CN111705061B

CN111705061B - 和心脏疾病相关的piRNA-P1与piRNA-P1反义核苷酸、应用和药物

Info

Publication number: CN111705061B
Application number: CN202010710507.1A
Authority: CN
Inventors: 王昆; 周露玙; 王凯
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111705061A

Abstract

本发明提供了一种和心脏疾病相关的piRNA‑P1与piRNA‑P1反义核苷酸、应用和药物，涉及生物医药技术领域。piRNA‑P1含有如SEQ ID NO.2所示序列，在发生细胞死亡的心肌细胞和心脏组织中表达显著上调，对心肌细胞死亡具有促进作用；piRNA‑P1反义核苷酸含有如SEQ ID NO.1所示序列，能够下调piRNA‑P1的表达水平并抑制心肌细胞死亡；药物含有piRNA‑P1反义核苷酸，通过抑制piRNA‑P1的表达，能够良好的起到预防和/或治疗多种心脏疾病的作用。

Description

和心脏疾病相关的piRNA-P1与piRNA-P1反义核苷酸、应用和药物

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种和心脏疾病相关的piRNA-P1与piRNA-P1反义核苷酸、应用和药物。

背景技术

在我国心血管病发病的危险因素流行趋势较为明显，每年心血管病的发病人数也在不断增加。从整体来看，我国心血管病患病率与死亡率仍然处在上升的阶段。根据《中国心血管病报告2016》的数据统计，目前我国的心血管疾病病患人数约为2.9亿，其中脑卒中与冠心病患者人数均超过1100万，心力衰竭与肺原性心脏病患者总数约950万，风湿性心脏病250万，先天性心脏病200万，高血压所占人数最多，有2.7亿之多；心血管病死亡率居首位，远远高于肿瘤与其他疾病，占居民疾病死亡构成的40％以上，尤其是在农村近几年心血管病死亡率一直高于城市水平。我国因心血管疾病而产生的住院总费用快速增加，2004年至今，其年均增速远高于GDP增速。我国心血管疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，防治心血管病刻不容缓。目前关于心脏疾病发病机理尚不完全清楚，心脏疾病的预防、诊断和治疗尚不能达到让人满意的效果，急需开发新的技术方法用于心脏病的诊断和防治。

PIWI-interacting RNA(piRNA)是非编码小RNA中的一类，它的长度一般在24～35nt范围内；3’端存在甲基化修饰，5’端的第一个核苷酸有尿嘧啶偏向性、第10位的碱基有腺嘌呤偏向性；能够和PIWI家族蛋白相结合，通过DNA甲基化沉默转座子，在生殖系中表达量很高。人体内piRNA绝大多数分布在常染色体上，性染色体上分布极少；而小鼠体内的piRNA却集中分布在性染色体上。随着研究的不断深入，我们发现piRNA在细胞衰老、心血管疾病、癌症等多类疾病中均扮演着非常重要的角色。

心肌细胞的死亡是众多心脏疾病的病理基础。而细胞死亡的形式主要包括细胞凋亡和细胞坏死两种。在过去的观点中，细胞凋亡受到细胞信号通路的调控；而细胞坏死则不受细胞信号通路调控，是一种被动的细胞死亡形式。但随着研究不断地深入，近年来发现细胞坏死同样也是一个由基因控制的高度有序的自发的在一系列酶参与下完成的过程。细胞死亡对胚胎的正常发育，维持细胞群体正常生理功能及恶性病变、保证多细胞生物的健康生存过程中的修复都发挥着极其重要的作用。然而目前对于心肌细胞死亡的信号通路的研究还远远不够深入，piRNA在调控心肌细胞死亡过程中的通路也有待进一步的深入研究，所以寻找心脏中特异表达的、参与调控心肌细胞死亡的piRNA，并进一步阐明它的作用机制，达到开发以piRNA为策略的心脏疾病的诊断、治疗对于该领域的科研人员仍是一个挑战。

鉴于目前的情况，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种piRNA，命名为piRNA-P1，其与心脏疾病相关。

本发明的第二目的在于提供一种用于预防和/或治疗心脏疾病的piRNA-P1反义核苷酸。

本发明的第三目的在于提供所述piRNA-P1或所述piRNA-P1反义核苷酸在制备和心脏疾病相关的产品中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种含有所述piRNA-P1反义核苷酸的用于预防和/或治疗心脏疾病的药物。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了和心脏疾病相关的piRNA-P1，所述piRNA-P1含有如SEQ ID NO.2所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了用于预防和/或治疗心脏疾病的piRNA-P1反义核苷酸，所述piRNA-P1反义核苷酸含有如SEQ ID NO.1所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述piRNA-P1，所述piRNA-P1反义核苷酸在制备和心脏疾病相关的产品中的应用。

可选地，所述心脏疾病包括肥厚型心肌病、心肌纤维化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭。

可选地，所述产品包括药物，所述产品包括所述piRNA-P1反义核苷酸。

可选地，所述产品包括用于诊断心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括以piRNA-P1作为心脏疾病的诊断标志物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，所述药物包括所述piRNA-P1反义核苷酸。

可选地，所述药物还包括载体、药物递送制剂和辅料中的一种或多种；

可选地，所述载体包括病毒载体；

可选地，所述病毒载体包括腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种，优选包括腺病毒载体；

可选地，所述药物递送制剂包括壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种，优选包括脂质体；

可选地，所述辅料包括甘露醇、磷酸盐缓冲液和生理盐水中的一种或多种，优选包括磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的pH优选为6.0～8.0。

可选地，所述药物包括所述piRNA-P1反义核苷酸、药物递送制剂和辅料；

可选地，所述药物中piRNA-P1反义核苷酸的含量为1.0～1.2μg/μl；

可选地，所述中piRNA-P1反义核苷酸与药物递送制剂的质量比为1:(1～1.5)，优选为1:1.25，所述药物递送制剂优选为脂质体；

可选地，所述药物递送制剂和所述辅料的质量比为1：(150～250)，优选为1:200。

可选地，所述药物包括所述piRNA-P1反义核苷酸、病毒载体和辅料；

可选地，所述病毒载体为腺病毒载体；

可选地，piRNA反义核苷酸的腺病毒载体感染滴度为(0.5～2)×10¹⁶PFU，优选为1×10¹⁶PFU。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的piRNA-P1在发生细胞死亡的心肌细胞和心脏组织中表达显著上调，对心肌细胞死亡具有促进作用。本发明提供的piRNA-P1反义核苷酸能够下调piRNA-P1的表达水平并抑制心肌细胞死亡。本发明提供的用于预防和/或治疗心脏疾病的药物含有piRNA-P1反义核苷酸，该药物通过抑制piRNA-P1的表达，能够良好的起到预防和/或治疗多种心脏疾病的作用。同时，该药物治疗效果明显，应用范围广，使用环境友好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中H₂O₂处理心肌细胞(A)及心肌缺血损伤(B)的心肌细胞死亡过程中piRNA P1表达水平的变化试验结果示意图。P1 levels：piRNA P1的RNA表达水平；Control：对照组；H₂O₂：双氧水处理组；Sham：假手术组，为I/R组的阴性对照；I/R：ischemia/reperfusion，指对小鼠进行缺血再灌手术；

图2为实施例2中转染过表达piRNAP1的细胞死亡试验结果示意图；

图3为实施例3中转染P1-inhibitor细胞死亡试验结果示意图；

图4为实施例4中转染过表达的piRNA与转染P1-inhibitor敲低P1的原代心肌细胞H₂O₂处理后细胞培养上清液中LDH活性检测实验结果示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种piRNA，命名为piRNA-P1(或简称P1)，piRNA-P1含有如SEQ ID NO.2(5’-UCCAUUCACUCCUUCCUUCCCGACUAUUGG-3’)所示核苷酸序列。piRNA-P1在心肌缺血再灌、心肌梗死、冠心病、心肌肥大和心肌纤维化等心脏疾病中能够调控心肌细胞死亡，并且在心脏中特异性表达。本发明通过实验发现：piRNA-P1在心肌缺血损伤及H₂O₂诱导的心肌细胞死亡过程中表达显著上调，说明piRNA-P1与心肌细胞死亡，以及心肌细胞死亡过程中通路的调控相关，可以作为心脏疾病诊断和治疗的一个靶点。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的piRNA-P1反义核苷酸，所述piRNA-P1反义核苷酸含有如SEQ ID NO.1(5’-CCAAUAGUCGGGAAGGAAGGAGUGAAUGGA-3’)所示序列。piRNA-P1反义核苷酸与piRNA-P1互补，过转染piRNA-P1反义核苷酸能够下调piRNA P1的表达水平并抑制心肌细胞死亡。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了piRNA-P1或所述piRNA-P1反义核苷酸在制备和心脏疾病相关的产品中的应用。由于piRNA-P1的表达与心脏疾病相关，因此piRNA-P1可以作为心脏疾病的诊断标志物，以制备用于诊断心脏疾病的产品；而piRNA-P1反义核苷酸能够下调piRNA P1的表达，并且抑制心肌细胞的死亡，因此piRNA-P1反义核苷酸能够作为用于预防和/或治疗心脏疾病的产品中的活性成分。本发明所述的心脏疾病包括但不限于肥厚型心肌病、心肌纤维化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗心脏疾病的药物，该药物中含有piRNA-P1反义核苷酸。所述药物通过其中含有的piRNA-P1反义核苷酸下调piRNA-P1，起到缓解心脏疾病的效果。该药物选用的原料科学合理，药物作用明显，使用范围广；以核酸作为药物活性成分制备工艺较为简单，应用环境友好。可以理解的是所述药物中可以只含有piRNA-P1反义核苷酸一种活性成分，也可以含有其他具有治疗或辅助治疗心脏疾病，和/或含有其他具有治疗或辅助治疗其他疾病的活性成分，本发明对此不作限制。

所述药物中除去含有具有预防和/或治疗作用的活性成分，还可以包含载体、药物递送制剂和辅料中的一种或多种。“载体”指的是用于复制、转录和/或表达所述piRNA反义核苷酸的成分，所述载体的实例包括但不限于质粒或病毒载体。载体优选包括病毒载体，病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体中的一种或多种。病毒优选包括腺病毒载体。“药物递送制剂”指的协助药物活性成分进入机体的成分，其功能例如可以为但不限于为实现递送、提高递送效率或赋予药物靶向作用等。药物递送制剂的实例包括但不限于壳聚糖、胆固醇、纳米颗粒和脂质体中的一种或多种，优选包括脂质体。药学上可接受的辅料优选包括甘露醇、磷酸盐缓冲液和生理盐水中的一种或多种，优选包括磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的pH优选为6.0～8.0。

在一些可选的实施方式中，所述药物包括所述piRNA-P1反义核苷酸、药物递送制剂和辅料。在该实施方式中，所述药物中的piRNA反义核苷酸的含量优选为1.0～1.2μg/μl，例如可以为但不限于为1.0、1.1或1.2μg/μl；所述药物中piRNA-P1反义核苷酸与药物递送制剂的质量比优选为1：(1～1.5)，例如可以为但不限于为1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.4、1:1.45或1:1.5，优选为1:1.25。该实施方式中药物递送制剂优选为脂质体。药物递送制剂和辅料的质量比优选为1：(150～250)，例如可以为但不限于为1:150、1:160、1:170、1:180、1:190、1:200、1:210、1:220、1:230、1:240或1:250，优选为1:200。

在另一些可选的实施方式中，所述药物包括所述piRNA-P1反义核苷酸、病毒载体和辅料，其中病毒载体优选使用腺病毒载体，piRNA-P1反义核苷酸的腺病毒载体感染滴度优选为(0.5～2)×10¹⁶PFU，例如可以为但不限于为0.5×10¹⁶PFU、1×10¹⁶PFU、1.5×10¹⁶PFU或2×10¹⁶PFU，优选为1×10¹⁶PFU。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

心肌缺血及H₂O₂诱导的心肌细胞死亡过程中piRNAP1表达情况检测。

本实施例使用心肌细胞坏死实验模型，采用本实验室已建立的方法培养小鼠乳鼠原代心肌细胞(小鼠乳鼠购自青岛大任富城畜牧有限公司，小鼠品系为C57鼠，小鼠乳鼠原代心肌细胞的制备可参见以下文献：W.-Q.Uan,eUal,Foxo3a InhibiUs CardiomyocyUeHyperUrophy Uhrough UransacUivaUing CaUalase J Biol Chem.2008OcUober 31；283(44):29730-29739)，500μM H₂O₂处理不同时间，提取总RNA，实时荧光定量PCR技术检测piRNA P1的表达水平，如图1中的A所示，piRNA P1表达水平在H₂O₂诱导24h后显著上调。

本实施例以假手术处理的大鼠作为对照组，采用结扎小鼠冠状动脉左前降支建立心肌缺血模型，缺血不同时间取心脏缺血区及非缺血区心肌组织，提取总RNA，实时荧光定量PCR技术检测piRNA P1的表达水平，如图1中的B所示，结果显示I/R组较Sham组piRNA P1表达水平显著提高。

本实施例涉及的实时荧光定量PCR技术方法如下：选取经过实验处理后状态良好的心肌细胞或者是相关手术等处理后的心肌组织，采用Urizol法提取实验组和对照组的总RNA。使用Uakara反转录试剂盒(Code No.RR047A，Uakara公司)将RNA反转为cDNA，P1的反转录引物序列为：

5’GUCGUAUCCAGUGCAGGGUCCGAGGUAUUCGCACUGGAUACGACCCAAUA 3’即SEQ ID NO.3；扩增条件为：37℃ 15min；85℃ 5s；4℃ ∞。使用反转录试剂盒的Oligo dU Primer随机引物对内参进行反转，同时选取小鼠U6作为内参，使用Uakara定量试剂盒(Code No.RR820A，Uakara公司)，用Real-Uime PCR仪(CFX96 Real-Uime SysUem C1000UM Uhermal Cycler，BIO-RAD公司)对反转录后获得的cDNA进行定量检测，引物序列为：P1反向链:5’UCCAUUCACUCCUUCCUUCC 3’即SEQ ID NO.4，P1正向链:5’GUCGUAUCCAGUGCAGGGUC 3’即SEQID NO.5；U6反向链:5’AACGCUUCACGAAUUUGCGU 3’即SEQ ID NO.6，U6正向链:5’GCUUCGGCAGCACAUAUACUAA 3’即SEQ ID NO.7。扩增条件为：95℃ 3min；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。

实施例2

piRNA P1促进心肌细胞死亡的实验。

本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型。转染P1过表达药物组合物，P1随机序列作为对照(即NC，序列如SEQ ID NO.8所示：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)，12小时后，检测心肌细胞死亡；PI染色方法检测心肌细胞死亡情况(使用碘化丙啶(PI)染色标记坏死心肌细胞，DAPI染色标记心肌细胞的细胞核)，计算发生坏死的细胞数占心肌细胞数目的百分比。结果显示过表达piRNA-P1可以显著诱导心肌细胞死亡，结果如图2所示。

其中P1药物组合物的配方如下：

先配置A、B液，其中A液：5μl lipofectamine 3000 Transfection Kit试剂与95μl无血清F12培养基混合5min；B液：5μl P1水溶液与95μl无血清F12培养基混合5min；然后将A、B液混合静置10-20min，推荐15min；最后将A、B混合液加入含有2ml F12培养基的心肌细胞培养皿内。

实施例3

piRNA-P1-inhibiUor(piRNA-P1反义核苷酸，序列如SEQ ID NO:1所示)调控心肌细胞死亡的实验。

本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型。转染P1-inhibiUor药物组合物，P1-inhibiUor随机序列作为对照(即NC，序列如SEQ ID NO.9所示：5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’)，12小时后，使用H₂O₂诱导处理细胞24小时，检测心肌细胞死亡；PI染色方法检测心肌细胞死亡情况，结果显示抑制P1可以显著抑制H₂O₂诱导的心肌细胞死亡，结果如图3所示，说明P1-inhibiUor对心肌具有保护作用。

其中P1-inhibiUor药物组合物的配方如下：先配置A、B液，其中A液：5μllipofectamine 3000Transfection Kit试剂与95μl无血清F12培养基混合5min；B液：5μlP1-inhibiUor水溶液与95μl无血清F12培养基混合5min；然后将A、B液混合静置10-20min，推荐15min；最后将A、B混合液加入含有2ml F12培养基的心肌细胞培养皿内。

实施例4

通过心肌细胞分泌物检测P1、P1-inhibiUor对细胞死亡影响。

本实施例中使用原代培养的心肌细胞为模型。分别转染P1、P1-inhibiUor药物组合物，以及各自NC。待分别按照实施例2、3处理后，取细胞上清培养基检测LDH活性，结果如图4所示：图4中A为转染过表达P1的LDH活性检测试验结果示意图，结果显示过表达P1可以显著诱导心肌细胞死亡；图4中B为转染P1-inhibiUor的LDH活性进行检测的结果示意图，说明P1-inhibiUor对心肌细胞死亡具有保护作用。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛大学

<120> 和心脏疾病相关的piRNA-P1与piRNA-P1反义核苷酸、应用和药物

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccaauagucg ggaaggaagg agugaaugga 30

<210> 2

<211> 30

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uccauucacu ccuuccuucc cgacuauugg 30

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacccaata 50

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccattcact ccttccttcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgtatcca gtgcagggtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacgcttcac gaatttgcgt 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcttcggcag cacatatact aa 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caguacuuuu guguaguaca a 21

Claims

1.piRNA-P1反义核苷酸在制备和心脏疾病相关的产品中的应用；

所述piRNA-P1反义核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述心脏疾病包括肥厚型心肌病、心肌纤维化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物，所述产品包括piRNA-P1反义核苷酸。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括用于诊断心脏疾病的试剂盒，所述试剂盒包括以piRNA-P1作为心脏疾病的诊断标志物；

所述piRNA-P1的序列如SEQ ID NO.2所示。