CN101307102A - 人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及突变型低氧诱导因子1α，其编码核酸，含有低氧诱导因子1α野生型编码核酸的载体，特别是重组腺病毒载体，以及含有它们的药物组合物。本发明的突变蛋白质、核酸、载体和药物组合物可用于治疗缺血性疾病例如冠心病、外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行等。

Description

人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体及其应用

发明领域

本发明涉及基因治疗领域。更具体地，本发明涉及突变型低氧诱导因子1α，其编码基因，含有低氧诱导因子1α野生型及其突变型基因的载体，特别是重组腺病毒载体，该重组腺病毒载体的构建以及它们作为冠心病、外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行等的治疗剂应用。

背景技术

冠心病是威胁人类健康的重大疾病之一。其治疗措施目前主要有常规的药物治疗、冠脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)及冠脉旁路移植术(coronary artery bypass grafting，CABG)，然而相当一部分患者药物治疗难以见效，也不适于常规血运再通术处理，因此必须寻求其它方法。近年来，随着分子生物学技术的进步，基因治疗促缺血心肌血管新生已成为冠脉血运重建术中具有发展前景的新方向。

促血管生长因子研究较多的有血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)等，然而资料显示VEGF可导致血管渗漏、组织水肿等，FGF治疗则与蛋白尿有关。目前关于VEGF、FGF促血管新生的临床实验已基本停止。人们正在寻找一些新的基因，以期能诱导成熟的血管新生，而又对人体无其他副作用。低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor1，HIF-1)是一种能与DNA结合的蛋白，对多种低氧反应性基因(Hypoxia responsive genes，HRG)的转录都有调控作用，并且对血管新生基因有很强的调控作用。它是由α亚单位和β亚单位组成，其中HIF-1α是专一受O₂调节的亚单位，决定了HIF-1的活性。前期研究表明，应用具有组成型表达活性的HIF-1α基因治疗可诱导生理功能完整的血管新生。在常氧条件下，HIF-1αODD区402、564位的脯氨酸残基羟基化通过泛素酶系统和蛋白水解将HIF-1α降解，半衰期不超过5min。低氧条件下，HIF-1α的泛素化和降解过程受抑制，形成有活性的HIF-1蛋白，以发挥其促血管新生等生物学功能。而决定HIF-1α的转录活性区位于其羧基端(COOH-terminal transactivation domain，CAD)的第803位天冬酰胺，其羟化受阻可导致HIF-1α的强烈转录活性。目前应用HIF-1α研究促血管新生均集中在将其原始基因转染到在体动物，通过缺氧模型来研究，而对应用定点诱变的HIF-1α进行生物学功能研究尚报道不多。因此，我们在业已完成对HIF-1αPro₅₆₄、Pro₄₀₂/Pro₅₆₄、Pro₅₆₄/Asn₈₀₃以及Pro₄₀₂/Pro₅₆₄/Asn₈₀₃定点突变分析的基础上，先后构建了重组腺病毒载体Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564、Ad-HIF-1α_564/803以及Ad-HIF-1α_402/564/803，拟作为冠心病和外周动脉缺血性血管疾病等的治疗剂应用。

Ba rr报道通过导管经冠状动脉内导入含有细菌LacZ基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)10¹⁰pfu/ml，心肌转染率高达32％。导入基因在外周器官表达少，Giordano报道仅有1.3％的腺病毒到达冠脉循环以外。另外，心肌内注射DNA常常导致细胞的炎症反应和心肌纤维化。临床前期研究表明，应用具有组成型表达活性的HIF-1α基因治疗可诱导生理功能完整的血管新生，近年来在缺血性心脏病等涉及治疗性血管新生的疾病研究中，HIF-1α被认为是最具有临床应用前景的基因之一。Shyu KG等在鼠急性梗死心肌部位注射携带HIF-1α/VP16的质粒，发现梗塞范围较之对照组减小，梗死区周边血管密度明显增高。Date T等应用分别携带HIF-1α/VP16和HIF-1α/NF-kappaB的两种腺病毒载体感染新生鼠心肌细胞，之后进行模拟的缺血-再灌注处理，观察到有相关的心脏保护性因子VEGF、Glut-1、Glut-4、HSP70等mRNA表达水平升高，同时有保护培养的心肌细胞免受缺血再灌注损伤的作用。研究表明HIF-1α诱导的新生血管具有不渗漏、无组织水肿、无明显炎症反应等特点。此外，HIF-1α可促进HO-1、EPO等基因的转录，具有血管新生以外的心脏保护作用，包括抑制细胞凋亡、抗纤维化等。在胚胎发育的研究中发现，敲除HIF-1α基因的胚胎发育停滞，血管畸形。Lee等发现，在急性心肌缺血、心肌梗死早期的心肌细胞和内皮细胞的细胞核中，可以检测到HIF-1α及VEGF转录，而正常心肌和陈旧性心肌梗死的心肌中均检测不到。Masakuni等发现心肌梗死模型转基因大鼠心脏持续超表达HIF-1α能在梗死后4周显著增加梗死周围和梗死区的毛细血管密度及内皮生长因子、NO合酶表达。因此，HIF-1α基因治疗在通过诱导多因子表达而增加血管生成和(或)心肌细胞的存活上有其理论意义。

相对开胸手术而言，冠脉内导入基因是无创伤的，并且经过冠脉内导入重组腺病毒载体，检测不出伴随的炎症反应和心肌纤维化。目前，国内外尚无腺病毒介导的HIF-1α₅₆₄单突变体、HIF-1α_564/402双突变体、HIF-1α_564/803双突变体以及HIF-1α_402/564/803三突变体基因治疗上述疾病的报道，通过心导管经冠脉内导入重组腺病毒载体介导的基因治疗，可能是一种安全有效的方法，具有重大的临床应用价值。

发明内容

一方面，本发明提供突变型HI F-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)，其中与野生型HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比，所述突变型HIF-1α蛋白质第402位、第564位和第803位中一个、两个或者三个位点的氨基酸发生了突变。所述突变包括：第402位、第564位、或第803位发生单突变，第402位和第564位、第402位和第803位、或第564位和第803位发生双突变，以及第402位、第564位和第803位发生三突变。所述突变可以是缺失或替代，优选是替代。

在优选实施方案中，本发明的突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者该突变型HIF-1α蛋白质的转录因子活性与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者二者均提高。

在优选实施方案中，本发明的突变型HIF-1α蛋白质在第402位和/或第564位发生突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了。

在另一个优选实施方案中，本发明的突变型HIF-1α蛋白质在第803位发生突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质的转录因子活性与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了。

本发明所述野生型HIF-1α蛋白质是相对的。对于第402位突变而言，野生型HIF-1α蛋白质是第402位为脯氨酸(Pro)残基的HIF-1α蛋白质。对于第564位突变而言，野生型HIF-1α蛋白质是第564位是脯氨酸(Pro)残基的HIF-1α蛋白质。对于第803位突变而言，野生型HIF-1α蛋白质是第803位是天冬酰胺(Asn)残基的HIF-1α蛋白质。

在一个实施方案中，野生型HIF-1α蛋白质是人HIF-1α蛋白质，例如是第402位是脯氨酸(Pro)残基、第564位是脯氨酸(Pro)残基、第803位是天冬酰胺(Asn)残基的人HIF-1α蛋白质，例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质。

野生型HIF-1α蛋白质可以是天然存在的HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)，也可以是与天然存在的HIF-1α蛋白质相比有1个或者多个(例如1-10个、1-5个、1-3个、1-2个、1个)氨基酸的插入、替代和/或缺失，并具有HIF-1α生物活性的蛋白质。

本发明的突变型HIF-1α蛋白质包括除第402位、第564位和第803位之外与天然存在的HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比有1个或者多个(例如1-10个、1-5个、1-3个、1-2个、1个)氨基酸的插入、替代和/或缺失，并具有HIF-1α生物活性的蛋白质。优选是人HIF-1α蛋白质。

HIF-1α的生物活性是本领域已知的，包括例如转录因子活性。

在本发明突变型HIF-1α蛋白质的一个实施方案中，所述第402位的突变是脯氨酸(Pro)残基替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)。在另一个实施方案中，所述第564位的突变是脯氨酸(Pro)残基替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)。在另一个实施方案中，所述第803位的突变是天冬酰胺(Asn)残基替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)。在优选实施方案中，第402位、第564位、和/或第803位的突变(替代)能够阻止第402位、第564位、和/或第803位的羟化。

在一个优选实施方案中，本发明的突变型HIF-1α蛋白质是564位点单突变体、564位点和402位点双突变体、564位点和803位点双突变体或者402位点、564位点和803位点三突变体。

在一个优选实施方案中，本发明的突变型HIF-1α蛋白质是SEQID NO：2、3、4或5所编码的蛋白质。

在另一方面，本发明提供编码本发明的突变型HIF-1α蛋白质的核酸分子。

本发明还提供能够与SEQ ID NO：1-5之一在中等严紧条件(优选高严紧条件)下杂交、并编码突变型HIF-1α蛋白质的核酸分子。

在其它实施方案中，本发明指向在至少中等严紧条件下与本文提供的核酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的核酸。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。

典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5℃(低于探针Tm 5℃)；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在探针Tm以下约10-20℃；“低严紧性”发生在Tm以下约20-25℃。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6×SSC＝极低严紧性；3×SSC＝低至中等严紧性；1×SSC＝中等严紧性；0.5×SSC＝高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80％或更多序列同一性的核酸序列。

对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如，选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，实验室手册，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧性在内的杂交条件。

为便于说明，用于检测本发明的核酸分子与其它核酸分子杂交的合适的中度严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。

在优选实施方案中，本发明的核酸分子与野生型HIF-1α蛋白质编码核酸分子相比能够更稳定、更高水平表达HIF-1α蛋白质，该HIF-1α蛋白质优选与野生型HIF-1α蛋白质相比具有提高的转录因子活性。

在优选实施方案中，本发明的核酸分子是SEQ ID NO：2-4之一。

在另一方面，本发明提供包含本发明的核酸分子的载体，优选是病毒载体，更优选是腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。本发明还提供包含野生型HIF-1α编码核酸的腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。

在一个实施方案中，本发明的载体是能够表达本发明的核酸分子的表达载体；优选地，该表达载体与含有野生型HIF-1α蛋白质编码核酸分子的相同载体相比，能够更稳定、更高水平表达HIF-1α蛋白质；该HIF-1α蛋白质优选与野生型HIF-1α蛋白质相比具有提高的转录因子活性。

在另一方面，本发明提供含有本发明核酸分子或者本发明载体的宿主细胞。宿主细胞可以是动物细胞、植物细胞、微生物细胞包括真菌、细菌细胞。

在另一方面，本发明提供含有本发明突变型HIF-1α蛋白质、本发明核酸分子、或者本发明载体的组合物。本发明组合物优选是药物组合物，优选还含有可药用助剂，如赋形剂。更优选的，所述组合物是用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物组合物，该药物组合物优选可以被配置成注射液或冻干粉针。或者，所述组合物可以是促进血管新生或者改善缺血的药物组合物。所述组合物可以是用于提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平、和/或提高HIF-1α蛋白质的转录因子活性的组合物。

在另一方面，本发明提供本发明突变型HIF-1α蛋白质、本发明核酸分子、或者本发明载体在制备用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供本发明突变型HIF-1α蛋白质、本发明核酸分子、或者本发明载体在制备用于促进血管新生或者改善缺血的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供本发明突变型HIF-1α蛋白质、本发明核酸分子、或者本发明载体在制备用于提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平、和/或提高HIF-1α蛋白质的转录因子活性的药物中的用途。

在另一方面，本发明提供提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平、和/或提高HI F-1α蛋白质的转录因子活性的体外方法，包括将HIF-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)进行突变，其中与野生型HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比，所述突变型HIF-1α蛋白质第402位、第564位和第803位中一个、两个或者三个位点的氨基酸发生了突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者该突变型HIF-1α蛋白质的转录因子活性与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者二者均提高。

在另一方面，本发明提供提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平的体外方法，包括将HIF-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)进行突变，其中与野生型HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比，所述突变型HIF-1α蛋白质第402位和第564位中一个或者两个的氨基酸发生了突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了。

在另一方面，本发明提供提高HIF-1α蛋白质的转录因子活性的体外方法，包括将HIF-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)进行突变，其中与野生型HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比，所述突变型HIF-1α蛋白质第803位的氨基酸发生了突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质的转录因子活性与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了。

在本发明中，氨基酸残基编号以参考氨基酸序列SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列为基准，某氨基酸序列中氨基酸残基的编号是指在将该氨基酸序列和参考氨基酸序列SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列进行最佳比对后，与参考氨基酸序列该氨基酸残基编号对应的氨基酸残基位置。例如某氨基酸序列第402位是指将该氨基酸序列和参考氨基酸序列SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列进行最佳比对后，与参考氨基酸序列第402位氨基酸残基对应的氨基酸残基位置。参考氨基酸序列SEQ ID NO：1编码的氨基酸序列编号见序列表。

为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman的局部同一性算法((1982)Add.APL.Math 2：482)；Needleman和Wunsch的同一性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)；Pearson和Lipman的相似性搜索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575ScienceDr.，Madison，WI)；或目测。

适合于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述或者默认参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和肽的序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

因此，本发明包括与本文所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少50％序列同一性、优选至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列同一性的那些序列。

本发明构建了表达人HIF-1α基因的重组腺病毒载体，为采用HIF-1α基因治疗冠心病(CAD)、外周血管疾病(PAD)以及间歇性跛行(IC)奠定了基础。

低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是细胞对低氧/缺氧作出适应性反应的关键性转录因子，在缺氧条件下可稳定表达，它可通过对VEGF等60多种靶基因的转录调控而促进这些基因表达，参与了血管新生、红细胞生成、糖代谢等病理生理过程。HIF-1α是HIF-1的调节亚基和活性亚基，受低氧诱导，决定HIF-1的活性。HIF-1α蛋白稳定性调节是HIF-1α表达及活性调节的主要机制之一^[19]，主要与常氧状态下HIF-1αODD区Pro₅₆₄和Pro₄₀₂发生羟基化有关，将这两个位点分别突变后的单突变型HIF-1α在常氧状态下都可以得到表达，不过双突变型HIF-1α则近乎是一种组成型表达。另外Asn₈₀₃的突变可增强HIF-1α的转录活性，促进其靶基因的转录。

基因治疗关键的环节之一就是如何有效地将外源基因导入靶细胞内并使其稳定表达。腺病毒载体被认为是高效表达的基因转移载体，在心血管疾病的治疗中具有其优越性：①Ad基因组结构和功能已有较广泛深入的研究，为研制基因载体提供了坚实的基础；②容量大，所携带的基因片段可超过7.5kb，潜在负荷容量可达30kb；③可获取的滴度高(可达10¹⁰-10¹²pfu/ml)；④感染效率高，腺病毒载体在体外对动物血管内皮细胞和VSMC的感染效率可达100％，体内转染效率可达15～30％，为相同滴度逆转录病毒的100～1000倍；⑤适应范围广，对增殖和非增殖细胞均可转染，心肌细胞、VSMC及血管内皮细胞都是高度分化细胞，生理条件下在体内增殖不活跃，所以腺病毒载体适于心血管系统的基因转移；⑥遗传毒性较低，潜在危险性小，因为Ad感染和复制过程无需整合入宿主细胞基因组，由Ad介导的外源基因以附加型方式存在，避免了发生插入性突变的危险；⑦不受给药途径的限制。因此，腺病毒载体在心血管疾病基因治疗领域具有极大的应用前景，而成为目前基因治疗最主要的载体。

本发明构建的重组腺病毒Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_564/402、Ad-HIF-1α_564/803以及Ad-HIF-1α_402/564/803是E1区缺失的复制缺陷型腺病毒，E1区基因是腺病毒复制所必需的基因，该区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有明显的调控作用，E1区的功能由辅助细胞反式提供，最常用的辅助细胞是293细胞，是由人胚胎肾细胞经Ad5DNA片断转染后发生转化而形成的，其基因组中整合了含有腺病毒E1区的片段，可持续表达E1区蛋白，用于增殖E1区缺失的腺病毒载体。因此这就决定了复制缺陷型腺病毒在靶细胞中只有一次感染机会而无复制能力，从而完成腺病毒载体的功能，避免腺病毒本身对靶细胞的损害，达到基因转移的目的。我们构建的重组腺病毒Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_564/402、Ad-HIF-1α_564/803以及Ad-HIF-1α_402/564/803能在靶细胞中高表达HIF-1α，且突变体基因表达量较野生型高，能促进下游基因，如VEGF表达上调。

本发明还涉及如下方面：

本发明还涉及一种用于缺血性疾病(冠心病、外周血管疾病以及间歇性跛行)基因治疗的重组腺病毒载体，其特征是它含有人HIF-1α野生型及突变型基因。

在一个实施方案中，人HIF-1α基因包括野生型HIF-1α基因、564位点单突变体HIF-1α基因、564位点和402位点双突变体HIF-1α基因、564位点和803位点双突变体HIF-1α基因以及402位点、564位点和803位点三突变体HIF-1α基因。

在一个实施方案中，野生型HIF-1α基因、564位点单突变体HIF-1α基因、564位点和402位点双突变体HIF-1α基因、564位点和803位点双突变体HIF-1α基因以及402位点、564位点和803位点三突变体HIF-1α基因连接于腺病毒穿梭质粒的CMV启动子之下。

在一个实施方案中，重组腺病毒载体能够强效稳定表达HIF-1α基因。

在一个实施方案中，野生型HIF-1α基因序列基因序列全长为3958bp，其表达的HIF-1α蛋白是由826个氨基酸残基组成[见SEQ IDNO：1]。

在一个实施方案中，564位点单突变体HIF-1α基因序列全长为3958bp，其表达的HIF-1α蛋白是由826个氨基酸残基组成，且第564位上的氨基酸残基由脯氨酸残基(Pro)突变为其他任何氨基酸残基。

在一个实施方案中，564位点和402位点双突变体HIF-1α基因序列全长为3958bp，其表达的HIF-1α蛋白是由826个氨基酸残基组成，且第402位以及第564位上的氨基酸残基均由脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基。

在一个实施方案中，564位点和803位点双突变体HIF-1α基因序列全长为3958bp，其表达的HIF-1α蛋白是由826个氨基酸残基组成，且第564位上的氨基酸残基均由脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基，同时第803位上的氨基酸残基均由天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基。

在一个实施方案中，402位点、564位点和803位点三突变体HIF-1α基因序列全长为3958bp，其表达的HIF-1α蛋白是由826个氨基酸残基组成，且第402位、第564位上的氨基酸残基均由脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基，同时第803位上的氨基酸残基均由天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基。

在一个实施方案中，564单突变体HIF-1α基因重组腺病毒载体表达的HIF-1α蛋白第564位点上的氨基酸残基为丙氨酸(Ala)[见SEQID NO：2]。

在一个实施方案中，402和564双突变体HIF-1α基因腺病毒载体表达的HIF-1α蛋白第402位点和第564位点上的氨基酸残基均为丙氨酸(Ala)[见SEQ ID NO：3]。

在一个实施方案中，564和803双突变体HIF-1α基因腺病毒载体表达的HIF-1α蛋白第564位点和第803位点上的氨基酸残基均为丙氨酸(Ala)[见SEQ ID NO：4]。

在一个实施方案中，402、564和803三突变体HIF-1α基因腺病毒载体表达的HIF-1α蛋白第402位点、第564位点以及第803位点上的氨基酸残基均为丙氨酸(Ala)[见SEQ ID NO：5]。

在一个实施方案中，重组腺病毒载体是5型腺病毒载体。

本发明还涉及野生型HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法，包括：先构建表达质粒pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α_nature，后通过Kpn I、XbaI双酶切获得包括起始密码子在内的HIF-1α_nature cDNA片段，通过pcDNA3.1(+)分别克隆至穿梭质粒pShuttle2的人巨细胞病毒启动子(hCMV)和SV40多聚腺苷酸尾(po lyA)之间的多克隆位点间，以PI-SceI和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒，获得含有HIF-1α_nature cDNA的表达盒，通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接，重组成pAdeno-HIF-1α_nature腺病毒质粒，再分别经Pac I酶切线性化并暴露其两端的反向重复序列(ITRs)，纯化后以Lipofectamine 2000转染低代数HEK293细胞，包装出带有目的基因表达盒的重组腺病毒Ad-HIF-1α_nature。

本发明还涉及564单突变体HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法，包括：先通过用定点突变的方法将无突变型表达质粒pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α_nature的第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC，构建成564单突变型HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α-Ala₅₆₄，后续构建方法同前面所讲述野生型HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法构建出Ad-HIF-1α₅₆₄。

本发明还涉及564和402双突变体HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法，包括：在pShuttle2-HIF-1α-Ala564的基础上，用连续聚合酶链式反应(PCR)定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA，构建成564和402双突变体HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄，以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒，获得含有564和402双突变型HIF-1αcDNA的表达盒，通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接，重组成pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄腺病毒质粒，经酶切及测序鉴定正确后，在HEK293细胞中包装成为重组腺病毒Ad-HIF-1α_402/564。

本发明还涉及564和803双突变体HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法，包括：在pcDNA 3.1V5-HisA-HIF-1α-Ala₅₆₄的基础上，继续用前面所述的点突变方法将pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α-Ala₅₆₄的803位天冬酰胺(Asn)密码子AAT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT，构建成564和803双突变体HIF-1α基因真核表达载体pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，后续构建方法同前面所讲述野生型HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法构建出Ad-HIF-1α_564/803。

本发明还涉及402、564和803三突变体HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法，包括：在pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄和pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的基础上，先以BspT104I、Age I双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄获得大小为380bp含有突变点Ala402的目的片断，再以同样的方法以Age I和Bs pT104I双酶切pShuttle2-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，胶回收线性化pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃片段，进一步连接重组为pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，后续构建方法同前面所讲述野生型HIF-1α基因腺病毒载体的构建方法构建出Ad-HIF-1α_402/564/803。

本发明还涉及重组腺病毒载体作为治疗冠心病的治疗剂的应用。

本发明还涉及重组腺病毒载体作为治疗外周动脉缺血性血管疾病的治疗剂的应用。

本发明还涉及重组腺病毒载体作为治疗间歇性跛行的治疗剂的应用。

本发明的重组腺病毒载体均可以被配置成注射液或冻干粉针。

附图说明

为了让上述发明的特征、优势、目的以及其他方面的阐述更加的明晰，上述发明简述包含的详细内容有可能在附图/表中得到有关说明。这些附图/表成为发明详细内容的一部分。需要值得注意的是，这些附图/表仅是对本发明内容的进一步解释说明，因此对本发明的范围不构成任何限制。

图1、pcDNA3.1/V5-HisA结构示意图及其多克隆位点。

图2、pcDNA 3.1(+)结构示意图及其多克隆位点。

图3、穿梭质粒pShuttle2结构示意图及其多克隆位点。

图4、腺病毒骨架质粒pAdeno-X Viral DNA结构示意图及其酶切位点。

图5、腺病毒表达系统Adeno-X Adenoviral Expression System1构建流程图。

图6、pcDNA 3.1/V5-HisA-HIF-1α_nature酶切图。1：

pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α经Xba I单酶切；2：

pcDNA3.1/V5-Hi sA-HIF-1α经Kpn I、Xba I双酶切；M：DL15000Marker。

图7、pcDNA3.1(+)酶切图。M：DL15000Marker；1：pcDNA 3.1(+)；2：pcDNA 3.1(+)Kpn I、XbaI双酶切。

图8、pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature及pShuttle2酶切。M：DL15000Marker；1：pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_nature；2：pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature经Apa I、Nhe I双酶切；3：pShuttle2经Apa I、Nhe I双酶切。

图9、线性化pShuttle2及HIF-1α_nature cDNA胶回收。1：线性化pShuttle2；2：DL15000Marker；3：HIF-1α_nature cDNA。

图10、重组穿梭质粒电泳。M：DL15000Marker；1：pShuttle2；2：pShuttle2-LacZ；3：pShuttle2-HIF-1α_nature；4：pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄。

图11、重组穿梭质粒酶切鉴定。M：DL15000Ma rker；1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄经Apa I、Nhe I双酶切；2：pShuttle2-HIF-1α_nature经Apa I、Nhe I双酶切；3：pShuttle2-HIF-1α_nature经Apa I单酶切。

图12、重组穿梭质粒PCR鉴定。1：DL2000Ma rker；2-3：pShuttle2-HIF-1α_naturePCR产物(引物1、2)；4-5：pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄PCR产物(引物1、2)；6-7：pShuttle2-HIF-1α_naturePCR产物(引物3、4)；8-9：pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄PCR产物(引物3、4)。

图13、pShuttle2-HIF-1α_nature经PI-Sce I、I-Ceu I双酶切。M：DL15000 Marker；1-2：pShuttle2-HIF-1α_nature经PI-Sce I、I-Ceu I双酶切。

图14、pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄经PI-Sce I、I-Ceu I双酶切。M：DL15000 Marker；1-2：pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄经PI-SceI、I-Ceu I双酶切。

图15、pShuttle2-LacZ以PI-Sce I、I-CeuI双酶切。M：DL15000Marker；1-2：pShuttle2-LacZ经PI-Sce I、I-Ceu I双酶切。

图16、重组pAdeno-HIF-1αXho I酶切鉴定。M：λ-Hind IIIdigest；1：pAdeno-HIF-1α_nature、2：pAdeno-HIF-1α_natureXho I酶切。

图17、重组腺病毒质粒PCR鉴定。M1：DL2000 Marker；1：pAdeno-HIF-1α_naturePCR产物(引物1、2)；2：pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄PCR产物(引物1、2)；3：pAdeno-HIF-1α_naturePCR产物(引物3、4)；4：pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄PCR产物(引物3、4)；5：pAdeno-HIF-1α_naturePCR产物(引物A、B)；6：pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄PCR产物(引物A、B)；7：pAdeno-LacZ PCR产物(引物A、B)；M2：φχ174-HaeIII digest。

图18、重组腺病毒质粒Pac I酶切。M：λ-Hind III digest；1：pAdeno-HIF-1α_nature；2：pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄。

图19、重组腺病毒PCR鉴定。M1：DL2000Marker；1：Ad-HIF-1α_naturePCR产物；2：Ad-HIF-1α-Ala₅₆₄PCR产物；M2：φχ174-HaeIII digest。

图20、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄酶切鉴定。1：pShuttle2 HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄经BspT104I单酶切；2：pShuttle2HIF-1α-Ala402-Ala564经BspT104I、Age I双酶切；3：DL2000Marker；4：DL15000Marker。

图21、重组pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR鉴定。1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR产物(引物1、2)；2：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR产物(引物3、4)；3：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR产物(引物1、4)；4：DL2000Marker。

图22、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄测序结果

图23、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄酶切鉴定。1：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄；2：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄经Xho I单酶切；3：Markerλ-Hind III。

图24、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR鉴定。1：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR产物(引物A、B)；2：Marker DL2000。

图25、pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经PI-SceI、I-Ceu I双酶切。1：Ma rker：DL 15000；1-2：PI-Sce I、I-Ceu I双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃。

图26、pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃质粒PCR鉴定。M：Marker；1：引物3、4扩增片段；2、4：引物5、6扩增片段；3：引物A、B扩增片段。

图27、pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃引物3、4PCR产物

图28、pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃引物5、6PCR产物

图29、重组腺病毒质粒Pac I酶切。M：λ-Hind III digest；1：PacI酶切pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃。

图30、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104I酶切鉴定。1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104 I单酶切；2-3：pShuttle2 HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104I、AgeI双酶切；4：DL2000Marker；5：DL15000Marker。

图31、重组pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR鉴定。

M：Marker I；

1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物1、2，380bp)；

2：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物3、4，460bp)；

3：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物5、6，214bp)。

图32、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃测序结果。

图33、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃酶切鉴定。

1：Markerλ-Hind III；

2：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经Xho I酶切；

3：pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃；

图34、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR鉴定。

M：Marker I；

1：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物A、B，287bp)；

2：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物1、2，380bp)；

3：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物3、4，460bp)；

4：pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR产物(引物5、6，214bp)；

图35、pShuttle2-LacZ经PI-Sce I、I-Ceu I双酶切。M：MarkerDL15000；1-2：pShuttle2-LacZ经PI-Sce I、I-Ceu I.双酶切。

图36、Ad-lacZ转染HEK293细胞，X-gal染色[MOI＝100pfu/cell](×100)

图37、Ad-LacZ感染率的测定。A：10pfu/cell B：20pfu/cellC：50pfu/cell D：100pfu/cekk

表1、HIF-1α基因的萤光素活性。表1A萤光素对照质粒与腺病毒基因，表1B萤光素promoter质粒与腺病毒基因。

表2、pGL3-control与HIF-1α共转染结果方差分析。

表3、pGL3-promoter-HRE与HIF-1α共转染结果方差分析。

表4、MTT数值的析因设计方差分析结果。

图38、不同基因感染后的RNA。

图39、HIF-1α的RNA表达水平。M：Marker DL2000；1：Ad-LacZ；2：Ad-HIF-1α_nature；3：Ad-HIF-1α₅₆₄；4：AdHIF-1α_564/803。

图40、VEGF的RNA表达水平。M：Marker DL2000；1：Ad-LacZ；2：Ad-HIF-1α_nature；

3：Ad-HIF-1α₅₆₄；Lane4：Ad-HIF-1α_564/803。

图41、HIF-1α及其突变体Western blot结果。图中可见LacZ组HIF-1α蛋白基本不表达，其余各组均有表达。1：Ad-LacZ；2：Ad-HIF-1α_nature；3：Ad-HIF-1α₅₆₄；4：AdHIF-1α_564/803。

图42、基因转染后第28天DSA血管造影结果。图42A：生理盐水组；图42B：Ad-LacZ组；图42C：Ad-HIF-1α_nature组；图42D：Ad-HIF-1α₅₆₄组；图42E：Ad-HIF-1α_402/564组；图42F：Ad-HIF-1α_564/803组。

图43、基因转染后第28天DSA血管铸型结果。图43A：生理盐水组；图43B：Ad-LacZ组；图43C：Ad-HIF-1α_nature组；图43D：Ad-HIF-1α₅₆₄组；图43E：Ad-HIF-1α_402/564组；图43F：Ad-HIF-1α_564/803组。

具体实施例

实施例1低氧诱导因子1α野生型及其突变型重组腺病毒载体的构建

1.1材料与方法

1.1.1仪器设备

2500E型CO₂培养箱                      美国NuAire公司

超净工作台                            苏州科学仪器公司

CK40-F200倒置相差显微镜               日本OLYMPUS公司

细胞培养板                            美国Corning公司

UNIVERSAL 32R/16R型低温离心机         德国Hettich公司

超高速离心机                          美国BECKMEN公司

远红外不锈钢烤箱                      苏州科学仪器公司

FR-800PCR仪                           美国BioMetra公司

稳压稳流电泳仪                        美国Bio-Rad公司

GeneGenius凝胶成像分析系统            基因公司

Smartspcet^TM3000核酸/蛋白定量         美国BIO-RAD公司

仪

AE200型精密电子天平                   瑞士METLER公司

压力蒸汽灭菌器                        上海医用电子仪器厂

ML-902型定时恒温磁力搅拌器            上海浦江分析仪器厂

CB700型恒温摇床                       美国RKC

DK-8D型电热恒温水浴槽                 上海一恒科技有限公司

制冰机                                美国Scotsman公司

液氮罐                                四川亚西机械厂

-80℃低温冰箱                         美国Harris公司

1.1.2主要试剂

(1)、主要载体

腺病毒表达系统Adeno-X Adenoviral Expression System1(BD.Clontech公司，Cat.No.631524)，包括有穿梭质粒pShuttle2、对照穿梭质粒pShuttle2-lacZ、线性化腺病毒骨架质粒Adeno-XViral DNA；

(2)、酶

限制性内切酶Xba I、Kpn I、Apa I、Nhe I、Xho I(Takara公司)；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)TaqDNA聚合酶(Takara公司)；

限制性内切酶PI-Sce I、I-Ceu I、PacI及T₄DNA连接酶(NEB公司)。

(3)、细胞与感受态

大肠杆菌DH5α(北京鼎国公司)；HEK293A细胞(Invitrogen公司)

(4)、质粒、基因组提取和胶回收试剂盒

超纯质粒提取试剂盒(Qiagen公司)；凝胶回收试剂盒(Omega公司)；病毒基因组DNA提取试剂盒(北京天为时代公司)。

(5)、细胞培养试剂

胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM和Hepes干粉(Gibco公司)；0.05％胰酶+0.02％EDTA消化液。

(6)、转染与诱导试剂

Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；IPTG、X-Gal(Takara公司)；OPTI-MEM(Invitrogen公司)。

(7)其它常用基本试剂均购自国内厂家。

1.1.3常用液体配制

(1)、DMEM培养基配制

取1袋DMEM干粉溶于900ml灭菌三蒸水，加入Hepes干粉2.7g，常温下磁力搅拌3-4h，然后加入溶解好的碳酸氢钠2.0g，将三蒸水至终体积1000ml，混匀，CO₂充气平衡，过滤除菌，分装成100-250ml，抽样做无菌试验，4℃保存。

(2)、琼脂糖凝胶的配制

适量琼脂糖(Serva公司)和0.5×TBE或1×TAE，加入小烧瓶内，置微波炉加热，至琼脂糖完全溶解，取出冷却至约50～60℃左右，按终浓度0.5μg/ml加入溴化乙锭，轻轻混匀后倒入预先用胶带封好的电泳槽，插入电泳梳，室温下30～45min左右，使凝胶完全凝固，小心拔出梳子，撕去胶带，将凝胶安放进加有电泳缓冲液的电泳槽中。琼脂糖凝胶的浓度根据目的DNA的分子量大小不同而不同，DNA分子量越大，凝胶浓度越低，常用浓度范围为0.5～1.5％。

(3)、细菌培养基配制

LB液体培养基配制：在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠10g，摇动容器至完全溶解，用10mol/L NaOH(约0.2ml)调节pH值至7.0，再加入去离子水至总体积为1L，分装成100-250ml盐水瓶后高压灭菌，4℃保存。

LB固体培养基配制：在LB液体培养基基础上再加入终浓度1.5％的琼脂粉，高压灭菌，稍冷却至60℃左右，在每个10cm的细菌培养皿中倒入约20ml培养基，室温冷却至凝固，保鲜膜密封4℃保存，储存期限1个月。

LB选择性(抗性)固体培养基配制：将高压灭菌后的固体培养基置室温冷却至约50℃左右，加入相应的抗生素，余同上。抗生素的终浓度是氨苄青霉素50-100μg/ml、卡那霉素50μg/ml，保鲜膜密封4℃保存，储存期限1个月。

(4)、常用储存溶液

10×Tris-乙酸(TAE)：Tris碱68.4g，冰乙酸11.4ml，20ml0.5mol/L EDTA，10mol/L NaOH调pH至8.0。

5×Tris-硼酸(TBE)：Tris碱54g，硼酸27.5g，20ml 0.5mol/L EDTA，10mol/L NaOH调pH至8.0。配制好的缓冲液常温保存，使用时均稀释10倍，TAE工作液为1×，TBE工作液为0.5×。

X-gal溶液(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)：溶解200mg的X-gal于10ml的二甲基甲酰胺(DMF)，配制成20mg/ml，分装，用铝箔包裹装液管，避光储存于-20℃。

IPGT溶液(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)：在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，配成200mg/ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml/小份储存于-20℃。

CaCl₂溶液：称取0.56g CaCl₂(无水，分析纯)，溶于50ml三蒸水中，定容至100ml，0.1mo l/L高压灭菌，4℃保存。

(5)、β-gal染色试剂配制

固定液：85ml三蒸水、10ml 10×PBS、5ml 37％甲醛溶液、0.2ml25％戊二醛溶液，储于常温。

染液：70ml三蒸水、10ml 10×PBS、10ml 50mM亚铁氰化钾、10ml50mM铁氰化钾、0.2ml 1M氯化镁，4℃冰箱储存。

底物/染液：20ml染液、1ml 20mg/ml X-gal，染液含有1mg/mlX-gal，即配即用。

(6)引物

(1)HIF-1αcDNA突变区片段引物(由博亚公司设计并合成)

①突变1区(Pro402)片段引物

上游引物(Primer 1)：5′-AGCACGACTTGATTTTCTCCC-3′

下游引物(Primer 2)：5′-TTCTTGATTGAGTGCAGGGT-3′

PCR产物片段长380bp

②突变2区(Pro564)片段引物

上游引物(Primer 3)：5′-GACACAGAAGCAAAGAACCC-3′

下游引物(Primer 4)：5′-TCAAAGCGACAGATAACACG-3′

PCR产物片段长460bp

③突变3区(Asn803)片段引物

上游引物(Primer 5)：5′-CCAGACGATCATGCAGCTAC-3′

下游引物(Primer 6)：5′-GGTTTCTGCTGCCTTGTATAG-3′

PCR产物片段长214bp

(2)BD.Clontech所提供引物(两个引物分别与穿梭质粒表达盒及骨架质粒的部分序列结合)

上游引物(Primer A)：5′-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3′

下游引物(Primer B)：5′-AGATCTGAGCTTTCGCTACC-3′

PCR产物片段长287bp

备注：上述所有引物均按照说明书配制成终浓度10pmol/μl。

1.2实验方法

1.2.1、感受态大肠杆菌DH5α的制备

(1)、复苏冻存的DH5α，从LB平板上挑取单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12h左右，至对数生长后期(OD₆₀₀＝0.6左右)。

(2)、将该菌悬液以1∶100～1∶50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3h至OD600＝0.4左右。

(3)、将培养液转入离心管中，冰上放置约10min，然后于4℃下4000r pm离心5min。

(4)、弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻重悬细菌，冰上放置15-30min后，4℃下4000rpm离心5min。

(5)、弃去上清，加入4ml预冷含15％甘油的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细菌，用EP管分装成200μl/份，置4℃12～24h，即成感受态菌，可直接用于转化(可不加甘油)，或置-70℃冻存。

1.2.2、野生型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、获取HIF-1α_nature cDNA片段

①以Kpn I、Xba I双酶切pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α_nature(由本实验室根据HIF-1α基因序列设计相关引物采用PCR方法扩增而来，经DNA序列分析鉴定后，与pcDNA3.1/V5-HisA-重组而成。)，酶切反应体系如下：

质粒pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1αnature    约1μg

Kpn I                                 1μl

Xba I                                 1μl

10×M酶切缓冲液                       2μl

                                             

加灭菌去离子水至总体积为    20μl

②37℃恒温水浴3h

③加2μl电泳加样缓冲液终止反应

④将反应产物全部进行琼脂糖凝胶(1％)电泳

⑤准备胶回收用具，紫外灯下观察，切取含约2500bp大小核酸条带

(即HIF-1α_nature cDNA片段)的尽量少的凝胶，用滤纸吸干多余的水分后装入EP管称量。

⑥以Omega凝胶回收试剂盒回收HIF-1αnature cDNA片段

a.根据称量结果加入等体积的Binding Buffer(1ml/g)

b.60℃水浴7min或至胶完全融化

c.移入置于2ml收集管上的HindBind柱子内，10000rpm离心1min。

d.弃虑液，加300μl Binding buffer入柱子内，10000rpm离心1min。

e.弃虑液，加入700μl SPW Buffer(已加无水乙醇)，静置2-3min，10000rpm离心1min。

f.弃虑液，再次离心10000rpm离心1min。

g.柱子置于另一干净1.5ml EP管上，加入30μ1DNA洗脱液，静置1min，10000r pm离心1min，弃柱子，取2μl进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，观察回收HIF-1α_nature cDNA片段情况，余置-20℃保存。2、同以上方法以Kpn I、Xba I双酶切pcDNA3.1(+)，胶回收线性化pcDNA3.1(+)的大片段，约5400bp大小，回收后取适量进行琼脂糖凝胶(1％)电泳。

3、连接重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_natrue

①、10μl反应体系中，按线性化载体：外源DNA≈1∶3～5(摩尔数比)估计比例将相应量的线性化pcDNA3.1(+)及HIF-1α_naturecDNA片段，加入灭菌的0.5ml离心管中。

②、加入10×DNA连接缓冲液1μl、T4DNA连接酶0.5μl，用去离子水补足至总体积为10μl。

③、轻轻混匀，稍加离心，16℃连接12h左右。

4、连接产物转化感受态DH5α

①、取200μl贮存于-70℃感受态DH5α，冰浴融化。

②、加入上述连接产物10μl，轻轻混匀，冰浴20-30min。

③、于42℃水浴中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min。

④、加入LB液体培养基200μl，于37℃缓慢振摇培养45min(约100转/min)。

⑤、将培养物适量涂于氨苄青霉素抗性琼脂LB平板(约50～100μl/平板)，待平板表面没有液体流动时，37℃孵箱倒置培养12-16h。

5、重组子筛选及质粒提取

①无菌接种环挑取平板上生长的中等大小的单菌落约3～5个，分别接种于约5ml左右的氨苄抗性LB液体培养基，37℃振摇培养(约200转/分)至对数生长期(14～16h)。

②各取菌液10μl行菌液PCR鉴定，余则暂置于4℃保存。

③引物为HIF-1α突变1区片段引物，PCR反应体系及程序如下。

PCR反应体系：

菌液                         10μl

引物1(1OD/500μl)            2μl

引物2(1OD/500μl)            2μl

dNTP                         4μl

TaqDNA聚合酶                 0.25μl

10×PCR缓冲液                5μl

                                         

加灭菌去离子水至总体积为     50μl

PCR反应程序：94℃2mi n→94℃30s→52℃30s→72℃1min→72℃5min，其中扩增30个循环

④将PCR反应产物各取5μl进行琼脂糖凝胶(1.5～2％)电泳⑤紫外灯下观察电泳结果，取PCR鉴定正确的菌液1ml接种于100～200ml左右的氨苄抗性LB液体培养基，37℃振摇培养至对数生长后期。

⑥用Omega质粒提取试剂盒提取重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature质粒

a.取10-15ml饱和菌液加入离心管，5000rpm离心10min。

b.弃上清，加Solution I(已加入RNA酶)500μl充分重悬细菌。

c.转至2ml EP管内，加入Solution II 500μl，轻轻翻转EP管4-6次，使细菌充分裂解，时间不超过5min。

d.加入700μl Solution III，轻轻翻转EP管4-6次，使充分混合，此时会出现絮状沉淀物。

e.10000rpm离心10min

f.小心将上清转入置于2ml EP管上的HiBind miniprep柱子内，10000rpm离心1min。

g.弃虑液，于柱子内加入500μl Buffer HB，10000rpm离心1min。

h.弃虑液，加入750μl Wash Buffer(已加无水乙醇)，10000rpm离心1min。此步可重复一次。

i.弃虑液，10000rpm离心1min

j.将柱子置于1.5ml EP管，加50-100μl TE，静置1min，10000rpm离心1min。

6、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature质粒酶切鉴定

以Kpn I、XbaI对所提重组质粒作单、双酶切鉴定(酶切方法同前)

7、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α_nature

(1)、以Nhe I、ApαI双酶切pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature，因无通用酶切缓冲液故作先后单酶切。

①、先以Apa I单酶切pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature，酶切反应体系如下，酶切3h。

质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature      约1μg

Apa I                              1μl

10×L酶切缓冲液                    2μl

                                              

加灭菌去离子水至总体积为           20μl

②、乙醇沉淀法沉淀酶切产物

a.在酶切产物中加入TE 80μl，再加入无水乙醇200μl、3M醋酸钠10μl、糖原1μl。

b.充分摇动混匀，4℃下14000rpm离心5min。

c.小心弃去上清，此时可见有少量白色沉淀物。

d.小心加入300μl 75％乙醇，室温下14000rpm离心2min。

e.小心吸弃上清，室温约10min自然风干(可置超净台内)，避免过度干燥。

f.以15μl TE重新溶解DNA，即已线性化的pcDNA3.1(+)-HIF-1α。

③、再Nhe I单酶切线性化的pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_natrue，酶切体系如下，酶切条件同前。

线性化pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature     15μl

Nhe I                               1μl

10×M酶切缓冲液                     2μl

                                             

加灭菌去离子水至总体积为            20μl

④、酶切产物行琼脂糖凝胶(1％)电泳，胶回收HIF-1αnature cDNA片段，方法同前。

(2)、以Nhe I、Apa I先后酶切pShuttle2质粒，方法同上，对线性化pShuttle2作胶回收，以完全去除pShuttle2质粒双酶切后的多克隆位点内小片段DNA。

(3)、连接重组pShuttle2-HIF-1αnature，连接产物转化感受态DH5α，重组子筛选及重组pShuttle2-HIF-1αnature质粒提取。方法同前，只是在抗性筛选时改用卡那霉素，终浓度为50μg/ml。(4)、重组pShuttle2-HIF-1αnature质粒作Nhe I和Apa I单、双酶切鉴定，取0.5-1μl质粒用HIF-1α突变区片段引物作PCR鉴定，PCR产物送博亚公司测序。

8、酶切连接法重组腺病毒质粒

(1)、以PI-Sce I、I-Ceu I双酶切pShuttle2-HI F-1αnature，37℃恒温水浴3h，酶切反应体系如下：

质粒pShuttle2-HIF-1αnature            1μg

PI-Sce I(1U/μl)                    2μl

I-Ceu I(5U/μl)                     0.5μl

10×双酶切缓冲液                    3μl

                                       

加灭菌去离子水至总体积为            30μl

(2)、酶切产物作琼脂糖凝胶(1％)电泳，胶回收含有hCMV启动子、HI F-1αcDNA片段、SV40po ly A表达盒的大片段(称为CMV-HIF-1αnature，大小约3600bp)。

(3)、连接重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1αnature，连接反应体系如下，连接条件同前。

CMV-HIF-1αnature(约50ng/μl)         7.5μl

Adeno-X  Viral DNA(250ng/μl)         1.0μl

10×DNA连接缓冲液                     1.0μl

T4DNA连接酶                           0.5μl

                                                

                                      共10μl

(4)、连接产物转化感受态DH 5α后，在氨苄抗性LB平板上筛选重组子，挑取12～16个中等大小的单菌落，分别接种于5ml的氨苄抗性LB液体培养基，37℃振摇培养12～16h，至对数生长期，每管各取10μl菌液以BD.Clontech所提供引物行菌液PCR鉴定，PCR反应体系及程序如下：

PCR反应体系：

菌液                         10μl

引物A(1OD/500μl)            2μl

引物B(1OD/500μl)            2μl

dNTP                         4μl

TaqDNA聚合酶                 0.25μl

10×PCR缓冲液                5μl

                                            

加灭菌去离子水至总体积为     50μl

PCR反应程序：94℃2min→94℃15s→68℃2min→68℃3min，其中扩增30循环

(5)、将鉴定结果正确的菌液-70℃冻存后再次复苏，挑出5～6个单菌落，接种于约50ml氨卞抗性LB液体培养基，按上述步骤筛选及PCR鉴定。

(6)、鉴定正确的菌液每管各取3ml以维特洁超纯质粒提取试剂盒提取质粒，方法如下，余菌液暂保存于4℃。

①、将菌液10000rpm离心30s

②、弃上清，加Buffer S1(已加入RNase A1)250μl充分悬浮细菌沉淀。

③、加入Buffer S2 250μl，温和充分上下翻转混合4-6次，此步骤不超过5min。

④、加入450μl 4℃预冷的Buffer N，温和上下翻转混合8-10次。

⑤、加入650μl 4℃预冷的Buffer P1，温和上下翻转10次，再稍用力混合数次形成混浊的乳浊液，10000rpm离心1min。

⑥、吸弃蓝色上相，将无色下相转移至Filter(置于1.5ml离心管中)，10000rpm离心1min。

⑦、弃Filter，在虑液中加入450μl Buffer B，混匀。

⑧、将DNA-prep管置于2ml离心管中，将上述混合液加入DNA-prep管，3600rpm离心1min。

⑨、弃虑液，加入700μl已加无水乙醇的Buffer W2，3600rpm离心1min。

⑩、将DNA-prep管置于1.5ml离心管中，10000rpm离心1min。

、将DNA-prep管置于另一干净的1.5ml离心管中，在silica膜中央加60μl Eluent或去离子水，静置1min，10000rpm离心1min洗脱DNA。

、行琼脂糖凝胶(0.5％)电泳，观察质粒浓度。

(7)、以Qiagen Plasmid Mini Kit超纯质粒提取试剂盒提取上述质粒浓度最高的菌液中的质粒，步骤如下：

①、取5ml饱和菌液10000rpm离心1min

②、弃上清，加600μl Buffer P1(已加入RNase A)充分悬浮细菌沉淀，转移至2ml离心管。

③、加入600μl Buffer P2，温和充分上下翻转混合4-6次，此步骤不超过5min。

④、加入600μl预冷的Buffer P3，轻柔上下翻转混合4-6次，冰浴5min。

⑤、10000rpm离心10min，迅速取上清备用。⑥、以1ml Buffer QBT加入平衡QIAGEN-tip内的树脂，待无液滴再随重力自然流出时，加入上清，随重力自然流尽。

⑦、加入4×1ml Buffer QC至QIAGEN-tip内，随重力自然流尽。

⑧、以2×0.4ml 65℃预热的Buffer QF洗脱DNA

⑨、加0.56ml异丙醇(0.7倍洗脱液量)沉淀DNA，10000rpm离心30min，小心吸弃上清。

⑩、70％乙醇洗涤DNA，在超净台内自然风干(约5-10min)，避免过分干燥，以30-50μl TE重溶。

(8)、以Xho I酶切鉴定重组pAdeno-HIF-1α_nature质粒，以0.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果；同时以上述引物作PCR鉴定并送博亚公司测序。

1.2.3、Ala564单突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、pc DNA3.1V5-HisA-HIF-1α_nature的定点突变

(1)、第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC过程

①、建立热循环反应体系，在200μL薄壁EP管加入以下成分：

5μL 10×反应缓冲液

2μL(20ng)pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α_nature

1.25μL(125ng)sense primer：5′ctt ggagatgttagctgcctata tcccaatgga tg 3′

1.25μL(125ng)antisense primer：3′gaa cctctacaatcgacggatat agggttacct ac  5′

1μL dNTP混合物

加双蒸水38.5μL

最后加1μL PfuTurbo DNA多聚酶(2.5U/μL)

②、热循环反应条件

热循环完成后，将EP管置冰上2分钟，使其温度降至37℃以下。

③、加1μL Dpn I限制性内切酶到热反应管里，轻轻混匀后置37℃水浴1小时。

④、加1μL Dpn I限制性内切酶消化过的DNA溶液到50μL感受态大肠杆菌中，用枪头混匀。冰上放置30分钟。将反应管置42℃约45秒进行热休克，然后置冰上2分钟。加入LB培养液2ml，37℃水浴中以225-250rpm的速度摇菌1小时。离心3000转/分×5分钟，吸除上清，余100μL将细菌沉淀混匀，将菌液均匀地涂布于含氨苄青霉素100μg/L的LB琼脂板上。置37℃温箱16小时后挑取单个菌落摇、提质粒，并将菌种送公司测序。

2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala₅₆₄质粒并测序

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法1～6重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala₅₆₄质粒，并作鉴定及测序。

3、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄并测序

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法7重组pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄，并作鉴定及测序。

4、重组pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄质粒并鉴定及测序

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法8重组pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄质粒，并鉴定及测序。

1.2.4、Ala402-Ala564双突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄的定点突变

①、引物1、2PCR反应体系：

pShuttle2-HIF-1α-Ala564           1μl

引物1(1OD/500μl)                  2μl

引物2(1OD/500μl)                  2μl

dNTP                               4μl

TaqDNA聚合酶                       0.25μl

10×PCR缓冲液                      5μl

                                

加灭菌去离子水至总体积为           50μl

PCR反应程序：94℃2min→94℃30s→60℃30s→72℃1min→72℃5min，其中扩增30个循环

②、将PCR反应产物各取5μl进行琼脂糖凝胶(1.5～2％)电泳

③、将所有反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为172bp的目的片断。

④、引物3、4PCR反应体系：

pShuttle2-HIF-1α-Ala564           1μl

引物3(1OD/500μl)                  2μl

引物4(1OD/500μl)                  2μl

dNTP                               4μl

TaqDNA聚合酶                       0.25μl

10×PCR缓冲液                      5μl

                            

加灭菌去离子水至总体积为           50μl

PCR反应程序：94℃2min→94℃30s→60℃30s→72℃1min→72℃5min，其中扩增30个循环

⑤、将PCR反应产物取5μl进行琼脂糖凝胶(1.5～2％)电泳

⑥、将所有反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为223bp的目的片断。

⑦、引物1、4PCR反应体系：

前两步的胶回收产物各               2μl

引物1(1OD/500μl)            2μl

引物4(1OD/500μl)            2μl

dNTP                         4μl

TaqDNA聚合酶                 0.25μl

10×PCR缓冲液                5μl

                        

加灭菌去离子水至总体积为     50μl

PCR反应程序：94℃2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min→72℃5min，其中扩增30个循环

⑧、将PCR反应产物取5μl进行琼脂糖凝胶(1.5～2％)电泳

⑨、将所有反应产物于2％琼脂糖凝胶电泳，胶回收大小为380bp含有突变点Ala402的目的片断。

2、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄的构建及鉴定。

(1)、获取含有突变点Ala402HIF-1αcDNA片段

①、以BspT104I、AgeI双酶切大小为380bp含有突变点Ala402的目的片断，酶切反应体系如下

含有突变点Ala402的目的片断约        5μg(过量)

BspT104I                            1μl

Age I                               1μl

10×L酶切缓冲液                     2μl

                                         

加灭菌去离子水至总体积为            20μl

②、37℃恒温水浴3h

③、加2μl 10×Lodding buffer终止反应

④、将反应产物全部进行琼脂糖凝胶(1％)电泳

⑤、紫外灯下观察，迅速切取含约300bp大小核酸条带(即含有突变点Ala402片段)的尽量少的凝胶，紫外线照射时间尽量短于30S，用滤纸吸干多余的水分后装入EP管称量。

⑥、以Omega凝胶回收试剂盒回收含有突变点Ala402的HIF-1αcDNA片段

a.根据称量结果加入等体积的Binding Buffer(1ml/g)

b.60-65℃水浴7min至胶完全融化

c.移入置于2ml收集管上的HindBind柱子内，10000rpm离心1min。

d.弃滤液，加300μl Binding buffer入柱子内，10000rpm离心1min。

e.弃滤液，加入700μl SPW Buffer(已加无水乙醇)，静置2-3min，10000rpm离心1min。

f.重复e步骤

g.弃滤液，再次10000rpm离心1min。

h.柱子置于另一1.5ml EP管上，加入60℃预热的30μl DNA洗脱液，静置2min，10000rpm离心1min，弃柱子，取2μl进行琼脂糖凝胶(1％)电泳，观察回收含有突变点Ala402HIF-1αcDNA片段浓度，余置-20℃保存。

(2)、同以上方法以Age I和BspT104I双酶切pShuttle2-HIF1α-Ala₅₆₄，胶回收线性化pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄片段，约6300bp大小，回收后取2μl进行琼脂糖凝胶(1％)电泳了解其浓度。

(3)、以后基本按以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法3-5重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄，后以Kpn I及Kpn I、Apa I对所提重组质粒作单、双酶切鉴定(酶切方法同1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法6)3、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄的构建及鉴定。

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HI F-1α_nature构建”中方法8重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄，并鉴定及测序。1.2.5、Ala564-Ala803双突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、获取含有突变点Ala803HIF-1αcDNA片段

以本说明书“1.2.3、重组pcDNA 3.1(+)-HIF-1α-Ala₅₆₄构建”中方法1获取含有突变点Ala803HIF-1αcDNA片段。第803位天冬酰胺(Asn)密码子AAT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT过程：基本上同该步骤，以pcDNA 3.1V5-HisA-HIF-1α-Ala₅₆₄为底物，senseprimer：5’ccagttatga ttgtgaagtt gctgctccta tacaaggcag 3’和anntisense primer：3′ggtcaatact aacacttcaa cgacgaggatatgttccgtc 5′为引物，扩增循环数为14cycles

2、重组pcDNA 3.1(+)-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃质粒并测序

方法基本同本说明书“1.2.2、重组pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法1-6重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃质粒，并鉴定及测序。

3、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的构建及鉴定

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法7重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，并鉴定及测序。

4、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的构建及鉴定

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法8重组穿梭质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，并鉴定及测序。1.2.6、Ala402-Ala564-Ala803三突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的构建

(1)、获取含有突变点Ala402HIF-1αcDNA片段同本说明书“1.2.4、Ala402-Ala564双突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建”中方法2(1)。

(2)、同以上方法以Age I和BspT104 I双酶切pShuttle2-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，胶回收线性化pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃片段，约6300bp大小，回收后取2μl进行琼脂糖凝胶(1％)电泳了解其浓度。以后步骤基本同本说明书“1.2.4、Ala402-Ala564双突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建”中方法3。

2、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的构建及鉴定。

以本说明书“1.2.2、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法8重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃，并鉴定及测序。

1.2.7LacZ基因重组腺病毒载体的构建

方法基本同本说明书“1.2.2、重组pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_nature构建”中方法1-8，主要不同是连接产物转化后涂板时，在每个氨苄抗性LB平板上均匀涂有100μl X-gal及20μl IPTG混合液，培养后挑蓝色克隆鉴定和培养。

1.2.8、重组腺病毒Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564、Ad-HIF-1α_564/803、Ad-HIF-1α_402/564/803的包装

(1)HEK293细胞的培养

①、HEK293细胞的复苏取出冻存细胞，37℃水浴迅速融化，加入25ml含10％FBS的DMEM，轻轻混匀，800rpm离心2-3min，弃去上清后加入10ml全培重悬，加入到6cm培养板中培养。

②、HEK293细胞的传代待HEK293细胞汇合度至85-95％左右，PBS 5ml清洗细胞2次，加入2ml 0.05％胰酶+0.02％EDTA，待细胞消化好后加入全培10ml，800rpm离心2-3min后弃去上清后加入全培，按1∶3-5比例加入培养板中培养。

③、HEK293细胞的冻存按上述方法消化细胞后，加入全培800rpm离心2-3min，弃去上清加入含20％DMSO、10％FBS的DMEM重悬，-20℃4h～-70℃12h梯度降温后加入液氮中。

(2)、HEK293细胞准备以含10％FBS的DMEM培养HEK293细胞，转染前一天细胞传代于6孔板培养皿培养，细胞数0.3～0.5×106/平皿，使得转染时细胞汇合率在60％左右。

(3)、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF1α_nature、pAdeno-HIFlαAla₅₆₄、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以及pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃准备

①、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF1α_nature、pAdeno-HIF1αAla₅₆₄、pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以及pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃各约3μg以Pac I酶切，暴露其反向重复序列。酶切反应体系如下，37℃水浴酶切2h。

质粒pAdeno-HIF1α_nature                    约3μg

(pAdeno-HIF1αAla₅₆₄/

pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄/

pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃/

pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃)

Pac I                                  1μl

10×BSA                                3μl

10×NEB3酶切缓冲液                     3μl

加灭菌去离子水至总体积为               30μl

②、酶切产物以酚-氯仿-异戊醇抽提纯化，乙醇沉淀。

a.将酶切产物加入TE 70μl。

b.加入100μl酚-氯仿-异戊醇溶液(三者比例为25∶24∶1)，轻轻混匀。

c.4℃12000rpm离心5min以使溶液分层

d.小心将上层液相(约90μl)转移至1.5ml离心管

e.按上述乙醇沉淀法沉淀DNA，即线性化后的pAdeno-HIF1α_nature、pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以及pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃。

③、以约20μl三蒸水重溶，取约2μl行琼脂糖凝胶(0.5％)电泳。

(3)、线性化后的pAdeno-HIF1α_nature、pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以及pAdeno-HIF1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃转染HEK293细胞

①、以Opti-MEM I各200μl分别稀释线性化后的pAdenoHIF-1α_nature、pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄、pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以及pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃及9μl Lipofectamine2000，5-10min后将两者轻轻混匀。

②、两者的混合液在室温孵育20min后，将混合液直接加入上述培养有293细胞的1孔6孔板内，摇动培养板，轻轻摇匀，置细胞培养箱内。

③、在37℃、5％的CO2培养箱中孵育4-5h后，更换为5ml含10％FBS无抗生素的DMEM继续培养。

④、转染24h后，绿色荧光显微镜观察，估计绿色细胞的比例。

⑤、转染后每天观察细胞，待约10-14天左右大部分细胞出现细胞病变效应(CPE)后收集细胞，予500μl PBS重悬，-20℃～37℃反复冻融细胞3次，离心收集上清，此称为病毒原液，病毒称为Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564、Ad-HIF-1α_564/803、Ad-HIF-1α_402/564/803，置-20℃保存。

1.2.9、重组腺病毒Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564、Ad-HIF-1α_564/803、Ad-HIF-1α_402/564/803的体外扩增、纯化以及滴度测定

(1)、上述5种重组腺病毒体外大量扩增

主要步骤为：将HEK293细胞接种于150mm平皿中，待细胞生长至90％融合时，加入重组腺病毒Ad-HIF-1α_nature，转染复数(multiplicity of infection，MOI)约为10pfu/cell，置入37℃5％CO₂培养箱中继续培养，48-72h后细胞完全出现CPE时，分别收集细胞，冻存于-80℃备用。反复如此，累计到50-60个平皿后统一纯化病毒。

同上法，分别体外扩增重组腺病毒Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564、Ad-HIF-1α_564/803、Ad-HIF-1α_402/564/803。

(2)、重组腺病毒的纯化

主要步骤如下：

①、细胞冻融后离心，4℃12000g×10min，取上清；

②、每20ml上清中加入10ml 20％PEG8000/2.5mol/LNaCl，混匀后冰浴1h；

③、离心，4℃12500g×30min，弃上清；

④、收集沉淀，溶于5ml 1.1g/ml CsCl中；

⑤、离心，4℃ 8000g×5min，取上清；

⑥、制备不连续CsCl密度梯度：依次加入2ml 1.4g/ml CsCl、3ml 1.3g/ml CsCl、5ml上清；

⑦、离心，4℃60000g×2h，吸出病毒带(1.3--1.4g/ml密度之间)；

⑧、转入透析袋，4℃透析过夜后过滤除菌分装-70℃保存备用。

(3)、病毒滴度测定[VP(Viral particles)/ml O.D.260nm]：

①、4℃融化病毒保存液；

②、在无菌超净台内用病毒裂解液与病毒液按1∶1的比例稀释；

③、56℃震荡培养10min；

④、准备1ml含有相同比例的病毒裂解液和透析缓冲液作为空白对照液，测定260nm处吸光值；

⑤、以病毒裂解液代替空白对照液，继续测定260nm处吸光值；

⑥、将吸光值与稀释度相关系数相乘即可得出病毒滴度：病毒滴度(OPU/ml)＝OD₂₆₀×病毒稀释度×测定稀释度×1.1×10¹²。

1.2.10重组腺病毒转染效率测定

(1)、Ad-LacZ感染HEK293细胞：用HEK293细胞于6孔培养板中培养，8h后换成无血清、含谷氨酰胺的DMEM-HG培养基，维持24-48h后，按MOI值0、20、50、75、100、200pfu/cell加入纯化Ad-LacZ液，3h后换成DMEM-HG培养基继续37℃5％CO2培养48h，每个MOI值设3个平行孔。

(2)、X-gal染色：

①、弃去培养液，用37℃预热的PBS冲洗一遍，然后加入足量10％多聚甲醛室温孵育固定60min；

②、弃去固定液，室温下用PBS彻底洗3遍(第一遍将冲洗液立刻弃去，第二、第三遍则让冲洗液保留5min)；

③、加入最小体积的X-gal溶液；

④、37℃孵育2h至过夜，阳性细胞将被染成蓝色。染色完成后可将培养板置于4℃保存。

(3)、计算：每孔随机3个400倍视野按有无蓝染细胞计数，计算蓝染细胞百分率，每个MOI值的感染效率为9个视野的平均的蓝染细胞百分率。

1.3实验结果

1.3.1野生型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、重组pcDNA3.1(+)-HIF-1α_nature质粒酶切鉴定

(1)、Kpn I、Xba I双酶切pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α_nature重组pcDNA 3.1/V5-HisA-HIF-1α_nature质粒经Xba I酶切后呈线性化，电泳结果为大小8000bp左右片段，与预期值一致；经Kpn I、XbaI双酶切后电泳可见有约2500bp、5500bp两个产物片段，分别与HIF-1α_naturecDNA及pcDNA3.1/V5-HisA质粒大小相符(图6)。(2)、Apa I、Nhe I双酶切重组质粒pcDNA3.1(+)-HI F-1α_nature及pShuttle2

重组pcDNA 3.1(+)-HIF-1α_nature电泳可见有多种构象存在；以Apa I、Nhe I双酶切后可见产物呈2500bp、5400bp左右两个片段，分别与HIF-1αcDNA及pcDNA 3.1(+)质粒大小相符(图8)。

2、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α_nature酶切PCR及鉴定

(1)、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α_nature经Apa I、Nhe I单、双酶切后，电泳可见单酶切后线性化的重组穿梭质粒大小在6500bp左右，符合预期值；双酶切后两个产物片段大小各为4000bp、2500bp左右，符合预期值(图11)。

(2)、重组穿梭质粒以HIF-1α_nature cDNA的两组片段引物作PCR扩增见相应的两种扩增产物，第一对引物(即突变1区引物)扩增结果产物片段大小460bp，第二对引物(即突变2区引物)扩增结果产物片段大小214bp，均符合预期值(图12)。

(3)、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α_nature以PI-Sce I、I-CeuI双酶切后可形成两个酶切产物，即CMV-HIF-1α_nature(Ala564)和去掉CMV启动子、多克隆位点、多聚腺甘酸尾polyA的pShuttle2，大小分别约为3600bp、2900bp，从电泳结果看符合预期值(图13)。

3、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α_nature酶切及PCR鉴定

(1)、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α_nature以Xho I酶切，酶切片段有约14500、8046、4300、2465bp等，符合预期值(图16)。

(2)、重组腺病毒质粒Pac I酶切后可产生大、小两个片段，大片段约33kb，小片段近3000bp，从电泳结果看酶切产物符合预期值(图18)。

(3)、重组腺病毒质粒以HIF-1α_nature cDNA的两组引物及BD.Clontech公司所提供的引物行PCR鉴定，分别扩增出460、214、287bp的三种产物片段，与预期值一致(图17)。

1.3.2Ala564单突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄酶切鉴定

(1)、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄经Apa I、Nhe I单、双酶切后，电泳可见单酶切后线性化的重组穿梭质粒大小在6500bp左右，符合预期值；双酶切后两个产物片段大小各为4000bp、2500bp左右，符合预期值(图11)。

(2)、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄以HIF-1α_naturecDNA的两组片段引物作PCR扩增见相应的两种扩增产物，第一对引物(即突变1区引物)扩增结果产物片段大小460bp，第二对引物(即突变2区引物)扩增结果产物片段大小214bp，均符合预期值(图12)。

(3)、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄以PI-Sce I、I-Ceu I双酶切后可形成两个酶切产物，即CMV-HIF-1α_nature(Ala564)和去掉CMV启动子、多克隆位点、多聚腺甘酸尾polyA的pShuttle2，大小分别约为3600bp、2900bp，从电泳结果看符合预期值(图14)。

2、重组腺病毒质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄酶切及PCR鉴定

(1)、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄以Xho I酶切，酶切片段有约14500、8046、4300、2465bp等，符合预期值(图16)。

(2)、重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄经Pac I酶切后可产生大、小两个片段，大片段约33kb，小片段近3000bp，从电泳结果看酶切产物符合预期值(图18)。

(3)、重组腺病毒质粒以HIF-1α_nature cDNA的两组引物及BD.Clontech公司所提供的引物行PCR鉴定，分别扩增出460、214、287bp的三种产物片段，与预期值一致(图17)。

1.3.3Ala402-Ala564双突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄的酶切鉴定

重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564BspT104I单酶切片段大小约6600bp，Age I、BspT104I双酶切两个片段大小分别为6300bp、300bp左右，酶切鉴定正确。(图20)

2、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄PCR鉴定

以重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄的三对引物行PCR鉴定，分别扩增出一约172bp、223bp、380bp的目的片断，符合预期值。(图21)

3、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄测序结果

测序后与GenBank的HIF-1αcDNA序列比对显示402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA(下划线处)。测序结果如下(图22)：

4、重组腺病毒载体pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄鉴定

提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄以Xho I酶切(图23)，酶切片段有约14500、8046、4300、2465bp，符合预期，鉴定正确，以BD Clontech公司所提供的引物行PCR鉴定，扩增出287bp的DNA片段(图24)，与预期值一致。

1.3.4Ala564-Ala803双突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以PI-Sce I、I-Ceu I双酶切

重组穿梭质粒以PI-Sce I、I-Ceu I双酶切后可形成两个酶切产物，即CMV-HIF-1α(Ala564)和去掉CMV启动子、多克隆位点、多聚腺甘酸尾polyA的pShuttle2，大小分别约为3600bp、2900bp，从电泳结果看符合预期值(图25)。

2、重组腺病毒质粒PCR鉴定

重组腺病毒质粒以HIF-1αcDNA的两组引物及BD.Clontech公司所提供的引物行PCR鉴定，分别扩增出460、214、287bp的三种产物片段，与预期值一致(图26)。

3、重组腺病毒质粒测序结果

重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以引物1、2及3、4行PCR扩增，产物测序结果如下，测序后与GenBank的HIF-1αcDNA序列比对显示564位脯氨酸密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC(图27)；803位天冬酰胺密码子AAT突变为丙氨酸密码子GCT(图28)。

4、重组腺病毒质粒Pac I酶切

重组腺病毒质粒Pac I酶切后可产生大、小两个片段，大片段约33kb，小片段近3000bp，从电泳结果看酶切产物符合预期值(图29)。

1.3.5Ala402-Ala564-Ala803三突变型人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体的构建

1、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的酶切鉴定重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃经BspT104I单酶切片段大小约6600bp，Age I、BspT104I双酶切两个片段大小分别为6300bp、300bp左右，酶切鉴定正确。(图30)

2、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃PCR鉴定

以重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃的三对引物行PCR鉴定，分别扩增出一约380bp、460bp、214bp的目的片断，符合预期值。(图31)

3、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃测序结果

测序后与GenBank的HIF-1αcDNA序列比对显示402位密码子由CCA诱变为GCA(见图32A下划线处)，564位密码子由CCC诱变为GCC(见图32B下划线处)，803位密码子由AAT诱变为GCT(见图32C下划线处)。

4、重组腺病毒载体pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃鉴定

提取重组腺病毒质粒pAdeno-HIF-1α-Ala₄₀₂-Ala₅₆₄-Ala₈₀₃以Xho I酶切(图33)，酶切片段有约14500、8046、4300、2465bp，符合预期，鉴定正确，以BD Clontech公司所提供的引物行PCR鉴定，扩增出287bp的DNA片段(图34)，与预期值一致。

1.3.6LacZ基因重组腺病毒载体的构建

1、重组穿梭质粒及对照质粒pShuttle2-LacZ以PI-Sce I、I-CeuI双酶切

pShuttle2-LacZ以PI-Sce I、I-Ceu I双酶切后可形成两个酶切产物，即CMV-LacZ和同样去掉CMV、polyA等的pShuttle2，大小分别约为4500bp、2900bp，从电泳结果看符合预期值(图35)。

2、重组腺病毒质粒pAdeno-lacZ以HIF-1α_naturecDNA的两组引物及BD.Clontech公司所提供的引物行PCR鉴定，分别扩增出287bp的目的片段，与预期值一致(图17)。

1.3.7重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564、Ad-HIF-1α_564/803、Ad-HIF-1α_402/564/803的滴度

在HEK293细胞内扩增后的重组腺病毒Ad-LacZ、Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_564/402、Ad-HIF-1α_564/803以及Ad-HIF-1α_402/564/803经氯化铯梯度离心法纯化后滴度分别为(7.755±0.477)×10¹¹OPU/ml、(5.077±0.188)×10¹¹OPU/ml、(6.848±0.129)×10¹¹OPU/ml、(6.292±0.260)×10¹¹OPU/ml、(6.193±0.221)×10¹¹OPU/ml；(6.544±0.217)×10¹¹OPU/ml。

1.3.8重组腺病毒Ad-LacZ对HEK293A细胞的转染率

随着MOI的增加，蓝染率增加，当MOI为100pfu/cell时，HEK293细胞蓝染率90％以上(图36)，说明本方法构建的重组腺病毒体外转染效率高，目的基因能有效地得以表达。

实施例2突变体HIF-1α基因促人脐静脉内皮细胞增殖的研究

2.1材料

2.1.1主要试剂

(1)、细胞相关

人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelia cell，HUVEC)、Medium 200、Low Serum Growth Supplement、Tryps in/EDTASolution、Trypsin Neutralizer Solution(Cascade biologics公司，Cat.No.C-023-5C、M-200-500、S-003-10、R-001-100、R-002-100)；3T3细胞(肿瘤研究所提供)；MTT、DMSO(Sigma公司)；DMEM/highglucose、新生牛血清(Hyclone公司，Cat.No.SH30022.01、SH30401.01)

(2)、抗体

HIF-1α单克隆抗体(Chemicon International公司，Cat.No.MAB5382)；羊抗鼠辣根过氧化物酶标记二抗(北京鼎国生物公司)；β-actin抗体(广州威佳公司分装)，Lamin(Invitrogen公司)

(3)、RNA相关主要试剂

DNA Polymerase I，Taq DNA Polymerase(2U/μl，大连Takara公司)；RNasin、DEPC(30U/μl，北京鼎国生物公司)；ReverseTranscription Kit(Promega公司)；dNTPs(100mM，Research GeneticsInc)；Superscript II RNase H Reverse Transcriptase(200U/μ1)，Trizol^TM Reagent(Invitrogen公司)；其它普通试剂例如氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖等均购自国产公司；Brilliant SYBR Green QPCRMaster Mix(Stratagene公司，Catalog#600548Single Kit，Revision#114002)

(4)、Western blot相关主要试剂

West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce公司，Cat.No.34096)；D-72显影液、酸性定影液(扬州照相器材厂)；RIPA蛋白裂解液(北京鼎国公司)；PMSF、小牛血清白蛋白(100μg/ml，Sigma公司)；脱脂奶粉(广州威佳公司)；其它如SDS、丙稀酰胺、吐温、Tris-base、甘氨酸、TEMED等为均分析纯试剂，购自国内相关厂家。

(5)、萤光素活性检测

Luciferase Reporter Assay Kit(Promega公司，Cat.No.E1500)，Luciferase Reporter Assay Kit包括10ml Substrate A、10mlSubstrate B、50ml 3×Cell Lysis Buffer；pShuttle2-LacZ(BDClonetech公司)；pGL3-control和pGL3-promoter-HRE质粒(BrendaLilly博士馈赠，Medical College of Georgia)

(6)、引物

VEGF：

上游引物：5’-CCC ACT GAG GAG TCCAAC AT-3’

下游引物：5’-CCT CGG CTT GTC ACA TTT TTC-3’

片段长200bp

GAPDH：

上游引物：5’-AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA-3’

下游引物：5′-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG-3′

片段长596bp

2.1.2材料仪器

X-ray片(KODAK)；PVDF膜(Millipore公司)；塑料杂交袋(北京鼎国公司)；0.22μm和0.45μm微孔滤膜(威佳公司)；荧光定量四通道PCR仪(Stratagene MX3000P)；Mini Western blot电泳仪(Bio-Rad公司)；荧光倒置显微镜(Nikon公司，日本)；HTS 7000 Bio AssayReader(美国Perkin Elmer公司)；水平振荡仪；涡旋震荡器；制冰机；分光光度计(Beckman公司)；超声粉碎仪；恒温循环水浴锅(Phamarcia公司)；磁力搅拌器；Whatman 3MM滤纸；摇床。

2.1.3常用液体配制

(1)MTT：称取1.5mg MTT，加入到30ml PBS中，溶解后0.22μm滤膜过滤，配制成5mg/ml的MTT溶液。置于-20℃保存，用时可以置于4℃。

(2)DEPC水：吸1ml DEPC，加入到999ml去离子水中，轻轻搅拌，混匀，加入处理RNA所用的移液器头、EP管等，然后置于搅拌器上常温搅拌，24h后将器皿高压烤干后即可使用。

(3)蛋白浓度测定液体：取200ml 88％磷酸、350mg Serva G蓝用95％乙醇定容至100ml，即Bradford储存液。使用时将上述Bradford储存液、15ml 95％乙醇、30ml 88％磷酸用双蒸水定容至500ml，后滤纸过滤，室温保存于棕色瓶中，即Bradford工作液。可使用数周，但在使用前需要再过滤。

(4)Western blot试剂

1、丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺液：用适量三蒸水溶解29.0g丙烯酰胺与1.0gN，N-亚甲双丙烯酰胺，并定容至100ml，过滤后棕色瓶4℃保存备用。

2、过硫酸胺：0.1g过硫酸胺溶于1.0mlH₂O中，4℃保存备用，有效期1W。

3、2×蛋白质样品缓冲液：三蒸水4.0ml、0.5mo l/L Tris(pH6.8)1.0ml，Glycerol 0.8ml、10％SDS 1.6ml、β-巯基乙胺(2-b-mercaptoethanol)0.4ml、0.05％溴酚兰(bromophenolblue)0.2ml，共8.0ml。

4、0.5mol/L Tris(pH 6.8)：6.06g Tris溶于60.0ml三蒸水，用1mol/L盐酸调节pH至6.8，用三蒸水定容至100.0ml。

5、1.0mol/L Tris(pH 6.8)：12.11g Tris溶于60.0ml三蒸水，用1mol/L盐酸调节pH至6.8，用三蒸水定容至100.0ml。

6、1.5mol/L Tris(pH 6.8)：18.15g Tris溶于60.0ml三蒸水，用1mol/L盐酸调节pH至6.8，用三蒸水定容至100.0ml。

7、5×甘氨酸电泳缓冲液(pH8.3)：Tris Base 9.0g，Glycine43.2g，SDS 3.0g，溶于600ml H₂O。使用时取100ml 5×甘氨酸电泳缓冲液，稀释至500ml    1×甘氨酸电泳缓冲液。

8、10％SDS：10.0g SDS溶于100ml三蒸水，充分溶解后，室温保存备用。

9、甘氨酸转移缓冲液：Glycine 2.93g，Tris 5.82g，SDS 0.37g，甲醇200ml，三蒸水定容至1000ml。

10、Coomassie Blue染色液：0.5g Coomassie Blue溶于90ml甲醇，20ml冰醋酸，三蒸水定容至200ml。

11、脱色液：与染色液相似，无Coomassie Blue。

12、封闭液：脱脂奶粉5g，加入100ml PBS-T配成5％的封闭液。

13、Lysis buffer：50mmol/L β-glycerophos phate(15.3g)，100mmol/L Na₃PO₄(40.0g)，2mmol/L MgCl₂(0.41g)，1mmol/LEDTA(0.38g)，0.5％Triton X-100，1mmol/L DTT(0.15g)，三蒸水定容至1000ml。

(5)人HUVEC培养基：Medium 200与Low Serum Growth Supplement以50∶1的比例混合，每次配制100ml，使用期限不超过1个月，4℃保存。

(6)萤光素试剂准备：Substrates A和B使用前需要混合后分装成小份，配制成检测底物，储存于20℃。注意配制和检测时的温度均不应超过25℃。3×Cell Lysis Buffer用120ml去离子水稀释成1×Buffer。

2.2方法

2.2.1TCID 50法病毒滴度测定

(1)、检测前天，将HEK293A细胞以1×10⁴接种至96孔培养板内，每孔加入200μl完全培养基(含10％FBS的DMEM)，置于37℃、5％的CO₂培养箱中。

(2)、病毒的稀释将病毒液10μl加入含有990μl DMEM的EP管内作1∶100稀释，浓度即为原病毒液的10^-2，以此浓度开始，在EP管内按1∶10用DMEM倍比稀释病毒液，每次吸出150μl，稀释成1500μl，即成10^-3～10^-10各级梯度浓度的病毒稀释液。由10^-3稀释度开始，每横排(共12孔)的前10孔内加同一稀释度的病毒液100μl，由10^-3～10^-10依次共8个横排。

(3)、每横排的最后两孔加不含病毒液的DMEM各100μl作阴性对照，培养板置37℃、5％的CO₂培养箱中孵育。

(4)、每天观察细胞是否出现的CPE现象并及时添加培养基。10天后，于倒置显微镜下观察培养板，计数可以观察到有CPE的培养孔，即使培养孔内只有几个细胞出现CPE，该孔即为阳性；如果CPE和细胞死亡难以区分，可以和阴性对照孔比较。

(5)、计算每排阳性孔的比率，将各排阳性孔比率总和记作X(包括10^-1、10^-2两种稀释度)。病毒滴度(pfu/ml)＝10^(X+0.8)

2.2.2病毒最佳感染率测定

(1)、测定前一天，以5×10⁴接种人脐静脉内皮细胞至24孔培养板，以M-200完全培养基，37℃5％CO₂孵箱中培养。

(2)、测定前以PBS洗细胞3遍，然后加入无血清培养基，Adeno-LacZ病毒液稀释成5×10⁵pfu/ml，然后分别以10、20、50、100pfu/cell滴度加入相应的培养孔中，每隔30min摇动培养板，于3小时后换成完全培养基。

(3)、于48小时后，细胞用PBS洗3遍，在室温下用前述的β-gal固定液2ml固定细胞5min。再用PBS洗3遍。每孔加入β-gal底物/染液2ml，37℃温育过夜，同时每8h倒置显微镜下观察染色，照相保存结果。

2.2.3HIF-1α及其诱变体基因的转录活性的测定

(1)、第1天将3T3细胞按2×10³接种至96孔培养板，加入完全DMEM培养基，37℃5％CO₂孵箱中培养过夜。

(2)、第2天将细胞换液，无血清培养基中混匀病毒液，以50pfu/cell的滴度感染细胞，3h后换成完全培养基。

(3)、第3天应用上章所述Lipofectamin 2000转染的方法，分别转染同等量的pGL3-control和pGL3-promoter-HRE质粒。

(4)、第4天应用PBS洗细胞3遍，尽量吸干液体，加入1×CellLysis Buffe 20μl，充分混匀裂解细胞。

(5)、迅速加入检测底物100μl，应用HTS 7000 Bio AssayReader检测萤光素活性，以430nm波长为激发光，550nm波长为吸收光，检测应在20min内完成。

(6)、实验分组示意图，分为Ad-LacZ(对照组)、Ad-HIF-1α、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_564/803(三个实验组)共四组，每一组均分别转染pGL3-cont rol和pGL 3-promot er-HRE质粒，重复3次，分组示意如下表示：

缩写：control：pGL3-control，HRE：pGL3-promoter-HRE(7)、统计方法：应用SPSS13.0进行统计学处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析显著后，采用SNK法进行多重比较。

2.2.4HIF-1α及其诱变体基因感染HUVEC后MTT的测定

(1)第1天，将HUVEC消化成单细胞悬液，以2×10³接种至96孔板，加入M-200完全培养基，37℃5％CO₂孵箱中培养24h。

(2)第2天，应用无血清M-200培养基稀释不同的病毒液，以50pfu/cell的滴度接种至细胞培养孔中，每孔液体补足至100μl。病毒组3h后换成M-200完全培养基。

(3)第3、5、7、9天，上午8时加入20μl 5mg/ml的MTT，然后于4h后弃掉上清，用滤纸吸干液体后，加入150μl DMSO。充分溶解结晶，然后在570nm的波长下测量。此操作不得超过30min。

(4)、实验分组：分为Ad-LacZ、Ad-HIF-1α、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_564/803共四组，每组重复12次。

(5)、统计方法：以SPSS13.0统计软件进行统计，采用析因设计资料方差分析，方差分析差异显著后，采用LSD法进行多重比较。

2.2.5Bradford法蛋白浓度测定

(1)、制作标准曲线

应用考马斯亮兰G-250(Bradford法)。这是一种简便而可靠的检测可溶性蛋白质的方法，不同浓度的蛋白加入染色剂后呈现出不同的颜色。用分光光度计检测其OD值，与标准曲线比较得出样本蛋白含量。制作标准曲线：标准蛋白质溶液为1mg/ml牛血清白蛋白，试管中分别加入0，10，20，30，40，50，60μl标准蛋白质溶液，不足部分用水补足60μl，加入考马斯亮兰G-250染色液。混匀后室温平衡15min，用752紫外分光光度计进行检测，检测波长为595nm，以测得的OD值为纵坐标，以蛋白质含量为横坐标作标准曲线。

样本蛋白质含量测定：取60μl样品溶液，细胞裂解液作对照，加3ml考马斯亮兰，同上测定得OD值，然后从标准曲线上查得其浓度，即得到样本的蛋白质含量。可以得到标准方程蛋白质浓度(μg)＝-39.163+253.742×光密度值。

(2)、标本蛋白浓度测定

①、取适量的待测蛋白溶液，用40mM Tris实验缓冲液稀释若干倍。

②、再取适量，加实验用缓冲液至每个标本终体积为100μl。

③、加入1ml Bradford工作液，翻转混匀，在3min后测A595值。

④、如所测A595值在标准曲线的2.5μg和15μg的A595值之外，需重新调整所取稀释后溶液体积，必要的话重新稀释样品，直至样品所测A595值在标准曲线的2.5μg和15μg的A595值之内。

⑤、根据标准曲线，计算蛋白样品的浓度。

2.2.6逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)

(1)、细胞总RNA抽提

①、直径10cm培养皿，镜下检查HUVEC的生长状况，生长至90％饱和时，开始RNA的抽提，此时细胞数约为10⁶。

②、弃培养基后，用PBS缓冲液冲洗3次，将残留液体尽量吸干，按1ml/10⁶细胞的比例，加入TRIzol试剂，反复吹打混匀，冰上放置10分钟，移至DEPC处理的EP管中。

③、加入氯仿(与TRIzol之比为1∶5)，充分振荡混匀，4℃12000rpm离心30min，上层水相转移至一新的离心管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，-20℃静置2h以上。

④、4℃12000rpm离心30min，弃上清，沉淀用DEPC处理水配制的70％乙醇和100％乙醇分别洗涤1次，每次4℃12000r pm离心15min。

⑤、室温自然干燥，用适量无核酸酶的水溶解RNA。

(2)、抽提RNA的纯度及浓度鉴定

①、取适量体积RNA标本，1％琼脂糖凝胶(含EB)，100V，电泳20分钟，紫外灯下鉴定RNA纯度。

②、取质量好的RNA标本，稀释后，测定A260和A280，计算RNA浓度和纯度(即A260/A280的比值)。

(3)、总RNA中基因组DNA的消化处理

取质量好的RNA标本进行DNase I消化处理，体系如下：

MgCl₂(25mM)                   40μl

10×PCR buffer                10μl

RNA                           10μg

RNasin                        200U

DNase I                       10U

                                     

DEPC treated water            to 100μl

37℃反应1小时后用TRIzol试剂再次抽提RNA，再次鉴定RNA的纯度及浓度，A_260/280比值达到1.8～2.0之间，方可进行下一步试验。

(4)、逆转录反应

①、总RNA 1μl在PCR仪上70℃10min，立即置于冰上2～3min。

②、冰上加入下列试剂：

MgCl₂(25mM)                    4μl

10×Reaction Buffer            2μl

RNain(40U/μl)             1μl

dNTPs(10mM)                2μl

AMV(15U/μl)               1μl

Random pr imer(0.5μ       1μl

g/μl)

DEPC treated water         8μl

                                   

Total                      20μl

室温放置10min。

③、PCR仪上42℃60min，95℃5min，即可获得cDNA，置-20℃保存备用。

(5)、PCR反应体系如下：

cDNA                       1.0μl

10×Reaction Buffer        2.5μl

primer                     1.0μl

dNTPs(10mM)                2.0μl

Taq polymerase(2U/μl)     0.2μl

Deionized water            18.7μl

                                        

Total                      25.0μl

HIF-1α跨诱变803位引物、VEGF、GAPDH的反应条件如下：

95℃2min→95℃30s→55℃45s→72℃45s→72℃5min，其中扩增30个循环

1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

2.2.7Western Blot

(1)、蛋白提取

①、10cm培养皿，至细胞生长到90％融合，PBS洗3遍。

②、加入少量的0.25％胰蛋白酶，消化2-3min，待细胞变圆后，立即加入血清终止消化，将细胞移入消毒的离心管中，1000rpm，5-7min。然后加入PBS重复洗3遍，最后一次尽量吸干剩余的液体。

③、先加入少量的PMSF(量根据RIPA的量来控制，与RIPA的比值为1∶100)，然后加入适量的冰预冷的裂解液RIPA后置于冰上30min，一般10⁶细胞加入500μl。

④、超声粉碎仪破碎细胞，一般根据溶液粘稠度来判断是否使用超声，若粘稠度较低，也可不使用超声。超声一般使用20J，置于冰上，每次不超过10s，一般要破碎6-7次。

⑤、12000rpm，4℃离心，30min。

⑥、取少量上清进行定量，将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加Loading Buffer后上样。或分装成小份，置于-70℃保存。(2)、免疫印迹电泳(Western blot)

①、将Bio-Rad Mini型电泳仪的仪器准备好，洗净玻璃板，固定于夹子上，短玻璃板向外，长玻璃在内，固定于Bio-Rad架子上。

②、配制8％的分离胶：根据HIF-1α的抗体大小120KD，配制8％浓度的分离胶，加入TEMED后迅速灌胶，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加1cm)，上部用100％乙醇封闭。

③、配制5％浓缩胶：待分离胶完全聚合后，根据需要，一次性使用塑料管中配制3ml 5％浓缩胶，加入TEMED后应快速旋转混合，迅速灌入浓缩胶。

④、蛋白样品处理与加样：在等浓缩胶聚合的过程中，将蛋白质样品与2×SDS-PAGE加样缓冲液按1∶1(10μl+10μl)在一个小EP管中混合，100℃加热10min，冰浴冷却，离心1s，再次加入巯基乙醇1μl，然后用微量加样器将蛋白质样品(总体积在30μl内)加入样品孔的底部，每孔上样的最大蛋白量：20-40μg。根据测定的蛋白浓度，使每孔上样的蛋白总量一致。

⑤、电泳：将电极插头按正负极与适当的电极相连；将电压调至60V，待样品移入分离胶(一般15min)，改为100V，直至样品染料电泳到底部再停止电泳(一般60-70min)。从电泳槽中取出凝胶玻璃板，用切胶尺子小心撬开两玻璃板，凝胶贴于其中的一块上，用尺子根据Maker来切下相应位置的条带，HIF-1α一般在分离胶开始后2cm以内。左上切角以标示凝胶的方向。

⑥、蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至固相支持体PVDF膜上：

A.ddH₂O清洗电极板，吸水纸揩干液滴；

B.戴手套，切6张滤纸与1张PVDF膜，与凝胶大小一致，并标记，一般在左上打角；

C.PVDF膜先泡于100％甲醇1min，ddH₂O漂洗1min，浸入电转移液中15min，注意驱除滤膜上的气泡；

D.在一浅托盘中加入少量的电转移液，把6张3MM滤纸浸泡于其中；

E.安装转移装置：

F.平放夹子，白色在下，白色一般对着转移槽中正极红板，然后依次放上滤纸，PVDF膜，胶，滤纸，黑色夹子。固定好夹子，注意用玻棒驱赶气泡，同时也不能让胶露在滤纸外面，以防短路。

G.根据蛋白分子量大小确定转膜电流的时间和大小，40Kd大小的蛋白一般100mA 70-90min即可。断开电源，拆除转移装置，去除各层，把凝胶转移至盛有考马斯亮蓝的染液托盘中进行染色，以检查蛋白质转移是否完全。

H.对PVDF膜行丽春红S染色。把PVDF膜放入含有丽春红S使用液的托盘中染色5-10min，摇床轻摇。蛋白带出现后，于室温用ddH₂O漂洗，期间换水数次。PVDF膜先甲醛浸泡1min，然后在空气中风干15min，再用甲醛浸润1min，去离子水清洗，即可放置于5％的脱脂奶粉中进行封闭。

⑦、封闭非特异性结合位点：将膜放入可加热密封的塑料袋中，根据膜面积，以0.1ml/cm²的量加入封闭液(5％脱脂奶粉，0.1％Tween20于PBS或TBS)，尽可能排除气泡，密封，平放于摇床平台上，室温孵育1-2h或4℃过夜。

⑧、一抗孵育：取出膜在TTBS中洗涤5min×3次；将膜放入可加热密封的塑料袋中，加入合适浓度的一抗，室温温育2h或37℃1h，或者4℃过夜。HIF-1α比例为1∶500，Lamin为1∶400。

⑨、二抗孵育：取出膜在TTBS中洗涤5min×3次；将膜放入可加热密封的塑料袋中，加入合适浓度的二抗，室温孵育1h。

⑩、ECL发光检测：取出膜在TTBS(或TPBS)中洗涤5min×3次；用平整的吸水滤纸轻轻吸去膜表面水分，将膜浸入ECL反应液中(Pierce Femo级A和B液等体积混合后立即使用)，室温1min。吸去化学发光液体，用食品保鲜膜覆盖，在暗室用X线片曝光，显影、定影后观察结果。

2.3结果

2.3.1病毒滴度测定

重组腺病毒Ad-HIF-1α_564/803扩增后按上述终点稀释试验法测得其病毒滴度＝10^(7.7+0.8)＝3.2×10⁸pfu/ml。重组腺病毒Ad-LacZ扩增后，其病毒滴度＝10^(8+0.8)＝6.3×10⁸pfu/ml。

2.3.2病毒适宜感染率的筛选

为了以较低滴度的病毒获得较高的感染率，将对照病毒Adeno-LacZ分别10、20、50、100pful/cell感染HUVEC，观察腺病毒对HUVEC的适宜感染滴度。结果显示10、20pfu/cell感染率较低，50、100pfu/cell的滴度可以获得较高的感染率，因此选较低的50pfu/cell的滴度为感染滴度，如此可以在获得较高感染率的同时，又不使用太高滴度的腺病毒，尽量避免腺病毒本身对细胞的影响。见图37。

2.3.3HIF-1α及诱变体转录活性的测定

为了检测构建的HIF-1α载体是否具有转录活性，采用萤光素活性系统来进行检测。其中的pGL3-control自身带有启动子区，没有HIF-1α的转录激活结合位点，当该质粒与HIF-1α基因及诱变体共转染时，各组之间的萤光素活性应该没有变化。同时应用pGL3-promoter-HRE与HIF-1α基因及诱变体共转染，该载体带有HIF-1α转录活性特异结合元件(Hypoxia Response Element，HRE)(其序列为5’-RCGTG-3’)，在两个载体共转染时，如果HIF-1α的转录活性增强，则可以特异的结合HRE，从而促进萤光素的表达，增强其活性。具体数值如下表1A/B，分别应用单因素方差分析，方差分析显著后用SNK法行多重比较。从统计分析得出如下结论：pGL3-control与HIF-1α基因及诱变体共转染后，各组单因素方差分析无显著性差异，P＝0.197，各组之间不存在萤光素活性的差异；而pGL3-promoter-HRE与HIF-1α基因及诱变体共转染单因素方差分析有显著性差异，P＝0.002，进行多重比较可知AH2组与其它组间均有显著性差异，其它各组间无显著性差异。具体见表2、3和图38。

2.3.4HI F-1α基因及其诱变体的感染HUVEC后的MTT结果

分别测试了4天感染了不同病毒的HUVEC的MTT活性，经析因设计资料方差分析统计结果显示具有显著性差异，P＜0.001，继之用LSD法行多重比较，并绘制了交互作用图，除Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄之间没有显著性差异外(P＝0.065)，其余各组间均有显著性差异，P＜0.001。结果见表4。

2.3.5HIF-1α基因及其下游靶基因VEGF的RNA水平变化

(1)、RNA质量的鉴定

SRNA提取后，首先进行凝胶电泳，比较28S、18S的比例以及5S的量的多少。28S的量不得少于18S，最好是2∶1，不得低于1∶1，若28S的量低于18S，则表明降解比较严重，RNA质量不合格，需重新提取。我们提取的RNA电泳后如图38，28S的量高于18S。进一步应用紫外分光光度计计算A260/A280的比值，比值就在1.8-2.0之间，若超出此比值，表明有DNA或者蛋白污染。

(2)、HIF-1α及基下游基因VEGF的核酸水平的变化

为了探讨HIF-1α及其诱变体在促进增殖的过程中，表达水平的变化，我们检测了HIF-1α及其下游基因VEGF的核酸水平的改变。结果表明HIF-1α基因及其诱变基因的腺病毒载体感染的HUVEC核酸表达水平均较Ad-LacZ腺病毒感染的HUVEC升高，本研究以GAPDH为内对照。结果见图39。

进一步，我们用RT-PCR的方法检测了VEGF表达水平，VEGF是HIF-1α基因明确的下游调控靶基因，而且是确认的内皮细胞增殖的重要促进基因。结果表明，VEGF在HIF-1α基因及其诱变体转染的HUVEC中表达均高于对照组(Adeno-LacZ组)，结果见图40。

2.3.6HIF-1α及其诱变体蛋白水平的变化

结果可见HIF-1α及其诱变体转染的3组HIF-1α蛋白表达均较对照组高，以Lami n对内对照。见图41。

实施例3腺病毒介导的HIF-1α基因对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响

3.1材料

3.1.1实验对象

SPF级雄性Wistar大鼠，10-12周龄，体重210-250g(230g±20g)。

3.1.2主要仪器及试剂

NSX-6000型数字血管X射线摄影Neusoft公司生产

装置

欧乃派克^TM(350mg I/ml)上海安盛药业有限公司

3.2方法

3.2.1基因转染方法：

大鼠后肢缺血模型的制备：Wistar雄性大鼠70只，体重210～250g，10％水合氯醛(3～4μl/g)腹腔注射麻醉。在严格无菌条件下，在左侧(后肢)大腿前方做纵形切口，暴露股动脉起始端及其分支，以细手术线结扎并离断股动脉，同时结扎下肢远端及分支血管，然后缝合皮肤。继续饲养。

急性下肢缺血模型建立成功后，即刻对大鼠进行基因转染。70只急性下肢缺血Wistar雄性大鼠随机分为7组，每组10只。在缺血局部肌肉内分5点(血管走向收肌内侧3点、外侧2点)，分别注射下列物质：生理盐水、Ad-LacZ；Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564以及Ad-HIF-1α_564/803，总容积为500μl。病毒滴度为4×10⁹OPU/cell以上。生理盐水组在麻醉后，只做皮肤切开缝合，不做血管结扎，不注射任何物质。

3.2.2DSA血管造影

每组大鼠在基因转染后第28天，用10％水合氯醛(3-4μl/g)腹腔注射麻醉后，于腹正中纵向切开皮肤及腹壁各层，打开腹腔，暴露腹主动脉。用5号静脉穿刺针顺行穿刺腹主动脉成功后，固定针头，注入2ml肝素盐水，调整机头位置后，用稀释一倍的350g I/ml欧乃派克进行血管造影，以35桢/分的速度连续摄像记录。

3.2.3制作下肢动脉铸型标本

基因注射第28天，过量麻醉处死大鼠，切开腹腔，暴露腹主动脉，插管固定，分次灌注5％及15％的有色填充剂进行下肢动脉血管铸型，24-36小时后去皮，并用碱腐蚀法去除肌肉组织，保留骨骼及动脉。对比各组的新生血管情况。

3.3结果

3.3.1DSA血管造影

基因转染后第28天造影结果显示：基因组(Ad-HIF-1α_nature[见图42C]、Ad-HIF-1α₅₆₄[见图42D]、Ad-HIF-1α_402/564[见图42E]以及Ad-HIF-1α_564/803[见图42F])术侧及对侧的血管密度明显多于非基因组(生理盐水组[见图42A]和Ad-LacZ组[见图42B])，而各基因组之间的差别不明显。

3.3.2血管铸型结果

基因组(Ad-HIF-1α_nature、Ad-HIF-1α₅₆₄、Ad-HIF-1α_402/564以及Ad-HIF-1α_564/803)术侧的毛细血管密度明显多于非基因组(生理盐水组[见图43A]和Ad-LacZ组[见图43B])，且Ad-HIF-1α₅₆₄[见图43D]、Ad-HIF-1α_402/564[见图43E]以及Ad-HIF-1α_564/803[见图43F]三组毛细血管密度明显多于野生型Ad-HIF-1α_nature[见图43C]组，其中尤以Ad-HIF-1α_564/803组最明显。

表1-A

表1-B

表2

感染基因类别	例数	Luciferase activity
			Ad-LacZ×control	3	2319.1±165.9
Ad-HIF-1αnature×control	3	2047.0±201.4
			Ad-HIF-1α564×control	3	2220.2±244.3
Ad-HIF-1α564/803×control	3	1989.4±118.1
			F值		1.97
P值		0.197

表3

感染基因类别	例数	Luciferase activity
			Ad-LacZ×HRE	3	2124.8±269.8＊
Ad-HIF-1αnature×HRE	3	2031.9±272.7＊△
			Ad-HIF-1α564×HRE	3	2030.7±238.7＊△▲
Ad-HIF-1α564/803×HRE	3	3029.1±66.5
			F值		13.065
P值		0.002

^＊vsAd-HIF-1α_564/803P＜0.01，△vsAd-Lacz×HRE P＞0.05，▲vs Ad-HIF-1α_nature×HREP＞0.05

表4

^*主效应的F统计量和P值；#交互效应的F统计量和P值。

序列表

SEQ ID NO：1

(i)SEQUENCE CHARACTERISTICS：

(A)TYPE 1：nucleic acid

TYPE 2：amino acid

(B)LENGTH 1：3958base pairs

LENGTH 2：826amino acids

(C)STRANDEDNESS 1：single

STRANDEDNESS 1：not relevant

(D)TOPOLOGY：linear

(ii)MOLECULE TYPE 1：DNA

MOLECULE TYPE 2：Protein

                                GT  GCTGCCTCGT  CTGAGGGGAC      12

AGGAGGATCA  CCCTCTTCGT  CGCTTCGGCC  AGTGTGTCGG  GCTGGGCCCT      62

GACAAGCCAC  CTGAGGAGAG  GCTCGGAGCC  GGGCCCGGAC  CCCGGCGATT     112

GCCGCCCGCT  TCTCTCTAGT  CTCACGAGGG  GTTTCCCGCC  TCGCACCCCC     162

ACCTCTGGAC  TTGCCTTTCC  TTCTCTTCTC  CGCGTGTGGA  GGGAGCCAGC     212

GCTTAGGCCG  GAGCGAGCCT  GGGGGCCGCC  CGCCGTGAAG  ACATCGCGGG     262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA    317

                Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

                 1               5                   10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC    362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

            15                   20                  25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT    407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala

             30                  35                  40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG    452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

             45                  50                  55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA    497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

             60                  65                  70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA    542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

             75                  80                  85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG    587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

             90                  95                 100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG    632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

            105                 110                 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT    677

Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser

            120                 125                 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA     722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

            135                 140                 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA     767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

            150                 155                 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT     812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

            165                 170                 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA     857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

            180                 185                 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC     902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

            195                 200                 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG     947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val

            210                 215                 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT     992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

            225                 230                 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA    1037

Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys

            240                 245                 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG    1082

Phe  Ser Tyr Cys Asp Glu ArgIle Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

            255                 260                 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT    1127

Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

            270                 275                 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT    1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

            285                 290                 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA    1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

            300                 305                 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC    1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

            315                 320                 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT    1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

            330                 335                 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA    1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

            345                 350                 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG    1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

            360                 365                 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC    1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

            375                 380                 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC    1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

            390                 395                 400

CCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC    1532

Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

            405                 410                 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT    1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr

            420                 425                 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA    1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

            435                 440                 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA    1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

            450                 455                 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA    1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

            465                 470                 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG    1757

Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met

            480                 485                 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT    1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

            495                 500                 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT    1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

            510                 515                 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA    1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

            525                 530                 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT    1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

            540                 545                 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT CCC TAT ATC    1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr Ile

            555                 560                 565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA    2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

            570                 575                 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA    2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

            585                 590                 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT    2117

Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr

            600                 605                 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA    2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

            615                 620                 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT    2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

            630                 635                 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA    2252

Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

            645                 650                 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA    2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

            660                 665                 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA    2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

            675                 680                 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT    2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

            690                 695                 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT    2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala    809

            705                 710                 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA    2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

            720                 725                 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT    2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

            735                 740                 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT    2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

            750                 755                 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT    2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

            765                 770                 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA    2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

            780                 785                 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT AAT GCT CCT ATA    2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile

            795                 800                 805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT    2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

            810                 815                 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT  AATTTCATTC  CTTTTTTTGG     2795

Leu Asp Gln Val Asn End

            825

ACACTGGTGG  CTCACTACCT AAAGCAGTCT  ATTTATATTT  TCTACATCTA      2845

ATTTTAGAAG  CCTGGCTACA ATACTGCACA  AACTTGGTTA  GTTCAATTTT      2895

TGATCCCCTT  TCTACTTAAT  TTACATTAAT  GCTCTTTTTT  AGTATGTTCT  2945

TTAATGCTGG  ATCACAGACA  GCTCATTTTC  TCAGTTTTTT  GGTATTTAAA  2995

CCATTGCATT  GCAGTAGCAT  CATTTTAAAA  AATGCACCTT  TTTATTTATT  3045

TATTTTTGGC  TAGGGAGTTT  ATCCCTTTTT  CGAATTATTT  TTAAGAAGAT  3095

GCCAATATAA  TTTTTGTAAG  AAGGCAGTAA  CCTTTCATCA  TGATCATAGG  3145

CAGTTGAAAA  ATTTTTACAC  CTTTTTTTTC  ACATTTTACA  TAAATAATAA  3195

TGCTTTGCCA  GCAGTACGTG  GTAGCCACAA  TTGCACAATA  TATTTTCTTA  3245

AAAAATACCA  GCAGTTACTC  ATGGAATATA  TTCTGCGTTT  ATAAAACTAG  3295

TTTTTAAGAA  GAAATTTTTT  TTGGCCTATG  AAATTGTTAA  ACCTGGAACA  3345

TGACATTGTT  AATCATATAA  TAATGATTCT  TAAATGCTGT  ATGGTTTATT  3395

ATTTAAATGG  GTAAAGCCAT  TTACATAATA  TAGAAAGATA  TGCATATATC  3445

TAGAAGGTAT  GTGGCATTTA  TTTGGATAAA  ATTCTCAATT  CAGAGAAATC  3495

ATCTGATGTT  TCTATAGTCA  CTTTGCCAGC  TCAAAAGAAA  ACAATACCCT  3545

ATGTAGTTGT  GGAAGTTTAT  GCTAATATTG  TGTAACTGAT  ATTAAACCTA  3595

AATGTTCTGC  CTACCCTGTT  GGTATAAAGA  TATTTTGAGC  AGACTGTAAA  3645

CAAGAAAAAA  AAAATCATGC  ATTCTTAGCA  AAATTGCCTA  GTATGTTAAT  3695

TTGCTCAAAA  TACAATGTTT  GATTTTATGC  ACTTTGTCGC  TATTAACATC  3745

CTTTTTTTCA  TGTAGATTTC  AATAATTGAG  TAATTTTAGA  AGCATTATTT  3895

TAGGAATATA  TAGTTGTCAC  AGTAAATATC  TTGTTTTTTC  TATGTACATT  3845

GTACAAATTT  TTCATTCCTT  TTGCTCTTTG  TGGTTGGATC  TAACACTAAC  3895

TGTATTGTTT  TGTTACATCA  AATAAACATC  TTCTGTGGAC  CAGGAAAAAA  3945

AAAAAAAAAA  AAA                                             3958

SEQ ID NO：2

   (i)SEQUENCE CHARACTERISTICS：

        (A)TYPE 1：nucleic acid

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           STRANDEDNESS 1：not relevant

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   (ii)MOLECULE  TYPE 1：DNA

       MOLECULE  TYPE 2：Protein

                                GT  GCTGCCTCGT  CTGAGGGGAC    12

AGGAGGATCA  CCCTCTTCGT  CGCTTCGGCC  AGTGTGTCGG  GCTGGGCCCT    62

GACAAGCCAC  CTGAGGAGAG  GCTCGGAGCC  GGGCCCGGAC  CCCGGCGATT   112

GCCGCCCGCT  TCTCTCTAGT  CTCACGAGGG  GTTTCCCGCC  TCGCACCCCC   162

ACCTCTGGAC  TTGCCTTTCC  TTCTCTTCTC  CGCGTGTGGA  GGGAGCCAGC   212

GCTTAGGCCG  GAGCGAGCCT  GGGGGCCGCC  CGCCGTGAAG  ACATCGCGGG     262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA    317

                Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

                 1               5                   10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC    362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

            15                  20                   25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT    407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala

            30                  35                   40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG    452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

            45                  50                   55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA    497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

            60                  65                   70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA    542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

            75                  80                   85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG    587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

            90                  95                  100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG    632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

            105                 110                 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT    677

Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser

            120                 125                 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA    722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

            135                 140                 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA    767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

            150                 155                 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT    812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

            165                 170                 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA    857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

            180                 185                 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC    902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

            195                 200                 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG    947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val

            210                 215                 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT    992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

            225                 230                 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA    1037

Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lyg

            240                 245                 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG    1082

Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

            255                 260                 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT    1127

Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

            270                 275                 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT    1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

            285                 290                 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA    1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

            300                 305                 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC    1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

            315                 320                 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT    1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

            330                 335                 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA    1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

            345                 350                 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG    1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

            360                 365                 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC    1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

            375                 380                 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC    1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

            390                 395                 400

CCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC    1532

Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

            405                 410                 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT    1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr

            420                 425                 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA    1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

            435                 440                 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA    1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

            450                 455                 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA    1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

            465                 470                 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG    1757

Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met

            480                 485                 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT    1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

            495                 500                 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT    1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

            510                 515                 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA    1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

            525                 530                 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT    1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

            540                 545                 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT GCC TAT ATC    1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Ala Tyr Ile

            555                 560             ▲  565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA    2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

            570                 575                 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA    2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

            585                 590                 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT    2117

Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr

            600                 605                 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA    2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

            615                 620                 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT    2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

            630                 635                 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA    2252

Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

            645                 650                 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA    2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

            660                 665                 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA    2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

            675                 680                 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT    2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

            690                 695                 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT    2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala    809

            705                 710                 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA    2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

            720                 725                 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT    2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

            735                 740                 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT    2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

            750                 755                 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT    2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

            765                 770                 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA    2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

            780                 785                 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT AAT GCT CCT ATA    2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile

            795                 800                 805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT    2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

            810                 815                 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT  AATTTCATTC  CTTTTTTTGG     2795

Leu Asp Gln Val Asn End

            825

ACACTGGTGG  CTCACTACCT  AAAGCAGTCT  ATTTATATTT  TCTACATCTA  2845

ATTTTAGAAG  CCTGGCTACA  ATACTGCACA  AACTTGGTTA  GTTCAATTTT  2895

TGATCCCCTT  TCTACTTAAT  TTACATTAAT  GCTCTTTTTT  AGTATGTTCT  2945

TTAATGCTGG  ATCACAGACA  GCTCATTTTC  TCAGTTTTTT  GGTATTTAAA  2995

CCATTGCATT  GCAGTAGCAT  CATTTTAAAA  AATGCACCTT  TTTATTTATT  3045

TATTTTTGGC  TAGGGAGTTT  ATCCCTTTTT  CGAATTATTT  TTAAGAAGAT  3095

GCCAATATAA  TTTTTGTAAG  AAGGCAGTAA  CCTTTCATCA  TGATCATAGG  3145

CAGTTGAAAA  ATTTTTACAC  CTTTTTTTTC  ACATTTTACA  TAAATAATAA  3195

TGCTTTGCCA  GCAGTACGTG  GTAGCCACAA  TTGCACAATA  TATTTTCTTA  3245

AAAAATACCA  GCAGTTACTC  ATGGAATATA  TTCTGCGTTT  ATAAAACTAG  3295

TTTTTAAGAA  GAAATTTTTT  TTGGCCTATG  AAATTGTTAA  ACCTGGAACA  3345

TGACATTGTT  AATCATATAA  TAATGATTCT  TAAATGCTGT  ATGGTTTATT  3395

ATTTAAATGG  GTAAAGCCAT  TTACATAATA  TAGAAAGATA  TGCATATATC  3445

TAGAAGGTAT  GTGGCATTTA  TTTGGATAAA  ATTCTCAATT  CAGAGAAATC  3495

ATCTGATGTT  TCTATAGTCA  CTTTGCCAGC  TCAAAAGAAA  ACAATACCCT  3545

ATGTAGTTGT  GGAAGTTTAT  GCTAATATTG  TGTAACTGAT  ATTAAACCTA  3595

AATGTTCTGC  CTACCCTGTT  GGTATAAAGA  TATTTTGAGC  AGACTGTAAA  3645

CAAGAAAAAA  AAAATCATGC  ATTCTTAGCA  AAATTGCCTA  GTATGTTAAT  3695

TTGCTCAAAA  TACAATGTTT  GATTTTATGC  ACTTTGTCGC  TATTAACATC  3745

CTTTTTTTCA  TGTAGATTTC  AATAATTGAG  TAATTTTAGA  AGCATTATTT  3895

TAGGAATATA  TAGTTGTCAC  AGTAAATATC  TTGTTTTTTC  TATGTACATT  3845

GTACAAATTT  TTCATTCCTT  TTGCTCTTTG  TGGTTGGATC  TAACACTAAC  3895

TGTATTGTTT  TGTTACATCA  AATAAACATC  TTCTGTGGAC  CAGGAAAAAA  3945

AAAAAAAAAA  AAA                                             3958

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   (i)SEQUENCE CHARACTERISTICS：

        (A)TYPE 1：nucleic acid

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           STRANDEDNESS 1：not relevant

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   (ii)MOLECULE  TYPE 1：DNA

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                                GT  GCTGCCTCGT  CTGAGGGGAC      12

AGGAGGATCA  CCCTCTTCGT  CGCTTCGGCC  AGTGTGTCGG  GCTGGGCCCT      62

GACAAGCCAC  CTGAGGAGAG  GCTCGGAGCC  GGGCCCGGAC  CCCGGCGATT     112

GCCGCCCGCT  TCTCTCTAGT  CTCACGAGGG  GTTTCCCGCC  TCGCACCCCC     162

ACCTCTGGAC  TTGCCTTTCC  TTCTCTTCTC  CGCGTGTGGA  GGGAGCCAGC     212

GCTTAGGCCG  GAGCGAGCCT  GGGGGCCGCC  CGCCGTGAAG  ACATCGCGGG     262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA    317

                Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

                 1               5                   10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC    362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

            15                  20                   25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT    407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala

            30                  35                   40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG    452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

            45                  50                   55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA    497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

            60                  65                   70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA    542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

             75                  80                  85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG     587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

             90                 95                  100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG     632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

            105                 110                 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT     677

Asn Lys Tyr MetGly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His  Ser

            120                 125                 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA     722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

            135                 140                 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA     767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

            150                 155                 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT     812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

            165                 170                 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA     857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

            180                 185                 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC     902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

            195                 200                 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG     947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val

            210                 215                 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT     992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

            225                 230                 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA    1037

Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys

            240                 245                 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG    1082

Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

            255                 260                 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT    1127

Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

            270                 275                 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT    1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

            285                 290                 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA    1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

            300                 305                 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC    1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

            315                 320                 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT    1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

            330                 335                 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA    1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

            345                 350                 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG    1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

            360                 365                 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC    1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

            375                 380                 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC    1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

            390                 395                 400

GCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC    1532

Ala Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

▲          405                 410                 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT    1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr

            420                 425                 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA    1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

            435                 440                 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA    1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

            450                 455                 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA    1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

            465                 470                 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG    1757

Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met

            480                 485                 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT    1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

            495                 500                 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT    1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

            510                 515                 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA    1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

            525                 530                 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT    1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

            540                 545                 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT GCC TAT ATC    1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Ala Tyr Ile

            555                 560             ▲  565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA    2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

            570                 575                 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA    2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

            585                 590                 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT    2117

Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr

            600                 605                 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA    2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

            615                 620                 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT    2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

            630                 635                 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA    2252

Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

            645                 650                 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA    2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

            660                 665                 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA    2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

            675                 680                 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT    2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

            690                 695                 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT    2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala    809

            705                 710                 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA    2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

            720                 725                 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT    2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

            735                 740                 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT    2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

            750                 755                 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT    2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

            765                 770                 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA    2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

            780                 785                 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT AAT GCT CCT ATA    2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Asn Ala Pro Ile

            795                 800                 805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT 2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

            810                 815                 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT  AATTTCATTC  CTTTTTTTGG  2795

Leu Asp Gln Val Asn End

            825

ACACTGGTGG  CTCACTACCT  AAAGCAGTCT  ATTTATATTT  TCTACATCTA  2845

ATTTTAGAAG  CCTGGCTACA  ATACTGCACA  AACTTGGTTA  GTTCAATTTT  2895

TGATCCCCTT  TCTACTTAAT  TTACATTAAT  GCTCTTTTTT  AGTATGTTCT  2945

TTAATGCTGG  ATCACAGACA  GCTCATTTTC  TCAGTTTTTT  GGTATTTAAA  2995

CCATTGCATT  GCAGTAGCAT  CATTTTAAAA  AATGCACCTT  TTTATTTATT  3045

TATTTTTGGC  TAGGGAGTTT  ATCCCTTTTT  CGAATTATTT  TTAAGAAGAT  3095

GCCAATATAA  TTTTTGTAAG  AAGGCAGTAA  CCTTTCATCA  TGATCATAGG  3145

CAGTTGAAAA  ATTTTTACAC  CTTTTTTTTC  ACATTTTACA  TAAATAATAA  3195

TGCTTTGCCA  GCAGTACGTG  GTAGCCACAA  TTGCACAATA  TATTTTCTTA  3245

AAAAATACCA  GCAGTTACTC  ATGGAATATA  TTCTGCGTTT  ATAAAACTAG  3295

TTTTTAAGAA  GAAATTTTTT  TTGGCCTATG  AAATTGTTAA  ACCTGGAACA  3345

TGACATTGTT  AATCATATAA  TAATGATTCT  TAAATGCTGT  ATGGTTTATT  3395

ATTTAAATGG  GTAAAGCCAT  TTACATAATA  TAGAAAGATA  TGCATATATC  3445

TAGAAGGTAT  GTGGCATTTA  TTTGGATAAA  ATTCTCAATT  CAGAGAAATC  3495

ATCTGATGTT  TCTATAGTCA  CTTTGCCAGC  TCAAAAGAAA  ACAATACCCT  3545

ATGTAGTTGT  GGAAGTTTAT  GCTAATATTG  TGTAACTGAT  ATTAAACCTA  3595

AATGTTCTGC  CTACCCTGTT  GGTATAAAGA  TATTTTGAGC  AGACTGTAAA  3645

CAAGAAAAAA  AAAATCATGC  ATTCTTAGCA  AAATTGCCTA  GTATGTTAAT  3695

TTGCTCAAAA  TACAATGTTT  GATTTTATGC  ACTTTGTCGC  TATTAACATC  3745

CTTTTTTTCA  TGTAGATTTC  AATAATTGAG  TAATTTTAGA  AGCATTATTT  3895

TAGGAATATA  TAGTTGTCAC  AGTAAATATC  TTGTTTTTTC  TATGTACATT  3845

GTACAAATTT  TTCATTCCTT  TTGCTCTTTG  TGGTTGGATC  TAACACTAAC  3895

TGTATTGTTT  TGTTACATCA  AATAAACATC  TTCTGTGGAC  CAGGAAAAAA  3945

AAAAAAAAAA  AAA                                             3958

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GT  GCTGCCTCGT  CTGAGGGGAC    12

AGGAGGATCA  CCCTCTTCGT  CGCTTCGGCC  AGTGTGTCGG  GCTGGGCCCT      62

GACAAGCCAC  CTGAGGAGAG  GCTCGGAGCC  GGGCCCGGAC  CCCGGCGATT     112

GCCGCCCGCT  TCTCTCTAGT  CTCACGAGGG  GTTTCCCGCC  TCGCACCCCC     162

ACCTCTGGAC  TTGCCTTTCC  TTCTCTTCTC  CGCGTGTGGA  GGGAGCCAGC     212

GCTTAGGCCG  GAGCGAGCCT  GGGGGCCGCC  CGCCGTGAAG  ACATCGCGGG     262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA    317

                Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

                 1               5                   10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC    362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

            15                  20                   25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT    407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala

            30                  35                   40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG    452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

            45                  50                   55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA    497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

            60                  65                   70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA    542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

            75                  80                   85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG    587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

            90                  95                  100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG    632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

            105                 110                 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT    677

Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser

            120                 125                 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA    722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

            135                 140                 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA    767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

            150                 155                 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT    812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

            165                 170                 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA     857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

            180                 185                 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC     902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

            195                 200                 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG     947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val

            210                 215                 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT     992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

            225                 230                 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA    1037

Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys

            240                 245                 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG    1082

Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

            255                 260                 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT    1127

Pro Glu Glu Leu Leu Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

            270                 275                 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT    1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

            285                 290                 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA    1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

            300                 305                 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC    1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

            315                 320                 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT    1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

            330                 335                 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA    1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

            345                 350                 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG    1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

            360                 365                 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC    1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

            375                 380                 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC    1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

            390                 395                 400

CCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC    1532

Pro Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

            405                 410                 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT    1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val  Pro Leu Tyr

            420                 425                 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA    1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

            435                 440                 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA    1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

            450                 455                 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA    1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

            465                 470                 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG    1757

Lys Leu Glu pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser phe Thr Met

            480                 485                 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT    1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

            495                 500                 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT    1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

            510                 515                 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA    1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

            525                 530                 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT    1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

            540                 545                 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT GCC TAT ATC    1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Ala Tyr Ile

            555                 560             ▲  565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA    2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

            570                 575                 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA    2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

            585                 590                 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT    2117

Ser Thr Val Thr Val Phe Gln Gln Thr Gln Ile Gln Glu Pro Thr

            600                 605                 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA    2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

            615                 620                 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT    2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

            630                 635                 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA    2252

Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

            645                 650                 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA    2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

            660                 665                 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA    2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

            675                 680                 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT    2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

            690                 695                 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT    2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala    809

            705                 710                 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA    2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

            720                 725                 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT    2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

            735                 740                 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT    2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

            750                 755                 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT    2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

            765                 770                 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA    2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

            780                 785                 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT GCT GCT CCT ATA    2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Ala Ala Pro Ile

            795                 800         ▲      805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT    2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

            810                 815                 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT  AATTTCATTC  CTTTTTTTGG     2795

Leu Asp Gln Val Asn End

            825

ACACTGGTGG  CTCACTACCT  AAAGCAGTCT  ATTTATATTT  TCTACATCTA     2845

ATTTTAGAAG  CCTGGCTACA  ATACTGCACA  AACTTGGTTA  GTTCAATTTT     2895

TGATCCCCTT  TCTACTTAAT  TTACATTAAT  GCTCTTTTTT  AGTATGTTCT     2945

TTAATGCTGG  ATCACAGACA  GCTCATTTTC  TCAGTTTTTT  GGTATTTAAA     2995

CCATTGCATT  GCAGTAGCAT  CATTTTAAAA  AATGCACCTT  TTTATTTATT     3045

TATTTTTGGC  TAGGGAGTTT  ATCCCTTTTT  CGAATTATTT  TTAAGAAGAT     3095

GCCAATATAA  TTTTTGTAAG  AAGGCAGTAA  CCTTTCATCA  TGATCATAGG     3145

CAGTTGAAAA  ATTTTTACAC  CTTTTTTTTC  ACATTTTACA  TAAATAATAA     3195

TGCTTTGCCA  GCAGTACGTG  GTAGCCACAA  TTGCACAATA  TATTTTCTTA     3245

AAAAATACCA  GCAGTTACTC  ATGGAATATA  TTCTGCGTTT  ATAAAACTAG     3295

TTTTTAAGAA  GAAATTTTTT  TTGGCCTATG  AAATTGTTAA  ACCTGGAACA  3345

TGACATTGTT  AATCATATAA  TAATGATTCT  TAAATGCTGT  ATGGTTTATT  3395

ATTTAAATGG  GTAAAGCCAT  TTACATAATA  TAGAAAGATA  TGCATATATC  3445

TAGAAGGTAT  GTGGCATTTA  TTTGGATAAA  ATTCTCAATT  CAGAGAAATC  3495

ATCTGATGTT  TCTATAGTCA  CTTTGCCAGC  TCAAAAGAAA  ACAATACCCT  3545

ATGTAGTTGT  GGAAGTTTAT  GCTAATATTG  TGTAACTGAT  ATTAAACCTA  3595

AATGTTCTGC  CTACCCTGTT  GGTATAAAGA  TATTTTGAGC  AGACTGTAAA  3645

CAAGAAAAAA  AAAATCATGC  ATTCTTAGCA  AAATTGCCTA  GTATGTTAAT  3695

TTGCTCAAAA  TACAATGTTT  GATTTTATGC  ACTTTGTCGC  TATTAACATC  3745

CTTTTTTTCA  TGTAGATTTC  AATAATTGAG  TAATTTTAGA  AGCATTATTT  3895

TAGGAATATA  TAGTTGTCAC  AGTAAATATC  TTGTTTTTTC  TATGTACATT  3845

GTACAAATTT  TTCATTCCTT  TTGCTCTTTG  TGGTTGGATC  TAACACTAAC  3895

TGTATTGTTT  TGTTACATCA  AATAAACATC  TTCTGTGGAC  CAGGAAAAAA  3945

AAAAAAAAAA  AAA                                             3958

SEQ ID NO：5

   (i)SEQUENCE CHARACTERISTICS：

        (A)TYPE 1：nucleic acid

           TYPE 2：amino acid

        (B)LENGTH 1：3958base pairs

           LENGTH 2：826amino acids

        (C)STRANDEDNESS 1：single

           STRANDEDNESS 1：not relevant

        (D)TOPOLOGY：linear

   (ii)MOLECULE  TYPE 1：DNA

       MOLECULE  TYPE 2：Protein

                                GT  GCTGCCTCGT  CTGAGGGGAC      12

AGGAGGATCA  CCCTCTTCGT  CGCTTCGGCC  AGTGTGTCGG  GCTGGGCCCT      62

GACAAGCCAC  CTGAGGAGAG  GCTCGGAGCC  GGGCCCGGAC  CCCGGCGATT     112

GCCGCCCGCT  TCTCTCTAGT  CTCACGAGGG  GTTTCCCGCC  TCGCACCCCC     162

ACCTCTGGAC  TTGCCTTTCC  TTCTCTTCTC  CGCGTGTGGA  GGGAGCCAGC     212

GCTTAGGCCG  GAGCGAGCCT  GGGGGCCGCC  CGCCGTGAAG  ACATCGCGGG     262

GAC CGA TTC ACC ATG GAG GGC GCC GGC GGC GCG AAC GAC AAG AAA    317

                Met Glu Gly Ala Gly Gly Ala Asn Asp Lys Lys

                 1               5                   10

AAG ATA AGT TCT GAA CGT CGA AAA GAA AAG TCT CGA GAT GCA GCC    362

Lys Ile Ser Ser Glu Arg Arg Lys Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala

            15              20                       25

AGA TCT CGG CGA AGT AAA GAA TCT GAA GTT TTT TAT GAG CTT GCT    407

Arg Ser Arg Arg Ser Lys Glu Ser Glu Val Phe Tyr Glu Leu Ala

            30              35                       40

CAT CAG TTG CCA CTT CCA CAT AAT GTG AGT TCG CAT CTT GAT AAG    452

His Gln Leu Pro Leu Pro His Asn Val Ser Ser His Leu Asp Lys

             45                 50                   55

GCC TCT GTG ATG AGG CTT ACC ATC AGC TAT TTG CGT GTG AGG AAA    497

Ala Ser Val Met Arg Leu Thr Ile Ser Tyr Leu Arg Val Arg Lys

             60                 65                   70

CTT CTG GAT GCT GGT GAT TTG GAT ATT GAA GAT GAC ATG AAA GCA    542

Leu Leu Asp Ala Gly Asp Leu Asp Ile Glu Asp Asp Met Lys Ala

            75                  80                   85

CAG ATG AAT TGC TTT TAT TTG AAA GCC TTG GAT GGT TTT GTT ATG    587

Gln Met Asn Cys Phe Tyr Leu Lys Ala Leu Asp Gly Phe Val Met

            90                  95                  100

GTT CTC ACA GAT GAT GGT GAC ATG ATT TAC ATT TCT GAT AAT GTG    632

Val Leu Thr Asp Asp Gly Asp Met Ile Tyr Ile Ser Asp Asn Val

            105                 110                 115

AAC AAA TAC ATG GGA TTA ACT CAG TTT GAA CTA ACT GGA CAC AGT    677

Asn Lys Tyr Met Gly Leu Thr Gln Phe Glu Leu Thr Gly His Ser

            120                 125                 130

GTG TTT GAT TTT ACT CAT CCA TGT GAC CAT GAG GAA ATG AGA GAA    722

Val Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Met Arg Glu

            135                 140                 145

ATG CTT ACA CAC AGA AAT GGC CTT GTG AAA AAG GGT AAA GAA CAA    767

Met Leu Thr His Arg Asn Gly Leu Val Lys Lys Gly Lys Glu Gln

            150                 155                 160

AAC ACA CAG CGA AGC TTT TTT CTC AGA ATG AAG TGT ACC CTA ACT    812

Asn Thr Gln Arg Ser Phe Phe Leu Arg Met Lys Cys Thr Leu Thr

            165                 170                 175

AGC CGA GGA AGA ACT ATG AAC ATA AAG TCT GCA ACA TGG AAG GTA    857

Ser Arg Gly Arg Thr Met Asn Ile Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val

            180                 185                 190

TTG CAC TGC ACA GGC CAC ATT CAC GTA TAT GAT ACC AAC AGT AAC    902

Leu His Cys Thr Gly His Ile His Val Tyr Asp Thr Asn Ser Asn

            195                 200                 205

CAA CCT CAG TGT GGG TAT AAG AAA CCA CCT ATG ACC TGC TTG GTG    947

Gln Pro Gln Cys Gly Tyr Lys Lys Pro Pro Met Thr Cys Leu Val

            210                 215                 220

CTG ATT TGT GAA CCC ATT CCT CAC CCA TCA AAT ATT GAA ATT CCT    992

Leu Ile Cys Glu Pro Ile Pro His Pro Ser Asn Ile Glu Ile Pro

            225                 230                 235

TTA GAT AGC AAG ACT TTC CTC AGT CGA CAC AGC CTG GAT ATG AAA   1037

Leu Asp Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Leu Asp Met Lys

            240                 245                 250

TTT TCT TAT TGT GAT GAA AGA ATT ACC GAA TTG ATG GGA TAT GAG   1082

Phe Ser Tyr Cys Asp Glu Arg Ile Thr Glu Leu Met Gly Tyr Glu

            255                 260                 265

CCA GAA GAA CTT TTA GGC CGC TCA ATT TAT GAA TAT TAT CAT GCT   1127

Pro Glu Glu Leu Lau Gly Arg Ser Ile Tyr Glu Tyr Tyr His Ala

            270                 275                 280

TTG GAC TCT GAT CAT CTG ACC AAA ACT CAT CAT GAT ATG TTT ACT    1172

Leu Asp Ser Asp His Leu Thr Lys Thr His His Asp Met Phe Thr

            285                 290                 295

AAA GGA CAA GTC ACC ACA GGA CAG TAC AGG ATG CTT GCC AAA AGA    1217

Lys Gly Gln Val Thr Thr Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys Arg

            300                 305                 310

GGT GGA TAT GTC TGG GTT GAA ACT CAA GCA ACT GTC ATA TAT AAC    1262

Gly Gly Tyr Val Trp Val Glu Thr Gln Ala Thr Val Ile Tyr Asn

            315                 320                 325

ACC AAG AAT TCT CAA CCA CAG TGC ATT GTA TGT GTG AAT TAC GTT    1307

Thr Lys Asn Ser Gln Pro Gln Cys Ile Val Cys Val Asn Tyr Val

            330                 335                 340

GTG AGT GGT ATT ATT CAG CAC GAC TTG ATT TTC TCC CTT CAA CAA    1352

Val Ser Gly Ile Ile Gln His Asp Leu Ile Phe Ser Leu Gln Gln

            345                 350                 355

ACA GAA TGT GTC CTT AAA CCG GTT GAA TCT TCA GAT ATG AAA ATG    1397

Thr Glu Cys Val Leu Lys Pro Val Glu Ser Ser Asp Met Lys Met

            360                 365                 370

ACT CAG CTA TTC ACC AAA GTT GAA TCA GAA GAT ACA AGT AGC CTC    1442

Thr Gln Leu Phe Thr Lys Val Glu Ser Glu Asp Thr Ser Ser Leu

            375                 380                 385

TTT GAC AAA CTT AAG AAG GAA CCT GAT GCT TTA ACT TTG CTG GCC    1487

Phe Asp Lys Leu Lys Lys Glu Pro Asp Ala Leu Thr Leu Leu Ala

            390                 395                 400

GCA GCC GCT GGA GAC ACA ATC ATA TCT TTA GAT TTT GGC AGC AAC    1532

Ala Ala Ala Gly Asp Thr Ile Ile Ser Leu Asp Phe Gly Ser Asn

▲          405                 410                 415

GAC ACA GAA ACT GAT GAC CAG CAA CTT GAG GAA GTA CCA TTA TAT    1577

Asp Thr Glu Thr Asp Asp Gln Gln Leu Glu Glu Val Pro Leu Tyr

            420                 425                 430

AAT GAT GTA ATG CTC CCC TCA CCC AAC GAA AAA TTA CAG AAT ATA    1622

Asn Asp Val Met Leu Pro Ser Pro Asn Glu Lys Leu Gln Asn Ile

            435                 440                 445

AAT TTG GCA ATG TCT CCA TTA CCC ACC GCT GAA ACG CCA AAG CCA    1667

Asn Leu Ala Met Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Thr Pro Lys Pro

            450                 455                 460

CTT CGA AGT AGT GCT GAC CCT GCA CTC AAT CAA GAA GTT GCA TTA    1712

Leu Arg Ser Ser Ala Asp Pro Ala Leu Asn Gln Glu Val Ala Leu

            465                 470                 475

AAA TTA GAA CCA AAT CCA GAG TCA CTG GAA CTT TCT TTT ACC ATG    1757

Lys Leu Glu Pro Asn Pro Glu Ser Leu Glu Leu Ser Phe Thr Met

            480                 485                 490

CCC CAG ATT CAG GAT CAG ACA CCT AGT CCT TCC GAT GGA AGC ACT    1802

Pro Gln Ile Gln Asp Gln Thr Pro Ser Pro Ser Asp Gly Ser Thr

            495                 500                 505

AGA CAA AGT TCA CCT GAG CCT AAT AGT CCC AGT GAA TAT TGT TTT    1847

Arg Gln Ser Ser Pro Glu Pro Asn Ser Pro Ser Glu Tyr Cys Phe

            510                 515                 520

TAT GTG GAT AGT GAT ATG GTC AAT GAA TTC AAG TTG GAA TTG GTA    1892

Tyr Val Asp Ser Asp Met Val Asn Glu Phe Lys Leu Glu Leu Val

            525                 530                 535

GAA AAA CTT TTT GCT GAA GAC ACA GAA GCA AAG AAC CCA TTT TCT    1937

Glu Lys Leu Phe Ala Glu Asp Thr Glu Ala Lys Asn Pro Phe Ser

            540                 545                 550

ACT CAG GAC ACA GAT TTA GAC TTG GAG ATG TTA GCT GCC TAT ATC    1982

Thr Gln Asp Thr Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Ala Tyr Ile

            555                 560             ▲  565

CCA ATG GAT GAT GAC TTC CAG TTA CGT TCC TTC GAT CAG TTG TCA    2027

Pro Met Asp Asp Asp Phe Gln Leu Arg Ser Phe Asp Gln Leu Ser

            570                 575                 580

CCA TTA GAA AGC AGT TCC GCA AGC CCT GAA AGC GCA AGT CCT CAA    2072

Pro Leu Glu Ser Ser Ser Ala Ser Pro Glu Ser Ala Ser Pro Gln

            585                 590                 595

AGC ACA GTT ACA GTA TTC CAG CAG ACT CAA ATA CAA GAA CCT ACT    2117

Ser Thr Val Thr Val  Phe Gln Gln Thr GlnIle Gln Glu Pro Thr

            600                 605                 610

GCT AAT GCC ACC ACT ACC ACT GCC ACC ACT GAT GAA TTA AAA ACA    2162

Ala Asn Ala Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Asp Glu Leu Lys Thr

            615                 620                 625

GTG ACA AAA GAC CGT ATG GAA GAC ATT AAA ATA TTG ATT GCA TCT    2207

Val Thr Lys Asp Arg Met Glu Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Ser

            630                 635                 640

CCA TCT CCT ACC CAC ATA CAT AAA GAA ACT ACT AGT GCC ACA TCA    2252

Pro Ser Pro Thr His Ile His Lys Glu Thr Thr Ser Ala Thr Ser

            645                 650                 655

TCA CCA TAT AGA GAT ACT CAA AGT CGG ACA GCC TCA CCA AAC AGA    2297

Ser Pro Tyr Arg Asp Thr Gln Ser Arg Thr Ala Ser Pro Asn Arg

            660                 665                 670

GCA GGA AAA GGA GTC ATA GAA CAG ACA GAA AAA TCT CAT CCA AGA    2342

Ala Gly Lys Gly Val Ile Glu Gln Thr Glu Lys Ser His Pro Arg

            675                 680                 685

AGC CCT AAC GTG TTA TCT GTC GCT TTG AGT CAA AGA ACT ACA GTT    2387

Ser Pro Asn Val Leu Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Thr Thr Val

            690                 695                 700

CCT GAG GAA GAA CTA AAT CCA AAG ATA CTA GCT TTG CAG AAT GCT    2432

Pro Glu Glu Glu Leu Asn Pro Lys Ile Leu Ala Leu Gln Asn Ala    809

            705                 710                 715

CAG AGA AAG CGA AAA ATG GAA CAT GAT GGT TCA CTT TTT CAA GCA    2477

Gln Arg Lys Arg Lys Met Glu His Asp Gly Ser Leu Phe Gln Ala

            720                 725                 730

GTA GGA ATT GGA ACA TTA TTA CAG CAG CCA GAC GAT CAT GCA GCT    2522

Val Gly Ile Gly Thr Leu Leu Gln Gln Pro Asp Asp His Ala Ala

            735                 740                 745

ACT ACA TCA CTT TCT TGG AAA CGT GTA AAA GGA TGC AAA TCT AGT    2567

Thr Thr Ser Leu Ser Trp Lys Arg Val Lys Gly Cys Lys Ser Ser

            750                 755                 760

GAA CAG AAT GGA ATG GAG CAA AAG ACA ATT ATT TTA ATA CCC TCT    2612

Glu Gln Asn Gly Met Glu Gln Lys Thr Ile Ile Leu Ile Pro Ser

            765                 770                 775

GAT TTA GCA TGT AGA CTG CTG GGG CAA TCA ATG GAT GAA AGT GGA    2657

Asp Leu Ala Cys Arg Leu Leu Gly Gln Ser Met Asp Glu Ser Gly

            780                 785                 790

TTA CCA CAG CTG ACC AGT TAT GAT TGT GAA GTT GCT GCT CCT ATA    2702

Leu Pro Gln Leu Thr Ser Tyr Asp Cys Glu Val Ala Ala Pro Ile

            795                 800          ▲     805

CAA GGC AGC AGA AAC CTA CTG CAG GGT GAA GAA TTA CTC AGA GCT    2747

Gln Gly Ser Arg Asn Leu Leu Gln Gly Glu Glu Leu Leu Arg Ala

            810                 815                 820

TTG GAT CAA GTT AAC TGA GCTTTTTCTT  AATTTCATTC  CTTTTTTTGG     2795

Leu Asp Gln Val Asn End

            825

ACACTGGTGG  CTCACTACCT  AAAGCAGTCT  ATTTATATTT  TCTACATCTA     2845

ATTTTAGAAG  CCTGGCTACA  ATACTGCACA  AACTTGGTTA  GTTCAATTTT     2895

TGATCCCCTT  TCTACTTAAT  TTACATTAAT  GCTCTTTTTT  AGTATGTTCT     2945

TTAATGCTGG  ATCACAGACA  GCTCATTTTC  TCAGTTTTTT  GGTATTTAAA     2995

CCATTGCATT  GCAGTAGCAT  CATTTTAAAA  AATGCACCTT  TTTATTTATT     3045

TATTTTTGGC  TAGGGAGTTT  ATCCCTTTTT  CGAATTATTT  TTAAGAAGAT     3095

GCCAATATAA  TTTTTGTAAG  AAGGCAGTAA  CCTTTCATCA  TGATCATAGG     3145

CAGTTGAAAA  ATTTTTACAC  CTTTTTTTTC  ACATTTTACA  TAAATAATAA     3195

TGCTTTGCCA  GCAGTACGTG  GTAGCCACAA  TTGCACAATA  TATTTTCTTA     3245

AAAAATACCA  GCAGTTACTC  ATGGAATATA  TTCTGCGTTT  ATAAAACTAG     3295

TTTTTAAGAA  GAAATTTTTT  TTGGCCTATG  AAATTGTTAA  ACCTGGAACA     3345

TGACATTGTT  AATCATATAA  TAATGATTCT  TAAATGCTGT  ATGGTTTATT     3395

ATTTAAATGG  GTAAAGCCAT  TTACATAATA  TAGAAAGATA  TGCATATATC     3445

TAGAAGGTAT  GTGGCATTTA  TTTGGATAAA  ATTCTCAATT  CAGAGAAATC     3495

ATCTGATGTT  TCTATAGTCA  CTTTGCCAGC  TCAAAAGAAA  ACAATACCCT     3545

ATGTAGTTGT  GGAAGTTTAT  GCTAATATTG  TGTAACTGAT  ATTAAACCTA     3595

AATGTTCTGC  CTACCCTGTT  GGTATAAAGA  TATTTTGAGC  AGACTGTAAA     3645

CAAGAAAAAA  AAAATCATGC  ATTCTTAGCA  AAATTGCCTA  GTATGTTAAT     3695

TTGCTCAAAA  TACAATGTTT  GATTTTATGC  ACTTTGTCGC  TATTAACATC     3745

CTTTTTTTCA  TGTAGATTTC  AATAATTGAG  TAATTTTAGA  AGCATTATTT     3895

TAGGAATATA  TAGTTGTCAC  AGTAAATATC  TTGTTTTTTC  TATGTACATT     3845

GTACAAATTT  TTCATTCCTT  TTGCTCTTTG  TGGTTGGATC  TAACACTAAC     3895

TGTATTGTTT  TGTTACATCA  AATAAACATC  TTCTGTGGAC  CAGGAAAAAA     3945

AAAAAAAAAA  AAA                                                3958

Claims (15)

1、突变型HIF-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)，其中与野生型HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比，所述突变型HIF-1α蛋白质第402位、第564位和第803位中一个、两个或者三个位点的氨基酸发生了突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者该突变型HIF-1α蛋白质的转录因子活性与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者二者均提高。

2、权利要求1的突变型HIF-1α蛋白质，其中第402位的突变是由脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，和/或第564位的突变是由脯氨酸(Pro)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，和/或第803位的突变是由天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)。

3、权利要求1或2的突变型HIF-1α蛋白质，其是564位点单突变体、564位点和402位点双突变体、564位点和803位点双突变体或者402位点、564位点和803位点三突变体。

4、权利要求1-3任一项的突变型HIF-1α蛋白质，其是SEQ IDNO：2、3、4或5所编码的蛋白质。

5、编码权利要求1-4任一项的突变型HIF-1α蛋白质的核酸分子。

6、权利要求5的核酸分子，其与野生型HIF-1α蛋白质编码核酸分子相比能够更稳定、更高水平表达HIF-1α蛋白质，该HIF-1α蛋白质优选与野生型HIF-1α蛋白质相比具有提高的转录因子活性。

7、权利要求5的核酸分子，其是SEQ ID NO：2-4之一。

8、包含权利要求5-7任一项的核酸分子或者野生型HIF-1α编码核酸的载体，优选是病毒载体，更优选是腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。

9、权利要求8的载体，其是能够表达权利要求5-7任一项的核酸分子的表达载体；优选地，该表达载体与含有野生型HIF-1α蛋白质编码核酸分子的相同载体相比，能够更稳定、更高水平表达HIF-1α蛋白质；该HIF-1α蛋白质优选与野生型HIF-1α蛋白质相比具有提高的转录因子活性。

10、含有权利要求5-7任一项的核酸分子或者含有权利要求8或9的载体的宿主细胞。

11、含有权利要求1-6任一项的蛋白质、权利要求5-7任一项的核酸分子、或者权利要求8或9的载体的组合物，特别是药物组合物，优选还含有可药用助剂，如赋形剂；特别是用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物组合物，该药物组合物优选可以被配置成注射液或冻干粉针。

12、权利要求1-6任一项的蛋白质、权利要求5-7任一项的核酸分子、或者权利要求8或9的载体在制备用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物中的用途。

13、权利要求1-6任一项的蛋白质、权利要求5-7任一项的核酸分子、或者权利要求8或9的载体在制备用于促进血管新生或者改善缺血的药物中的用途。

14、权利要求1-6任一项的蛋白质、权利要求5-7任一项的核酸分子、或者权利要求8或9的载体在制备用于提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平、和/或提高HIF-1α蛋白质的转录因子活性的药物中的用途。

15、提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平、和/或提高HIF-1α蛋白质的转录因子活性的体外方法，包括将HIF-1α蛋白质(优选人HIF-1α蛋白质)进行突变，其中与野生型HIF-1α蛋白质(例如SEQ ID NO：1编码的蛋白质)相比，所述突变型HIF-1α蛋白质第402位、第564位和第803位中一个、两个或者三个位点的氨基酸发生了突变，使得该突变型HIF-1α蛋白质在常氧条件下的半衰期或者表达水平与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者该突变型HIF-1α蛋白质的转录因子活性与野生型HIF-1α蛋白质相比提高了，或者二者均提高。

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