CN111973584B

CN111973584B - 柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在预防/保护肾脏缺血再灌注损伤中的应用

Info

Publication number: CN111973584B
Application number: CN202010788266.2A
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 代杰; 杨成宇
Original assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Current assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority date: 2020-08-07
Filing date: 2020-08-07
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2040-08-07
Also published as: CN111973584A

Abstract

本发明提出一种柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在预防/保护肾脏缺血再灌注损伤中的应用，属于生物医药领域，该应用证明柚皮素对人缺血再灌注致急性肾损伤预防/保护作用的可能性，并证明柚皮素的保护作用是通过减轻损伤肾脏炎症反应进行的，进一步通过生物信息学证明柚皮素的作用机制与同NF‑κB相关蛋白直接结合有关，最后通过实验证实应用柚皮素后NF‑κB表达量下降，从而为拓宽柚皮素可能的应用范围提供了理论基础。本发明能够应用于肾脏缺血再灌注损伤的理论研究和临床治疗中，为探究中药对缺血再灌注致急性肾损伤的预防/保护作用提供思路。

Description

柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在预防/保护肾脏缺血再灌注损伤中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在预防/保护肾脏缺血再灌注损伤中的应用。

背景技术

急性肾损伤(Acute kidney injury，AKI)由多种病因引起短时间内肾功突然下降，病死率高达50％-79％。研究显示，AKI损伤后肾组织的不完全修复，致使肾脏发生了不可逆的纤维化，幸存者进展为慢性肾衰竭的比例达35％-71％。因此，为了减缓和逆转肾脏疾病的进程，改善肾脏功能，针对肾损伤早期进行临床治疗对改善肾病患者预后具有重要意义。

肾脏缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion，IR)是AKI最常见的病因之一，在临床上广泛见于外科手术术后、肾脏移植术后、急性心功能不全等病理情况下。Wistar大鼠是动物实验大鼠里最为常用及生物医学研究中使用历史最长的品种，采用肾蒂暂时结扎后放开的标准手术方法造模可以很好地模拟人类急性肾损伤病理过程。大量肾缺血再灌注损伤的动物模型实验和人体病理组织学研究均表明，氧化应激、炎症及凋亡反应可能是缺血性急性肾损伤最重要的病理生理改变，而其中炎症反应是损伤的起始因素。

炎症是IR-AKI进程中病理学转变的关键。在IR-AKI发生时，缺血引起的内皮损伤导致血管收缩、凝血激活加剧组织缺血，同时激活内部免疫系统，大量炎症因子释放。作为细胞应激状态下炎症反应的核心分子，核因子κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)能够激活或抑制数百种靶基因，包括：趋化因子、细胞因子、粘附分子、炎症介质、氧化和凋亡抑制剂，因此在IR中发挥关键作用。

柚皮素(CAS：480-41-1)主要来源于漆树科植物梗树果实的核壳、樱花花蕾、梅花蕾，其化学式为C₁₅H₁₂O₅，分子量为272.25，具有抗菌、抗炎、抗氧化、降血脂、抗癌抗肿瘤、抗粥样动脉硬化等作用，被广泛地应用于医药、食品等领域。柚皮素在心脏及脑缺血损伤中的预防保护作用已得到广泛报道，但在肾脏缺血再灌注损伤中的保护作用至今未被证实，仅有的肾脏领域的研究局限于糖尿病肾病、药物诱导的肾损伤，在缺血再灌注急性肾损伤中的作用鲜有报道。另外，急性肾损伤发生机制尚缺乏定论，因此对其药物作用的研究仍缺乏有力证据，而针对发病机制探究急性肾损伤相关药物对临床诊疗具有重要意义。

发明内容

本发明提供了一种柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在预防/保护肾脏缺血再灌注损伤中的应用，主要从机制方面合理解释了柚皮素对预防/保护肾缺血再灌注损伤的可能性，从而为拓宽柚皮素可能的应用范围提供了理论基础。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在预防/保护肾脏缺血再灌注损伤中的应用。

作为优选，柚皮素通过与NF-κB相关蛋白直接结合减轻NF-κB引起的肾脏炎症，以预防/保护肾脏缺血再灌注损伤。

作为优选，所述NF-κB相关蛋白为BCL3、RELA、NFKBIA和NFKB2。

作为优选，柚皮素与NF-κB相关蛋白的结合能为RELA＞NFKB2＞BCL3＞NFKBIA。

作为优选，柚皮素与NFKBIA和BCL3结合于ANK结构域，具有蛋白结合功能；柚皮素与NFKB2和RELA结合于包括IPT结构域的结构域，具有免疫球蛋白样折叠并控制细胞的解离和细胞外物质侵入的功能；柚皮素结合于RELA的PFAM结构域，具有DNA结合和转录启动功能。

本发明还提供了一种柚皮素在制备预防/保护肾脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

本发明还提供了一种柚皮素通过减轻肾脏炎症反应在制备预防/保护肾脏缺血再灌注损伤药物中的应用。

本发明还提供了一种药物，所述药物包括以柚皮素作为唯一活性成分或以柚皮素作为药物活性成分的药物。

作为优选，还包括药学上可接受的载体，其中以柚皮素作为药物活性成分时，其在药物中所占重量百分比为0.1-99.9％。

作为优选，所述药物的剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、粉剂、溶液剂和注射剂中的任意一种。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

本发明通过柚皮素干预大鼠缺血再灌注急性肾损伤模型证明了柚皮素对人缺血再灌注致急性肾损伤预防/保护作用的可能性，并通过将实验验证和生物信息学技术结合，证明了其通过与NF-κB相关蛋白直接结合减轻了NF-κB引起的炎症反应从而预防缺血再灌注致急性肾损伤。

柚皮素作为植物提取物被广泛研究，但其对人肾脏缺血再灌注的保护作用未被发掘，本发明旨在证明柚皮素通过与NF-κB相关蛋白直接结合减轻了肾脏IR中的炎症反应从而预防/保护IR-AKI这一新用途以及这种保护作用的机制，为拓宽该药物可能的应用范围提供理论基础，为广大急性肾损伤患者带来福音。

附图说明

图1为本发明实施例所提供的不同分组条件下的大鼠肾脏石蜡固定切片HE染色病理结果示意图；

图2为本发明实施例所提供的不同分组条件下的肾小管损伤评分示意图，＊表示结果有显著差异P＜0.05，＊＊表示P＜0.01，＊＊＊表示P＜0.001。

图3为本发明实施例所提供的不同分组条件下的大鼠血肌酐水平示意图，＊表示结果有显著差异P＜0.05，＊＊表示P＜0.01，＊＊＊表示P＜0.001。

图4为本发明实施例所提供的模型中KIM-1表达变化的qRT-PCR结果，＊表示结果有显著差异P＜0.05，＊＊表示P＜0.01，＊＊＊表示P＜0.001。

图5为本发明实施例所提供的模型中TNF-α及IL-1β表达变化的qRT-PCR结果，＊表示结果有显著差异P＜0.05，＊＊表示P＜0.01，＊＊＊表示P＜0.001。

图6为本发明实施例所提供的对缺血再灌注致急性肾损伤基因集进行差异基因分析及蛋白质互作网络分析结果。

图7为本发明实施例所提供的枢纽蛋白与柚皮素分子一对一反向分子对接后，结合能最低的10个蛋白对接可视化模式图。

图8为本发明实施例所提供的反向分子对接中与柚皮素分子结合能最小的10个基因通路分析结果图。

图9为本发明实施例所提供的柚皮素与NF-κB相关蛋白结合的结构域功能分析。

图10为本发明实施例所提供的模型中NF-κB表达变化的qRT-PCR结果，＊表示结果有显著差异P＜0.05，＊＊表示P＜0.01，＊＊＊表示P＜0.001。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1柚皮素预处理分组

使用DMSO溶解柚皮素干粉制成母液，并用生理盐水稀释为柚皮素工作液。将30只8周龄，体重250-300g的健康雄性SPF级Wistar大鼠饲养于独立送风的隔离笼具中，温度控制于21℃±2℃，相对湿度控制于50％±15％，昼夜周期为12h，正常饮食，每2天更换一次垫料。随机均分为4组，分别为假手术组、AKI组、柚皮素+AKI组、DMSO+AKI组，每组各6只。给药组(柚皮素+AKI组)大鼠建模前7天开始，以腹腔注射的方式给予50mg/kg*d的柚皮素进行干预；对照组(DMSO+AKI组)以相同方式注射等浓度等量的DMSO生理盐水溶液。

AKI组、柚皮素+AKI组及DMSO+AKI组进行手术缺血再灌注处理，具体成模方式与成模标准见下述。

实施例2缺血再灌注模型及假手术模型制作

将6-8周Wistar大鼠在21℃±2℃、50％±15％湿度、12小时光照条件下培养，采用标准颗粒饲料、消毒无菌水喂养。每6只大鼠一笼，手术前12小时禁食。高压蒸汽灭菌器设定为120℃，时间为40min，手术器械放入进行灭菌。AKI组、柚皮素+AKI组及DMSO+AKI组大鼠预处理完成后，用现配戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠处于完全肌松状态为麻醉成功，腹部向上采取仰卧位，用弹力绳轻轻固定四肢，弹性绳固定门齿向上牵拉，因麻醉时间不能确定，大鼠可能术中清醒，如固定不好可能会咬伤术者。将舌头从侧面提出口腔，防止舌后坠阻塞咽口造成动物窒息。推毛器褪去动物腹部毛发备皮，以腹正中部位为中心进行碘伏消毒，半径为5cm，无菌纱布剪口制作无菌洞巾，于消毒区域覆盖。无菌手术钳提拉皮肤，执笔式拿握手术刀，沿腹正中线开腹，逐层切开皮肤、皮下组织、肌肉，到腹膜时，向上逐步挑切，逐层打开腹腔，手术切口3-4cm。双侧肾脏缺血时间根据参考文献得知夹毕时间为20min，肾功能下降较低，肾组织损害较轻，并不能达到急性肾损伤标准；肾动静脉夹毕时间为50min的时候，大鼠术后生存率明显下降，甚至直接进展为肾衰竭；肾脏缺血45min，急性肾损伤临床诊断及病理损伤更为典型且术后生存率较高。右肾造模时，将右侧肠管向动物左侧扒出，直至暴露出右侧肾脏与肾蒂，用生理盐水湿纱布盖住暴露于空气中的肠管，防止感染与脱水，注意维持正常血运谨防肠坏死。用镊子钝性分离肾周组织与肾蒂，暴露右肾静脉，用35mm血管夹钳夹住肾静脉至其血运完全消失，钳夹成功可见肾脏变白或变紫。右侧肾蒂夹毕后立即计时45分钟，将右侧肠管还纳回腹腔。左侧肾蒂相同方法夹毕处理。45分钟后，将血管夹取下，可见肾脏血运恢复，偏白色或偏紫色肾脏恢复为正常的淡红色。双侧血管夹取下后肠管回纳回腹腔，分层缝合腹部切口，注意消毒与无菌操作。缝合致密防止肠管脱出。麻醉苏醒后，及时为其补充食物与无菌水。

假手术组大鼠仍采用标准饲养方式，饲养相同日龄后于手术日进行假手术处理，即术前12小时禁食，用现配戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，用弹力绳轻轻固定四肢，弹性绳固定门齿向上牵拉。将舌头从侧面提出口腔，防止舌后坠阻塞咽口造成动物窒息。推毛器褪去动物腹部毛发备皮，以腹正中部位为中心进行碘伏消毒，半径为5cm，无菌纱布剪口制作无菌洞巾，于消毒区域覆盖。无菌手术钳提拉皮肤，执笔式拿握手术刀，沿腹正中线开腹，逐层切开皮肤、皮下组织、肌肉，到腹膜时，向上逐步挑切，逐层打开腹腔，手术切口3-4cm。将大鼠右侧腹腔中肠管用钝头手术镊或者手术刀柄向外翻出直至肉眼可见右侧肾蒂组织。用经生理盐水湿润的纱布包裹外露肠管防止干燥。用钝头镊子钝性分离肾周脂肪组织和肾蒂，避免损伤肾实质组织和肾动静脉及输尿管，直至肾静脉可以被清楚看到，将肠管还纳。再对左侧肠管和肾脏采取相同操作。双侧肾蒂均分离结束后，分层缝合腹部切口，注意消毒与无菌操作，缝合致密防止肠管脱出。

术后正常饲养24h后，戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧固定在手术架上，从腹正中线皮肤切开腹腔，使下腔静脉清楚暴露。用注射器朝下腔静脉离心端方向插入血管，吸出血液，吸取血液时要快速防止血液凝固堵塞针管。然后取肾脏组织，将肾脏被膜剥除后，取右侧肾组织沿肾蒂部位冠状位切成两半，4％甲醛进行固定为病理切片用，左侧肾脏去被膜后进行PCR样本采集。

实施例3大鼠血肌酐、尿素氮监测

将5ml上述取出的血液样本置于5ml EP管内静置1h，高速离心机以3000rpm转速离心15min，留取上层血清移至新EP管中，用于血肌酐、尿素氮的检测，4℃储存。24h内将标本送至医院检验科，采用除蛋白法测定血肌酐(购自南京建成)水平，检测结果见表1。

表1大鼠血肌酐(μmol/l)结果

根据表1结果所示，AKI组相比于假手术组血肌酐水平显著上升，达到急性肾损伤水平，说明本实验造模成功。DMSO+AKI组与AKI组相比肌酐水平无显著差异，证明DMSO溶剂对大鼠肾功能无明显影响。而柚皮素+AKI组相比于AKI组，血肌酐水平有统计学意义上的下降，证明柚皮素对大鼠缺血性急性肾损伤有预防/保护作用。血肌酐水平柱状示意图如图3所示。

实施例4石蜡固定病理切片、HE染色

4.1 石蜡固定取去被膜完整右肾组织，用组织体积的5倍的4％聚甲醛固定，后进行石蜡包埋。石蜡包埋过程包括脱水、透明、浸蜡和包埋过程。具体如下：

(1)脱水：组织经过75％，85％，95％，100％酒精的脱水。脱水时间应视组织块大小、厚薄和固定剂的不同确定，本实验采取75％酒精20min，85％酒精20min，95％酒精20+90min，100％酒精15+15min。脱水要彻底、充分。

(2)透明：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。组织在这类媒浸液中浸渍出现透明状态，透明剂浸渍过程称透明，这个液体就称为透明剂。本实验采用二甲苯作为透明剂，效果良好。透明时间根据组织块大小、厚薄也有些许不同，本实验采取二甲苯浸渍20min后更换新二甲苯再浸渍20min的方法以使透明完全。

(3)浸蜡：组织经透明剂(二甲苯)之后，移入熔化的石蜡内，石蜡逐渐取代透明剂浸入组织间隙。浸蜡是在60～62℃的温箱内进行的。本实验为尽量排净二甲苯浸蜡分两缸进行。浸蜡时间根据肾组织大小，厚薄确定，经摸索确定为2h。

(4)包埋：将已经经过固定、脱水、透明、浸蜡的肾组织从蜡浴取出，置入熔化石蜡的包埋框内，包埋成块，使组织和包埋剂相熔一体并迅速冷却。先把取下的肾组织放置于金属包埋框底，将金属包埋框内放满石蜡，用弯头镊子平整组织、调整到底部，包埋机设定温度64-65℃。蜡液表面凝固后，将包埋器投入冷水浴中，使石蜡冷却凝固(组织长径与包埋框盒长径垂直)。

4.2 石蜡切片

操作流程：

(1)将切片刀装在刀架上，将石蜡块装在切片机上，固定好。把位置调整合适，切片所需厚度适宜(5-8微米厚)。

(2)转动切片机手柄，先粗切标本，快速暴露出组织最大切面后仔细切片。

(3)把切出蜡片下端托起，轻轻放于温水中(温度40℃)，使组织展平。

4.3 HE染色

(1)切片常规脱蜡后放入水中，贴到载玻片上45℃烘干；(2)苏木精水溶液中染色1-2min，水洗；(3)加入1％盐酸乙醇分色数秒后水洗；(4)氨水返蓝数秒；(5)流水冲洗1h后镜下观察细胞核成蓝色；(6)酒精伊红染2-3min，水洗；(7)染色后的切片经梯度乙醇脱水，再经二甲苯使切片透明，最后树胶封片；(8)染色结果：胞核呈蓝色，胞浆呈红色，红细胞呈橙色，其他成分呈深浅不同红色。

除直接观察肾小管形态和管型数量外，肾组织受损的程度，还通过HE染色的肾切片(n＝6-8)中肾小管坏死、铸型形成和扩张的肾小管百分比来衡量：0＝正常；1＝10％；2＝10％-25％；3＝26％-50％；4＝51％-75％；5＝75％。

根据图1所示的HE染色病理结果，计算肾小管损伤评分，如图2所示，评估大鼠肾脏损伤情况。从病理结果看，AKI组相比于假手术组，肾小管上皮细胞水肿增多，管型增多，肾小管及其管腔形态不规则出现萎缩的肾小管及扩大的肾小管，肾间质炎性细胞增多，DMSO+AKI组与AKI组损伤程度基本相似。柚皮素+AKI组相比于AKI组，肾小管损伤评分有所好转，形态学上间质炎性细胞有所减少，管型相对较少，肾小管形态部分恢复，水肿有所好转。提示柚皮素对于缺血再灌注致急性肾损伤有部分预防和缓解作用。

实施例5实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)检测模型中KIM-1、TNF-α、IL-1β、NF-κB表达变化

5.1 mRNA提取

将收集的Trizol及组织裂解物溶液，每毫升Trizol加入200μl的氯仿，手动混匀1min后冰上放置3min后再4℃，12000rpm离心，收集上清，加入等体积的异丙醇，4℃放置10min后离心，弃上清加入1ml75％乙醇，涡旋震荡后再次离心，吸去上清，待液体晾干后加入适量DEPC水溶解，最后使用分光光度计检测RNA浓度。所提RNA浓度均在1μg/μl左右，OD260/OD280的比值均在1.8至2.0之间。

5.2 去除体系DNA及反转录

①去除基因组DNA反应

按如下成分于冰上配制反应混合液。为了保证反应液配制的准确性，避免误差，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制总体系，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。本实验RNA上样量按700ng计算，RNA上样体积＝700ng/RNA浓度，RNase Free dH2O＝7μl-RNA上样体积。

去除基因组DNA反应体系反应条件为42℃2min；4℃保持。

②反转录体系

使用TAKARA逆转录试剂盒(RR037a)，按照其说明书进行逆转录。反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，减少误差，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制总体系，然后再分装到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

反转录体系反应条件为：37℃15min；85℃5sec；4℃保持。

5.3 实时荧光定量PCR

按下列组份配制qRT-PCR反应液(反应液配制请在冰上进行)，仍然是先配置总体系后分装，最后加样本。

使用所得cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，引物序列为:

体系为2μl逆转录产物，前、后向引物各0.8μl，10μl SYBA Green Mix，6.4μlRNase free双蒸水，反应条件为：95℃30s 1个循环；95℃5s，60℃40s，40个循环。

本实施例进行了三次独立实验，实验数据用三次独立实验的平均值±标准差(SD)来表示。数据在Graphpad prism 5.0软件(Graphpad software，San Diego，CA)中通过单向方差分析(ANOVA)进行分析，采用Bonferroni法进行组间两两比较。P<0.05被认为有显著差异。

结果如图4-图5所示，根据qRT-PCR结果，KIM-1水平在AKI手术后显著升高，证明本实验成模良好，柚皮素用药后KIM-1水平显著下降(P＜0.05)，证明柚皮素可部分预防、保护缺血再灌注致急性肾损伤。TNF-α、IL-1β均为炎症损伤的标记分子，其表达量反映炎症反应的强弱，急性肾损伤后受损肾脏二者释放增加，证明炎症水平急剧加重；应用柚皮素后TNF-α及IL-1β水平显著下降，说明柚皮素在缺血再灌注致急性肾损伤中的保护性作用与其抗炎特性有关；DMSO+AKI组KIM-1及炎症损伤标记物表达量与AKI组大致相似，证明DMSO并不能对肾脏炎症水平产生影响。

根据生物信息学预测，柚皮素能与NF-κB家族多个分子稳定结合。如图10所示，作为炎症反应的核心分子，NF-κB水平在AKI后显著升高，促进下游炎症反应分子表达，启动受损肾脏炎症反应。应用柚皮素后，NF-κB表达量显著下降，结合上述炎症损伤标记物——TNF-α、IL-1β与NF-κB的同步变化，可以认为NF-κB为柚皮素预防IR-AKI的靶蛋白。

实施例6生物信息学预测柚皮素预防/保护缺血再灌注致急性肾损伤的机制

6.1 差异基因分析与蛋白质互作网络分析

检索NCBI GEO数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)IR-AKI相关芯片得到GSE98622数据集，下载预处理后的矩阵文件(TXT)后，通过R语言利用limma包进行差异基因分析，校正后P值(adj.P.Val)小于0.05并且|log₂FC|>2为差异基因筛选阈值。利用R软件中的pheatmap包(version，1.0.8)绘制火山图实现可视化。

将差异表达基因导入STRING(STRING；version 10.0；http://string-db.org/)数据库构建蛋白质互作网络，进一步利用Cytoscape(version 3.6.1；www.cytoscape.org/)软件绘制蛋白质互作网络图。NetworkAnalyzer计算整个互作网络的拓扑结构特征值，通过cytoHubba app中6种不同算法计算各个枢纽蛋白的相对得分，前20位基因中，在6种算法中出现≥2次的基因纳入下一步筛选。利用MCODE app(ftp://ftp.mshri.on.ca/pub/BIND/Tools/MCODE)计算得出互作网络结构相对稳定的蛋白通路及相关蛋白，再与cytoHubba得到的基因取交集，最终得到枢纽基因。

6.2 枢纽基因与柚皮素反向分子对接

从RCSB PDB网站(http://www.rcsb.org/)下载枢纽基因的三级结构，若三级结构未知则利用SWISS-MODEL数据库(https://swissmodel.expasy.org/repository/)进行同源建模，构建IR-AKI的枢纽蛋白库。从PubChem compound数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载柚皮素分子三维结构。利用autodock软件进行枢纽蛋白库蛋白与柚皮素分子的一对一反向分子对接计算，并对所选取的蛋白与柚皮素之间的结合能进行分析排序。利用PyMOL软件使对接分子可视化，并展示其对接氨基酸残基。

6.3 柚皮素靶标基因通路分析

结合能最低的10个基因被认为最有可能与柚皮素结合，选取其为靶标基因。将靶标基因的Gene Symbol导入Funrich软件中，分析其“Biological Pathway”。

6.4 NF-κB相关蛋白与柚皮素结合结构域功能分析

从UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)获得相关蛋白信息，通过SMART(https://smart.embl.de/)分析与柚皮素对接相关结构域的功能。

按照校正P值(adj.P.Val)小于0.05并且|log₂FC|>2的标准，我们找到359个差异基因，其中上调的基因有138个，下调的基因有221个(图6差异基因火山图)。将差异分析得到的359个差异基因蛋白导入Cytoscape，综合上述结果，共得到109个IR-AKI的枢纽基因(图6蛋白质互作网络图)。

为探究柚皮素对IR-AKI保护机制，柚皮素与枢纽蛋白进行一对一反向分子对接，二者结合能越低则结合越稳定。因此如表2所示，按照结合能由低到高对蛋白进行排序，结合能最低的10个蛋白认为最有可能与柚皮素结合(图7)。

表2与柚皮素对接结合能最低的10个蛋白

通路分析显示，能与柚皮素稳定作用的调控基因主要富集于NF-κB相关炎症通路(adj.P<0.05，图8)，提示柚皮素可能是通过NF-κB通路保护IR-AKI。应用分子对接等技术进一步对柚皮素与NF-κB相关蛋白的结合模式及结合位点所在结构域功能进行分析(图9)，结果显示柚皮素与NFKBIA和BCL3均结合于ANK结构域，该结构域具有蛋白结合功能；NFKB2和RELA的结合区域均包括IPT结构域，该结构域具有免疫球蛋白样折叠并控制细胞的解离和细胞外物质的侵入；此外，柚皮素还能结合于RELA的PFAM(RHD-DNA-binding)结构域，该结构域具有DNA结合和转录启动功能。因此，柚皮素与NF-κB相关蛋白均结合在保守的、已识别的功能活跃结构域，通过调节蛋白的关键结构域活性发挥IR-AKI过程中炎症反应的抑制作用。通过qRT-PCR检测NF-κB表达量变化，证实柚皮素抑制NF-κB表达，进一步证明柚皮素通过与NF-κB相关蛋白结合预防/保护缺血再灌注致急性肾损伤。

Claims

1.柚皮素在制备预防/保护肾脏缺血再灌注损伤药物中的应用，其特征在于，柚皮素通过与NF-κB相关蛋白直接结合减轻NF-κB引起的肾脏炎症。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NF-κB相关蛋白为BCL3、RELA、NFKBIA和NFKB2。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，柚皮素与NF-κB相关蛋白的结合能为RELA＞NFKB2＞BCL3＞NFKBIA。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，柚皮素与NFKBIA和BCL3结合于ANK结构域，具有蛋白结合功能；柚皮素与NFKB2和RELA结合于包括IPT结构域的结构域，其具有免疫球蛋白样折叠并控制细胞的解离和细胞外物质侵入的功能；柚皮素结合于RELA的PFAM结构域，具有DNA结合和转录启动功能。

5.如权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括以柚皮素作为唯一活性成分或以柚皮素作为药物活性成分的药物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体，其中以柚皮素作为药物活性成分时，其在药物中所占重量百分比为0.1-99.9％。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、粉剂、溶液剂和注射剂中的任意一种。