CN102120764A

CN102120764A - 三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用

Info

Publication number: CN102120764A
Application number: CN2010100193063A
Authority: CN
Inventors: 吴平生; 刘城; 宾建平; 王月刚; 赖艳娴; 谢宜军; 郭寿贵; 童锴; 胡英芳; 傅锐斌
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-01-11
Filing date: 2010-01-11
Publication date: 2011-07-13

Abstract

本发明的发明名称是三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用。本发明涉及三突变型低氧诱导因子1α，其编码核酸，含有三突变型低氧诱导因子1α编码核酸的载体，特别是重组腺病毒载体，以及含有它们的药物组合物。三突变型HIF-1α蛋白质，能够与CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白P300(CBP/p300)以及组蛋白去乙酰酶(HDAC)等辅助激活因子结合促进血管内皮生长因子(VEGF)等HIF-1α下游靶基因的表达。本发明的三突变蛋白质、核酸、载体和药物组合物可用于治疗缺血性疾病的促血管新生治疗，例如冠心病、外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行等。

Description

三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用

发明领域

本发明涉及三突变型低氧诱导因子1α基因治疗领域。更具体地，本发明提供一种利用三突变型低氧诱导因子1α基因促进血管新生的方法，包括三突变型低氧诱导因子1α基因的构建，含有三突变型低氧诱导因子1α基因的载体的构建，特别是重组腺病毒载体的构建；该三突变型HIF-1α蛋白质，能够与CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白P300(CBP/p300)以及组蛋白去乙酰酶(HDAC)等辅助激活因子结合促进血管内皮生长因子(VEGF)等HIF-1α下游靶基因的表达，以及它们作为冠心病、外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行等的治疗剂应用。

背景技术

缺血性血管疾病(冠心病、缺血性脑血管病以及外周血管病)已成为威胁人类健康的重大疾病。我国缺血性血管疾病发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前，对其主要治疗措施包括常规药物治疗、血运重建等，已经取得了重大成就。然而，相当一部分患者目前的药物治疗难以见效，也不适于常规血运重建术处理，因此必须开辟新的治疗途径。

近年来，促血管新生已成为缺血性血管疾病的治疗新方向，是当前国际上最热点研究领域之一。先前曾报道了许多促血管新生因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、Flt1(VEGF-receptor)、成纤维生成因子(FGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)、Endoglin、转化生成因子β(TGF-β)和血管生成素(angiopoietin)等。有些因子曾试用于临床，比如VEGF，但结果显示VEGF可导致新生血管不成熟、组织水肿及血管渗漏，因而其临床试验已停止(Lee，Springer et al.2000；Schwarz，Speakman et al.2000；Grines，Watkins et al.2002；Losordo，Vale et al.2002；Masaki，Yonemitsu et al.2002；Fam，Verma et al.2003；Lee，Rentz et al.2003；Semenza 2003)。

血管新生是组织对缺氧的适应性反应，广泛存在于从胚胎发育、伤口愈合到肿瘤生长等生理/病理过程中；同时，它是一个复杂的生物学过程，需要多种因子参与，依靠单一的促血管新生因子很难完成。近10年研究显示：低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一个非常重要的核转录因子，能直接或间接调控100多种下游靶基因(review in(Wenger，Stiehl et al.2005；Ke and Costa 2006))，这些下游靶基因包括：血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成、干细胞诱导分化等(Kaluz，Kaluzova et al.2008)。到目前为止，已查明经HIF-1α直接调控参与血管新生的基因有30多种，是血管新生的上游核心调控因子(Thurston，Suri et al.1999；Bruick and McKnight 2001；Semenza 2002；Hirota and Semenza 2005)。《Science》曾经发表评述：“ Discovery of these could open up new therapeutic possibilitiesfor the many diseases such as ischemic

HIF-1是由α和β两个亚基组成的异二聚体(Wang，Jiang et al.1995)，α亚基为其功能活性发挥的关键性调节亚基，组织中HIF-1α的量与活性受氧浓度的调节。HIF-1α结构域中含有氧依赖降解区(OxygenDependent Degradation Domain，ODDD)，与HIF-1α的稳定性有关(Pugh，O′Rourke et al.1997)。同时HIF-1α的C末端含有2个相对独立的转录激活区(Transactivation Domains，TAD)：N-TAD和C-TAD(Ruas，Poellinger et al.2002)，其中N-TAD与ODDD有部分重叠，参与HIF-1α稳定性的调节；C-TAD则与共激活因子CBP/P300结合启动下游靶基因的转录(Lando，Peet et al.2002)。

HIF-1α稳定性调节主要与ODDD区上Pro402以及Pro5642个脯氨酸残基羟基化有关(Ivan，Kondo et al.2001)。常氧情况下，Pro402和/或Pro564被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain，PHD)羟化后，HIF-1α与 pVHL泛素E3连接酶结合经泛素途径降解，故HIF-1α在常氧下的半衰期很短，约1-2min，5min即可全部降解(Salceda and Caro 1997)；低氧时，PHD功能受到抑制，HIF-1α不被降解因而变得稳定，稳定的HIF-1α与HIF-1β结合后，从胞浆转位到核内。机体对HIF-1α的氧依赖的调节是双重调节(Pugh and Ratcliffe 2003)，除了前述稳定性调节以外，更稳重要的是HIF-1α转录活性调节。常氧情况下，C-TAD结构域内803位点上的天门冬酰胺(Asn⁸⁰³)在HIF-1α抑制因子(Factor InhibitingHIF，FIH)作用下羟化，故即使稳定的HIF(半衰期内，＜2-5min)转位到核内后，因HIF-1α的C-TAD不能与转录共激活因子CBP/P300结合，转录活性由此受到抑制；低氧时，FIH功能受到抑制，不能有效的催化结构域内Asn⁸⁰³羟基反应，从而使CBP/300与非羟化的C-TAD结合激活下游靶基2因转录(Hewitson，McNeill et al.2002；Masson and Ratcliffe2003)。

目前报道的HIF-1α的亚型有HIF-1α^WT，HIF-1α^FL，HIF-1α⁷³⁶，HIF-1α⁵⁵⁷，HIF-1α⁵¹⁶，HIF-1α⁷⁸⁵(Lee，Bae et al.2004；Gaber，Dziurla etal.2005)以及HIF-1α³⁹⁰(Vincent，Shyu et al.2000)等。突变型HIF-1α缺乏部分或者全部ODDD或/和C-TAD，故稳定性和/或转录活性明显降低。Chun等先后实验证实(Chun，Choi et al.2000；Chun，Choi et al.2001；Chun，Choi et al.2002)：因HIF-1α⁷³⁶、HIF-1α⁵⁵⁷以及HIF-1α⁵¹⁶三种缺陷型缺乏C-TAD结构域，突变型HIF-1α虽能与HIF-1β结合从胞浆转位到核内，但是其转录活性明显低于HIF-1α^WT，HIF-1α^FL，VEGF的表达不足HIF-1α^WT以及HIF-1α^FL的1/3。突变型HIF-1α⁷⁸⁵含有C-TAD结构域，故其虽保留了转录活性；但是其ODDD结构域缺陷(AA_512-554)，并不能增加其在常氧下的稳定性(Jeong，Bae et al.2002)。另一方面，HIF-1α作为一个核转录因子能调控如此众多的下游靶基因参与血管新生过程取决于HIF-1α的TAD区与转录辅助激活因子的共同作用(Herzig，Long et al.2001；Yoon，Puigserver et al.2001；Hermanson，Glasset al.2002；Kasper，Boussouar et al.2002；Liu，Auboeuf et al.2002；Wu，Qin et al.2002)。目前已明确与HIF-1αTAD区的转录活性绝对的需要辅助激活因子有CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白P300(CREB binding protein/p300，CBP/p300)的辅助(Kasper，Boussouar et al.2005)。此外，组蛋白去乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)亦在该过程起重要作用(Kasper，Boussouar et al.2005)，说明基因序列的完整性是其功能正常发挥的基础。

我们力图在保留HIF-1α基因结构完整性的基础上，通过基因工程技术获得在常氧条件下能成组表达且具有高效的转录活性HIF-1α，从而使HIF-1α常氧条件下具有促血管新生潜能，进一步开发出安全、稳定、高效的促血管新生的基因治疗药物。

发明内容

本项发明是以野生型HIF-1α在低氧条件下具有稳定性和高转录活性的特点为基础。HIF-2α以及HIF-3α与HIF-1α具有相似的基因和蛋白结构以及生物学功能，故在本发明中主要阐述HIF-1α。

一方面，本发明是以野生型HIF-1α蛋白质的结构以及功能为基础。本发明提供的野生型HIF-1α蛋白质是人HIF-1α蛋白质，是由SEQ ID NQ：2所编码的蛋白质。在一个实施例中，在野生型HIF-1α蛋白质氨基酸序列中，第402位上的氨基酸残基是脯氨酸残基(Pro 402)、第564位上的氨基酸残基是脯氨酸残基(Pro 564)、第803位上的氨基酸残基是天门冬酰胺残基(Asn 803)；野生型HIF-1α蛋白质可以是天然存在的HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NQ：2所编码的蛋白质)，也可以是与天然存在的HIF-1α蛋白质具有相似结构且具有HIF-1α生物学功能的通过生物工程技术人工合成的相关蛋白质。

本发明所述三突变型HIF-1α蛋白质与野生型HIF-1α蛋白质相比，该三突变型HIF-1α蛋白质氨基酸序列上第402位上的脯氨酸残基(Pro 402)，第564位上的脯氨酸残基(Pro 564)以及第803位上的天门冬酰胺残基(Asn 803)均发生突变。所述突变可以是替代或者缺失，优选是替代。在优选的实施例中，三突变型HIF-1α蛋白质是由SEQ ID NQ：1所编码的蛋白质。在三突变型HIF-1α蛋白质氨基酸序列中，第402位上的脯氨酸残基(Pro 402)被替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)；第564位上的脯氨酸残基(Pro 564)被替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)；第803位上的天门冬酰胺残基(Asn 803)被替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)；

在优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下能明显促进下游靶基因(例如促血管新生基因：VEGF、PLGF、PAI-1、PDGF，Ang-1以及Ang-2等)表达，与低氧条件下野生型HIF-1α蛋白质转录活性相比，该三突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下具有高效的转录活性。在另一个优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-1α蛋白质，与野生型HIF-1α蛋白质相比，其通过与辅助激活因子CBP/p300或/和HDAC结合，来促进促进下游靶基因(例如促血管新生基因：VEGF、PLGF、PAI-1、PDGF，Ang-1以及Ang-2等)表达。

在另一个优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-1α蛋白质，与野生型HIF-1α蛋白质相比，能明显增加下游靶基因(例如促血管新生基因：VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF等)的在常氧条件下的稳定性。

在另一个优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-1α蛋白质，与野生型HIF-1α蛋白质相比，能明显促进形成成熟的具有功能的新生血管(例如：促进内皮细胞增殖、黏附、迁移以及降低新生血管渗漏)。

另一方面，本发明提供编码本发明中所述野生型HIF-1α蛋白质以及三突变型HIF-1α蛋白质的核酸序列。

在一个实施例中，本发明所述野生型HIF-1α核苷酸序列编码由826氨基酸残基组成的野生型HIF-1α蛋白质。在野生型HIF-1α核苷酸序列SEQ ID NQ：2中，与编码第402位上的脯氨酸残基相对应的密码子是CCA，与编码第564位上的脯氨酸残基相对应的密码子是CCC，与编码第803位上的天门冬酰胺残基相对应的密码子是AAT。

在优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-1α核苷酸序列编码由826氨基酸残基组成的三突变型HIF-1α蛋白质。在三突变型HIF-1α核苷酸序列SEQ ID NQ：1中，编码第402位上的脯氨酸残基的密码子由CCA替代为其他密码子(例如GCA)，编码第564位上的脯氨酸残基的密码子由CCC替代为其他密码子(例如GCC)，编码第803位上的天门冬酰胺残基的密码子由AAT替代为其他密码子(例如GCT)。

在其他实施例中，本发明指向至少中等度严紧条件下与本文提供的核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的核苷酸。在核酸杂交反应时，根据核酸的性质，长度，高度的互补性，核苷酸序列组成来确定其严紧程度。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或者探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在约Tm以下约5～10℃；“中等严紧性”发生在约Tm以下约10～20℃；“低等严紧性”发生在约Tm以下约20～25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或者离子强度条件和/或依次或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高的选择性应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如选择相对低的盐和/或高温条件。Sambrook等(Sambrook，J等《分子克隆——实验室手册》，Cold Spring Harbor Press，Plain-view，N.Y.)提供了中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

本发明中所涉及的核酸与其他核酸分子杂交的高等严紧性实验条件为：在2×SSC、0.1％SDS、1mM EDTA(pH＝8.0)以及室温条件下杂交，继而分别在低严紧条件(2×SSC、0.1％SDS以及室温)、中严紧条件(0.2×SSC、 0.1％SDS以及42℃)、高严紧条件(0.2×SSC以及68℃)条件下洗涤10～15分钟。本领域技术人员应当理解，然而，如上所述，最佳条件会有所不同，依具体的杂交反应根据相关实验经验来确定。

在优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-1α核苷酸序列编码的三突变型HIF-1α蛋白质，与野生型HIF-1α核苷酸序列编码的野生型HIF-1α蛋白质相比，三突变型HIF-1α核苷酸序列能更稳定、更高水平的表达HIF-1α蛋白质，而这种三突变型HIF-1α蛋白质与野生型HIF-1α相比具有更高的促进下游靶基因转录的活性。

在另一方面，本发明提供包含本发明的核酸分子载体，优选是病毒载体，更优选是腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。本发明还提供包含野生型HIF-1α编码核酸的腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。

在一个实施例中，本发明所述载体是能够表达三突变型HIF-1α核酸序列的表达载体，与含有野生型HIF-1α核酸序列的表达载体相比，能够更稳定，更高水平的表达HIF-1α蛋白质，而这种三突变型HIF-1α蛋白质与野生型HIF-1α相比具有更高的促进下游靶基因转录的活性。

在另一方面，本发明提供含有本发明核酸分子或者本发明的宿主细胞。宿主细胞可以是动物细胞、植物细胞和微生物(包括真菌以及细菌等)等。

在另一方面，本发明提供含有本发明三突变型HIF-1α蛋白质、或本发明三突变型HIF-1α核苷酸序列、或本发明载体的组合物。本发明组合物优选是药物组合物，优选还含有药用助剂。如：赋形剂。更优选的，所述组合物是用于治疗缺血性疾病的药物组合物，该药物组合物优选可以被配置成注射液或者冻干粉针。或者，该组合物可以是促进血管新生或改善缺血的药物组合物，所述药物组合物是用于提高常氧条件下HIF-1α蛋白质表达水平，或延长HIF-1α蛋白质半衰期，以及增强HIF-1α蛋白质转录的组合物。

在另一方面，本发明提供含有本发明三突变型HIF-1α蛋白质、或本发明三突变型HIF-1α核苷酸序列、或本发明载体在制备用于治疗缺血性疾病以及可以是促进血管新生或改善缺血的药物用途。

在另一方面，本发明提供含有本发明三突变型HIF-1α蛋白质、或本发明三突变型HIF-1α核苷酸序列、或本发明载体在制备用于提高常氧条件下HIF-1α蛋白质表达水平，或延长HIF-1α蛋白质半衰期，以及增强HIF-1α蛋白质转录的药物中的用途。

本发明构建了表达人HIF-1α基因的重组腺病毒载体，为采用HIF-1α转基因治疗缺血性疾病(冠心病、外周血管疾病以及间歇性跛行)奠定了基础。本发明构建的重组人HIF-1α基因腺病毒载体是E1区复制缺陷型腺病毒E1区基因是腺病毒复制所必需的基因，该区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有明显的调控作用，E1区的功能由辅助细胞反式提供，最常用的辅助细胞是293细胞，是由人胚胎肾细胞经Ad5DNA片断转染后发生转化而形成的，其基因组中整合了含有腺病毒E1区的片段，可持续表达E1区蛋白，用于增殖E1区缺失的腺病毒载体。因此这就决定了复制缺陷型腺病毒在靶细胞中只有一次感染机会而无复制能力，从而完成腺病毒载体的功能，避免腺病毒本身对靶细胞的损害，达到安全转移基因之目的。

附图说明

为了让上述发明的特征、优势、目的以及其他方面的阐述更加的明晰，上述发明简述包含的详细内容有可能在附图/表中得到有关说明。这些附图/表成为发明详细内容的一部分。需要值得注意的是，这些附图/表仅是对本发明内容的进一步解释说明，因此对本发明的范围不构成任何限制。

图1、pcDNA3.1/V5-HisA结构示意图及其多克隆位点。

图2、pcDNA3.1(+)结构示意图及其多克隆位点。

图3、穿梭质粒pShuttle2结构示意图及其多克隆位点。

图4、腺病毒骨架质粒pAdeno-X Viral DNA结构示意图及其酶切位点。

图5、腺病毒表达系统Adeno-X Adenoviral Expression System 1构建流程图。

图6、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native质粒以Kpn I、Xba I作单、双酶切鉴定图。1：pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α经Xba I单酶切；

2：pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α经Kpn I、Xba I双酶切；

M：DL15000 Marker。

图7、pcDNA3.1(+)酶切图。

1：pcDNA3.1(+)；

2：pcDNA3.1(+)Kpn I、Xb_a I双酶切。

M：DL15000 Marker；

图8、重组pShuttle2-HIF-1α_native质粒作Nhe I、Apa I单、双酶切鉴定图。

1：pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_native；

2：pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native经Apa I、Nhe I双酶切；

3：pShuttle2经Apa I、Nhe I双酶切。

M：DL15000 Marker；

图9、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α_native测序结果。

图9A：402位点；图9B：564位点；图9C：803位点；

图10、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104

I、Age I单、双酶切鉴定图。

1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104I单酶切；

2-3：pShuttle2HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104I、Age I双酶切；

4：DL2000 Marker；

5：DL15000 Marker。

图11、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃测序结果。

图11A：402位点；图11B：564位点；图11C：803位点；

图12、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经PI-Sce

I、I-Ceu I双酶切。

M：DL15000Marker；

1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经PI-Sce I、I-CeuI双酶切。

图13、pAdeno-HIF-1α_native经Xho I酶切鉴定。

1：pAdeno-HIF-1α_native.

2：pAdeno-HIF-1α_nativediges ted by Xho I.

M：λ-Hind III digest.

图14、pAdeno-HIF-1α_native经突变区引物PCR鉴定。

1：pAdeno-HIF-1α_nativePCR产物(引物1、2，380bp)；

2：pAdeno-HIF-1α_nativePCR产物(引物3、4，460bp)；

3：pAdeno-HIF-1α_nativePCR产物(引物5、6，214bp)；

图15、pAdeno-HIF-1α_native经BD.Clontech所提供引物PCR鉴定(引物A、B)。

图16、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经Xho I酶切鉴定。

1：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃；

2：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经Xho I酶切；

3：Markerλ-Hind III；

图17、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经突变区引物PCR鉴定。

M：Marker I；

1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物A、B，287bp)；

2：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物1、2，380bp)；

3：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物3、4，460bp)；

4：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物5、6，214bp)；

图18、三突变HIF-1α在常氧条件下的表达以及其对下游促血管新生基因的转录活性。图18A：HIF-1α的mRNA的表达水平；图18B：

VEGF的mRNA的表达水平；图18C：PLGF的mRNA的表达水平；图18D：PAI-1的mRNA的表达水平；图18E：PDGF的mRNA的表达水平；

图19、三突变HIF-1α常氧条件下的稳定性以及其对下游促血管新生基因的稳定性的影响。图19A：HIF-1α的半衰期；图19B：VEGF的半衰期；图19C：PLGF的半衰期；图19D：PAI-1的半衰期；图19E：PDGF的半衰期；

图20、三突变HIF-1α基因在常氧条件下的促血管新生作用。图20A：三突变型HIF-1α对HMVEC-L细胞增殖的影响；图20B：三突变型HIF-1α对HMVEC-L迁移的影响；图20C：三突变型HIF-1α对HMVEC-L管样形成能力的影响；图20D-E：三突变型HIF-1α对HMVEC-L血管渗漏的影响。

图21、辅助激活因子CBP/p300在HIF-1α诱导的促血管新生基因转录中的作用。

图21A：VEGF的mRNA的表达水平；图21B：PLGF的mRNA的表达水平；图21C：PAI-1的mRNA的表达水平；图21D：PDGF的mRNA的表达水平；

图22、辅助激活因子HDAC在HIF-1α诱导的促血管新生基因转录中的作用。

图22A：VEGF的mRNA的表达水平；图22B：PLGF的mRNA的表达水平；图22C：PAI-1的mRNA的表达水平；图22D：PDGF的mRNA的表达水平；

图23、辅助激活因子CBP/p300和HDAC在HIF-1α诱导的促血管新生基因转录中的作用。

图23A：VEGF的mRNA的表达水平；图23B：PLGF的mRNA的表达水平；图23C：PAI-1的mRNA的表达水平；图23D：PDGF的mRNA的表达水平；

图24、病毒滴度测定(终点稀释实验法)示意图；

具体实施例

实施例1三突变型HIF-1α重组腺病毒载体的构建

1、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native的构建

(1)、以Kpn I、Xba I 酶切pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α_native，用Omega凝胶回收试剂盒(具体步骤参照试剂盒使用说明)胶回收目的基因片段(HIF-1α_nativecDNA片段)，约2500bp大小，回收后取适量进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，其结果见图6。

酶切反应体系如下：

pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α_native 约1μg

Kpn I 1μL

Xba I 1μL

10×M酶切缓冲液 2μL

加灭菌去离子水至总体积为 20μL

(2)、同以上方法以Kpn I、Xba I双酶切pcDNA3.1(+)，胶回收线性化pcDNA3.1(+)片段(方法同HIF-1α_nativecDNA片段的回收)，约5400bp大小，回收后取适量进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，其结果见图7。

(3)、将获得的HIF-1α_nativecDNA片段以及pcDNA3.1(+)片段在T4DNA连接酶的作用下连接重组为pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native。

连接反应体系：

HIF-1α_native cDNA片段 6μL

pcDNA3.1(+)片段 2μL

10×ligase Buffer 1μL

T4 DNA ligase(5Weiss u/μL) 0.5μL

总体积 10.0μL

16℃ 10-12h

(4)、将连接产物转化感受态DH5α，涂布到氨苄青霉素抗性固体培养基平皿。转化的具体步骤：

①、取200μL贮存于-70℃感受态DH5α，冰浴融化。

②、加入上述连接产物10μL，轻轻混匀，冰浴20-30min。

③、于42℃水浴中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min。

④、加入LB液体培养基200μL，于37℃缓慢振摇培养45min(约100转/min)。

⑤、将培养物适量涂于氨苄青霉素抗性琼脂LB平板(约50～100μL/平板)，待平板表面没有液体流动时，37℃孵箱倒置培养12-16h。

(5)、重组子筛选及质粒提取，具体步骤如下：

①无菌接种环挑取平板上生长的中等大小的单菌落约3～5个，分别接种于约5ml左右的氨苄抗性LB液体培养基，37℃振摇培养(约200转/分)过夜后，各取菌液10μL行菌液PCR鉴定，余则暂置于4℃保存。

②引物为HIF-1α突变1区或/和突变2区或/和突变3区片段引物，PCR反应体系及程序如下：

PCR反应体系：

菌液 10.0μL

引物1或3或5(10D/500μL) 2.0μL

引物2或4或6(10D/500μL) 2.0μL

dNTP 4.0μL

TaqDNA聚合酶 0.25μL

10×PCR缓冲液 5.0μL

加灭菌去离子水至总体积为 50.0μL

PCR反应程序：94℃2min→94℃30s→52℃30s→72℃1min→72℃5min，其中72℃1min→94℃30s共30个循环。附引物序列如下：

①突变1区(Pro402)片段引物

上游引物(Primer 1)：5′-AGCACGACTTGATTTTCTCCC-3′

下游引物(Primer 2)：5′-TTCTTGATTGAGTGCAGGGT-3′

PCR产物片段长380bp

②突变2区(Pro564)片段引物

上游引物(Primer 3)：5′-GACACAGAAGCAAAGAACCC-3′

下游引物(Primer 4)：5′-TCAAAGCGACAGATAACACG-3′

PCR产物片段长460bp

③突变3区(Asn803)片段引物

上游引物(Primer 5)：5′-CCAGACGATCATGCAGCTAC-3′

下游引物(Primer 6)：5′-GGTTTCTGCTGCCTTGTATAG-3′

PCR产物片段长214bp

备注：上述所有引物均按照说明书配制成终浓度10pmol/μL。

③将PCR反应产物各取5μL进行琼脂糖凝胶(1.5～2％)电泳，紫外灯下观察电泳结果正确后(不保存该电泳结果)，取PCR鉴定正确的菌液1ml接种于100～200ml左右的氨苄青霉素抗性LB液体培养基，37℃振摇培养过夜。

④用Omega质粒提取试剂盒提取重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α质粒质粒(具体步骤参照试剂盒使用说明)。

(6)、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native质粒酶切鉴定。以Kpn I、XbaI对所提重组质粒作单、双酶切鉴定(酶切方法同前)

2、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α_native的构建

(1)、以Nhe I、Apa I双酶切pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native，具体步骤如下：

①先以Apa I单酶切获得线性化的pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native，Apa I单酶切反应体系如下：

Apa I单酶切反应体系

pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native 约1.0μg

Apa I 1.0μL

10×L酶切缓冲液 2.0μL

加灭菌去离子水至总体积为 20.0μL

酶切约 2-3h

②、乙醇沉淀法获得Apa I单酶切产物，方法如下：

a.在酶切产物中加入TE 80μL，再加入无水乙醇200μL、

3M醋酸钠10μL、糖原1μL。

b.充分摇动混匀，4℃下14000rpm离心5min。

c.小心弃去上清，此时可见有少量白色沉淀物。

d.小心加入300μL 75％乙醇，室温下14000rpm离心2min。

e.小心吸弃上清，室温约10min自然风干(可置超净台内)，避免过度干燥。

f.以15μL TE重新溶解DNA，即已线性化的pcDNA3.1(+)-HIF-1α。

③、再Nhe I单酶切线性化的pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native，Nhe I单酶切反应体系如下：

Nhe I单酶切反应体系

线性化pcDNA3.1(+)-HIF-1α_native 约1.0μg

Nhe I 1.0μL

10×M酶切缓冲液 2.0μL

加灭菌去离子水至总体积为 20.0μL

酶切约 2-3h

④、酶切产物行琼脂糖凝胶(1％)电泳，胶回收HIF-1α_nativecDNA片段，方法同前，其结果见图8。

(2)、以Nhe I、Apa I先后酶切pShuttle2质粒，方法同上，对线性化pShuttle2作胶回收，以完全去除pShuttle2质粒双酶切后的多克隆位点内小片段DNA，其结果见图8。

(3)、连接重组pShuttle2-HIF-1α_native，连接产物转化感受态DH5α，重组子筛选及重组pShuttle2-HIF-1α_native质粒提取。方法同前，只是在抗性筛选时改用卡那霉素，终浓度为50μg/mL。

(4)、重组pShuttle2-HIF-1α_native质粒作Nhe I和Apa I单、双酶切鉴定，将酶切产物进行琼脂糖凝胶(1.5～2％)电泳，紫外灯下观察电泳结果正确后(不保存该电泳结果)，取0.5-1μL质粒用HIF-1α突变区片段引物作PCR鉴定，并将PCR产物送基因测序公司(博亚)测序，测序结果见图9。 3、在pShuttle2-HIF-1α_native基因序列的基础上运用定点突变技术构建pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803

(1)、将HIF-1α_native基因序列上编码HIF-1α_native蛋白质第402位脯氨酸残基(Pro)的密码子CCA突变为丙氨酸(Ala)密码子GCA，反应体系如下：

(2)、在重组质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402的基础上，将HIF-1α-Ala402基因序列上编码HIF-1α-Ala402蛋白质第564位脯氨酸残基(Pro)的密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC；

第564位脯氨酸残基(Pro)突变的PCR反应体系：基本同上第1阶段反应体系，以pShuttle2-HIF-1α-Ala402为底物，以sense primer： 5′ctt ggagatgtta gctgcctata tcccaatgga tg 3′和anntisense primer：antisense primer：3′gaa cctctacaat cgacggatat agggttacct ac 5′为引物，扩增循环数为20个循环。

(3)、在重组质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564的基础上，将HIF-1α-Ala402-Ala564基因序列上编码HIF-1α-Ala402-Ala564蛋白质第803位天冬酰胺(Asn)密码子AAT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT

第803位天冬酰胺(Asn)突变的PCR反应体系：基本上同该步骤，以pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564为底物，以sense primer：5’ccagttatga ttgtgaagtt gctgctccta tacaaggcag 3’和anntisenseprimer：3′ggtcaatact aacacttcaa cgacgaggat atgttccgtc 5′为引物，扩增循环数为20个循环。从而获得重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803。

(4)、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104I、Age I单、双酶鉴定。BspT104I单酶切片段大小约6600bp，Age I、BspT104I双酶切两个片段大小分别为6300bp、300bp左右，其结果见图10。取0.5-1μL质粒用HIF-1α突变区片段引物作PCR鉴定，并将PCR产物送基因测序公司(博亚)测序，测序结果见图11。

4、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803

(1)、以PI-Sce I、I-Ceu I双酶切pShuttl e2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，37℃恒温水浴3h，酶切反应体系如下：

PI-Sce I、I-Ceu I双酶切反应体系

pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803 约1.0μg

PI-Sce I(1U/μL) 2.0μL

I-Ceu I(5U/μL) 0.5μL

10×双酶切缓冲液 3.0μL

加灭菌去离子水至总体积为 30.0μL

37℃恒温水浴 2-3h

(2)、酶切产物作琼脂糖凝胶(1％)电泳，胶回收含有hCMV启动子、HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803cDNA片段、SV40poly A表达盒的大片段，称为CMV-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，大小约3600bp，其结果见图12。

(2)、连接重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803，连接反应体系如下，连接条件同前。

连接反应体系：

CMV-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803片段 7.5μL

Adeno-X Viral DNA 1.0μL

10×DNA ligase Buffer 1.0μL

T4 DNA ligase 0.5μL

总体积 10.0μL

(4)、连接产物转化感受态DH5α后，在氨苄抗性LB平板上筛选重组子，挑取适量中等大小的单菌落，分别接种于5ml的氨苄抗性LB液体培养基，37℃振摇过夜，每管各取10μL菌液以BD.Clontech所提供引物行菌液PCR鉴定，PCR反应体系及程序如下：

PCR反应体系：

菌液 10.0μL

引物A(1OD/500μL) 2.0μL

引物B(1OD/500μL) 2.0μL

dNTP 4.0μL

TaqDNA聚合酶 0.25μL

10×PCR缓冲液 5.0μL

加灭菌去离子水至总体积为50.0μL

PCR反应程序：94℃2min→94℃15s→68℃2min→68℃3min，其中 68℃2min→94℃15s共30个循环。

附BD.Clontech公司所提供引物(两个引物分别与穿梭质粒表达盒及骨架质粒的部分序列结合)

上游引物(Primer A)：5′-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3′

下游引物(Primer B)：5′-AGATCTGAGCTTTCGCTACC-3′

PCR产物片段长287bp

备注：上述所有引物终浓度10pmol/μL。

(5)、将鉴定结果正确的菌液接种于约50ml氨卞抗性LB液体培养基，按上述步骤筛选及PCR鉴定。

(6)、将鉴定正确的菌液每管各取3ml用Qiagen Plasmid Mini Kit超纯质粒提取试剂盒(具体步骤参照试剂盒使用说明)提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803。

(7)、以Xho I酶切鉴定重组pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803质粒，以0.5％琼脂糖凝胶电泳，酶切片段有约14500、8046、4300、2465bp，其结果见图16，以用HIF-1α突变区片段引物以及BD.Clontech所提供引物作PCR鉴定，其结果见图17，并将突变区PCR产物送基因测序公司(博亚)测序。

5、以构建重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803的方法构建pAdeno-HIF-1α_native并鉴定，鉴定结果见图13-15。

实施例2携三突变型HIF-1α基因重组腺病毒的包装、体外扩增以及滴度测定

1、HEK293细胞准备

转染前一天HEK293细胞以3～5×10⁵/孔细胞密度接种于6孔板，用含10％FBS的DMEM培养基，置于37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养，待到细胞融合率在60-70％左右时，即可开始转染。

2、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803的准备

①、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803以 Pac I酶切，暴露其反向重复序列。酶切反应体系如下：

PI-Sce I酶切反应体系：

pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803 约3.0μg

PI-Sce I(1U/μL) 1.0μL

10×BSA 3.0μL

10×NEB3酶切缓冲液 3.0μL

加灭菌去离子水至总体积为 30.0μL

37℃恒温水浴 2-3h

②、酶切产物以酚-氯仿-异戊醇抽提纯化，乙醇沉淀。具体步骤如下：

a.将酶切产物加入TE 70μL。

b.加入100μL酚-氯仿-异戊醇溶液(三者比例为25∶24∶1)，轻轻混匀。

c.4℃12000rpm离心5min以使溶液分层。

d.小心将上层液相(约90μL)转移至1.5ml离心管。

e.按上述乙醇沉淀法沉淀DNA，即线性化后的pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803。

③、以约20μL三蒸水重溶，取约2μL行琼脂糖凝胶(0.5％)电泳。

3、线性化后的pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803转染HEK293细胞。具体步骤如下：

①、以Opti-MEM I各20μL分别稀释线性化后的pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803以及9μL Lipofectamine2000，5-10min后将两者轻轻混匀。

②、两者的混合液在室温孵育20min后，将混合液直接加入上述培养有293细胞的1孔6孔板内，摇动培养板，轻轻摇匀，置细胞培养箱内。

③、在37℃、5％的CO2培养箱中孵育4-5h后，更换为5ml含10％FBS无抗生素的DMEM继续培养。

④、转染后每天观察细胞，待约10天左右大部分细胞出现细胞病变效应(CPE)后收集细胞，予500μL PBS重悬，-20℃～37℃反复冻融细胞3次，离心收集上清，此称为病毒原液，病毒称为Ad-HIF-1α-Tr ip，置-20℃保存。

4、同以上方法包装携野生型HIF-1α基因重组腺病毒，称之为Ad-HIF-1α-_native

5、上述2种重组腺病毒体外大量扩增

主要步骤为：将HEK293细胞接种于150cm²平皿中，待细胞生长至80-90％融合时，加入重组腺病毒Ad-HIF-1α-Trip，转染复数(multiplicity of infection，MOI)约为10pfu/cell，置入37℃5％CO₂培养箱中继续培养，48-72h后细胞完全出现CPE时，分别收集细胞，冻存于-80℃备用。反复如此，既而纯化病毒。

同上法，分别体外扩增重组腺病毒Ad-HIF-1α_native。

6、病毒滴度测定——采用终点稀释实验法，方法如下：

①检测前在96孔平底培养板内，每孔加入100μL(含约10⁴个293细胞)细胞悬液(含5％FBS的DMEM)，37℃、5％的CO2培养箱中孵育20-24h使细胞贴壁。

②病毒的稀释将病毒液(原液或扩增液)10μL加入含有990μL DMEM的EP管内作1∶100稀释，浓度即为原病毒液的10^-2，从此浓度开始，在24孔板内作病毒液的1∶10倍比稀释，即成10^-3～10^-10各种梯度浓度的病毒稀释液，每种稀释度应有1～2ml DMEM。

③由10^-3稀释度开始，每横排(共12个孔)的前10孔内加同一稀释度的病毒液100μL，由10^-3～10^-10依次共8个横排。

④每横排的最后两个孔加不含病毒液的DMEM各100μL作阴性对照

⑤培养板置37℃、5％的CO2培养箱中孵育

⑥10天后，于倒置显微镜下观察培养板，计数可以观察到有CPE的培养孔，即使培养孔内只有几个细胞出现CPE，该孔即为阳性；如果CPE和细胞死亡难以区分，可以和阴性对照孔比较(见图24)。

⑦计算每排阳性孔的比率，将各排孔阳性比率总和记作X(包括10-1、10-2两种稀释度)。

⑧病毒滴度(pfu/ml)＝10(x+0.8)

本测试前提：如果阴性对照没有显示任何CPE改变或细胞生长问题，最低稀释孔显示100％感染(10/10)和最高稀释孔显示0％感染(0/10)，就说明该测试是有效的。

实施例3三突变型HIF-1α在体外常氧条件下的表达及转录活性

为了评估三突变型HIF-1α在体外常氧条件下的表达水平。

人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以8.0×10³/孔的细胞密度接种于96孔板，置于常氧培养箱(37℃20％O₂5％CO₂)中培养平衡10-12h后，更换为含2％FBS的EBM-2培养基，置于不同条件下继续培养24小时后，用QuantiGene 2.0Reagent System(Panomics，Inc.)检测HIF-1α以及下游促血管新生基因(VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF)的在常氧条件下表达水平。

人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以75×10⁴/cm²的细胞密度接种于150cm²细胞培养瓶，置于常氧培养箱(37℃20％O₂5％CO₂)中培养平衡10-12h后，更换为含2％FBS的EBM-2培养基，置于不同条件下继续培养72小时后，用ELISA法检测上清中VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的含量。

常氧条件(37℃20％O₂5％CO₂)下有正常对照组(不施加任何处理)、去铁敏组(模拟低氧，Deferoxamine，100μmol/L)以及病毒转染组(分别用Ad-HIF-1α-native、Ad-HIF-1α-Trip以及Ad-Null以MOI＝200pfu/cell转染HMVEC-L细胞)；低氧条件(37℃1％O₂5％CO₂)下为低氧组(Hypoxia)。

HIF-1α表达水平如图18A所示：对照组(1399.67±60.02)与Ad-Null组(1281.83±69.03)HIF-1α表达水平之间无显著性差异(P＝0.133)；与对照组相比，去铁敏组(1949.83±100.23)、低氧组(2688.83±160.94)、Ad-HIF-1α-native(2109.33±46.58)以及Ad-HIF-1α-Trip(3302.67±41.88)诱导的HIF-1α表达明显增加，有显著性差异(P＝0.000)；且Ad-HIF-1α-Trip组HIF-1α表达HIF-1α表达水平明显高于低氧组(P＝0.000)以及其它各实验组(P＝0.000)。Ad-HIF-1α-Trip组能明显促进下游促血管新生基因VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的表达，与其它各组相比，有显著性差异(P＝0.000)，如图18B-18E所示。

实施例4三突变型HIF-1α在体外常氧条件下的稳定性

为了评估三突变型HIF-1α在体外常氧条件下的稳定性以及对下游促血管新生基因的稳定性的影响。

人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以8.0×10³/孔的细胞密度接种于96孔板，置于常氧培养箱(37℃20％O₂5％CO₂)中培养平衡10-12h后，更换为含2％FBS的EBM-2培养基，置于不同条件下(同实施例3中设置)继续培养48h，然后用放线菌素D(Act.D 10μmol/L)干扰RNA合成，分于加入Act.D后立即、1h、2h、4h以及6h收集细胞样本，用QuantiGene 2.0Reagent System(Panomics，Inc.)分析HIF-1α、VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的mRNA表达水平的变化。

在常氧条件下，三突变型HIF-1α(Ad-HIF-1α-Trip)能将HIF-1αmRNA的半衰期从(1.84±0.06)h延长至(4.53±0.16)h，与低氧条件下HIF-1αmRNA的半衰期(3.02±0.12)h相比，有显著性差异(P＝0.000)，如图19A所示。三突变型HIF-1α能明显增加VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的mRNA在常氧条件下的稳定性，VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的mRNA在常氧条件下的半衰期分别从(1.09±0.13)h、(0.71±0.00)h、(0.86±0.01)h以及(0.80±0.22)h延长到(4.42±0.25)h、(2.59±0.31)h、(2.76±0.08)h以及(2.84±0.18)h，明显高于其它组(P＝0.000)，如图19B-19E所示。

实施例5三突变型HIF-1α在体外常氧条件下的血管新生潜能

为了观察三突变型HIF-1α在体外常氧条件下的血管新生潜能，将从如下四个方面进行评估：

(1)、三突变型HIF-1α对HMVEC-L细胞增殖的影响。人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以2.0×10³/孔的细胞密度接种于96孔板，于37℃5％CO₂孵箱中培养12h后，更换为含2％FBS的EBM-2培养基，置于不同条件下(同实施例3中设置)继续培养，分别于第1d、2d、3d、4d、5d、6d以及7d应用MTS试剂盒检测细胞增殖率。

(2)、三突变型HIF-1α对HMVEC-L迁移的影响。人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以10×10⁴/孔的细胞密度接种于35mm培养皿，于37℃5％CO₂孵箱中培养4-6h待细胞贴壁后，更换为含2％FBS的EBM-2培养基继续培养48-72小时待形成单细胞层后，用200μL枪头划痕，置于不同条件下(同实施例3中设置)继续培养，12h后在光学显微镜下观察HMVEC-L在不同处理下的迁移能力并用图像软件分析。

(3)、三突变型HIF-1α对HMVEC-L管样形成能力的影响。人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以10×104/孔的细胞密度接种于预先由Matrigel基质胶(BD公司)包被的96孔板中，于37℃5％CO₂孵箱中培养待细胞贴壁后立即，置于不同条件下(同实施例3中设置)继续培养，8h后在光学显微镜下观察管样结构并用图像软件分析。

(4)、三突变型HIF-1α对HMVEC-L血管渗漏的影响。人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-L)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以1×10⁴/孔的细胞密度接种于12孔transwell板(0.4μm孔径，corning公司)上层小室，用含2％FBS的EBM-2培养基培养，置于不同条件下(同实施例3中设置)继续培养48-72h待形成单细胞层后，向transwell上层小室中加入FITC-右旋糖酐(FITC-dextran，1mg/mL，平均分子量40000；Sigma)，然后加入凝血酶(1U/mL，Sigma)刺激，分别于加入后立即、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h以及96h从下层小室中回收25μL的培养基，用全波长酶标仪测量其中FITC-dextran的含量以评估不同刺激下出HPAECs单层细胞的渗漏特点。

如图20A所示，三突变型HIF-1α能明显促进HMVEC-L细胞增殖，与其它各组相比有显著性差异(P＝0.000)。三突变型HIF-1α诱导的细胞增殖曲线第5d达到高峰；如图20B所示，三突变型HIF-1α能明显促进HMVEC-L细胞迁移，与其它各组相比有显著性差异(P＝0.000)；如图20C所示，三突变型HIF-1α能明显促进管样形成，与其它各组相比有显著性差异(P＝0.000)；如图20D，20E所示，无论有无凝血酶作用，三突变型HIF-1α能降低血管的渗漏率(体外)，与其它各组相比有显著性差异(P＝0.000)。与对照组相比，虽然低氧组以及去铁敏组能促进HMVEC-L细胞增殖、迁移以及成样形成(P＝0.000)，但是明显低于Ad-HIF-1α-Trip组(P＝0.000)，然而，低氧组以及去铁敏组血管渗漏率明显高与对照组(P＜0.05)。

实施例6辅助激活因子CBP/p300或/和HDAC在HIF-1α诱导的血管新生中的作用

使用辅助激活因子CBP/p300的特异性抑制剂——姜黄素(Curcumin，Cur)，评价辅助激活因子CBP/p300在HIF-1α诱导的血管新生中的作用；使用辅助激活因子HDAC的特异性抑制剂——古抑霉素A(trichostatinA，TSA)，评价辅助激活因子HDAC在HIF-1α诱导的血管新生中的作用；联合使用姜黄素和TSA同时抑制CBP/p300和HDAC活性后，HIF-1α下游靶基因(VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF)的表达水平变化。

人肺型微血管内皮细胞(HMVEC-Ls)用EBM-2培养基制备成单细胞悬液，以8.0×10³/孔的细胞密度接种于96孔板，置于常氧培养箱(37℃20％O₂ 5％ CO₂)中平衡培养10-12h后，用不同浓度的姜黄素或/和古抑霉素A预处理HMVEC-Ls1h，并置于不同条件下继续培养共24小时，用QuantiGene 2.0 Reagent System(Panomics，Inc.)检测下游促血管新生基因(VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF)的在常氧条件下表达水平。

如图21所示，随着姜黄素浓度的升高，对CBP/p300的抑制逐渐增强，VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的表达水平逐渐下降，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；然而，姜黄素(40μmol/L，100μmol/L以及100μmol/L)各浓度组PDGF mRNA表达水平分别减少了(77.2±4.7)％，(82.6±3.6)％和(95.2±1.5)％，VEGF mRNA表达分别减少了(31.5±13.2)％，(57.3±11.1)％和(83.6±5.6)％，此外，即使在CBP/p300功能受到明显抑制时(100μmo l/L)，仍有(47.4±11.0)％PLGF和(58.2±7.8)％PAI-1表达。这些结果表明，PDGF对CBP/p300功能的抑制极度敏感，VEGF则对其高度敏感，而PLGF和PAI-1的表达对其呈中度敏感。

同样，如图22所示，随着TSA浓度的升高，对HDAC的抑制逐渐增强，VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的表达水平逐渐下降，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；TSA(100ng/mL，300ng/mL以及600ng/mL)各浓度组分别抑制了(44.8±15.7)％，(93.8±2.2)％和(96.5±1.4)％的PDGF mRNA表达而VEGF mRNA的表达分别被抑制(42.2±16.7)％，(83.0±5.6)％和(87.5±3.9)％下降。相对于PDGF和VEGF，PLGF和PAI-1表达为中度抑制。这些数据表明，辅助激活因子HDAC在HIF-1α诱导的PDGF、VEGF、PLGF以及PAI-1的表达中的作用与辅助激活因子CBP/p300相似。

我们进一步同时抑制辅助激活因子CBP/p300和HDAC的功能(40μmol/L姜黄素+100ng/mL TSA)发现(图23)：仅单独抑制辅助激活因子CBP/p300或HDAC，并不能阻断全部的PDGF、VEGF、PLGF以及PAI-1的表达；与40μmol/L姜黄素刺激下对PDGF表达抑制相比，对VEGF、PLGF以及PAI-1的表达抑制要轻(P＜0.05)；而100ng/mL TSA刺激下对PDGF的表达抑制相比，对VEGF、PLGF以及PAI-1的表达抑制要深(P＜0.05)；但同时抑制辅助激活因子CBP/p300至和HDAC的功能后，VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的表达以进一步减少至(24.7±6.4)％，(45.5±7.4)％，(40.0±8.0)％和(7.9±2.5)％。这些结果表明，HDAC依赖的途径与CBP/p300依赖的途径共同参与了HIF-1α诱导的VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF的表达，且控制了约50％以上的上述基因的表达。

在辅助激活因子CBP/p300或/和HDAC被抑制的过程中，我们发现，Ad-HIF-1α-Trip组的VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF表达水平明显高于Ad-HIF-1α-564/402组、低氧组以及去铁敏组(P＜0.05)这些结果表明：除其CBP/p300和HDAC之外的他辅助激活因子也参与了HIF-1α诱导的VEGF、PLGF、PAI-1以及PDGF等下游促血管新生基因的表达(图21-23)。

序列表

SEQ ID NO：1

(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS：

(A)TYPE 1：nucleic acid

TYPE 2：amino acid

(B)LENGTH 1：3958 base pairs

LENGTH 2：826 amino acids

(C)STRANDEDNESS 1：single

STRANDEDNESS 1：not relevant

(D)TOPOLOGY：linear

(ii)MOLECULE TYPE1：DNA

MOLECULE TYPE 2：Protein

GT GCTGCCTCGT CTGAGGGGAC 12

AGGAGGATCA CCCTCTTCGT CGCTTCGGCC AGTGTGTCGG GCTGGGCCCT 62

GACAAGCCAC CTGAGGAGAG GCTCGGAGCC GGGCCCGGAC CCCGGCGATT 112

GCCGCCCGCT TCTCTCTAGT CTCACGAGGG GTTTCCCGCC TCGCACCCCC 162

ACCTCTGGAC TTGCCTTTCC TTCTCTTCTC CGCGTGTGGA GGGAGCCAGC 212

GCTTAGGCCG GAGCGAGCCT GGGGGCCGCC CGCCGTGAAG ACATCGCGGG 262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA 317

Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

1 5 10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC 362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

15 20 25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT 407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala

30 35 40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG 452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

45 50 55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA 497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

60 65 70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA 542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

75 80 85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG 587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

90 95 100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG 632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

105 110 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT 677

Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser

120 125 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA 722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

135 140 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA 767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

150 155 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT 812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

165 170 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA 857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

180 185 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC 902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

195 200 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG 947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys pro Pro Met Thr Cys Leu Val

210 215 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT 992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

225 230 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA 1037

Leu Asp Ser Lys Thr phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys

240 245 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG 1082

Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

255 260 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT 1127

Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

270 275 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT 1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

285 290 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA 1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

300 305 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC 1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

315 320 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT 1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

330 335 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA 1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

345 350 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG 1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

360 365 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC 1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

375 380 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC 1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

390 395 400

GCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC 1532

Ala Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

▲ 405 410 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT 1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr

420 425 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA 1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

435 440 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA 1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

450 455 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA 1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

465 470 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG 1757

Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met

480 485 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT 1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

495 500 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT 1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

510 515 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA 1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

525 530 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT 1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

540 545 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT GCC TAT ATC 1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Ala Tyr Ile

555 560 ▲ 565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA 2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

570 575 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA 2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

585 590 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT 2117

Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr

600 605 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA 2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

615 620 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT 2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

630 635 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA 2252

Pro Ser pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

645 650 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA 2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

660 665 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA 2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

675 680 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT 2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

690 695 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT 2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala 809

705 710 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA 2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

720 725 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT 2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

735 740 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT 2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

750 755 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT 2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

765 770 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA 2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

780 785 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT GCT GCT CCT ATA 2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Ala Ala Pro Ile

795 800 ▲ 805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT 2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

810 815 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT AATTTCATTC CTTTTTTTGG 2795

Leu Asp Gln Val Asn End

825

ACACTGGTGG CTCACTACCT AAAGCAGTCT ATTTATATTT TCTACATCTA 2845

ATTTTAGAAG CCTGGCTACA ATACTGCACA AACTTGGTTA GTTCAATTTT 2895

TGATCCCCTT TCTACTTAAT TTACATTAAT GCTCTTTTTT AGTATGTTCT 2945

TTAATGCTGG ATCACAGACA GCTCATTTTC TCAGTTTTTT GGTATTTAAA 2995

CCATTGCATT GCAGTAGCAT CATTTTAAAA AATGCACCTT TTTATTTATT 3045

TATTTTTGGC TAGGGAGTTT ATCCCTTTTT CGAATTATTT TTAAGAAGAT 3095

GCCAATATAA TTTTTGTAAG AAGGCAGTAA CCTTTCATCA TGATCATAGG 3145

CAGTTGAAAA ATTTTTACAC CTTTTTTTTC ACATTTTACA TAAATAATAA 3195

TGCTTTGCCA GCAGTACGTG GTAGCCACAA TTGCACAATA TATTTTCTTA 3245

AAAAATACCA GCAGTTACTC ATGGAATATA TTCTGCGTTT ATAAAACTAG 3295

TTTTTAAGAA GAAATTTTTT TTGGCCTATG AAATTGTTAA ACCTGGAACA 3345

TGACATTGTT AATCATATAA TAATGATTCT TAAATGCTGT ATGGTTTATT 3395

ATTTAAATGG GTAAAGCCAT TTACATAATA TAGAAAGATA TGCATATATC 3445

TAGAAGGTAT GTGGCATTTA TTTGGATAAA ATTCTCAATT CAGAGAAATC 3495

ATCTGATGTT TCTATAGTCA CTTTGCCAGC TCAAAAGAAA ACAATACCCT 3545

ATGTAGTTGT GGAAGTTTAT GCTAATATTG TGTAACTGAT ATTAAACCTA 3595

AATGTTCTGC CTACCCTGTT GGTATAAAGA TATTTTGAGC AGACTGTAAA 3645

CAAGAAAAAA AAAATCATGC ATTCTTAGCA AAATTGCCTA GTATGTTAAT 3695

TTGCTCAAAA TACAATGTTT GATTTTATGC ACTTTGTCGC TATTAACATC 3745

CTTTTTTTCA TGTAGATTTC AATAATTGAG TAATTTTAGA AGCATTATTT 3895

TAGGAATATA TAGTTGTCAC AGTAAATATC TTGTTTTTTC TATGTACATT 3845

GTACAAATTT TTCATTCCTT TTGCTCTTTG TGGTTGGATC TAACACTAAC 3895

TGTATTGTTT TGTTACATCA AATAAACATC TTCTGTGGAC CAGGAAAAAA 3945

AAAAAAAAAA AAA 3958

SEQ ID NO：2

(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS：

(A)TYPE 1：nucleic acid

TYPE 2：amino acid

(B)LENGTH 1：3958base pairs

LENGTH 2：826amino acids

(C)STRANDEDNESS 1：single

STRANDEDNESS 1：not relevant

(D)TOPOLOGY：linear

(ii)MOLECULE TYPE 1：DNA

MOLECULE TYPE 2：Protein

GT GCTGCCTCGT CTGAGGGGAC 12

AGGAGGATCA CCCTCTTCGT CGCTTCGGCC AGTGTGTCGG GCTGGGCCCT 62

GACAAGCCAC CTGAGGAGAG GCTCGGAGCC GGGCCCGGAC CCCGGCGATT 112

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ACCTCTGGAC TTGCCTTTCC TTCTCTTCTC CGCGTGTGGA GGGAGCCAGC 212

GCTTAGGCCG GAGCGAGCCT GGGGGCCGCC CGCCGTGAAG ACATCGCGGG 262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA 317

Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

1 5 10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC 362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

15 20 25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT 407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val phe Tyr Glu Leu Ala

30 35 40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG 452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

45 50 55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA 497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

60 65 70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA 542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

75 80 85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG 587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

90 95 100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG 632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

105 110 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT 677

Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser

120 125 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA 722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

135 140 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA 767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

150 155 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT 812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

165 170 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA 857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

180 185 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC 902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

195 200 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG 947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val

210 215 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT 992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

225 230 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA 1037

Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys

240 245 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG 1082

Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

255 260 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT 1127

Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

270 275 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT 1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

285 290 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA 1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

300 305 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC 1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

315 320 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT 1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

330 335 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA 1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

345 350 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG 1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

360 365 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC 1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

375 380 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC 1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

390 395 400

CCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC 1532

Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

405 410 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT 1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr

420 425 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA 1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

435 440 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA 1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

450 455 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA 1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

465 470 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG 1757

Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met

480 485 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT 1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

495 500 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT 1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

510 515 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA 1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

525 530 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT 1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

540 545 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT CCC TAT ATC 1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile

555 560 565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA 2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

570 575 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA 2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

585 590 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT 2117

Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr

600 605 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA 2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

615 620 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT 2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

630 635 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA 2252

Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

645 650 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA 2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

660 665 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA 2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

675 680 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT 2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

690 695 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT 2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala 809

705 710 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA 2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

720 725 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT 2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

735 740 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT 2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

750 755 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT 2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

765 770 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA 2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

780 785 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT AAT GCT CCT ATA 2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile

795 800 805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT 2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

810 815 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT AATTTCATTC CTTTTTTTGG 2795

Leu Asp Gln Val Asn End

825

ACACTGGTGG CTCACTACCT AAAGCAGTCT ATTTATATTT TCTACATCTA 2845

ATTTTAGAAG CCTGGCTACA ATACTGCACA AACTTGGTTA GTTCAATTTT 2895

TGATCCCCTT TCTACTTAAT TTACATTAAT GCTCTTTTTT AGTATGTTCT 2945

TTAATGCTGG ATCACAGACA GCTCATTTTC TCAGTTTTTT GGTATTTAAA 2995

CCATTGCATT GCAGTAGCAT CATTTTAAAA AATGCACCTT TTTATTTATT 3045

TATTTTTGGC TAGGGAGTTT ATCCCTTTTT CGAATTATTT TTAAGAAGAT 3095

GCCAATATAA TTTTTGTAAG AAGGCAGTAA CCTTTCATCA TGATCATAGG 3145

CAGTTGAAAA ATTTTTACAC CTTTTTTTTC ACATTTTACA TAAATAATAA 3195

TGCTTTGCCA GCAGTACGTG GTAGCCACAA TTGCACAATA TATTTTCTTA 3245

AAAAATACCA GCAGTTACTC ATGGAATATA TTCTGCGTTT ATAAAACTAG 3295

TTTTTAAGAA GAAATTTTTT TTGGCCTATG AAATTGTTAA ACCTGGAACA 3345

TGACATTGTT AATCATATAA TAATGATTCT TAAATGCTGT ATGGTTTATT 3395

ATTTAAATGG GTAAAGCCAT TTACATAATA TAGAAAGATA TGCATATATC 3445

TAGAAGGTAT GTGGCATTTA TTTGGATAAA ATTCTCAATT CAGAGAAATC 3495

ATCTGATGTT TCTATAGTCA CTTTGCCAGC TCAAAAGAAA ACAATACCCT 3545

ATGTAGTTGT GGAAGTTTAT GCTAATATTG TGTAACTGAT ATTAAACCTA 3595

AATGTTCTGC CTACCCTGTT GGTATAAAGA TATTTTGAGC AGACTGTAAA 3645

CAAGAAAAAA AAAATCATGC ATTCTTAGCA AAATTGCCTA GTATGTTAAT 3695

TTGCTCAAAA TACAATGTTT GATTTTATGC ACTTTGTCGC TATTAACATC 3745

CTTTTTTTCA TGTAGATTTC AATAATTGAG TAATTTTAGA AGCATTATTT 3895

TAGGAATATA TAGTTGTCAC AGTAAATATC TTGTTTTTTC TATGTACATT 3845

GTACAAATTT TTCATTCCTT TTGCTCTTTG TGGTTGGATC TAACACTAAC 3895

TGTATTGTTT TGTTACATCA AATAAACATC TTCTGTGGAC CAGGAAAAAA 3945

AAAAAAAAAA AAA 3958

Claims

1.三突变型HIF-1α蛋白质是由1-826个氨基酸残基组成[SEQ ID NO.1编码的蛋白质]，包含氧依赖降解结构域(ODDD)以及转录激活区(TAD)这两个重要的功能区，其中ODDD区内第402位上的脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，和第564位上的脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，以及TAD区内第803位上的天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)。

2.权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的稳定性不再受脯氨酸羟化酶(PHD)的调控，从而使其在常氧条件下的稳定性不低于野生型HIF-1α蛋白质[SEQ ID NO.2编码的蛋白质]在低氧条件下的稳定性。

3.权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的转录活性不再受HIF-1抑制因子(FIH-1)的调控，从而其在常氧条件下也具有高效的转录活。

4.权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质，能够与CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白P300(CBP/p300)以及组蛋白去乙酰酶(HDAC)等辅助激活因子结合促进血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PLGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、纤溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)等HIF-1α下游靶基因的表达。

5.编码权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质是三突变型HIF-1α核酸分子[SEQ ID NO.1中的核酸分子序列]。

6.权利要求5的三突变型HIF-1α核酸分子，与野生型HIF-1α核酸分子[SEQ ID NO.2中的核酸分子序列]相比，其编码的三突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下更稳定且更高的表达水平，该HIF-1α蛋白质与野生型HIF-1α蛋白质相比在常氧条件下具有更高的转录活性。

7.含有权利要求1所述的三突变型HIF-1α核酸分子的表达载体，优选是病毒载体，更优选是腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。

8.权利要求7的载体，其是能够表达权利要求6-7的三突变型HIF-1α核酸分子的表达载体；优选地，该表达载体与含有野生型HIF-1α蛋白质编码核酸分子的相同载体相比，能够更稳定、更高水平表达HIF-1α蛋白质；该HIF-1α蛋白质优选与野生型HIF-1α蛋白质相比具有提高的转录因子活性。

9.含有权利要求2中载体的宿主细胞，可以是原核细胞，也可以是真核细胞。

10.提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的稳定性或者表达水平、和/或提高HIF-1α蛋白质的转录活性的体外方法，包括同时将野生型HIF-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)分子序列中第402位点、第564位点上的脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，以及第803位上的天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，其与野生型HIF-1α蛋白质相比，该三突变型HIF-1α蛋白质第402位、第564位和第803位点上的氨基酸发生了突变，使得该三突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的稳定性或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，以及该三突变型HIF-1α蛋白质的转录活性与野生型HIF-1α蛋白质相比也提高了。

11.提供HIF-1α核酸分子呈成组型表达的体外方法：在允许权利要求1所述三突变型HIF-1α核酸分子表达的条件下，用该核酸分子转染细胞，从而使核酸分子呈成组型表达。

12.提高HIF-1α核酸分子表达的体外方法，在允许权利要求7中载体所携带的核酸分子表达的条件下，通过该载体介导权利要求1的三突变型HIF-1α核酸分子转染细胞，从而增加HIF-1α核酸分子在该细胞中的表达。

13.提供一个减轻低氧或缺血所导致组织损伤的方法：在机体的低氧或缺血部位给予有效剂量的权利要求1所提供的三突变型HIF-1α核酸分子，该核酸分子由药学上可接受的载体所介导，从而减轻低氧或缺血所导致的组织损伤。

14.权利要求13所述的低氧或缺血所导致组织损伤与心、脑，或周围循环障碍密切相关。

15.提供一种在哺乳动物体内促进血管新生的方法：给予哺乳动物有效剂量权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质，或权利要求5的三突变型HIF-1α核酸分子，或者权利要求7或8的载体的组合物；或/和给予CBP/p300以及CBP/p300的激动剂；或/和给予HDAC以及HDAC的激动剂。

16.权利要求15中的哺乳动物，优选是人。

17.含有权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-1α核酸分子、或者权利要求7或8的载体的组合物，特别是药物组合物，优选还含有可药用助剂，如赋形剂；特别是用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物组合物，该药物组合物优选可以被配置成注射液或冻干粉针。

18.权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-1α核酸分子、或者权利要求7或8的载体在制备用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物中的用途。

19.权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-1α核酸分子、或者权利要求7或8的载体在制备用于促进血管新生或者改善缺血的药物中的用途。

20.权利要求1的三突变型HIF-1α蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-1α核酸分子、或者权利要求7或8的载体在制备用于提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的稳定性或者表达水平、和/或提高HIF-1α蛋白质的转录因子活性的药物中的用途。