산화적 스트레스에 대한 독활의 간 보호효과를 활성산소(ROS) 생성량을 측정하여 알아본 도이며,

도 9는 tBHP에 의해 유도된 마우스 간세포에서의 지질과산화 정도의 감소효과를 나타낸 도이고,

도 10은 tBHP에 의해 유도된 랫트 간에서의 지질과산화 정도의 감소효과를 나타낸 도이며,

도 11은 사염화 탄소로 유도된 랫트 간에서의 지질과산화 정도의 감소효과를 나타낸 도이고,

도 12는 독활 추출물이 항산화 효소의 발현에 미치는 영향을 조사한 도이며,

도 13은 tBHP에 의한 간손상으로 간세포에서 혈청으로 유리된 ALT(alanine aminotransferase) 효소의 활성변화를 측정한 도이고,

도 14는 tBHP에 의한 간손상으로 간세포에서 혈청으로 유리된 AST(aspartate aminotransferase) 효소의 활성변화를 측정한 도이며,

도 15는 사염화탄소에 의한 간손상으로 간세포에서 혈청으로 유리된 ALT(alanine aminotransferase) 효소의 활성변화를 측정한 도이고,

도 16은 사염화탄소에 의한 간손상으로 간세포에서 혈청으로 유리된 AST(aspartate aminotransferase) 효소의 활성변화를 측정한 도이다.

Claims (5)

1. 독활(Aralia continentalis Kitagawa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 치료용 약학 조성물. (독립항)
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매 가용 추출물인 약학조성물. (종속항)
3. 제 1항에 있어서, 상기 간질환은 자가면역성 간질환, 약물유인성 간질환, 알코올성 간질환, 감염성 간질환, 선천성대사성 간질환, 급성간염, 만성간염, 간경변증, 간경화, 지방간 또는 간암인 약학조성물. (종속항)
4. 독활(Aralia continentalis Kitagawa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 및 개선용 건강기능식품. (독립항)
5. 제 4항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품. (종속항)

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