CN113304167B - Ensrnot00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用，证实了ENSRNOT00000084277在慢性疼痛相关抑郁情绪形成中的重要作用，而上调ENSRNOT00000084277可明显改善慢性疼痛大鼠的抑郁样行为。因此，ENSRNOT00000084277可以作为分子靶点用于制备防治慢性疼痛相关抑郁情绪的药物，为抑郁防治药物的研发提供了新的思路。

Description

ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物 中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用。

背景技术

慢性疼痛一直是全世界关注的重要健康问题之一。越来越多的研究表明，长期慢性疼痛可导致焦虑、抑郁、厌恶等负性情绪的产生，而这些负性情绪远比疼痛本身带来的痛苦更为严重，而且负性情绪的长期存在还可以加重疼痛的感觉，严重影响患者的生活质量。抑郁情绪是常见的慢性疼痛相关负性情绪之一，但目前对于慢性疼痛相关抑郁情绪临床上尚无有效的治疗手段。因此，研究慢性疼痛相关抑郁情绪形成的机制以及寻找新的药物治疗靶点具有重要的现实意义和紧迫性。

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt的RNA，其本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在表观遗传水平、转录水平、转录后水平等多个层面调控基因表达，参与多种生理或病理过程。近年来的研究显示，lncRNA的异常表达与多种神经精神系统疾病的发生发展密切相关，如阿尔茨海默症、脑卒中、慢性疼痛、焦虑症、抑郁症等。因此，慢性疼痛相关抑郁情绪形成的lncRNA对于制备相关防治药物具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用。

本发明的第二个目的是提供ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物以上述ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

本发明的技术方案如下：

ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用，ENSRNOT00000084277的序列为SEQ ID NO.1，具体如下所示：GTTGGTTTTA CATTAACCTCTGCCCAAACC TTGTCCTTTC TGGGGCACTG AGTGCAACTG TGTGCTCTTG TTCCCACGAC CTAGGGATCCAGGTACAGTT GCTTTCCTGC TTTCTGCTTG CAGAGTTAGA TGCCAGCCAT CTGTCCAACT GCTGGGCAGGGAAGATAAAC ACTGCAGCCC TGGGAGCCCT GCAGAGAGCA GAGGAAAGAA TTCTTGAGGA CCCCCACCCCACACGTTTCG AAAGGAGACA TAATCAGCAA ACGGCTCGAA AAGCAGCTAA CTTAAGAGTA AATAACGATCAAGAGGTACC ATGGAAGAGA CAATGTCCTG TTGGCCAGCA CAATTAAAAT CAATATCACT GGTAAGAAAATGATATATCC ACTGTGAATG ACTTTGGAAT GGTTTCTGTC AGGGCCCTTG CTTGTGATTA AAGCTAAGGACGAAAAATTC ACACAGCTGT TTGGAGGTCG GTTTATATTG G。

ENSRNOT00000084277用于制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物时，药物可以制成固体制剂或者液体制剂。进一步地，在本发明提供的技术方案的基础上，药物可以制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。

在一种优选方案中，ENSRNOT00000084277以腺相关病毒(AAV)作为载体，制备ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒(rAAV-EF1a-lncRNA(LOC102552829-201)

-bGH polyA-CMV-mCherry-hGH polyA,简称为rAAV-lncRNA)。

本发明还提供ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用。

在一种优选方案中，本发明提及的ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒(rAAV-EF1a-lncRNA(LOC102552829-201)-bGH polyA-CMV-mCherry-hGH polyA,简称rAAV-lncRNA)，制备方法包括如下步骤：

1)质粒构建：①载体线性化：以质粒PT-2743(rAAV-EF1a-lncRNA(n424059)-bGHpolyA-CMV-mCherry-hGH polyA)为骨架进行改造，采用SalI和NheI酶切，获得线性化的载体片段。②目的片段获取：将基因合成质粒pUC57-2733用SalI和NheI酶切，获得目的基因LOC102552829-201。③骨架和目的基因连接：将线性化载体与片段混合，在T4连接酶作用下，实现片段与载体的连接。④转化大肠杆菌Trans1-T1，挑取单克隆，并通过PCR检测、酶切和测序鉴定出阳性克隆。

2)腺相关病毒包装：构建好的病毒载体和pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)质粒进行大量抽提，再细胞转染，裂解细胞，超速离心获得病毒颗粒，测定病毒滴度。

本发明采用坐骨神经分支选择性神经损伤(SNI)方法建立神经病理性疼痛大鼠模型，通过基因芯片筛选及qRT-PCR验证。结果发现：ENSRNOT00000084277在慢性疼痛抑郁大鼠中央杏仁核(CeA)中的表达明显降低，表明ENSRNOT00000084277下调与慢性疼痛相关抑郁情绪的形成有关。进一步地，采用腺相关病毒(AAV)介导的过表达技术，在SNI慢性疼痛抑郁大鼠CeA内注ENSRNOT00000084277过表达病毒，结果发现：上调ENSRNOT00000084277对慢性疼痛大鼠抑郁样行为具有改善作用。接下来，又采用正常大鼠CeA内注射ENSRNOT00000084277敲低病毒，结果发现：下调ENSRNOT00000084277可诱导其抑郁样行为的产生。从而从正反两方面明确ENSRNOT00000084277在慢性疼痛相关抑郁情绪形成中的作用，为抑郁防治药物的研发提供了新的思路。

另外，过表达或敲低ENSRNOT00000084277对大鼠疼痛行为均无明显影响。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物以上述ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。该药物组合物可以为固体制剂或液体制剂，特别是注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。药学上可接受的辅料在整个制剂技术发展过程中起到关键的作用，许多制剂中辅料占到大部分，因而很大程度上辅料的性质决定了制剂的性质。优良的辅料可以增强主药的稳定性，延长药剂的有效期；可以调控主药在体内外的释放速度；可以改变药物在体内的吸收，增加生物利用度，对具体的辅料类型不作限定。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明证实了ENSRNOT00000084277在慢性疼痛相关抑郁情绪形成中的重要作用，而上调ENSRNOT00000084277可明显改善慢性疼痛大鼠的抑郁样行为。因此，ENSRNOT00000084277可以作为分子靶点用于制备防治慢性疼痛相关抑郁情绪的药物，为抑郁防治药物的研发提供了新的思路。

附图说明

图1是ENSRNOT00000084277在SNI诱导的慢性疼痛抑郁大鼠CeA中的表达变化；

图2是过表达ENSRNOT00000084277对SNI大鼠抑郁样行为及疼痛行为的影响；其中，(A)相对表达量；(B)不动时间；(C)糖水偏好实验；(D)机械痛阈；(E)冷痛评分；

图3是敲低ENSRNOT00000084277对正常大鼠抑郁样行为及疼痛行为的影响；其中，(A)相对表达量；(B)不动时间；(C)糖水偏好实验；(D)机械痛阈；(E)冷痛评分。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

1、主要实验方法：

(1)实验动物：健康雄性SPF级SD大鼠由徐州医科大学实验动物中心提供，体重200～220g。

(2)神经病理性疼痛模型制备：SD大鼠随机分为假手术组(Sham)和SNI模型组。SNI模型组采用选择性坐骨神经分支损伤法建立神经病理性疼痛模型，具体操作如下：大鼠给予10％水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于实验操作台。沿大鼠左侧大腿股骨外凹陷处切开皮肤，作约1～2cm长切口，钝性分离周围组织暴露大鼠坐骨神经的3个分支，保留腓肠神经，采用铬制羊肠线结扎并切断胫神经和腓总神经。切口采用4.0丝线缝合。Sham组大鼠只分离暴露坐骨神经而不结扎。实验所有操作均严格遵守无菌原则。

(3)机械刺激缩足阈值(MWT)的测定：分别于术前1天及术后第1、3、7、14、21、28天测定大鼠机械痛阈值。实验前将大鼠放置于底部为金属丝网的透明有机玻璃箱(7×9×11cm)内适应30min。实验开始后，采用Von Frey细丝按照从小到大力度垂直刺激左后脚掌外侧区域，每次持续6～8s，间隔3min。阳性反应的表现为后足出现缩足或舔足。如该力度刺激不能引起阳性反应，则给予相邻大一级力度的刺激；如出现阳性反应则给予相邻低一级力度刺激，将26g作为测定阈值，根据up-down方法计算50％机械刺激缩足阈值。

(4)冷痛的测定：将待测大鼠放在大鼠疼痛行为测试台上，用特制的塑料笼罩住，待适应环境30min后，用小型喷雾器喷射约0.05ml丙酮于大鼠左后足底，观察20s内大鼠的反应，大鼠的反应采用Flatters and Bennett的4分法评价：0分，没有任何反应；1分，大鼠迅速缩足；2分，大鼠反复缩足；3分，大鼠反复缩足并舔足底。以5min为间隔，重复3次，总和3次测试分数，即为大鼠的冷痛评分。

(5)强迫游泳实验：于正式实验前24h将大鼠分别放入透明有机玻璃缸中，水温25℃，大鼠预适应15min。次日，在同样的情况下进行强迫游泳6min，实验过程中采用摄像机进行摄像。实验结束后观察并记录后5min内大鼠的累计不动时间。不动是指大鼠在水中停止挣扎呈漂浮状态，或者仅有细小的肢体运动以保持头部在水面上。每只动物实验结束后擦干并换水。

(6)糖水偏好实验：大鼠适应环境3d后进行糖水训练，以改变大鼠原来的饮水嗜性。实验方法为：第一个24h给予大鼠两瓶1％的蔗糖溶液，第二个24h给予大鼠一瓶1％的蔗糖溶液，一瓶普通饮用水。随后禁水禁食23h后，给予大鼠预先称量好的两个饮水瓶(各100ml左右)：一瓶为1％的蔗糖溶液，一瓶为普通饮用水。大鼠自由饮水1h后，称取两瓶饮水瓶的重量，计算消耗量，并计算动物对糖水的偏爱率。

(7)RT-qPCR：采用TRIzol试剂盒提取海马组织总RNA，测定其纯度和浓度，随后采用反转录试剂盒合成cDNA，再进行荧光定量PCR反应，循环条件设置为：预变性95℃2min，95℃15s、60℃30s反应45个循环。以β-actin为内参，计算目的基因的相对表达量。ENSRNOT00000084277的引物序列如下：上游：5’-CCT CTG CCC AAA CCT TGT CCT TTC-3’，下游：5’-GCA AGC AGA AAG CAG GAA AGC AAC-3’。β-actin的引物序列如下：上游：5’-CCCATC TAT GAG GGT TAC GC-3’，下游：5’-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3’。

(8)ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒制备：ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒(rAAV-EF1a-lncRNA(LOC102552829-201)-bGH polyA-CMV-mCherry-hGH polyA,简称rAAV-lncRNA)和阴性对照病毒(rAAV-CMV-mCherry-WPRE-pA,简称rAAV-NC)具体包括如下步骤：

1)质粒构建：①载体线性化：以质粒PT-2743(rAAV-EF1a-lncRNA(n424059)-bGHpolyA-CMV-mCherry-hGH polyA)为骨架进行改造，采用SalI和NheI酶切，获得线性化的载体片段。②目的片段获取：将基因合成质粒pUC57-2733用SalI和NheI酶切，获得目的基因LOC102552829-201。③骨架和目的基因连接：将线性化载体与片段混合，在T4连接酶作用下，实现片段与载体的连接。④转化大肠杆菌Trans1-T1，挑取单克隆，并通过PCR检测、酶切和测序鉴定出阳性克隆。

2)腺相关病毒包装：①准备质粒：把外源基因克隆进合适的载体。构建好的病毒载体和pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)质粒进行大量抽提。②细胞转染：接种AAV-293细胞于10cm皿，48h后用于转染，转染时汇合度达到70～80％。转染前1h取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入10ml的Opti-MEM培养基。将待转染的病毒载体质粒32μg(pHelper：pAAV-RC：穿梭质粒＝1：1：1)溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min；将转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为500μl，轻轻混匀，静置5min；将转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体；取出细胞皿，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中。6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入10ml新鲜完全培养基培养。③病毒收获及纯化：转染60h后，使用细胞刮将细胞刮下，并收集到离心管，1500g4℃离心5min，将细胞沉淀重悬在9ml的lysis buffer中，将培养液收集至500ml瓶中，取细胞裂解液置于液氮中冷冻3min，37℃水浴，反复冻融3-4次，加入250U的benzonase，混匀后37℃孵育1h，加入NaCl至终浓度为150mM，混匀后37℃孵育30min，2500g、室温离心10min，取上清弃去沉淀。将离心后的上清倒入第2)步中收集的上清中，加入PEG8000和NaCl至终浓度分别为8％、0.5M，4℃过夜，12000rpm，4℃离心1.5h，弃掉上清，沉淀用10ml PBS重悬，再将重悬后的病毒原液加入到装有碘克沙醇的超速离心管中(碘克沙醇的浓度分别为15％、25％、40％、60％)，63000rpm、18℃离心2h。用10ml注射器抽出40％层样品装入透析袋中，4℃透析，12-16h换透析液，每次使用2L缓冲液。收集透析后的样品，使用超滤管进行浓缩。④滴度测定：通过定量PCR检测基因组中AAV载体的基因组拷贝数来测定AAV的病毒颗粒数。用质粒标准品，计算标准品的浓度，稀释至1E+8个/μl，梯度稀释，直至1E+3个/μl，共6个梯度；取5μl浓缩后的病毒样品，加入NaOH至终浓度为1M，55℃水浴30min后加入HCl中和，加入纯水或1XPBS稀释10倍；在每个反应孔中加入反应液18μl，然后加入2μl的模板；上机，退火温度设为60℃，按照标准操作得到Ct值并计算AAV样品中的拷贝数。将空载体和腺相关病毒骨架共转染293细胞，包装阴性对照病毒。

(9)ENSRNOT00000084277敲低腺相关病毒制备：敲低腺相关病毒(rAAV-U6-shRNA(LOC102552829-201)-U6-shRNA(LOC102552829-201)-CMV-mCherry

-SV40 polyA,简称shRNA-lnc)和阴性对照病毒(rAAV-U6-shRNA(scramble)-U6-shRNA(scramble)-CMV-mCherry-SV40 polyA,简称shRNA-NC)，制备方法包括如下步骤：

1)质粒构建：

①载体线性化：以质粒PT-4004(PFD-rAAV-U6-shRNA(空载)-CMV-mCherry-SV40polyA)为骨架进行改造，采用EcoRI和SpeI酶切，获得线性化的载体片段。

②具有同源臂的插入片段的获得：设计片段引物。

2739-SpeI-F1	gcacgcgtatcgatactagtgagggcctatttcccatgattcc
		2739-R1	aaggaatcatgggaaataggccctcggatccaaaaaGCAACTGTGTGCTCTTGT
2739-F2	ACAAGAGCACACAGTTGCtttttggatccgagggcctatttcccatgattcctt
		2739-EcoRI-R2	accgtaagttatgtgaattcaaaaaGCTGTTTGGAGGTCGGT

其中引物2739-SpeI-F1含有与线性化的U6-shRNA1片段SpeI酶切位点末端20bp同源区，反向引物2739-EcoRI-R2含有与线性化的U6-shRNA5片段EcoRI酶切位点末端20bp同源区，2739-R1与2739-F2反向互补。通过PCR分别获得带有与载体同源区的目的片段。

③同源重组：将线性化载体与片段按比例混合，在同源重组酶Exnase作用下，实现多个片段与载体的同源重组连接。

④转化大肠杆菌Trans1-T1，挑取单克隆，并通过PCR检测、酶切和测序鉴定出阳性克隆。

2)腺相关病毒包装：同上述步骤(8)中ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒制备。

(10)脑立体定位注射：

动物麻醉后，取俯卧位置于脑立体定位注射仪上，调整两侧耳杆，观察左右读数相同时拧紧耳杆上的固定螺丝。手术刀纵向切开头皮，充分暴露颅骨，显示出矢状缝和前囟。调整上颌固定器高度，使前囟中心点和人字缝尖处在同一水平面。参照大鼠脑图谱确定CeA的坐标。定位前囟坐标为0点，选择的CeA坐标为前囱后2.1mm，中线旁开4.5mm，深度8.6mm。确定位置后用牙科钻在做好标记的位置钻孔，以刚好钻透颅骨为宜，垂直插入微量注射针至合适深度，进针后停留5min，按照0.1μl/10s的速度匀速注射，注射结束后停留10min，再将微量注射器针头缓慢拔出。

(11)数据分析：数据以Mean±SEM表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较采用LSD检验或Dunnett’s T3检验。检验水准α＝0.05，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、实验结果及分析：

(1)SNI诱导的慢性疼痛抑郁大鼠CeA中ENSRNOT00000084277的表达变化

如图1所示，与Sham组相比，SNI组大鼠CeA内ENSRNOT00000084277的表达水平明显降低(P<0.01)，提示ENSRNOT00000084277下调可能参与SNI大鼠疼痛相关抑郁情绪的形成。

(2)过表达ENSRNOT00000084277对SNI大鼠抑郁样行为及疼痛行为的影响

为了观察上调CeA内ENSRNOT00000084277对SNI大鼠抑郁样行为的影响，我们在脑立体定位注射ENSRNOT00000084277过表达病毒(rAAV-lncRNA)14天后通过强迫游泳实验和糖水偏好实验检测大鼠抑郁样行为。如图2A所示，注射rAAV-lncRNA能明显上调SNI大鼠CeA内ENSRNOT00000084277的表达量。如图2B,C所示，SNI大鼠强迫游泳不动时间明显延长(P<0.01)，糖水偏好率明显降低(P<0.01)，说明SNI大鼠表现为明显的抑郁样行为；而注射rAAV-lncRNA的SNI大鼠强迫游泳不动时间明显缩短(P<0.01)，糖水偏好率明显增加(P<0.05)，这说明上调CeA内ENSRNOT00000084277可以明显改善SNI大鼠的抑郁样行为。另外，如图2D,E所示，SNI大鼠从术后1天开始至术后28天，机械痛阈均显著下降(P均<0.01)，冷痛评分显著升高(P均<0.01)，表明SNI大鼠表现为明显的机械痛敏和冷痛敏行为；而注射rAAV-lncRNA的SNI大鼠的机械痛阈和冷痛评分均无明显改变，说明上调CeA内ENSRNOT00000084277对SNI大鼠的痛敏行为没有明显影响。

(3)敲低ENSRNOT00000084277对正常大鼠抑郁样行为及疼痛行为的影响

为了观察下调ENSRNOT00000084277对正常大鼠抑郁样行为的影响，我们在脑立体定位注射ENSRNOT00000084277敲低病毒(shRNA-lnc)14天后采用强迫游泳实验和糖水偏好实验检测大鼠抑郁样行为。如图3A所示，注射shRNA-lnc能明显下调正常大鼠CeA内ENSRNOT00000084277的表达量。如图3B,C所示，与对照组相比，shRNA-lnc组大鼠强迫游泳不动时间明显延长(P<0.01)，糖水偏好率明显降低(P<0.05)，说明下调CeA内ENSRNOT00000084277可诱导正常大鼠出现抑郁样行为。另外，如图3D,E所示，shRNA-lnc注射后，大鼠机械痛阈和冷痛评分均无明显改变(P>0.05，P>0.05)，说明下调CeA内ENSRNOT00000084277对正常大鼠的痛敏行为没有明显影响。

总之，本发明鉴定出在慢性痛抑郁大鼠CeA内差异表达的ENSRNOT00000084277，并从正反两方面证实其参与了慢性疼痛相关抑郁情绪的形成。因此，ENSRNOT00000084277可以作为分子靶点用于制备慢性疼痛相关抑郁情绪的防治药物。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 481

<211> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttggtttta cattaacctc tgcccaaacc ttgtcctttc tggggcactg agtgcaactg 60

tgtgctcttg ttcccacgac ctagggatcc aggtacagtt gctttcctgc tttctgcttg 120

cagagttaga tgccagccat ctgtccaact gctgggcagg gaagataaac actgcagccc 180

tgggagccct gcagagagca gaggaaagaa ttcttgagga cccccacccc acacgtttcg 240

aaaggagaca taatcagcaa acggctcgaa aagcagctaa cttaagagta aataacgatc 300

aagaggtacc atggaagaga caatgtcctg ttggccagca caattaaaat caatatcact 360

ggtaagaaaa tgatatatcc actgtgaatg actttggaat ggtttctgtc agggcccttg 420

cttgtgatta aagctaagga cgaaaaattc acacagctgt ttggaggtcg gtttatattg 480

g 481

Claims (5)

1.ENSRNOT00000084277在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用，其特征在于，所述ENSRNOT00000084277的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ENSRNOT00000084277以腺相关病毒作为载体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物制成液体制剂或固体制剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物制成注射剂、口服液、颗粒剂、粉剂、片剂或胶囊剂。

5.ENSRNOT00000084277过表达腺相关病毒在制备慢性疼痛相关抑郁情绪防治药物中的应用，其特征在于，所述ENSRNOT00000084277的序列如SEQ ID NO.1所示。

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