KR101967752B1 - 다이플렉트리아 바르바타 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

다이플렉트리아 바르바타 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 식품 조성물, 약학적 조성물 및 상기 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata)의 추출물은 세포 분화 및 성장 관련 단백질인 pERK, pPKB 단백질의 인산화를 촉진시켜 상처 부위의 세포 증식을 활성화시키고, 콜라겐 또는 엘라스틴 등의 세포 외 기질의 합성을 증가시키며 피부 노화를 촉진하는 MMP-3의 발현을 감소시켜 상처 치유 및 재생 효능을 가진다. 나아가, 항산화 효소 활성 및 항산화 단백질의 발현을 증가시켜, 항산화, 항노화 또는 상처 재생을 목적으로 하는 화장품, 의약외품, 식품, 의약품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

다이플렉트리아 바르바타 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic Composition which comprises Diplectria barbata Extract as an active ingredient}
본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 의약외품 조성물, 식품 조성물, 약학적 조성물 및 상기 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
잘 먹고 잘 사는 웰빙(well-being) 트렌드에 부응하여, 화장품은 선택이 아닌 필수 요소로 부가가치가 높은 산업으로 자리 잡아 가고 있고, 이에 천연물, 미생물, 단백질 배양액, 줄기세포 유래 배양물까지 다양한 소재 개발이 이루어지고 있다. 최근에는 화장품 성분의 유전자 변형이나 환경 호르몬으로 인한 문제점이 대두되면서 장기적으로 인체에 유해하지 않고 안전하게 사용할 수 있는 천연물질에 대한 기능성 화장품의 기대가 높아지고, 수요가 증가하고 있다.
식물은 오래 전부터 인류 복지에 도움을 주는 다양한 천연물질들의 공급원이 되어 왔다. 이들 물질들은 대부분 이차대사산물로서 의약품, 식품 첨가물, 화장품 원료, 향료, 색소 등의 용도로 사용되고 있다. 유기합성 분야의 발달에 의한 수많은 새로운 화합물들의 합성에도 불구하고 식물은 아직도 신물질의 근원으로 인정받고 있다. 매년 식물에서 발견되는 새로운 화학구조를 갖는 신물질이 수천 가지 이상이며, 그 중 상당수는 생리활성을 갖고 있음을 고려한다면 식물은 중요한 원료가 된다고 할 수 있다.
한편, Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.(이하, 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata))는 원산지가 베트남이며, 현재까지 학명은 아직 알려지지 않은 멜라스토마 과(Melastomataceae family, 야모란 과) 식물이다. 최근 천연물의 효능에 대해 연구는 세계적으로 활발하지만, 아직까지 다이플렉트리아 바르바타의 성분, 효능 등에 대한 연구는 이루어진 바가 없다.
본 발명자들은 항산화, 항노화 또는 상처 재생 효과를 나타내면서 부작용이 적은 천연물을 찾고자 연구한 결과, 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 의 추출물을 얻어 항산화, 항노화 및 상처 재생 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 다이플렉트리아 바르바타 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물, 피부 상태 개선용 의약외품 조성물, 항산화용 또는 항노화용 식품 조성물, 상처 재생 또는 피부 재생용 약학적 조성물 및 다이플렉트리아 바르바타를 추출하는 단계; 를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항산화용 또는 항노화용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 상처 재생 또는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata)를 추출하는 단계; 를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata)의 추출물은 세포 분화 및 성장 관련 단백질인 pERK, pPKB 단백질의 인산화를 촉진시켜 상처 부위의 세포 증식을 활성화시키고, 콜라겐 또는 엘라스틴 등의 세포 외 기질의 합성을 증가시키며 피부 노화를 촉진하는 MMP-3의 발현을 감소시켜 상처 치유 및 재생 효능을 가진다. 나아가, 항산화 효소 활성 및 항산화 단백질의 발현을 증가시켜, 항산화, 항노화 또는 상처 재생을 목적으로 하는 화장품, 의약외품, 식품, 의약품 등으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata)의 잎과 나무 모양이다.
도 2는 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 인간 섬유아 세포주에 농도별 처리 후 MTT 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 인간 섬유아 세포주에 농도별 처리 후 상처 재생 경과를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 인간 섬유아 세포주에 농도별 처리 후 세포 분화 및 성장 관련 단백질인 pERK, pPKB-S473 단백질량 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 인간 섬유아 세포주에 농도별 처리 후 세포 외 기질(Extracellular matrix) 활성 단백질인 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 및 세포간 기질 분해 효소인 MMP-3 단백질의 단백질 발현량을 나타낸 도이다.
도 6 내지 9는 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 인간 섬유아 세포주에 농도별 처리 후 항산화 효소의 발현량을 측정하여 추출물의 항산화 효능을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 6은 비교군인 BHT(Butylated hydroxyl toluene)와 비교하여 추출물 처리군의 항산화능을 나타낸 도이다. 도 7은 항산화 효소인 HO-1, NRF2의 발현 정도를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸 것이고(GAPDH는 대조군으로 사용), 도 8은 이를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다. 도 9는 추출물의 농도별 처리에 따른 총항산화 능력(Total Antioxidant Capacity)를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10 내지 12는 상처 모델 마우스의 상처 부위에 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 농도별로 처리하고 이를 관찰한 결과를 나타낸 도이다. 도 10은 마우스의 상처 재생 정도를 육안으로 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 11은 추출물의 농도에 따른 마우스의 상처 재생 정도를 육안으로 확인한 결과를 나타낸 것이고, 도 12는 이를 상처 부위의 면적 변화로 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.
도 13은 상처 부위에 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 농도별로 처리함에 따른 피부층의 회복을 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 상처 부위에 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 농도별로 처리함에 따른 콜라겐, 엘라스틴, MMP-3의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata)는 그 풀네임이 Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos. 이며, 학명은 아직 알려지지 않았다. 베트남이 원산지이며, 아직까지 다이플렉트리아 바르바타의 구체적인 성분, 효능에 대해서는 알려진 바가 없고, 본 발명에서는 다이플렉트리아 바르바타의 항산화, 항노화 및 상처 재생 효과를 최초로 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물은 항산화용 또는 항노화용 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서, "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미한다. 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화 촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO2, ONOO-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증 반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역 세포들의 면역 반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다. 상기와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다.
본 발명에 있어서, “항노화”는 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 모공 수축, 축소, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능 등을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"은, 화장료 조성물로써 항산화 또는 항노화에 따른 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 항산화 및 항노화 효과를 달성함으로써, 건강증진에 기여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물은 식물체의 잎, 줄기, 뿌리 및 전초(식물의 전체)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 잎 또는 줄기의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물”은 다이플렉트리아 바르바타를 추출하여 수득한 추출물을 의미하는데, 본 발명의 목적상, 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 다이플렉트리아 바르바타를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올, 탄화수소계 용매 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 메탄올로 추출된 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 추출물에는, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나 이상이 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다. 또한, 상기 의약외품 조성물은 피부 외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있으며, 상기 개인위생용품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔, 세정 겔 등이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항산화용 또는 항노화용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “식품 조성물”은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 다이플렉트리아 바르바타 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있으며, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 천연물로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 하므로 안정성 면에서 문제가 없기 때문에 혼합량에 큰 제한은 없다.
본 발명에 있어서, "기능성 식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말한다.
본 발명의 추출물이 사용될 수 있는 식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 적용될 수 있는 식품에는 예컨대, 특수영양식품(예: 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예: 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예: 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예: 스낵류), 유가공품(예: 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예: 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면스프 등) 등 모든 식품을 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 상처 재생 또는 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 상처 재생 또는 피부 재생에 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 콜라겐, 엘라스틴 등의 세포 외 기질의 재건 및 합성을 증가시키고, 기질 단백질을 분해하여 피부 노화를 촉진하는 MMP-3의 발현을 낮추는 효과가 있으므로, 상처 재생 또는 피부 재생에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 보다 효과적인 예방 또는 치료를 위하여, 본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여함이 바람직하고, 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata)를 추출하는 단계; 를 포함하는 화장료 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 항산화용 또는 항노화용 화장료 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출은 다이플렉트리아 바르바타의의 잎, 줄기, 뿌리 및 전초(식물의 전체)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 잎 또는 줄기의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다. 이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실험예 및 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
각 실험의 통계는 ± S.D를 사용하였고, p < 0.05 (*), p<0.01 (**)로 기록하였다.
실시예 1. 실험 준비
1-1. 다이플렉트리아 바르바타 ( Diplectria barbata ) 추출물 제조
멜라스토마 과(Melastomataceae family, 야모란 과)에 속하는 베트남 원산지 Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.(이하, 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata))의 잎과 줄기를 메탄올로 추출한 것을 생명공학연구원 해외허브센터에서 공급 받아 사용하였다. 구체적으로, 다이플렉트리아 바르바타를 45℃에서 메탄올(Methyl alcohol 99.9%, HPLC급)에 침지시키고 15분 동안 초음파 분쇄(sonication) 후 상온에서 2시간 정치시키는 과정을 하루에 10회씩 총 3일 동안 수행하여 추출한 추출액을 얻었다. 이후, 상기 추출액을 여과하고 농축 및 건조시킨 뒤 저온실(-4℃)에서 보관하며 이하 실시예에 적용하였다. 다이플렉트리아 바르바타의 잎과 줄기를 도 1에 나타내었다. 이하 실험에서는 다이플렉트리아 바르바타의 잎과 줄기 추출물(이하, '추출물')을 이용하여 실험을 수행하였다.
1-2. 인간 피부 섬유아 세포주 배양
인간 피부 섬유아 세포인 NHDF를 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), 우태아 혈청 10%, 항생제 10%를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
실시예 2. 다이플렉트리아 바르바타 추출물 처리에 따른 세포 생존율 측정
인간 섬유아 세포주를 대상으로 추출물을 농도별로 처리하고, MTT 분석을 통해 세포 생존율(cell viability)을 측정하였다.
인간 섬유아 세포주인 NHDF를 96-웰 플레이트에 비처리군과 농도별 처리군으로 나누어 각각 3 웰씩(1 X 103 개/웰) 배양하였다. 24시간 배양 후, 농도 별 다이플렉트리아 바르바타 처리군(실험군)에는 새 미디어 100㎕와 함께 추출물을 각각 0, 10, 25, 50㎍/ml씩 처리하여 24시간 동안 더 배양하였다. 24시간 후 각 웰 당 90㎕의 새 미디어에 Ez-Cyto(MTT) 시약 10㎕를 넣은 후 30분간 반응시켰다. 인큐베이션 한 색이 변하기 시작한 후, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay plate reader)를 이용하여 450nm(reference 650nm)에서 흡광도를 측정하고 그래프로 나타내었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 추출물을 50㎍/ml까지 처리하여도 세포 생존율이 유지되어, 본원 발명의 추출물은 세포 독성이 없음을 확인하였다.
실시예 3. 다이플렉트리아 바르바타 추출물 처리에 따른 상처 재생 효과 측정
인간 섬유아 세포주를 대상으로 추출물을 농도별로 처리하고, 일반적인 항노화 실험에서 많이 시행하는 세포 상처 재생 실험을 수행하였다.
실시예 1-2에서 기재한 방법으로 배양한 NHDF 세포주를 6-웰 플레이트에 각각 1 X 106씩 총 4웰에 깔아주었다. 다음날 세포가 약 70% 이상 자랐을 때, 10㎕ 팁으로 동일한 간격으로 세포 표면을 긁어 상처를 내었다. 이후, 대조군 웰에는 새 미디어를 2㎖씩만 넣어주고, 나머지 3개 웰에는 미디어 2㎖에 추출물을 각각 1㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 의 농도별로 넣어주고, 24시간 배양 후, 현미경으로 관측하였다. 현미경 상에서 사진 촬영을 한 결과를 도 3의 A에 나타내었고, 상기 도 3의 A의 점선 사이(상처 부위)에 직선을 각각 5개 그은 후 5개 수치의 평균 낸 값을 수치화시켜 정량화한 결과를 도 3의 B에 나타내었다.
도 3의 A에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 처리한 추출물의 농도가 증가함에 따라 상처 치유(wound closure)가 우수하게 나타남을 확인하였다. 또한, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, 추출물을 처리해준 경우 모든 농도에 있어서 상처 부위의 회복율이 대조군에 비하여 유의적으로 높음을 확인하였다.
실시예 4. 다이플렉트리아 바르바타 추출물 처리에 따른 세포 분화 및 성장관련 단백질의 발현량 측정
인간 섬유아 세포주를 대상으로 추출물을 농도별로 처리하고, 그에 따른 세포 분화 및 성장관련 단백질의 발현량을 측정하기 위해 anti-pERK, anti-ERK2, anti-PKB, anti-pPKB(S473) 및 anti-GAPDH 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
배양한 NHDF 세포주를 6-웰 플레이트에 각각 1 X 106씩 총 4웰에 깔아주었다. 다음날 대조군 웰에는 새 미디어를 2㎖씩만 넣어주고, 나머지 3개 웰에는 미디어 2㎖에 추출물을 각각 1㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 의 농도별로 넣어주고, 24시간 배양 후, 미디어를 제거하고, 1X PBS로 워싱한 후에 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 0.5% NP40, 10 mM beta-glycerophosphate, 50 mM sodium fluoride, 0.2 mM sodium vanadate, 10 mM PNPP, 5 mM PMSF 및 10 ㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin)으로 만들어진 lysis buffer로 세포를 용해시켰다. Bradford protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA)로 용해시킨 단백질의 농도를 잰 다음 10ug를 정량하여 Laemmli sample buffer와 농도에 맞게 섞어 끓인 후 SDS-PAGE에 로딩하였다. 이후 전개(transfer), 블로킹(milk blocking)하고 TBS-T로 씻어준 후 1차 항체를 넣고 하룻밤 두었다. 다음날 TBS-T 세척 후 Rabbit 2차 항체를 1시간 인큐베이팅 한 뒤, 20분간 TBS-T로 3차례 씻어준 후 필름으로 현상하였다. 1차 항체는 collagen(ab138492)-AbCam, Elastin(sc-374638), MMP-3(sc-21732), pERK(sc-7383), ERK(sc-1647), NRF2(#13032)-Santa Cruz, GAPDH(#5174s), pPKB(#3787s), PKB(#9272s), HO-1(#5853)-Cell Signaling Tech를 사용하였고, 2차 항체로는 mouse, rabbit-Komabiotech를 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 상처 부위에 추출물을 처리한 군에서 피부 섬유아 세포에서 분화와 침윤 기능으로 잘 알려진 MAPK의 하위 단백질인 ERKs(Extracellular signal-regulated kinases)와 AKT/PKB(protein kinase B) 단백질의 인산화를 확인하였고, 추출물의 농도가 높아질수록 인산화 단백질 발현량이 증가함을 확인하였다. 이의 정량화 결과는 도 4의 B에 나타내었다. 이로써 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 ERK, PKB 신호 전달에 의한 세포 증식을 활발하게 유도할 수 있으며, 이를 통해 상처 재생에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 다이플렉트리아 바르바타 추출물 처리에 따른 콜라겐, 엘라스틴 및 MMP -3 발현량 측정
인간 섬유아 세포주를 대상으로 추출물을 농도별로 처리하고, 세포외 기질(extracellular matrix) 활성 단백질인 콜라겐, 엘라스틴 및 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3(Matrix metalloproteinase-3) 발현량을 측정하기 위해 웨스턴 블랏을 수행하였다.
배양한 인간 섬유아 세포주를 6-웰 플레이트에 각각 3 X 105 로 깔아주었다. 다음 날 새 미디어에 추출물을 농도별로 (0, 1, 10, 25, 50㎍/㎖) 처리하고 24시간 배양하였다. 이후, 1X PBS로 씻어준 다음 단백질을 추출하고, 웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 A에 나타낸 바와 같이, 세포외 기질 활성 유전자인 콜라겐, 엘라스틴은 처리해준 추출물의 농도에 따라 발현량이 증가함을 확인하였다. 반면, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3는 농도별로 발현량이 감소함을 확인하였다. 이의 정량화 결과는 도 5의 B에 나타내었다. 이로 인해 본원 발명의 추출물은 세포외 기질의 재건 및 합성을 증가시켜서 상처 재생을 돕고, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3의 발현을 크게 억제함으로써 상처 재생에 우수함을 확인하였다.
실시예 6. 다이플렉트리아 바르바타 추출물 처리에 따른 항산화 효능 측정
6.1 DPPH를 이용한 항산화 실험
화합물 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)는 에탄올 내에서 자유라디칼을 발생하는데, 본 발명에 따른 추출물과 DPPH를 일정 비율로 혼합하여 생성된 자유라디칼의 양이 어느 정도 감소하는지를 분광광도계로 측정하여 간접적으로 시료의 항산화 활성을 측정함으로써, 추출물이 항산화 효과를 갖는지를 확인하였다.
비교군으로는 DPPH를 이용한 실험에서 사용되는 표준물질인 BHT(Butylated hydroxyl toluene)를 사용하였으며, BHT와 비교한 항산화제로서의 활성능력을 비교값으로 항산화 능력을 측정하였다. BHT를 에탄올로 용해시킨 후 농도별로 96-웰 플레이트에 넣었다. 에탄올로 조제한 0.2mM 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 각 웰에 100㎕씩 넣고, 추출물 시료를 100㎕씩 넣은 후, 실온에서 30분 동안 방치한 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험군과 대조군에 대한 흡광도 측정 후, 아래 식을 이용하여 항산화능의 정도를 대조군의 흡광 강도를 기준으로 백분율로 표시하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
Figure 112017080664073-pat00001
도 6에 나타낸 바와 같이, 비교군과 비교하여, 추출물이 비교군인 BHT와 비슷한 정도의 우수한 항산화 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 추출물의 농도가 높아질수록 항산화능이 증가함을 확인하였다.
6.2 NRF2 및 HO-1 발현량 측정
추출물의 항산화 활성을 확인해보기 위해, 산화나 스트레스 상황에서 항산화 효소의 발현을 증가시켜 염증 및 외부의 유해한 자극으로부터 세포를 보호하는 기능으로 알려져 있는 NRF2와 항산화 효소인 HO-1의 단백질 발현량을 측정하였다. 배양한 인간 섬유아 세포주를 6-웰 플레이트에 각각 3 X 105 로 깔아주었다. 다음날 새 미디어에 추출물을 농도별로 (0, 10, 25, 50㎍/㎖) 처리하고 24시간 배양하였다. 그 후, 1X PBS로 씻어준 다음 단백질을 추출하고, 웨스턴 블랏을 통해 단백질 발현량을 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 이를 정량화한 결과를 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 추출물의 농도가 높을수록 NRF-2 및 HO-1의 발현량이 증가함을 확인하였다. 따라서 본원 발명의 추출물은 세포를 보호하고 항산화 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.
6.3 Total antioxidant capacity( 총항산화능 ) 분석
배양한 NHDF 세포주를 6-웰 plate에 각각 1 X 106 로 깔아주었다. 다음날, 추출물을 각각 1㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖ 농도별로 넣고 24시간 배양 후, 트립신 처리 후 1X PBS로 세포를 모아 10분간 4℃에서 1,000-2,000 x g으로 원심분리 하였다. PBS 제거 후 차가운 60mM NaOH 100㎕를 넣고, 니들을 이용하여 세포를 분쇄하고, 4분간 4℃에서 1,500 x g으로 원심분리 하였다. 상층액을 튜브에 옮겨 아이스에 꽂은 다음, 상층액으로 총항산화능을 분석하였다. 이는 Total antioxidant capacity Assay (cell-biolabs Cat. STA-360)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 구체적으로, 각 웰 당 20㎕ 의 Uric acid standard와 샘플을 96-웰 플레이트에 각각 3웰씩 넣은 후 1X 반응 버퍼(Reaction Buffer) 180㎕를 넣고 조심스럽게 섞어준 후, 490nm의 흡광도로 측정 후 1X 구리 이온 시약(Copper Ion Reagent) 50㎕를 각 웰에 넣고 5분간 상온에서 쉐이커에서 흔들어 주었다. 각 웰에 1X 반응 정지액(Stop Solution) 50㎕ 를 넣은 후, 플레이트를 다시 490nm로 측정하고 프로토콜 계산식대로 계산하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 추출물의 농도가 높을수록 총항산화 능력(Total antioxidant capacity)이 높아짐을 확인하였다.
상기 DPPH 항산화 효능 실험, 항산화 단백질 발현 측정, 총항산화능 분석 결과를 통해, 본원 발명의 추출물이 항산화 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 7. 상처 모델 마우스에서 다이플렉트리아 바르바타 추출물의 상처 재생 효과 확인
7.1 Mouse Wound healing assay
세포에서 관찰한 추출물의 세포 재생 효능을 In vivo에서 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. B/J male 마우스의 등을 제모하고, biopsy punch로 동일한 크기의 상처 4곳을 낸 직후, 대조군은 물만 바르고, 나머지 3군데 상처에 각각 추출물을 10㎍/㎖, 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖로 처리해 준 후 6일간 매일 관찰 사진을 찍었다. 실험 방법을 도 10에 나타내었고, 상처 재생을 육안으로 관찰한 결과를 도 11에 나타내었으며, 이를 정량화한 결과를 도 12에 나타내었다.
도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 추출물을 처리한 상처가 재생이 활발함을 확인하였다. 또한, 추출물의 농도가 높아질수록 상처 재생이 더욱 활발해지며, 상처 면적이 줄어드는 속도가 빠름을 확인하였다.
7.2 마우스 피부 조직 면역 염색
비교군과 농도별 추출물 처리군의 피부를 헤마톡실린으로 염색하였다. 또한, 마우스의 등에 상처 낸 곳의 피부 조직을 10% neutralized formalin을 이용하여 16시간 동안 고정하고 세척한 후 파라핀에 고정하였다. 약 5mm 정도 두께로 조직을 자른 다음 슬라이드 고정 후 H&E 염색과 항체 Anti-collagen(ab138492)-AbCam, Anti-MMP3(sc-21732), Anti-Elastin(sc-374638)-Santa Cruz 염색 후 현미경으로 촬영하였다. 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 추출물을 바르지 않은 피부에 비해 추출물을 농도별로 처리한 피부층이 두꺼워 지는 것을 확인하였다. 이를 통해 추출물에 의한 피부의 재생에 따른 피부층의 회복 효과를 확인하였다.
또한, 도 14에 나타낸 바와 같이, 마우스 피부에서도 콜라겐, 엘라스틴이 추출물을 바르지 않은 피부에 비해 추출물을 바른 피부 조직에서 그 발현량이 증가하였고, 세포 간 기질 분해 효소인 MMP-3은 발현량이 줄어드는 것을 확인하였다. 이는 세포 실험 결과와 상응하는 결과임을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 추출물이 In vitro에서 뿐만 아니라, In vivo에서도 세포외 기질 활성 유전자인 콜라겐, 엘라스틴의 발현을 증가시키고, 이러한 기질 단백질을 분해하여 피부 노화를 촉진하는 MMP-3의 발현을 감소시킴으로써, 상처 치유 및 상처 재생에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본원 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 항산화, 항노화 화장품 조성물 및 상처 재생 조성물로써 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.
상기와 같이, 본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물은 세포 증식, 세포 외 기질의 재건 및 합성을 증가시키고, 항산화 효소 활성 및 항산화 단백질 발현을 증가시키며, 기질 단백질을 분해하여 피부 노화를 촉진하는 MMP-3의 발현을 감소시켜 상처 치유, 상처 재생, 항산화 및 항노화 효과가 우수함을 실험을 통해 확인하였다.
이하 본 발명의 다이플렉트리아 바르바타 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 또는 항노화용 식품 조성물 및 상처 재생 또는 피부 재생용 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 식품 제제의 제조
1-1: 건강식품의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 g
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 g
비타민 C 10 mg
비오틴 10 g
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 g
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
1-2: 건강음료의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3 g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
제제예 2: 약학적 제제의 제조
2-1: 산제의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 200 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
2-2: 정제의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 100 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
2-3: 캡슐제의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 100 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.
2-4: 주사제의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 100 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4·2H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
2-5: 액제의 제조
다이플렉트리아 바르바타 추출물 200 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

Claims (13)

  1. 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항산화용 화장료 조성물로서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 항산화용 화장료 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 다이플렉트리아 바르바타의 잎 또는 줄기로부터 추출된 것을 특징으로 하는, 항산화용 화장료 조성물.
  5. 삭제
  6. 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 피부 상태 개선용 의약외품 조성물로서,
    상기 피부 상태 개선은 피부 재생 또는 상처 재생인 것을 특징으로 하는, 피부 상태 개선용 의약외품 조성물.
  7. 삭제
  8. 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 항산화용 식품 조성물로서,
    상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 항산화용 식품 조성물.
  9. 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.) 추출물을 유효성분으로 함유하는, 상처 재생 또는 피부 재생용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 추출물은 콜라겐 또는 엘라스틴의 발현을 증가시키고, MMP-3의 발현을 감소시키는 것인, 상처 재생 또는 피부 재생용 약학적 조성물.
  11. 다이플렉트리아 바르바타(Diplectria barbata (Wall. Ex C.B. Clarke) Franken & Roos.)를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하는 단계; 를 포함하는 항산화용 화장료 조성물의 제조방법.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서, 상기 추출은 다이플렉트리아 바르바타의 잎 또는 줄기로부터 수행되는 것을 특징으로 하는, 항산화용 화장료 조성물의 제조방법.
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