CN105050616A - 包含缺氧诱导因子-1α的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文中公开了包含缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的治疗剂。本文中还公开了治疗有此需要的受试者的缺氧或局部缺血的方法。所述方法可包括向有此需要的受试者施用疫苗。在哺乳动物中，胚胎发育和成人动态平衡的维持依赖于向哺乳动物的组织和细胞提供氧气(02)和其他营养物质的功能性血管系统的建立。

Description

包含缺氧诱导因子-1α的组合物及其使用方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/800,703的优先权，其全部内容在此通过引用并入。

政府利益的声明

本发明是在由美国国家卫生研究院授予的合同号K12HL083772-01下借助政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及包含缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的组合物和治疗缺氧或局部缺血的方法。

背景技术

在哺乳动物中，胚胎发育和成人动态平衡的维持依赖于向哺乳动物的组织和细胞提供氧气(O₂)和其他营养物质的功能性血管系统的建立。氧气至这些组织的和细胞的局部递送是由循环系统通过预存血管的紧张度的瞬间变化、新血管的建立(血管生成)和现有血管的重塑(以接受增加的血流)(动脉生成)来调节的。生理和病理状况下的组织灌流由缺氧诱导因子-1(HIF-1)调节。

HIF-1是由氧调节α亚基(HIF-1α)和组成型表达的β亚基(HIF-1β)组成的异二聚体转录因子。HIF-1通过指导通过对血管紧张度的作用、血管生成和/或动脉生成参与血管内平衡的基因的转录来介导后生生物的有核细胞的对缺氧和局部缺血的适应性响应。在病理状况诸如严重肢体缺血(CLI)下，HIF-1可被抑制，从而导致减少的组织灌流、静止时缺血性疼痛的表现、溃疡和/或坏疽，并最终导致截肢。

因此，存在对用于治疗与局部缺血和/或缺氧相关的治疗的组合物和方法(包括增加患病组织的组织灌流和恢复对局部缺血和缺氧的正常生理响应)的鉴定和开发的需要。

发明内容

本发明涉及一种包含缺氧诱导因子-1α(HIF-α)的治疗剂。本发明还涉及治疗有此需要的受试者的缺氧或局部缺血的方法。所述方法可以包括向所述受试者施用所述治疗剂。

附图说明

图1显示举例说明缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白的特征的示意图。

图2显示举例说明实验性研究设计的概要的示意图。EP，电穿孔；HIF-1a，缺氧诱导因子1α；IM，肌内注射；LDPI，激光多普勒灌注成像仪；pVAX，空骨架质粒DNA。

图3显示(A)利用激光多普勒灌注成像仪记录的代表性图像；(B)将股动脉结扎后天数相对肢体灌注率(结扎的/未结扎的)绘图的曲线图；(C)将股动脉结扎后天数相对肢体运动评分绘图的曲线图；和(D)将处理组相对小于3的肢体坏死评分的百分比绘图的曲线图。

图4显示(A)利用编码HIF-1α的DNA与电穿孔(EP)的组合处理的小鼠、(B)利用编码HIF-1α的DNA的肌内(IM)注射处理的小鼠、(C)pVAX1DNA(空载体对照)和EP的组合处理的小鼠和(D)假处理的肢体的后肢术后恢复的总体描绘。在图4A-图4D的每一个图中，箭头指示患病肢体。

图5显示(A)用苏木精和伊红(H&E)染色的收肌组织切片的代表性显微照片(原始放大倍数，x200)；(B)将处理组相对组织坏死(面积百分比)绘图的曲线图；(C)针对CD31+毛细血管染色的收肌组织的代表性显微照片(原始放大倍数，x200)；和(d)将处理组相对毛细血管密度(CD31+细胞/HPF)绘图的曲线图。

图6显示(A)将处理组相对总动脉数(SMA+血管/HPF)绘图以及(B)将处理组相对血管面积(μm²)绘图的曲线图。

图7显示(A)编码小鼠HIF-1α的核酸序列，其中下划线标示起始密码子和编码IgE前导序列的核苷酸，双下划线和粗体标示编码代替脯氨酸的丙氨酸的密码子；和(B)小鼠HIF-1α的氨基酸序列，其中下划线标示起始甲硫氨酸和连接于HIF-1α氨基酸序列的IgE前导序列，双下划线和粗体标示已替代了HIF-1α的氨基酸序列中的野生型脯氨酸残基的丙氨酸残基。

图8显示(A)编码小鼠HIF-1α的核酸序列，其中5'末端上的下划线标示用于克隆目的的BamHI限制性位点(即，GGATCC)和Kozak序列(即，GCCACC)，3'末端上的下划线标示终止密码子(即，TGATAA)和用于克隆目的的XhoI限制性位点(即，CTCGAG)，双下划线和粗体标示编码替代脯氨酸的丙氨酸的密码子；和(B)小鼠HIF-1α的氨基酸序列，其中双下划线和粗体标示已替代了HIF-1α的氨基酸序列中的野生型脯氨酸残基的丙氨酸残基。

图9显示(A)编码人HIF-1α的核酸序列，其中双下划线和粗体标示编码替代脯氨酸的丙氨酸的密码子；和(B)人HIF-1α的氨基酸序列，其中双下划线和粗体标示已替代了HIF-1α的氨基酸序列中的野生型脯氨酸残基的丙氨酸残基。

具体实施方式

本发明涉及用于治疗缺氧或局部缺血的治疗剂。所述治疗剂可以包含缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)。所述治疗剂可以促进或诱发血管形成。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的毛细血管密度、侧支血管形成、血管尺寸或其组合。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的组织灌流。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可减少被施予所述治疗剂的受试者的组织坏死。

因此，所述治疗剂可用于治疗缺氧或局部缺血的方法。缺氧或局部缺血可与严重肢体缺血相关。

1.定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员理解的含义相同的含义。在冲突的情况下，以本文件(包括定义)为准。下文中描述了优选的方法和材料，尽管可在本发明的实施或测试中使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。本文中公开的材料、方法以及实施例仅仅是说明性的并非意在限制。

如本文中所用，术语“包含/包括”、“包括”、“具有”、“有”、“可以”、“含有”及其变型意欲为不排除另外的行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词语。除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“和(and)”以及“该(the)”包括复数参考物。本公开还涵盖“包含/包括”本文中提出的实施方案或组件、“由所述实施方案或组件组成”和“基本上由所述实施方案或组件组成”的其它实施方案，无论是否明确地显示。

如本文中所用，“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列还可包括有效地连接于能够在施用了核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。

如本文中所用，“互补”或“互补的”意指核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。

如本文中可互换使用的“电穿孔”、“电-透化”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱发生物膜中的微观通路(孔)；它们的存在允许生物分子诸如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧通过进入另一侧。

如本文中所用，“片段”意指编码能够改变或影响哺乳动物中的血管内平衡的变化(例如，但不限于通过对血管紧张度的作用、血管生成和/或动脉生成)的多肽的核酸序列或其部分。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一个的DNA片段。所述片段可以是选自编码下文中所示的蛋白质片段的各种核苷酸序列的至少一个的DNA片段。片段可包含下文中所示的核酸序列的一个或多个的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的核酸序列的至少一个的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多核苷酸。

关于多肽序列的“片段”意指能够改变或影响哺乳动物中的血管内平衡的变化(例如，但不限于通过对血管紧张度、血管生成和/或动脉生成的作用)的多肽。所述片段可以是选自下文中所示的各种氨基酸序列的至少一个的多肽片段。片段可包含下文中所示的蛋白质的一个或多个的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，片段可包含下文中所示的蛋白质的至少一个的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多氨基酸。

如本文中所用，“遗传构建体”或“构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包括有效地连接于能够在施用了核酸分子的个体的细胞中指导表达的调控元件(包括启动子和多聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文中所用，术语“可表达的形式”是指基因构建体或构建体，所述基因构建体或构建体含有有效地连接于编码蛋白质的编码序列的必需调控元件，以便当存在于个体的细胞中时，所述编码序列将被表达。

如本文中所用，“缺氧”意指环境氧气(O₂)浓度的降低。

如在本文中在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中所用，“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区域上相同的残基。可通过如下步骤计算百分比：将两条序列最佳地比对，在指定的区域上比较两条序列，测定在两条序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数，及将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及指定的比较区域仅包括单条序列的情况下，将单条序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，可将胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)认为是等同的。人工或通过使用计算机序列算法诸如BLAST或BLAST2.0来获得同一性。

如本文中所用，“局部缺血”意指其中组织灌流被缩减，使得氧气(O₂)的可用度不足以满足组织代谢需要的状况。

如本文中所用，核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括描述的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同的目的作为给定的核酸使用。因此，核酸还包括基本上相同的核酸和其补体。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链或双链的，或可含有双链和单链序列的部分。核酸可以是DNA(基因组和cDNA)、RNA或杂交体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，及碱基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤)的组合。核酸可以通过化学合成法或通过重组法获得。

如本文中所用，“有效连接的”意指基因的表达在与其空间上连接的启动子的控制下。启动子可位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与在所述启动子来源自的基因中该启动子与其控制的基因之间的距离大致相同。如在本领域中是已知的，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。

如本文中所用，“肽”、“蛋白质”或“多肽”可意指氨基酸的连接的序列，并且可以是天然的、合成的或者经修饰的或者天然和合成的组合。

如本文中所用，“启动子”意指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以进一步增强所述序列的表达和/或改变其的空间表达和/或时间表达。启动子还可包含与转录起始位点相距多达数千碱基对的远端增强子或阻遏子元件。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可针对表达发生的细胞、组织或器官或针对表达发生所处的发育阶段，或响应外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地，或差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文中可互换使用，并且是指可被连接在本文中所示的蛋白质或氨基酸序列的氨基末端上的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文中使用的信号肽/前导序列优选促进蛋白质从产生其的细胞分泌。在从细胞分泌后，通常从蛋白质的其余部分(通常称为成熟蛋白)切割信号肽/前导序列。信号肽/前导序列连接在蛋白质的氨基末端上。

如本文中所用，“严格杂交条件”可意指第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶)(诸如在核酸的复杂混合物中)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下是不同的。可选择比特定序列在限定的离子强度、pH下的热熔点(T_m)低约5-10℃作为严格条件。T_m可以是50％的与靶互补的探针在平衡(由于靶序列过量存在，因此在T_m下，50％的探针在平衡时被占据)时与靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)。严格条件可以是在pH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，诸如约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)以及温度为至少约30℃(对于短探针(例如，约10-50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针(例如，大于约50个核苷酸)的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以为至少2至10倍本底杂交。示例性严格杂交条件包括下列条件：50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS在42℃下孵育，或者5xSSC、1％SDS在65℃下孵育，在65℃于0.2xSSC和0.1％SDS中洗涤。

如本文中所用，“受试者”可意指想要或需要利用本文中描述的治疗剂免疫的哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。

如本文中所用，“基本上互补的”可意指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个核苷酸的区域上具有至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，或两条序列在严格杂交条件下杂交。

如本文中所用，“基本上相同的”可意指第一与第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。基本上相同的还可意指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。

如本文中所用，“治疗”或“处理”可意指通过预防、抑制、压制或完全消除疾病的方式来保护动物免受疾病侵害。预防疾病包括在疾病发作之前向动物施用本发明的治疗剂。抑制疾病包括在疾病引发后但在其临床表现之前向动物施用本发明的治疗剂。压制疾病包括在疾病临床表现后向动物施用本发明的治疗剂。所述疾病可与缺氧和/或局部缺血相关联。

本文中针对核酸所用的“变体”意指(i)参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)参考的核苷酸序列或其部分的补体；(iii)与参考核酸或其互补序列基本上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

“变体”还可被定义为通过氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上相异的，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特定抗体结合或促进免疫应答的能力。疫苗还可意指具有与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质基本上相同的氨基酸序列的的蛋白质。氨基酸的保守取代，即利用具有相似性质(例如，疏水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本领域中被认为通常包括较小变化。如本领域中所理解的，这些较小变化可部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数(hydropathicindex)来鉴定。Kyte等人，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本领域中已知具有相似亲疏水性指数的氨基酸可被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，具有±2的亲疏水性指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于显示可导致保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景中考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报导与抗原性和免疫原性密切相关的有用的度量。如本领域中所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致保留生物活性例如免疫原性的肽。可利用彼此亲水性值在±2以内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸，并且具体地那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质显示的。

变体可以是在全长的全基因序列或其片段上基本上相同的核酸序列。核酸序列可在全长的基因序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。变体可以是在全长的氨基酸序列或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在全长的所述氨基酸序列或其片段上具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

如本文中所用，“载体”意指含有复制起始点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自主复制的染色体外载体和优选地，是DNA质粒。载体可含有或包括一个或多个异源核酸序列。

对于本文中数值范围的引述，明确地以相同的精度包括其间的每一个中介数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还包括数值7和8，而对于范围6.0-7.0，明确地包括数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

2.治疗剂

治疗剂可包含药剂、其片段、其变体或其组合。所述药剂可促进或诱发血管形成。所述药剂可促进或诱导血管紧张度、血管生成和/或动脉生成。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的毛细血管密度、侧支血管形成、血管尺寸或其组合。相较未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的组织灌流。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可减少被施予所述治疗剂的受试者的组织坏死。

本发明的治疗剂可具有有效治疗剂所需的特性，诸如是安全的，以使治疗剂本身不会引起疾病或死亡；预防疾病；和提供施用的容易性、副作用少、生物稳定性和每剂量的低成本。该治疗可通过包含所述药剂来实现这些特性的一些或全部特性。

a.药剂

所述治疗剂可包含药剂。所述药剂可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。所述核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。所述核酸序列还可包含编码通过肽键连接于所述药剂的接头或标签序列的额外序列。所述氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段或其组合。

(1)HIF-1α

所述药剂可以是缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、其片段、其变体或其组合。HIF-1α是转录因子HIF-1的两个亚基之一。另一个亚基是HIF-1β。因此，HIF-1是α和β亚基的异二聚体，其中β亚基是组成型表达的并且α亚基的稳定性受氧浓度调节。

两个亚基都是转录因子的碱性螺旋-环-螺旋PER-ARNT-SIM(bHLH-PAS)家族的成员。如图1中显示的，HIF-1α含有bHLH结构域和2个PAS结构域以及N末端转录激活结构域(NTAD)和C末端转录激活结构域(CTAD)。此外，HIF-1α含有2个被含有脯氨酰-羟化酶结构域(PHD)(即，PHD1、PHD2和PHD3)的酶羟化的脯氨酸残基(例如，人HIF-1α中的P402和P564)，和位于CTAD中的通过抑制HIF的因子(FIH)羟化的天冬酰胺残基(例如人HIF-1α中的N803)。这些残基在氧存在的情况下在HIF-1α中被羟化。

具体地，羟化的天冬酰胺残基在空间上抑制HIF-1α与转录辅助激活因子之间的相互作用，然而羟化的脯氨酸残基被希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白(pVHL)识别并结合。pVHL发现于包含延伸因子B、延伸因子C和cullin-2的复合物中，并且具有遍在蛋白连接酶E3活性。该复合物介导羟化HIF-1α的遍在蛋白化，所述羟化HIF-1α随后通过26S蛋白酶体降解。

因此，在常氧存在的情况下，HIF-1α不稳定和/或不能与转录辅助激活因子相互作用，从而HIF-1是无活性的。在缺氧或局部缺血状态下，HIF-1α的羟基被减少或抑制，从而稳定HIF-1α并允许HIF-1介导对缺氧和局部缺血的适应性响应。这些适应性响应可包括指导通过对血管紧张度的作用、血管生成和/或动脉生成参与血管动态平衡的基因的转录。

然而，在病理状态下，HIF-1可被抑制，从而导致减少的组合灌流、静止时缺血性疼痛的表现、溃疡和/或坏疽，和最终导致截肢。这样的病理状况可包括严重肢体缺血。

因此，所述治疗剂可用于治疗涉及缺氧和/或局部缺血的病理状况。缺氧或局部缺血可与严重肢体缺血、外周动脉疾病、伤口愈合、血管疾病、循环系统疾病、冠状动脉病、心血管疾病、糖尿病或其组合相关联。缺氧或局部缺血可与严重肢体缺血相关联。

相较于未施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的毛细血管密度、侧支血管形成、血管尽管或其组合。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可增加被施予所述治疗剂的受试者的组织灌流。相较于未被施予所述治疗剂的受试者，所述治疗剂可减少被施予所述治疗剂的受试者的组织坏死。

编码HIF-1α的核酸可来自许多生物体，例如，小鼠(小家鼠)和人(智人)。可针对密码子选择和相应的RNA转录物优化编码HIF-1α的核酸。编码HIF-1α的核酸可以是针对表达而优化的密码子和RNA。在一些实施方案中，编码HIF-1α的核酸可包含Kozak序列(例如，GCCACC)，以增强翻译的效率。编码HIF-1α的核酸可包含多个终止密码子(例如，TGATGA，TGATAA等)，以增强翻译终止的效率。编码HIF-1α的核酸还可编码免疫球蛋白E(IgE)的前导序列。IgE前导序列在核酸中可位于HIF-1α的5'。编码HIF-1α的核酸还可包含编码IgE前导序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码HIF-1α的核酸不含或不包含编码IgE前导序列的核苷酸序列。

在一些实施方案中，编码HIF-1α的核酸可以是异源核酸序列和/或含有或包括一个或多个异源核酸序列。编码HIF-1α的核酸可以被突变，以使得HIF-1α的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸或残基被另一种氨基酸或残基替代或取代。编码HIF-1α的核酸可以被突变，以使得HIF-1α的氨基酸序列中可被羟化的一个或多个残基(例如，脯氨酸、天冬酰胺等)被不能被羧化的另残基替代或取代。编码HIF-1α的核酸可被突变，以使得HIF-1α的氨基酸序列中的一个或多个脯氨酸残基被不能被羟基化的残基替代或取代。编码HIF-1α的核酸可被突变，以使得HIF-1α的氨基酸序列不能被pVHL识别和/或结合。编码HIF-1α的核酸可被突变，以使得HIF-1α的氨基酸序列不能遍在蛋白化。编码HIF-1α的核酸可被突变，以使得HIF-1α的氨基酸序列不能被降解，例如，但不限于被26S蛋白酶体降解。编码HIF-1α的核酸可被突变，以使得无论细胞和/或组织中的氧浓度如何，HIF-1α的氨基酸序列都是稳定的，因此，HIF-1α蛋白可在细胞和/或组织中积累。

小鼠HIF-1α可以是核酸序列SEQIDNO:1，其编码SEQIDNO:2(图7A和图7B)。SEQIDNO:2是小鼠HIF-1α的氨基酸序列，其中两个脯氨酸残基已被丙氨酸被替代。这种替代可防止或减少HIF-1α的羟化，从而防止或减少HIF-1α被pVHL识别。SEQIDNO:2是通过肽键连接于IgE前导序列的小鼠HIF-1α的氨基酸序列。

在一些实施方案中，小鼠HIF-1α可以是在SEQIDNO:1中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，小鼠HIF-1α可以是编码在SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠HIF-1α可以是在SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，小鼠HIF-1α可以是核酸序列SEQIDNO:3，其编码SEQIDNO:4(图8A和8B)。SEQIDNO:4是小鼠HIF-1α的氨基酸序列，其中两个脯氨酸残基已被丙氨酸替代，如图8B中显示的。该替代可防止或减少HIF-1α的羟化，从而防止或减少HIF-1α被pVHL识别。SEQIDNO:4是未通过肽键连接于IgE前导序列的小鼠HIF-1α的氨基酸序列。

在一些实施方案中，小鼠HIF-1α可以是在SEQIDNO:3中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，小鼠HIF-1α可以是编码在SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。小鼠HIF-1α可以是在SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

人HIF-1α可以是核酸序列SEQIDNO:5，其编码SEQIDNO:6(图9A和图9B)。SEQIDNO:6是人HIF-1α的氨基酸序列，其中两个脯氨酸已被丙氨酸替代，如图9B中显示的。该替代可防止或减少HIF-1α的羟化，从而防止或减少HIF-1α被pVHL识别。

在一些实施方案中，人HIF-1α可以是在SEQIDNO:5中所示的核酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的核酸序列。在其它实施方案中，人HIF-1α可以是编码在SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列的核酸序列。人HIF-1α可以是在SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列的完整长度上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性的氨基酸序列。

一些实施方案涉及SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5的片段。片段可包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:5的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列例如免疫球蛋白的前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。

可提供具有与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:5的片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的片段。此类片段可包含与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:5具有95％或更高同一性的核酸的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的HIF-α核酸序列的片段具有96％或更高同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-α核酸序列的片段具有97％或更高同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-α核酸序列的片段具有98％或更高同一性的原性片段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-α核酸序列的片段具有99％或更高同一性的片段。在一些实施方案中，片段可包含编码前导序列，例如免疫球蛋白前导序列诸如IgE前导序列的序列。在一些实施方案中，片段可不含编码前导序列的编码序列。

可提供SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的片段。片段可包含SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如免疫球蛋白前导序列，诸如IgE前导序列。在其它实施方案中，片段可不含前导序列。

可提供具有与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6的片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的片段。此类片段可包含与SEQIDNO:2,SEQIDNO:4和/或SEQIDNO:6具有95％或更大的同一性的蛋白质的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1α蛋白质序列的片段具有96％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1α蛋白序列的片段具有97％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1α蛋白序列的片段具有98％或更大的同一性的片段。一些实施方案涉及与本文中的HIF-1α蛋白序列的片段具有99％或更大的同一性的片段。在一些实施方案中，片段包含前导序列，例如免疫球蛋白的前导序列，诸如IgE前导序列。在其它实施方案中，片段可以不含前导序列。

b.载体

所述治疗剂可包含一种或多种包含编码所述药剂的异源核酸的载体。所述一种或多种载体可以能够表达药剂。所述载体可包含编码所述药剂的异源核酸。所述载体可具有含有复制起始点的核酸序列。所述载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。所述载体可以是自主复制的染色体外载体或整合进宿主基因组的载体。

所述一个或多个载体可以是表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞的质粒。一旦表达载体在细胞内，由所述基因编码的蛋白质由细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生。所述质粒通常被工程化以含有充当增强子和启动子区域调控序列并导致表达载体上携带的基因的高效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，从而表达蛋白质。

所述载体可具有表达信号诸如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆的基因之间的距离的调整以及转录终止序列和PTIS(可携带的翻译起始序列)的插入。

(1)表达载体

所述载体可以是环状质粒或线性核酸。所述环状质粒和线性核酸能够在适当的主题细胞中指导特定核苷酸序列的表达。所述载体可具有有效地连接于编码药剂的核苷酸序列的启动子，所述编码抗原的核苷酸序列可有效地连接于终止信号。所述载体还可含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着其组件的至少一个对于其至少一个其它组件是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，仅当将宿主细胞暴露于一些特定的外部刺激物时所述诱导型启动子才启动转录。在多细胞生物体的情况下，所述启动子还可于对特定的组织或器官或发育阶段是特异性的。

(2)环状和线性载体

所述载体可以是环状质粒，其可通过整合进细胞基因组转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起始点的自主复制质粒)。

所述载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA或佐剂并使得细胞能够将所述序列翻译成被免疫系统或佐剂识别的抗原的任何其它表达载体。

本文中还提供了能够经由电穿孔被有效地递送至受试者，并且表达期望的药剂的线性核酸或线性表达盒(“LEC”)。所述LEC可以是不存在任何磷酸主链的任何线性DNA。所述DNA可编码药剂。所述LEC可含有启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。所述药剂的表达可受启动子控制。所述LEC可以不含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。所述LEC可以不含与期望的药剂基因表达无关的其它核酸序列。

所述LEC可来源于任何能够被线性化的质粒。所述质粒可以能够表达药剂。所述质粒可以是pNP(PuertoRico/34)或pM2(NewCaledonia/99)。所述质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或任何其它能够表达编码所述药剂的DNA并使得细胞能够将所述序列翻译成药剂的表达载体。

所述LEC可以是pcrM2。所述LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别来源于pNP(PuertoRico/34)和pM2(NewCaledonia/99)。

(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号

所述载体可具有启动子。所述启动子可以是能够驱动基因表达和调控分离的核酸表达的任何启动子。此类启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶的转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文中描述的药剂序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于特定应用。可将启动子在载体中置于离转录起始位点与其在天然背景中离转录起始位点的距离大约相同的距离。然而，在不丧失启动子功能的情况下，可接受该距离的变化。

所述启动子可有效地连接于编码所述药剂和转录物的高效多腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止的核酸序列。所述启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或显示对于在真核细胞中的表达是有效的另一种启动子。

所述载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。所述载体可含有在结构基因下游的转录终止区以提供高效终止。所述终止区可获自与启动子序列相同的基因或可获自不同的基因。

c.赋形剂和治疗剂的其它组分

治疗剂还可包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子诸如媒介物、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可包括表面活性剂，诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂(Freundsincompleteadjuvant)，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。

转染促进剂是多聚阴离子、多聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且所述聚-L-谷氨酸可以以低于6mg/ml的浓度存在于治疗剂中。转染促进剂还可包括表面活性剂诸如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂，LPS类似物，包括单磷酰脂质A、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡诸如角鲨烯和角鲨烯，并且还可将透明质酸与基因构建体结合施用。所述DNA质粒治疗剂还可包括转染促进剂，诸如脂质、脂质体，包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，作为DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640)、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子，包括聚-L-谷氨酸盐(LGS)或脂质。治疗剂中的转染剂的浓度低于4mg/ml、低于2mg/ml、低于1mg/ml、低于0.750mg/ml、低于0.500mg/ml、低于0.250mg/ml、低于0.100mg/ml、低于0.050mg/ml或低于0.010mg/ml。

治疗剂还可包含如1994年4月1日提交的美国系列No.021,579(其通过引用完全并入)中描述的遗传促进剂。

可按照待使用的施用模式配制治疗剂。可注射治疗药物组合物可以是无菌、无热原和无颗粒的。可使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。所述治疗剂可包含血管收缩剂。等渗溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。治疗剂还可包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使得制剂在室温或环境温度长时间稳定，包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。

3.治疗方法

本发明还涉及治疗有此需要的受试者的缺氧或局部缺血的方法。所述方法可包括向所述受试者施用本文中公开的治疗剂。被施予所述治疗剂的受试者可具有增加的毛细血管密度、侧支血管形成、血管尺寸或其组合。被施予所述治疗剂的受试者可具有增加的组织灌流。被施予所述治疗剂的受试者可具有减少的组织坏死。

缺氧或局部缺血可与严重肢体缺血、外周动脉疾病、伤口愈合、血管疾病、循环系统疾病、冠状动脉病、心血管疾病、糖尿病或其组合相关联。缺氧或局部缺血可与严重肢体缺血相关联。所述治疗方法可减少、消除或预防有此需要的受试者的严重肢体缺血。

治疗剂量可为1μg至10mg的活性成分/kg的体重/时间，并且可以为20μg至10mg的组分/kg的体重/时间。可每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30或31天施用所述治疗剂。用于有效治疗的治疗剂量的次数可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个剂量。

a.施用

可按照制药领域内的技术人员公知的标准技术配制治疗剂。可通过考虑诸如特定受试者的年龄、性别、体重和状况以及施用途径的因素，利用医学领域内的技术人员公知的技术按剂量施用此类组合物。所述受试者可以是哺乳动物，诸如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。

可预防性或治疗性施用所述治疗剂。在预防性施用中，可以足以诱发免疫应答的量施用所述治疗剂。在治疗性应用中，以足以引发治疗作用的量向有此需要的受试者施用所述治疗剂。足以实现该作用的量被定义为"治疗有效剂量"。对该用途有效的量将取决于例如所施用的治疗剂方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的一般健康状态以及处方医生的判断。

所述治疗剂可通过如Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等人(美国专利No.5,580,859，1996年12月3日授予的)；Felgner(美国专利No.5,703,055，1997年12月30日授予的)；和Carson等人(美国专利No.5,679,647，1997年10月21日授予的)(所有文献和美国专利的内容通过引用以其整体并入本文)中描述的本领域公知的方法来施用。可将所述治疗剂的DNA复合成可以例如使用治疗剂枪向个体施用的颗粒或珠粒。本领域技术人员将了解药学上可接受的载体，包括生理上可接受的化合物的选择取决于例如表达载体的施用途径。

可经由多种途径施用所述治疗剂。典型的递送途径包括胃肠外施用，例如真皮内、肌内或皮下递送。其它途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。具体地对于治疗剂的DNA，可将所述治疗剂递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等人，美国专利No.5,580,859和5,703,055，将所有所述美国专利的内容通过引用以其整体并入本文)。所述治疗剂还可被施用至肌肉，或经由真皮内或皮下注射，或经皮肤(诸如通过离子电渗疗法)进行施用。还可应用所述治疗剂的表皮施用。表皮施用可包括机械或化学刺激表皮的最外层以刺激针对所述刺激物的免疫应答(Carson等人，美国专利No.5,679,647，其内容通过引用以其整体并入本文)。

还可将所述治疗剂配制用以经由鼻道施用。适用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可包括具有例如在约10至约500微米范围内的粒度的粗粉，以其中采用从鼻中吸入，即，通过从拿至靠近鼻的粉剂的容器经鼻道快速吸入的方式来施用所述粗粉。所述制剂可以是鼻喷雾剂、滴鼻剂或利用喷雾器的气溶胶施用。所述制剂可包含所述治疗剂的水性或油性溶液。

所述治疗剂可以是液体制剂诸如悬浮剂、糖浆剂或酏剂。所述治疗剂还可以是用于胃肠外、皮下、真皮内、肌内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，诸如无菌悬浮剂或乳剂。

可将所述治疗剂掺入脂质体、微球或其它聚合物基质(Felgner等人，美国专利No.5,703,055；Gregoriadis、LiposomeTechnology，第I至III卷(第2版，1993)，其内容通过引用以其整体并入本文)。脂质体可由磷脂或其它脂质组成，并且可以是被相对简单地产生和施用的无毒、生理上可接受和可代谢的载体。

所述治疗剂可经由电穿孔，诸如通过美国专利No.7,664,545(其内容通过引用并入本文)中描述的方法来施用。所述电穿孔可以是利用美国专利No.6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359(其内容通过引用以其整体并入本文)中描述的方法和/或设备来进行。所述电穿孔可经由微创装置来进行。

微创电穿孔装置(“MID”)可以是用于将上述治疗剂和相关流体注射进身体组织的设备。所述装置可包括空心针、DNA盒和流体递送装置，其中所述装置适合用于驱动使用的流体递送装置，以在将针插入所述身体组织过程中同时(例如，自动地)将DNA注射进身体组织。这具有在针被插入的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致流体在整个身体组织中的更均匀分布的有利方面。在注射过程中经历的疼痛可因被注射的DNA在更大面积上的分布而减弱。

MID可将治疗剂注射进组织而无需使用针。MID可以以使治疗剂穿透组织的表面并进入下面的组织和/或肌肉的力，以小流或射流的形式注射治疗剂。小流或射流后方的力可通过膨胀压缩的气体(诸如二氧化碳)使其在几分之一秒内通过微孔来提供。微创电穿孔装置以及使用它们的方法的实例描述于公开的美国专利申请No.20080234655、美国专利No.6,520,950、美国专利No.7,171,264、美国专利No.6,208,893、美国专利No.6,009,347、美国专利No.6,120,493、美国专利No.7,245,963、美国专利No.7,328,064和美国专利No.6,763,264中，其每一个的内容通过引用并入本文。

MID可包含产生无痛穿透组织的高速液体射流的注射器。此类无针注射器是商购可得的。可在本文中使用的无针注射器的实例包括美国专利No.3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310(其每一个的内容通过引用并入本文)中描述的那些注射器。

适用于直接或间接电转运的期望的治疗剂可使用无针注射器(通常通过使组织表面与注射器接触以以足以使治疗剂穿透进组织的力驱动药剂射流的递送)来引入(例如，注射)待治疗的组织中。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，则以足以使药剂穿透通过解质层和分别进入真皮层，或进入下面的组织和肌肉的力来朝向粘膜或皮肤表面注射所述药剂。

无针注射器特别适合用于将治疗剂递送至所有类型的组织，特别地皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可用于将含有治疗剂的液体推进至表面并进入受试者的皮肤或粘膜。可使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽部、下喉咽部、口咽、唇、咽喉、肺、心脏、肾脏、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任意组合。

MID可具有使组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如以矩形或正方形模式建立的)中的多对电极之间脉冲，提供了优于在一对电极之间脉冲的结果的改善的结果。例如在标题为"NeedleElectrodesforMediatedDeliveryofDrugsandGenes"的美国专利No.5,702,359中公开了其中可在治疗性治疗过程中对多对针对进行脉冲的针的阵列。在该申请(其通过引用并入本文，就如同充分列出一样)中，将针置于环状阵列中，但具有连接器和使得能够在相对的针电极对之间产生脉冲的转换设备。可使用一对用于将重组表达载体递送至细胞的针电极。这样的装置和系统在美国专利No.6,763,264(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。或者，可使用单针装置，所述装置允许注射DNA和利用与常规注射针相似的单针进行电穿孔，和施加具有比通过目前使用的装置递送的脉冲的电压更低的电压的脉冲，从而减轻患者经历的触电感。

MID可包含一个或多个电极阵列。所述阵列可包含两个或更多个具有相同直径或不同直径的针。可均匀或不均匀地间隔针。针可以为0.005英寸至0.03英寸、0.01英寸至0.025英寸、或0.015英寸至0.020英寸。针的直径可为0.0175英寸。针可相隔0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。

MID可由脉冲发生器和两个或更多个-针式注射器组成，所述注射器在单个步骤中递送治疗剂和电穿孔脉冲。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机对脉冲和注射参数进行灵活编程，以及全面记录和存储电穿孔及患者的数据。脉冲发生器可在很短的时间中递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送在100ms持续时间中递送3个15伏的脉冲。这种MID的实例是由InovioBiomedicalCorporation提供的Elgen1000系统，其在美国专利No.7,328,064(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。

MID可以是CELLECTRA(InovioPharmaceuticals、BlueBellPA)装置和系统，其为标准电极系统，帮助将大分子诸如DNA引入体内或植物的选定组织的细胞内。标准电极系统可包含多个针电极；皮下针；提供从可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的传导连接的电连接器；和电源。操作员可握住固定在承载结构上的多个针电极并牢固地将其插入至体内或植物的选定组织。随后经由皮下针将大分子递送入选定组织。激活可编程恒定电流脉冲控制器并将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒定电流电脉冲帮助将生物分子引入多个电极之间的细胞。通过借由恒定电流脉冲限制组织中的功耗来使因细胞的过热而引起的细胞死亡降至最低。Cellectra装置和系统在美国专利No.7,245,963(其内容通过引用并入本文)中进行了描述。

MID可以是Elgen1000系统(InovioPharmaceuticals)。Elgen1000系统可包括提供空心针的装置；和流体递送装置，其中所述设备被适配成驱动使用的流体递送装置，以在将针插入所述身体组织的过程中同时(例如自动地)将流体(本文中描述的治疗剂)注射至身体组织中。有利方面是在将针插入的同时逐渐注射流体的能力导致流体在整个身体组织中的更均匀分布。还相信在注射过程中经历的疼痛因被注射的流体的体积在更大区域中的分布而减轻。

此外，流体的自动注射帮助自动监测和记录注射的流体的实际剂量。如果需要，该数据可由控制单元存储以用于存档。

应理解，注射速率可以是线性的或非线性的，并且可在已将针插入通过待治疗的受试者的皮肤后以及当它们被进一步插入进身体组织时进行注射。

可利用本发明的设备向其中注射流体的适当的组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，还可以是肌肉组织。

所述设备还包含用于将针引导插入身体组织的针插入装置。流体注射速率受针插入的速率控制。这具有可控制针插入和流体注射以便插入的速率可匹配所需注射速率的有利方面。其还使得所述设备更容易被用户操作。如果需要，可提供用于自动地将针插入身体组织的装置。

用户可选择开始注射流体的时间。然而，理想地，当针尖已到达肌肉组织时开始注射，并且所述设备可包括用于感应针已插入对于开始流体的注射是足够的深度的装置。这意味着当针已到达所需深度(该深度通常为肌肉组织开始时的深度)时可提醒自动地开始注射流体。肌肉开始时的深度可以例如被采用来作为预设针插入深度，诸如被认为对于针穿过皮肤层是足够的4mm的值。

所述传感装置可包含超声探针。所述传感装置可包含用于感应阻抗或电阻的变化的装置。在该情况下，所述装置可能不这样记录针在身体组织中的深度，而是被适配成感应当针从不同类型的体身组织移动至肌肉中时阻抗或电阻的变化。这些备选装置的任一种提供了感应注射可开始的相对准确和简单的操作装置。如果需要，还可记录针插入的深度，并且可将所述深度用于控制流体的注射以便在记录针插入的深度的同时，确定待注射的流体的体积。

所述装置还可包含：用于支持针的基座；和用于在其中接受基座的壳体，其中所述基座相对于壳体是可移动的，以便当基座相对于壳体位于第一向后位置时将针在壳体内收回，以及当基座位于壳体内的第二向前位置时针伸出壳体。这对于用户是有利的，因为可将所述壳体在患者的皮肤上排成一列，随后可通过相对于基座移动壳体将针插入患者的皮肤。

如上所述，期望实现速率受控的流体注射，以便当将针插入皮肤时，流体在针的长度上均匀分布。所述流体递送装置可包含被适配成以受控速率注射流体的活塞驱动装置。活塞驱动装置可以例如通过伺服马达来驱动。然而，活塞驱动装置可通过相对于壳体在轴向方向上移动的基座来驱动。应理解，可提供用于流体递送的备选装置。因此，例如，可提供可被挤压以以受控或非受控速率进行流体递送的封闭容器来替代注射器和活塞系统。

上述设备可用于任何类型的注射。然而设想其在电穿孔领域中是特别有用的，因此其还可包含用于对针施加电压的装置。这使得针不仅能用于注射而且还可在电穿孔过程中用作电极。这是特别有利的，因为这意味着电场被施加至与注射流体相同的区域。历来存在关于电穿孔的问题，因为极难精确地将电极与先前注射的流体对齐，所以用户意欲在更大面积上注射比所需的体积更大的体积的流体，和在更高的区域上施加电场以试图保证注射物质与电场之间的重叠。通过使用本发明，可减小注射的流体体积和施用的电场的尺寸，同时实现电场与流体之间的良好拟合。

本发明具有通过下列非限定性实施例说明的多个方面。

4.实施例

实施例1

用于实施例2-5的材料和方法

在下述实施例2-5中描述的实验使用实施例1中在此描述的方法，和调查组织缺血期间血管生成的刺激。具体地，调查检测在组织缺血期间HIF-1α对血管生成的刺激。通过单独的体内电穿孔(EP)或肌内(IM)注射施用编码组成型表达的HIF-1α基因(如上文中所描述的，从而包含脯氨酸至丙氨酸的取代)的DNA质粒。

方法概述

在分配至3个组：(1)HIF-EP(n＝13)；(2)HIF-IM(n＝14)和(3)空质粒(pVAX)-EP(n＝12)的小鼠中进行左肌动脉结扎。将单次剂量的HIF-1α或pVAXDNA(每种20μL，5μg/μL)注射入缺血的收肌，随后进行EP(组1和3)。组2中的小鼠接受单独的HIF-1α质粒DNA的IM注射。从结扎前至结扎后第0、3、7、14和21天，如下文中更详细地描述的，测量利用激光多普勒灌注成像仪定量的肢体灌流恢复、肢体功能和肢体坏死。在第21天，处死存活的小鼠(4-5只/组)，使用苏木精和伊红对收肌的坏死进行染色，并且如下文中更详细描述的，经由抗-a-平滑肌肌动蛋白抗体的毛细血管密度(抗-CD31抗体)。

详细方法

实验方案。进行(图2)实验以评估下列变量：(1)使用超声激光多谱勒仪评价肢体灌流随时间的恢复；(2)调查肢体保留和存活离自离断的程度；和(3)评估组织的组织学特性(包括组织坏死的程度)的改善。将39只年龄和性别匹配的野生型Balb/c小鼠分配至以下3个处理组的一个组中：(1)13只小鼠(积极处理，HIF-1aDNA/EP)；(2)14只小鼠(阳性对照，HIF-1aDNA/IM)；和(3)12只小鼠(阴性对照，空质粒[pVAX]DNA/EP)。左肢接受干预，然而右肢不接受干预以允许测量的变量的小鼠内比较和调整。在第21天结束时，在最终的组织分析中包括每组平均4至5只动物。

股动脉结扎。关照上述称重为25g至30g的小鼠(TheJacksonLaboratory,BarHarbor,Me)，并且在根据宾夕法尼亚大学医学院的大学机构动物护理和使用委员会的指导方针批准后对其进行手术。手术前，以0.1mL/10g的体重(0.25mL至0.30mL/小鼠)使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(100mg/kg的氯胺酮的甲苯噻嗪)的腹膜内注射来麻醉小鼠。如先前所述进行股动脉结扎。7,8。简言之，以无菌方式暴露左股动脉，将其与股神经和静脉分离，使用6.0丝缝合线(FisherScientific,Pittsburgh,Pa)在股深动脉起源的远端将其结扎。随后利用间断的4.0丝缝合线(FisherScientific)缝合皮肤。

质粒。在左股动脉结扎后，立即使用具有30规针的胰岛素注射器在结扎位置远端按照制造商的说明书(GenScriptUSAInc,Piscataway,NJ)用组成型表达的HIF-1a质粒DNA(经改良和优化的)或pVAX质粒DNA注射收肌。如下施用处理：(1)在实验组(HIF-EP)的左收肌中施用20mL(5mg/mL)的HIF-1a质粒DNA的IM注射，随后进行EP；(2)在阳性对照组(HIF-IM)的左收肌中施用20mL(5mg/mL)的HIF-1a质粒DNA的IM注射；和(3)在阴性对照组(pVAXEP)的左收肌中施用20mL(5mg/mL)的pVAX质粒DNA的IM注射，随后进行EP。

体内EP。在质粒DNA注射后，立即使用三电极阵列CELLECTRADNA递送装置(InovioBiomedical,BlueBell,Pa)对治疗位置施用体内方波-脉冲EP。所述三电极阵列由3个26规固体不锈钢电极以等腰三角形形式组成。具体的EP条件被恒定地设置在0.1安培的电流，2个脉冲，52ms/脉冲(50-100V)以及4秒的脉冲间隔。质粒注射与EP之间的持续时间为20秒。用于质粒注射/EP的事件序列如下：(1)将一次性电极组件放置在手柄的容器中，并按压手柄上的启动按钮；(2)使用具有30规针的胰岛素注射器施用20mL(5mg/mL)的HIF-1a质粒DNA的IM注射；(3)紧接着，将三个阵列针置于围绕注射部位的区域中；(4)随后按压手柄上的启动按钮，并且在4秒的倒计时后，脉冲被递送。随后从肌肉轻轻地取下所述阵列。对于pVAX-EP组重复相同的顺序。

肢体灌流测量。手术前使用激光多普勒灌注成像仪(LDPI)进行基线肢体灌流测量，并立即重复股动脉的术后结扎。简言之，使用LDPI(MoorInstrumentsInc,Wilmington,Del)在每一个时间点上进行系列灌流测量。在每一个时间点上计算灌流比率(结扎/未结扎的肢体)和对于每一只小鼠获得的平均值。以(0)至(1000)的范围内的代码显示灌流信号。

足部运动和坏死评分。为了评估后肢功能的恢复，基于活性步行运动的评分系统由对治疗组不知情的盲观察者在每个时间点通过触摸连续进行。简言之，如下进行评分：评分0，无腿使用；评分1，腿的使用；评分2，积极的脚使用；评分3，完全的足的使用或脚趾的伸展；和评分4，不受限制的运动。此外，由类似地盲目观察者对坏死的严重度进行评分以评估每一个时间点上需要无痛致死的小鼠。简言之，如下进行评分：评分0，无坏死；评分1，紫绀/变色；评分2，1至2个脚趾的坏死/损失；评分3：3至5个脚趾的坏死/损失；评分4，严重坏死(延伸至足背或更高)。无痛致死评分≥3或具有肢体自离断的小鼠。

组织收获以及坏死和血管生成的免疫组织化学。在第21天针进行组织收获和形态学分析以进行坏死分析。进行毛细血管生长和侧支血管形成/重塑的免疫组织化学。简言之，通过CO₂吸入对小鼠进行无痛致死，并用磷酸盐缓冲盐水，接着以4％多聚甲醛进行心内灌注。对收肌进行解剖，将在4％多聚甲醛固定48小时，在使用低温恒温器切片(10-15mm的切片)之前，将其包埋在石蜡中。为了进行形态测定分析析，将切片用苏木精和伊红染色，并将其封装在Fluoromount-G介质(SouthernBiotech,Birmingham,Ala)中，以评估百分比组织坏死。进行免疫荧光染色。简单地说，使用抗人CD31的小鼠单克隆抗体(DakoCytomation,Inc,Carpentaria,Calif)进行CD31的染色，并用德州红色荧光染料(GeneLinkInc,Hawthorne,NY)进行复染以检测血管内皮细胞。使用抗a-SMA的小鼠单克隆抗体(ResearchDiagnosticsInc,Flanders,NJ)，并用Alexa568荧光染料(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)进行复染以检测血管平滑肌细胞。进行微波辐照以进行抗原修复。将切片在0.3％过氧化氢中进行孵育以阻断过氧化物酶活性。使用Vectastain试剂盒(VectorLaboratories,Burlingame,Calif)进行蛋白质封闭、与第二生物素化抗体的孵育和阿瓦斯丁-生物素的相互作用。在每组织载玻片量化坏死，毛细血管生长和侧支血管形成执行上的平均5个随机选择的领域做了每组织切片200倍的放大倍数下在平均5个随机选择的视野上进行坏死、毛细管生长和侧支血管形成的定量，并使用ImageJ软件进行分析。

统计分析。汇总统计表示为样本大小和平均均值±平均值的标准误差。用于分析的计算的变量包括每一个图像的LDPI比率和每一个时间点上的每个小鼠的平均LDPI比率。同时，评估临床足部运动、坏死评分和免疫组织化学分析结果。数据遵循具有一个重复因子(日)和一个非重复因子(处理)的双因素混合效应实验设计与和。在认识到随着术后日子的推进存在处理的效应修正的情况下，每一天通过进行适合于一元固定效果模型的方差分析来评估处理对连续反应变量的简单效果。当在处理组之间发现统计学上显著的差异时，每一天通过将Bonferonni调整应用于多重比较来评估处理组的成对比较之间的差异。当用于方差分析的假设似乎是不合理时，进行Wilcoxon秩和非参数检验。肢体坏死得分对处理组的列联表采用皮尔逊未修正卡方检验来分析，以评估处理组间的肢体坏死评分差异的分布。对于假设的所有测试，为了宣告统计显著性，将I类误差(a)固定在.05。所有分析均采用STATA(Intercooled)，11版统计软件(STATACorp,LP,CollegeStation,Tex)来进行。

实施例2

HIF-1αDNA的体内EP和肢体血流恢复

检查接受HIF-1αDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1αDNA质粒的IM递送的小鼠的缺血组织中的肢体血流恢复。

图3A显示在股动脉结扎，接着注射质粒(缺氧诱导因子-EP[HIF-EP]和空骨架质粒DNA-EP[pVAX-EP])的电穿孔(EP)或单独的注射质粒(低氧诱导因子肌肉注射[HIF-IM])后，后肢血流的时间过程。在图3A中，在指定的天上记录代表性激光多普勒灌注成像仪(LDPI)，灌流信号以代码显示，即差的灌流为(0)，良好灌流为(1000)。

在股动脉结扎后第0天，左肢(结扎的，白色箭头)中的血流的急性减少很明显(图3A)。因此，这些LDPI测量显示相较于第0天的未结扎肢体，结扎的肢体中的急剧减少的血流(图3A)。相较于另外两个组(HIF-IM和pVAX-EP)(图3A)，在利用HIF-EP处理的组中观察到持续的血流恢复。

此外，连续LDPI测量显示结扎的肢体中的稳定血流恢复(但以可变的速率和一致性进行)。在积极处理组(HIF-EP)和阳性对照组(HIFIM)中，血流恢复在第3天至第7天非常明显。恢复在第14天在两个组中减少，但其在第21天增加。总的来说，HIF-EP小鼠相较于HIF-IM小鼠从第3天至第14天具有相似的血流恢复。

图3B显示，利用缺氧诱导因子1α(HIF-1α)DNA，随后利用EP的处理改善了小鼠的股动脉结扎后肢体灌流恢复。使用LDPI从术前一天至术后第21天连续进行肢体灌流恢复。计算每一个时间点上每一只小鼠和每一个处理组的平均灌流比率(结扎/未结扎的肢体)。为了评估直至第21天的统计显著性(P<.05)，将数据均表达为平均值±平均值的标准误差(误差条贯穿每一个动物)。*HIF-EP相对pVAX-EP；P<.001；**HIF-IM相对pVAX-EP；P<.01；和^aHIF-EP相对HIF-IM；P<.05。在第21天检测到HIF-EP与HIF-IM之间的肢体血流的显著改善(1.03±0.15相对0.78±0.064；图3B)。血流恢复在pVAX-EP组中以慢得多的速率维持。

实施例3

肢体功能恢复和HIF-1αDNA的体内EP

在接受HIF-1αDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1αDNA质粒的IM递送的小鼠的缺血组织中检测肢体功能恢复。

图4A、图4B、图4C和图4D分别显示股动脉结扎后并分别用HIF-EP、HIF-IM、pVAX-EP处理的和正常假处理的肢体的严重肢体缺血的恢复。图3C显示临床足部运动在利用HIF-1αDNA，随后EP处理的小鼠中在股动脉结扎后得到改善。测定足部运动，并将其评为0-4分作为功能读出参数，以评估缺血诱导后的功能缺损。积极的足部运动在pVAX-EP小鼠中显著受损，但在第21天在HIF-EP小鼠中得到显著改善。对于统计显著性(P<.05)，数据为平均值±平均值的标准误差(误差条贯穿每一只小鼠)。*HIF-EP相对pVAX-EP；P<.001；**HIF-IM相对pVAX-EP；P<.01；和^aHIF-EP相对HIF-IM；P<.05。

这些数据显示，在第0天对于所有3个处理组，存在急剧的肢体功受损。HIF-EP和HIF-IM小鼠从第3天至第14天显示相似的肢体功能的改善。在第21天看到足部运动的统计上显著的差异(3.5±0.58相对2.4±1.14；P<.05)，其中HIF-EP小鼠的足部运动评分显著高于HIF-IM小鼠。pVAX-EP小鼠一直至第21天都显示最差的肢体功能恢复(图3C)。

实施例4

HIF-1αDNA的体内EP和肢体坏死

在接受HIF-1αDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1αDNA质粒的IM递送的小鼠的缺血组织中检测肢体坏死。

图3D显示，在21天的过程中，在利用HIF-1α，接着EP处理的小鼠中临床肢体坏死评分得到改善。将0至4的临床评分系统用于测定股动脉结扎后肢体坏死率，具有≥3的评分的小鼠被认为具有严重的坏死，并将其无痛致死。当与HIF-EP和HIF-IM小鼠相比较时，更多的pVAX-EP小鼠具有>3的肢体坏死，从而要求无痛致死。数据汇总为39只小鼠直至21天的平均值±平均值的标准误差(误差条)，(HIF-EP，n＝13；HIF-IM，n＝14；pVAX-EP，n＝12)，在P<.05时，统计上显著。

这些数据表明，肢体功能恢复与坏死程度和/或因严重坏死或自离断而对无痛致死的需要相关。HIF-EP小鼠显示如相较于HIF-IM小鼠(77％612％相对43％614％；P<.05)以及相较于pVAX-EP(77％612％相对17％611％；P<0.01；图3D)的最低肢体坏死率(肢体坏死评分<3)和需要无痛致死的自离断。

实施例5

组织坏死、毛细血管密度、侧支血管和血管面积

在接受HIF-1αDNA质粒的体内-EP介导的递送和HIF-1αDNA质粒的IM递送的小鼠的缺血组织中检测组织坏死、毛细血管密度、侧支血管和血管面积。

在第21天用苏木精和伊红以及免疫荧光染料针对坏死染色的收肌组织切片、CD31阳性内皮细胞和α-SMA阳性的血管的代表性显微照片分别示于图5A和5C。图5A显示在第21天利用苏木精和伊红(H&E)染色的收肌组织切片的代表性显微照片(原始放大倍数，x200)，显示了相对于阳性对照组(低氧诱导因子肌肉注射[HIF-IM])在阴性对照组(空骨架质粒DNA-电穿孔[pVAX-EP])中在结扎的肌肉中存在更大的坏死组织面积。在积极处理组(HIF-EP)中存在更少的坏死炎症浸润细胞。

图5C显示定量毛细血管密度的第21天针对CD31+毛细血管染色的收肌组织的代表性显微照片(原放大倍数，×200)。CD31+毛细血管的数量相较于接受阴性对照治疗(pVAX-EP)和阳性对照(HIF-IM)的那些结扎的肢体肌肉在接受HIF-EP处理的结扎的肢体肌肉中更多。

图5B显示汇总定量数据，该数据揭示相较于阳性对照组(HIF-IM)和阴性对照组(pVAX-EP)在积极处理组(HIF-EP)中存在显著更少的百分比坏死组织面积。数据表示为平均值±平均值的标准误差(误差条)，将统计显著性设置在P<.05。*P<.001(HIF-EP相对HIF-IM)；**P<.01(HIF-IM相对pVAX-EP)；和^#P<.0001(HIF-EP相对pVAX-EP)。HIF-EP小鼠相较于对照小鼠在第21天具有更少的收肌坏死(HIF-EP相对HIF-IM，20.7％±1.75％相对44％±3.73％，P<.001；HIF-EP相对pVAX-EP，20.7％±1.75％相对60.05％±2.17％；P<.0001；以及HIF-IM相对pVAX-EP，44％±3.73％相对60.05％±2.17％，P<.01；图5B)。

图5D显示表明CD31+毛细管在积极处理组(HIF-EP)中相较于阴性对照组(pVAX-EP)和阳性对照组(HIF-IM)显著更高的定量数据汇总。数据表示为平均值±平均值的标准误差，将统计显著性设置在P<.05。*P<.001(HIF-EP相对HIF-IM)；**P<.001(HIF-IM相对pVAX-EP)；和^#P<.0001(HIF-EP相对pVAX-EP)。相较于对照组(HIF-EP相对HIF-IM，96.83±5.72根血管/高倍视野[hpf]相对62.87±2.0根血管/hpf；P<.001；HIF-EP相对VAX-EP，96.83±5.72根血管/hpf相对39.37±2.76根血管/hpf；P<.0001；和HIF-IM相对pVAX/EP，62.87±2.0根血管/hpf相对39.37±2.76根血管/hpf；P<.001；图5D)，在HIF-EP小鼠的收肌中毛细血管密度(CD31+内皮细胞)得以增加。

图6A描绘定量数据汇总，该数据显示平滑肌肌动蛋白(SMA)+血管(血管重塑/络脉)在积极处理组(缺氧诱导因子-电穿孔[HIF-EP])中相较于阴性对照组(空骨架质粒DNA-EP[pVAX-EP])和阳性对照组(低氧诱导因子-肌内注射[HIF-IM])中显著更高。数据表示为平均值±平均值的标准误差，将统计显著性设置在P<.05。*P<.0001(HIF-EP相对HIF-IM)；**P<.0001(HIF-IM相对pVAX-EP)；和^#P<.001(HIF-EP相对pVAX-EP)。侧支血管数量/血管重塑在HIF-EP小鼠中相较于对照组也获得增加(HIF-EP相对HIF-IM，76.33±1.94根血管/hpf相对37.5±1.56根血管/hpf；P<.0001；HIF-EP相对pVAXEP，76.33±1.94根血管/hpf相对18.5±1.34根血管/hpf；P<.00001；和HIF-IM相对pVAX-EP，37.5±1.56根血管/hpf相对18.5±1.34根血管/hpf；P<.001；图6A)。

图6B描绘显示SMA+血管在积极处理组(HIF-EP)中相较于阴性对照组(pVAX-EP)和阳性对照组(HIF-IM)在总面积(μm²)上显著更大的定量数据汇总。将统计显著性设置在P<.05。*P<.001(HIF-EP相对HIF-IM)；**P<.05(HIF-IM相对pVAX-EP)；和^#P<.0001(HIF-EP相对pVAX-EP)。总血管面积在HIF-EP中相对于对照更大(HIF-EP相对HIF-IM，15,521.67±1298.16μm²相对7788.87±392.04μm²；P<.001；HIF-EP相对pVAX-EP，15,521.67±1298.16μm²相对4640.25±614.01μm²；P<.0001；和HIF-IM相对pVAX-EP，7788.87±392.04μm²相对4640.25±614.01μm²；P<.05；图6B)。

实施例6

实施例2-5的结果的概述

概括上述调查，HIF-1α质粒DNA的体内EP-介导的递送在肢体缺血的小鼠模型中改善了新生血管形成。具体地，所述调查表明HIF-1αDNA的体内EP显著改善肢体灌流(HIF-EP：1.03±0.15相对HIF-IM：0.78±0.064；P<.05，相对pVAX-EP：0.41±0.019；P<.001)、肢体功能恢复(HIF-EP：3.5±0.58相对HIF-IM，2.4±1.14；P<.05，相对pVAX-EP：2.4±1.14；P<.001)和第21天的肢体自离断(HIF-EP：77％±12％相对HIF-IM：43％±14％；P<.05，相对pVAX-EP:17％±11％；P<.01)。

所述调查还表明收肌坏死得以减少(HIF-EP：20.7％±1.75％相对HIF-IM：44％±3.73；P<.001，相对pVAX-EP：60.05％±2.17％；P<.0001)，毛细血管密度得以增加(HIF-EP：96.83±5.72根血管/高倍视野[hpf]相对HIF-IM：62.87±2.0根血管/hpf；P<.001，相对pVAX-EP：39.37±2.76根血管/hpf；P<.0001)，侧支血管形成得以增加(HI-EP：76.33±1.94根血管/hpf相对HIF-IM：37.5±1.56根血管/hpf；P<.0001，相对pVAX-EP：18.5±1.34根血管/hpf；P<.00001)，以及血管更大(HIF-EP：15,521.67±1298.16μm²相对HIF-IM：7788.87±392.04μm²；P<.001相对pVAX-EP：4640.25±614.01μm²；P<.0001)。

因此，这些数据表明直至研究的终点(即第21天)接受HIF-1α质粒DNA的体内EP-介导的递送的小鼠中的肢体灌流恢复、生理肢体功能的统计上显著的改善，以及毛细血管水平上的改善的血管供应、血管重塑和组织形态学特性。接受HIF-1α质粒DNA的IM递送的小鼠没有保持这些收益直至研究的终点(即第21天)。这些数据还表明，接受HIF-1α质粒DNA的体内EP-介导的递送的小鼠具有显著更低的肢体坏死和自离断率。

应理解，前文详述和所附实施例仅是例举性的并且无意被视为对本发明的范围的限制，所述范围仅由所附权利要求和它们的等同物确定。

对公开的实施方案的各种改变和改进对于本领域技术人员来说是显而易见的。可在不背离其精神和范围的情况下进行这样的改变和改进，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用方法相关的那些改变和改进。

Claims (19)

1.一种包含缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的治疗剂。

2.根据权利要求1所述的治疗剂，其中HIF-1α由如SEQIDNO:1中所示的核苷酸序列、如SEQIDNO:3中所示的核苷酸序列、如SEQIDNO:5中所示的核苷酸序列、与SEQIDNO:1具有95％或更大的同一性的核苷酸序列、与SEQIDNO:3具有95％或更大的同一性的核苷酸序列或与SEQIDNO:5具有95％或更大的同一性的核苷酸序列编码。

3.根据权利要求2所述的治疗剂，其中HIF-1α由如SEQIDNO:5中所示的核苷酸序列编码。

4.根据权利要求2所述的治疗剂，其还包含如SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列、如SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列、与SEQIDNO:2具有95％或更大的同一性的氨基酸序列、与SEQIDNO:4具有95％或更大的同一性的氨基酸序列或与SEQIDNO:6具有95％或更大的同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的治疗剂，其还包含如SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的治疗剂，其中将HIF-1α突变，以便HIF-1α在细胞中不能被羟化。

7.根据权利要求6所述的治疗剂，其中HIF-1α的脯氨酸残基在细胞中不能被羟化。

8.根据权利要求1所述的治疗剂，其还包含药学上可接受的赋形剂。

9.一种在有此需要的受试者中治疗缺氧或局部缺血的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1所述的疫苗。

10.根据权利要求9所述的方法，其中施用所述疫苗包括电穿孔。

11.根据权利要求9所述的方法，其中施用所述疫苗包括肌内施用和皮内施用的至少一种。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述缺氧或局部缺血与严重肢体缺血、外周动脉疾病、伤口愈合、血管疾病、循环系统疾病、冠状动脉病、心血管疾病或糖尿病相关联。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述缺氧或局部缺血与严重肢体缺血相关联。

14.根据权利要求9所述的方法，其中相较于未被施予所述疫苗的受试者，毛细血管密度、侧支血管形成或血管尺寸的至少一个在被施予所述疫苗的受试者中得以增加。

15.根据权利要求9所述的方法，其中相较于未被施予所述疫苗的受试者，组织灌流在被施予所述疫苗的受试者中得以增加。

16.根据权利要求9所述的方法，其中相较于未被施予所述疫苗的受试者，组织坏死在被施予所述疫苗的受试者中得以减少。

17.一种核酸分子，其包含选自以下的核苷酸序列：SEQIDNO:5和与SEQIDNO:5具有95％或更大的同一性的核苷酸序列。

18.根据权利要求17所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列是质粒。

19.一种氨基酸分子，其包含选自以下的氨基酸序列：SEQIDNO:6和与SEQIDNO:6具有95％或更大的同一性的氨基酸序列。