CN115851902A - Rp11-544d21.2的制药用途、在制备抗心衰药物方面的用途及药物与制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明“RP11‑544D21.2的制药用途、在制备抗心衰药物方面的用途及药物与制备方法”属于生物医药领域。本发明提供RP11‑544D21.2的制药用途、以及RP11‑544D21.2在制备抗心衰药物或制备心衰动物模型方面的用途。本发明还进一步提供以RP11‑544D21.2为靶点的抗心衰新药。基于RP11‑544D21.2,本发明还提供抗心衰药物的筛选方法和制备方法,以及心衰动物模型的制备方法。本发明实验证实敲低RP11‑544D21.2可以抑制成纤维细胞的增殖,缓解血管紧张素II诱导的向肌成纤维细胞的分化,动物实验提示有望改善心功能,缓解心脏重塑。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及RP11-544D21.2的制药用途、在制备抗心衰药物方面的用途及药物与制备方法。
背景技术
慢性心力衰竭是不同的心血管疾病发展到终末阶段的临床综合征,主要病理生理特点为心室充盈和/或射血能力受损,最后导致心室泵血功能低下,其预后不良,死亡率高,是威胁人类健康和导致医疗负担增加的最主要病因之一。由于人口老龄化,心血管疾病相关危险因素如高血压,高血脂,糖尿病发病率居高不下,心力衰竭的患病率也在逐年升高。据报道,心力衰竭5年病死率高达50%,给经济社会也带来了沉重的医疗负担。因此,亟需寻找新的更有效的心力衰竭的治疗靶点。
长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸的不具有编码能力的RNA。过去认为长链非编码RNA是基因组转录的暗物质,近年来越来越多的研究表明长链非编码RNA在生长发育以及疾病的发生发展过程钟可发挥重要的调控作用。不同于microRNA具有经典的作用途径和作用方式,长链非编码RNA的作用机制十分复杂多样。它可以和蛋白质,RNA以及DNA分子发生相互作用,而且在基因表达的整个过程,包括染色质重塑,转录激活或抑制,可变剪切,翻译后修饰等都可以发挥调节作用。目前关于长链非编码RNA在心力衰竭尤其是心脏纤维化中的作用研究尚不清楚。
RP11-544D21.2是一段已报道的长链非编码RNA,在“Identification of cardiaclong non-coding RNA profile in human dilated cardiomyopathy”一文中有披露,但关于RP11-544D21.2的制药用途,本领域现有技术尚未见报道,尤其是抗心衰的制药用途,更是一片空白。
发明内容
针对本领域现有技术存在的上述空白,本发明提供RP11-544D21.2在制备抗心衰药物方面的用途及其药物与制备方法。
本发明的技术方案如下:
RP11-544D21.2的制药用途。
RP11-544D21.2在制备抗心衰药物或制备心衰动物模型方面的用途。
通过抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达、和/或,结合或降解RP11-544D21.2抗心衰;
优选地,所述抗心衰指:抑制成纤维细胞的增殖或分化、和/或,提高心脏射血分数、和/或,改善心脏的收缩功能、和/或,改善心脏的舒张功能。
一种抗心衰药物,其特征在于,其药物靶点包括:RP11-544D21.2。
所述的一种抗心衰药物的药效活性成分包括:抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质、和/或,结合或降解RP11-544D21.2的物质;
优选地,所述抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质、或,所述结合或降解RP11-544D21.2的物质包含:RP11-544D21.2的反义互补片段;
优选地,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6、GapmeR-FIRL组成的组;
所述ASO1的靶序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ASO2的靶序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ASO3的靶序列如SEQ ID NO.4所示;
所述siRNA4的靶序列如SEQ ID NO.5所示;
所述siRNA5的靶序列如SEQ ID NO.6所示;
所述siRNA6的靶序列如SEQ ID NO.7所示;
所述GapmeR-FIRL的序列如SEQ ID NO.8所示;
更优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自:由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6组成的混合物、或,GapmeR-FIRL;
GapmeR-FIRL尤其可用在缓解小鼠心衰症状或小鼠抗心衰药物的制备上。
优选地,所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述RP11-544D21.2的反义互补片段的试剂。
一种抗心衰药物的筛选方法,其特征在于,从待选物质中筛选能结合或降解RP11-544D21.2的物质,和/或,能抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质。
一种抗心衰药物的制备方法,其特征在于,包括:以结合或降解RP11-544D21.2的物质,和/或,抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质作为抗心衰药物的药效活性成分。
优选地,所述结合或降解RP11-544D21.2的物质,或,抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质包含:RP11-544D21.2的反义互补片段;
优选地,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6、GapmeR-FIRL中的一种或两种以上;
所述ASO1的靶序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ASO2的靶序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ASO3的靶序列如SEQ ID NO.4所示;
所述siRNA4的靶序列如SEQ ID NO.5所示;
所述siRNA5的靶序列如SEQ ID NO.6所示;
所述siRNA6的靶序列如SEQ ID NO.7所示;
所述GapmeR-FIRL的序列如SEQ ID NO.8所示;
更优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自:由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6组成的混合物、或,GapmeR-FIRL;
优选地,在所述抗心衰药物中添加药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述RP11-544D21.2的反义互补片段的试剂。
一种心衰动物模型的建立方法,其特征在于,在动物体内过表达RP11-544D21.2。
所述过表达RP11-544D21.2指:用连接有RP11-544D21.2序列的重组腺相关病毒表达载体感染动物;
优选地,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述动物选自:鼠、兔、猴。
在一些国家和地区的专利法允许的前提下,本发明还请求保护RP11-544D21.2在防治心衰方面的用途。
本发明的一个目的在于提供一种用于治疗心力衰竭的药物,所述药物的药效成分包括以RP11-544D21.2为药物靶点,且通过结合、降解、和/或下调表达所述RP11-544D21.2的物质起到治疗心力衰竭的药效。
结合:即通过某种物质与RP11-544D21.2结合即可降低表达,如GapmeR,ASO,smartsilence,siRNA,microRNA等;
降解:即通过某种物质可诱导RP11-544D21.2经核酸酶降解,如GapmeR,ASO,smartsilence,siRNA,microRNA等与RP11-544D21.2单链以碱基配对方式结合形成双链结构,从而易被核酸酶识别降解;
下调:即通过某种物质下调RP11-544D21.2的生成量;
以这三种方式中的任一种皆可起到降低RP11-544D21.2表达量的作用。任何规模的出于商业目的将上述各物质装入标有抗心力衰竭用途的商品包装内的行为均落入本发明请求保护的范围。
进一步的,所述药物的药效成分包括下调表达RP11-544D21.2的物质。
进一步的,所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述反义互补序列片段RP11-544D21.2-反义核酸的试剂。本领域技术人员可根据客观需求,将本发明的抗心力衰竭药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料,制成各类剂型,便于销售或推广。
本发明的另一目的在于提供一种用于治疗心力衰竭的药物的筛选方法,通过检测待选物质是否能结合、降解、和/或下调表达RP11-544D21.2;从而,筛选出能对RP11-544D21.2的表达起抑制作用的物质。
本发明的第三目的在于提供一种用于治疗心力衰竭的药物的制备方法,包括:将可结合、降解、和/或下调表达所述RP11-544D21.2的物质作为治疗心力衰竭药物的活性成分。
本发明发现RP11-544D21.2定位于心脏成纤维细胞的细胞核中且在心衰时表达上调,开发了以RP11-544D21.2为靶点的治疗心力衰竭的药物。之后,通过细胞实验证实下调RP11-544D21.2能够抑制成纤维细胞的增殖与分化,同时敲低小鼠体内同源的基因GM26861发现,抑制GM26861的表达可以抑制心脏纤维化,改善心功能,提示针对RP11-544D21.2的治疗能够改善心力衰竭。
本发明对RP11-544D21.2进行了深入的分子机制研究,并根据其功能将其命名为FIRL.根据RP11-544D21.2(FIRL)的序列,申请人设计了RP11-544D21.2smart silencer用来干扰细胞内RP11-544D21.2的表达(si-FIRL),RP11-544D21.2smart silencer选自3条siRNA和/或3条ASO中的一条或一条以上,优选3条siRNA和3条ASO。3条siRNA和3条ASO的序列如SEQ ID NO.2-7所示。另外,申请人包装了腺病毒在细胞内过表达RP11-544D21.2(Ad-FIRL)。研究结果表明干扰RP11-544D21.2的表达(si-FIRL)可以抑制成纤维细胞的增殖,降低血管紧张素II诱导的分化标志物(ACAT2,POSTN,FN1)的表达。过表达RP11-544D21.2(Ad-FIRL)可以促进成纤维细胞的增殖,进一步增加血管紧张素II诱导的分化标志物(ACAT2,POSTN,FN1)的表达。根据RP11-544D21.2(FIRL)在人类基因组中的位置,本发明找到了小鼠基因组上同源的基因GM26861,通过GapmeR敲低GM26861的表达(gapmeR-FIRL,具体序列为SEQ ID NO.3),结果发现抑制FIRL的表达能够缓解TAC诱导的心功能损伤,抑制心脏纤维化,改善心肌重构。
本发明的有益效果是:本发明首次提出RP11-544D21.2的制药用途,尤其是其在制备抗心衰药物方面的用途,并基于该制药用途提出以RP11-544D21.2为药物靶点的抗心衰新药。本发明的用于治疗心力衰竭的药物的药效成分包括以RP11-544D21.2为药物靶点,通过结合、降解、和/或下调表达所述RP11-544D21.2的物质;本发明通过以RP11-544D21.2为药物作用靶点、且下调表达RP11-544D21.2分子能起到显著抑制心脏成纤维细胞的增殖及分化,潜在缓解心肌重塑、改善心脏功能的作用。作为基因表达调控的新工具,反义核酸是一种新型靶向分子治疗药物,区别于传统的治疗药物,具有易于合成,易于检测,定量精确,经化学修饰后能増加其稳定性并提高亲和力,可通过特殊药物递送系统有效定位到靶器官等优点,本发明以RP11-544D21.2为治疗靶点,通过转染能够敲低RP11-544D21.2表达的反义核酸,可以抑制成纤维细胞的增殖,缓解血管紧张素II诱导的向肌成纤维细胞的分化,动物实验提示有望改善心功能,缓解心脏重塑。该药物的成功开发将为心力衰竭的治疗开创新局面,为其他疾病治疗药物的研制提供借鉴。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1心衰病人和对照人群心脏组织中RP11-544D21.2(FIRL)的表达量和亚细胞定位。A,qPCR检测心衰病人和对照人群心脏组织中RP11-544D21.2(FIRL)的表达量;B,通过荧光原位杂交,检测心衰病人和对照人群心脏组织切片中RP11-544D21.2(FIRL)的表达量和亚细胞定位,FIRL分别与成纤维细胞(Col1a1)、心肌细胞(cTNT)、内皮细胞(CD31)、免疫细胞(CD45)共染,标尺为20μm。
图2RP11-544D21.2(FIRL)对人心脏成纤维细胞(HCF)的作用。A-B,敲低HCF中RP11-544D21.2(FIRL)的表达(si-FIRL)后EdU检测HCF的增殖,染色代表图(A)和统计图(B);C-D,在HCF中过表达RP11-544D21.2(FIRL)(Ad-FIRL)后EdU检测HCF的增殖,染色代表图(C)和统计图(D);E-F,在基础状态下或者血管紧张素II(AngII,1μM)干预的条件下,敲低HCF中RP11-544D21.2(FIRL)的表达(si-FIRL)(E)或者在HCF中过表达RP11-544D21.2(FIRL)(Ad-FIRL),qPCR检测成纤维细胞分化的相关标志物的表达(ACTA2,POSTN,FN1),标尺为100μm。
图3敲低小鼠体内RP11-544D21.2同源基因GM26861后心功能检测结果。A,超声结果显示敲低FIRL的表达(gapmeR-FIRL)可以提高心脏射血分数(Ejection Fraction),改善心功能损伤;B,心脏米勒导管血流动力学检测发现敲低FIRL的表达(gapmeR-FIRL)可以改善心脏的收缩功能和舒张功能。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
试剂与耗材
本发明实验例1和2涉及到的仪器设备、试剂与耗材及生物材料的来源如下:
1)仪器设备
2)试剂与耗材
GapmeR(购自Qiagen)、TRIZOL(购自Invitrogen公司)、EdU检测试剂盒(购自广州锐博公司);
生物材料的来源
本发明实验例1的心衰患者组织来自于武汉协和医院心脏移植病人,对照样本来自于红十字会,均签署了知情同意书;
实验例2使用的HCF(原代人心脏成纤维细胞)细胞来自ScienCell公司;
实验例3使用的C57BL/6小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司。
第1组实施例、RP11-544D21.2的制药用途
本组实施例提供RP11-544D21.2的制药用途。
RP11-544D21.2可用于制药是本发明首次提出。任何将RP11-544D21.2用于制药或做为药物成分的行为,或,任何合成、表达、抑制、沉默、降低、敲低、敲除RP11-544D21.2用于治疗的行为均落入本发明的保护范围。
第2组实施例、RP11-544D21.2在制备抗心衰药物或制备心衰动物模型方面的用途
本组实施例提供RP11-544D21.2在制备抗心衰药物或制备心衰动物模型方面的用途。
任何将RP11-544D21.2用于制备抗心衰药或做为抗心衰药物成分的行为,或,任何合成、表达、抑制、沉默、降低、敲低、敲除RP11-544D21.2用于治疗心衰的行为均落入本发明的保护范围。
任何将RP11-544D21.2用于制备心衰动物模型的行为,或,任何合成、表达、抑制、沉默、降低、敲低、敲除RP11-544D21.2用于构建载体和/或转化和/或感染/侵染动物的行为均落入本发明的保护范围。
在一些实施例中,通过抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达、和/或,结合或降解RP11-544D21.2抗心衰;
优选地,所述抗心衰指:抑制成纤维细胞的增殖或分化、和/或,提高心脏射血分数、和/或,改善心脏的收缩功能、和/或,改善心脏的舒张功能。
第3组实施例、本发明的抗心衰药物
本组实施例提供一种抗心衰药物。本组所有的实施例都具备如下共同特征:所述抗心衰药物的靶点包括:RP11-544D21.2。
在具体的实施例中,所述的一种抗心衰药物的药效活性成分包括:抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质、和/或,结合或降解RP11-544D21.2的物质;
优选地,所述抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质、或,所述结合或降解RP11-544D21.2的物质包含:RP11-544D21.2的反义互补片段;
优选地,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6、GapmeR-FIRL组成的组;
所述ASO1的靶序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ASO2的靶序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ASO3的靶序列如SEQ ID NO.4所示;
所述siRNA4的靶序列如SEQ ID NO.5所示;
所述siRNA5的靶序列如SEQ ID NO.6所示;
所述siRNA6的靶序列如SEQ ID NO.7所示;
所述ASO1的靶序列是指:与ASO1本身序列反义互补的DNA序列,ASO1本身序列为中间10个是DNA碱基、两端分别修饰有5个RNA碱基的单链杂合结构。
所述ASO2的靶序列是指:与ASO2本身序列反义互补的DNA序列,ASO2本身序列为中间10个是DNA碱基、两端分别修饰有5个RNA碱基的单链杂合结构。
所述ASO3的靶序列是指:与ASO3本身序列反义互补的DNA序列,ASO3本身序列为中间10个是DNA碱基、两端分别修饰有5个RNA碱基的单链杂合结构。
所述siRNA4的靶序列是指:与siRNA4本身序列反义互补的DNA序列。
所述siRNA5的靶序列是指:与siRNA5本身序列反义互补的DNA序列。
所述siRNA6的靶序列是指:与siRNA6本身序列反义互补的DNA序列。
所述GapmeR-FIRL的序列如SEQ ID NO.8所示;
ASO为antisense oligonucleotides的首字母缩写,意为反义寡核苷酸,具有分子生物学领域技术人员可理解的常规技术含义。ASO是单链DNA,与靶RNA形成杂合双链后通过RNase H的途径敲低FIRL,对细胞核内FIRL的敲低作用更好。
siRNA是双链RNA,具有分子生物学领域技术人员可理解的常规技术含义。siRNA与靶RNA互补后通过形成RISC复合体降解FIRL,主要对胞浆内的FIRL起到敲低的作用;因为lncRNA(非编码RNA)的丰度一般比较低,也比较难敲低,而且往往在胞核有所分布,smartsilencer是用来敲低lncRNA的手段之一。理论上单独使用上述的一条或者两条ASO或者siRNA能达到敲低效果,多条核苷酸混合(即smartsilencer)的方式经本发明下述实验例证明效果更优。
GapmeR全称为Antisense LNAGapmeRs,是一类能高效抑制mRNA和lncRNA功能的反义寡核苷酸,具有分子生物学领域技术人员通常理解的常规技术含义。
更优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自:由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6组成的混合物、或,GapmeR-FIRL。
优选地,所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述RP11-544D21.2的反义互补片段的试剂。
在一组具体的实施例中,所提供的治疗心力衰竭的药物的药效成分以RP11-544D21.2为药物靶点,且通过敲低或者敲除RP11-544D21.2起到所述治疗心力衰竭的药效。本发明通过实验发现,心力衰竭病人的心脏组织中RP11-544D21.2含量明显增加(图1),这表明RP11-544D21.2可能在心力衰竭病理生理过程中起调控作用,并进一步通过实验证明,在人的原代心脏成纤维细胞中敲低RP11-544D21.2的表达可以抑制成纤维细胞的增殖,抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。
进一步地,所述药物的药效成分包括可降低RP11-544D21.2的物质。本领域技术人员熟知,针对长链非编码RNA可以通过小干扰RNA-siRNA,锁核酸修饰RNA-GapmeR,反义核酸ASO等分子生物学手段,促进RP11-544D21.2的降解。
优选地,所述药物的药效成分包含靶向的RP11-544D21.2序列片段。本发明发现RP11-544D21.2位于细胞核内,单纯通过siRNA很难有效敲低,所以针对RP11-544D21.2的序列设计了smart silence,其中包含3条ASO,3条si-RNA,具体序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地,所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、培养、和/或扩繁所述敲低RP11-544D21.2表达的试剂;本领域技术人员可根据客观需求,将本发明的抗心衰药物添加各种药学上可接受的辅剂/辅料,制成各类剂型,便于销售或推广。
第4组实施例、本发明抗心衰药物的筛选方法
本组实施例提供一种抗心衰药物的筛选方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征:从待选物质中筛选能结合或降解RP11-544D21.2的物质,和/或,能抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质。
第5组实施例、本发明的抗心衰药物的制备方法
本组实施例提供一种抗心衰药物的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征:所述一种抗心衰药物的制备方法包括:以结合或降解RP11-544D21.2的物质,和/或,抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质作为抗心衰药物的药效活性成分。
在一些实施例中,所述结合或降解RP11-544D21.2的物质,或,抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质包含:RP11-544D21.2的反义互补片段;
优选地,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6、GapmeR-FIRL中的一种或两种以上;
所述ASO1的序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ASO2的序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ASO3的序列如SEQ ID NO.4所示;
所述siRNA4的序列如SEQ ID NO.5所示;
所述siRNA5的序列如SEQ ID NO.6所示;
所述siRNA6的序列如SEQ ID NO.7所示;
所述GapmeR-FIRL的序列如SEQ ID NO.8所示;
更优选地,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自:由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6组成的混合物、或,GapmeR-FIRL;
优选地,在所述抗心衰药物中添加药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述RP11-544D21.2的反义互补片段的试剂。
第6组实施例、本发明心衰动物模型的建立方法
本组实施例提供一种心衰动物模型的建立方法。本组实施例具备如下共同特征:在动物体内过表达RP11-544D21.2。
在具体的实施例中,所述过表达RP11-544D21.2指:用连接有RP11-544D21.2序列的重组腺相关病毒表达载体感染动物;
优选地,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
优选地,所述动物选自:鼠、兔、猴。
长链非编码RNA的表达具有组织和细胞的特异性,因此针对RP11-544D21.2的成药性更高,既可以广泛的敲低RP11-544D21.2在体内的表达,也可以采用靶向给药的方法特异性的敲低心脏中RP11-544D21.2的表达。经过特殊修饰后的反义核酸,具有半衰期长,稳定性好,而且靶点特异性高,副作用少,病人依从性高,生产制备方便成本低周期快,一次注射后可以实现对RP11-544D21.2的长久抑制作用。另外,本发明发现心衰患者以及心衰的动物模型中RP11-544D21.2的表达明显升高,如图1所示,因此,任何采用检测RP11-544D21.2评价心衰模型的建立或者筛选治疗心衰药物的用途均落入本专利的保护范围。
实验例1、心衰病人和对照人群心脏组织中RP11-544D21.2(FIRL)的表达量和亚细胞定位(1)qPCR检测RP11-544D21.2(FIRL)的表达量
实验方法:收集6个健康的成年男性和10个终末期心力衰竭的成年男性患者的心肌组织,TRIZOL法提取总RNA后逆转录qPCR检测RP11-544D21.2(FIRL)的表达量,所用引物为:
H-FIRL-F:5’-GCACTCCCAGACCAAGAGAT-3’;(SEQ ID NO.9)
H-FIRL-R:5’-ACGTAAGTCATGCTTGTGGGT-3’;(SEQ ID NO.10)
H-GAPDH-F:5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’;(SEQ ID NO.11)
H-GAPDH-R:5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’.(SEQ ID NO.12)。
实验结果:如图1-A所示,心衰患者心脏组织中RP11-544D21.2的含量显著上调。
(2)人心脏组织切片RP11-544D21.2(FIRL)荧光原位杂交染色
实验方法:
①切片常规脱蜡复水及抗原修复;
②RNA杂交:
a.滴加预杂交缓冲液覆盖组织于杂交炉中55℃杂交30分钟;
b.用杂交液1:2000稀释探针(100uM),然后在杂交炉中55℃杂交1小时(注意杂交液提前预热,切片放入湿盒中防止干片);
c.60℃下用洗涤液I洗涤3次,每次5分钟;
d.60℃下用洗涤液II洗涤1次,每次5分钟;
e.60℃下用洗涤液III洗涤1次,每次5分钟;
f.PBS洗涤1次,5分钟;
g.3%H2O2处理30分钟以阻断内源性过氧化物酶;
h.TN缓冲液洗涤3次,每次5分钟;
i.TNB缓冲液封闭30分钟,然后加入用封闭液1:250稀释的HRP标记的地高辛一抗,室温孵育30分钟;
j.TNT缓冲液清洗3次,每次5分钟,PBS清洗一次,5分钟;
k.TSA用0.01%TBST 1:500稀释,避光孵育10分钟,注意此步骤后续操作全部在避光的条件下操作;
l.TNT缓冲液清洗3次,每次5分钟,PBS清洗一次,5分钟。
③检测蛋白及细胞核染色:5%血清封闭后滴加一抗4℃孵育过夜,PBST洗涤3遍后相应种属二抗常温孵育45分钟,PBST洗涤3遍后染核镜检。
实验结果:如图1-B所示,Col1a1染色阳性区域为成纤维细胞,cTNT染色阳性区域为心肌细胞,CD31染色阳性区域为内皮细胞,CD45染色阳性区域为免疫细胞。由图可以看出RP11-544D21.2主要定位于心脏成纤维细胞的细胞核内,其他细胞类型内有少量分布。在心衰时,成纤维细胞核内的RP11-544D21.2显著增加,其他细胞类型中无显著变化。
实验例2、RP11-544D21.2(FIRL)对心脏成纤维细胞的增殖和分化的作用(1)EdU检测心脏成纤维细胞的增殖能力
实验方法:针对RP11-544D21.2(FIRL)的序列,设计反义核酸smart silencer(含有3条siRNA和3条ASO)转染成纤维细胞后用来敲降RP11-544D21.2(FIRL)的表达,将RP11-544D21.2(FIRL)的全长序列包装进腺病毒表达载体(pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP)中,感染成纤维细胞实现基因的过表达。
所述感染成纤维细胞为分子生物学领域常用技术手段,具体做法实际是:将RP11-544D21.2(FIRL)的全长序列克隆进腺病毒表达载体,然后在293细胞内包装成腺病毒,最后用腺病毒感染成纤维细胞实现FIRL的过表达。
试剂盒购于广州锐博,步骤如下:
①弃掉培养板中的培养基,在厚迭卫生纸上拍干,然后用PBS清洗2次,每次5分钟,注意在操作过程中不要反复直接对着细胞冲洗以免将细胞冲掉,应沿着侧壁缓慢加入各种缓冲液;
②在通风橱中每孔加入50ul甲醛固定液处理20分钟;
③吸净甲醛固定液,每孔加入50ul 2mg/ml的甘氨酸溶液中和甲醛,于摇床上室温孵育6分钟;
④弃掉甘氨酸溶液,每孔加入100ul PBS,水平摇床洗涤5分钟,重复洗涤一次,每孔加入100ul PBST(0.5%TritonX-100in PBS)处理10分钟,再用PBS清洗5分钟;
⑤弃PBS后每孔加入80ul 1XApollo染色反应液,在避光的条件下室温孵育40分钟,之后弃掉染色反应液,用PBS清洗2遍;
⑥用PBS将Hoechst 33342稀释至1X,室温摇床上孵育20分钟,之后再用PBS清洗2遍,每次3分钟,荧光显微镜下拍照观察。
实验结果:由图2A-B所示,敲低HCF中RP11-544D21.2(FIRL)的表达(si-FIRL)后HCF的增殖能力减弱;C-D,在HCF中过表达RP11-544D21.2(FIRL)(Ad-FIRL)可以促进成纤维细胞的增殖。
(2)qPCR检测心脏成纤维细胞分化的标志物
实验方法:HCF在转染si-FIRL或者感染Ad-FIRL及它们的对照后,经过PBS或者血管紧张素II(1uM)处理24小时,qPCR检测分化相关标志物的表达,引物序列如下:
H-POSTN-F 5’-TCCCCGTGACTGTCTATAAGC-3’(SEQ ID NO.13)
H-POSTN-R 5’-ACCTTGGTGACCTCTTCTTGT-3’(SEQ ID NO.14)
H-ACTA2-F 5’-GTGTTGCCCCTGAAGAGCAT-3’(SEQ ID NO.15)
H-ACTA2-R 5’-GCTGGGACATTGAAAGTCTCA-3’(SEQ ID NO.16)
H-FN1-F 5’-ACAAGCATGTCTCTCTGCCA-3’(SEQ ID NO.17)
H-FN1-R 5’-TCAGGAAACTCCCAGGGTGA-3’(SEQ ID NO.18)。
实验结果:如图2C-D所示,在基础状态下,敲降HCF中RP11-544D21.2(FIRL)的表达(si-FIRL)或者在HCF中过表达RP11-544D21.2(FIRL)(Ad-FIRL)对成纤维细胞分化的相关标志物的表达(ACTA2,POSTN,FN1)没有影响。血管紧张素II(AngII)干预的条件下,敲降HCF中RP11-544D21.2(FIRL)的表达(si-FIRL)可以抑制成纤维细胞的分化,相反,过表达RP11-544D21.2(FIRL)(Ad-FIRL)可以促进成纤维细胞的分化。
实验例3、敲低小鼠FIRL缓解TAC诱导的心功能损伤
实验方法:根据RP11-544D21.2在染色体上的位置,申请人找到了小鼠同源的基因GM26861,根据其序列设计了GapmeR-FIRL:5’-ACTTGATGATAGGACA-3’(SEQ ID NO.8)
1.C57BL/6小鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司,饲养于华中科技大学实验动物研究中心SPF级(无特殊病原体)动物房。新购买的小鼠均适应性饲养一周后再进行干预。
2.主动脉缩窄术(transverse aortic constriction,TAC):选取8周龄且体重均一的雄性C57BL/6小鼠进行造模。1.5%戊巴比妥(50mg/kg)麻醉小鼠成功后,仰卧位固定于操作台上。打开呼吸机连接气管插管,直视下将插管插入声门,呼吸频率约为80次/分钟,可看到胸廓随呼吸机频率具有明显起伏即提示气管插管成功。用刀片剃去胸前部毛发,碘伏消毒皮肤。剪开心前区皮肤,钝性分离筋膜肌肉暴露肋骨,剪短第二肋骨。拿撑开器充分暴露视野后可看到覆盖于主动脉弓处的白色胸腺。轻柔分离胸腺暴露主动脉弓,顺主动脉弓方向置一27G钝性针头。用7-0不可吸收丝线在头臂干和左颈总动脉之间的主动脉弓处结扎。轻轻退出27G针头。逐层缝合肌肉皮肤,拔出气管插管,置于电热毯上待小鼠苏醒。
3.药物处理:小鼠被随机分为以下3组:sham、TAC+gapmeR-control、TAC+gapmeR-FIRL;假手术组(sham)小鼠只行开胸操作不做结扎处理;TAC+gapmeR-control组小鼠不注射gapmeR,TAC+gapmeR-FIRL组小鼠腹腔注射gapmeR。GapmeR由Qiagen公司设计并合成,溶于无菌生理盐水中。小鼠腹腔注射gapmeR,注射剂量为20mg/kg。在TAC术前3天注射GapmeR,。
4.超声及血流动力学检测:小鼠心脏超声采用VisualSonics Vevo 2100小动物超声机,探头选择30MHz高频探头。具体步骤如下:动物经过乙醚诱导麻醉后固定于操作台,脱去前胸毛发,涂抹耦合剂。使用异氟烷进行维持麻醉,使心率控制在500-600次每分。探头置于胸骨左侧,模式选择B型超声,打出心室长轴的清晰图像。转换为M型超声,于乳头肌根部记录室壁运动。转换探头方位,B型超声记录心脏横轴切面,M型超声记录分析室壁运动情况。将探头置于小鼠颈部右侧,B型超声模式下找出主动脉结扎处,利用多普勒模式分析结扎处血流。导管检测:小鼠采用1%戊巴比妥麻醉,仰卧位固定于操作台上。沿前正中线剪开颈部皮肤,由中间向两边钝性分离颈前肌肉暴露气管。沿颈动脉上下分离周围的肌肉筋膜,并使用显微镊分离出伴行的迷走神经。在颈动脉的远心端打结用于牵引固定,在颈动脉的近心端使用动脉夹夹闭血流。在显微镜下用显微剪在动脉夹的远心端剪一小口,取经过肝素处理的米勒导管沿破口小心插入。待插至动脉夹处松开动脉夹继续送入导管,当压力值显示最小值为0mmHg时即为进入左室,此时进行心室内压力的监测。
实验结果:如图3-A所示,超声结果显示敲低FIRL的表达(gapmeR-FIRL)可以提高心脏射血分数(Ejection Fraction),改善心功能损伤;图3-B所示,心脏米勒导管血流动力学检测发现敲低FIRL的表达(gapmeR-FIRL)可以改善心脏的收缩功能和舒张功能。
Claims (10)
1.RP11-544D21.2的制药用途。
2.RP11-544D21.2在制备抗心衰药物或制备心衰动物模型方面的用途。
3.根据权利要求2所述的RP11-544D21.2在制备抗心衰药物方面的用途,其特征在于,通过抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达、和/或,结合或降解RP11-544D21.2抗心衰;
和/或,所述抗心衰指:抑制成纤维细胞的增殖或分化、和/或,提高心脏射血分数、和/或,改善心脏的收缩功能、和/或,改善心脏的舒张功能。
4.一种抗心衰药物,其特征在于,其药物靶点包括:RP11-544D21.2。
5.根据权利要求4所述的一种抗心衰药物,其特征在于,其药效活性成分包括:抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质、和/或,结合或降解RP11-544D21.2的物质;
和/或,所述抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质、或,所述结合或降解RP11-544D21.2的物质包含:RP11-544D21.2的反义互补片段;
和/或,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
和/或,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6、GapmeR-FIRL组成的组;
所述ASO1的靶序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ASO2的靶序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ASO3的靶序列如SEQ ID NO.4所示;
所述siRNA4的靶序列如SEQ ID NO.5所示;
所述siRNA5的靶序列如SEQ ID NO.6所示;
所述siRNA6的靶序列如SEQ ID NO.7所示;
所述GapmeR-FIRL的序列如SEQ ID NO.8所示;
更和/或,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自:由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6组成的混合物、或,GapmeR-FIRL;
和/或,所述药物还包括药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述RP11-544D21.2的反义互补片段的试剂。
6.一种抗心衰药物的筛选方法,其特征在于,从待选物质中筛选能结合或降解RP11-544D21.2的物质,和/或,能抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质。
7.一种抗心衰药物的制备方法,其特征在于,包括:以结合或降解RP11-544D21.2的物质,和/或,抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质作为抗心衰药物的药效活性成分。
8.根据权利要求7所述的一种抗心衰药物的制备方法,其特征在于,所述结合或降解RP11-544D21.2的物质,或,抑制或沉默或敲低或敲除或下调RP11-544D21.2的表达的物质包含:RP11-544D21.2的反义互补片段;
和/或,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
和/或,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6、GapmeR-FIRL中的一种或两种以上;
所述ASO1的靶序列如SEQ ID NO.2所示;
所述ASO2的靶序列如SEQ ID NO.3所示;
所述ASO3的靶序列如SEQ ID NO.4所示;
所述siRNA4的靶序列如SEQ ID NO.5所示;
所述siRNA5的靶序列如SEQ ID NO.6所示;
所述siRNA6的靶序列如SEQ ID NO.7所示;
所述GapmeR-FIRL的序列如SEQ ID NO.8所示;
更和/或,所述RP11-544D21.2的反义互补片段选自:由ASO1、ASO2、ASO3、siRNA4、siRNA5、siRNA6组成的混合物、或,GapmeR-FIRL;
和/或,在所述抗心衰药物中添加药学上可接受的辅料,和/或,用于缓冲、合成、和/或纯化所述RP11-544D21.2的反义互补片段的试剂。
9.一种心衰动物模型的建立方法,其特征在于,在动物体内过表达RP11-544D21.2。
10.根据权利要求9所述的一种心衰动物模型的建立方法,其特征在于,所述过表达RP11-544D21.2指:用连接有RP11-544D21.2序列的重组腺相关病毒表达载体感染动物;
和/或,所述RP11-544D21.2的序列如SEQ ID NO.1所示;
和/或,所述动物选自:鼠、兔、猴。
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